CN107613971A - 用于减少、或预防或逆转哺乳动物对象中皮肤色素沉着增加的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明包括化合物、包括其的组合物和使用其中的化合物和/或组合物的方法，其用于调节哺乳动物对象中的皮肤色素沉着。在某些实施方式中，本发明的化合物治疗或预防与对象中色素过度相关联的皮肤紊乱或疾病。在其它实施方式中，本发明的化合物充当非典型的性类固醇激素受体GPRE1的拮抗剂并且不结合至典型的核雌激素受体(ER)。在又其它实施方式中，本发明的化合物充当非典型的性类固醇激素受体PAQR7的拮抗剂并且不结合至典型的核孕酮受体(PR)。

Description

用于减少、或预防或逆转哺乳动物对象中皮肤色素沉着增加 的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求了2015年4月6日提交的美国临时申请号62/143,597和2015年9月10日提交的申请号62/216,792的优先权，其申请的全部内容通过引用以其全部并入本文。

关于联邦赞助的研究或研发的声明

本发明在由国立卫生研究院/国立癌症研究所授予的CA163566下，和在由国立卫生研究院SPORE授予的CA174523下利用政府支持完成。政府在本发明中享有某些权利。

背景技术

人肤色在从暗褐色到淡粉色-白色色调的种类范围内。人的皮肤色素沉着主要进化以调节穿透皮肤的紫外线(UV)辐射的量，从而控制辐射的生化效应。影响人的实际肤色的最重要的物质是黑色素。

黑色素控制来自太阳的通过吸收穿透皮肤的UV辐射的量。虽然UV辐射可以帮助产生维生素D，但是过度地暴露于UV可能损害健康。黑色素在被称为黑素细胞的皮肤细胞内产生，并且是深色皮肤人的肤色的主要决定因素。产生的黑色素的量和类型二者由在不完全显性下起作用的多种基因控制。驻留在基底表皮(basal epidermis)中的黑素细胞通过合成黑色素(黑素生成)——一种被认为主要通过α-促黑激素(αMSH)调节的复杂过程——控制人肤色。αMSH肽由垂体中枢地分泌，并且响应于UV损伤由周围角质化细胞局部地分泌。αMSH结合至黑皮质素受体1(MC1R)——一种G蛋白偶联受体(GPCR)——激活腺苷酸环化酶，并且增加胞质cAMP。该二级信使激活下游转录事件的级联，导致黑色素合成需要的基因的表达。

黑素生成在被称为黑素体的小的膜结合包装内发生。当黑素体充满黑色素时，它们移动进入黑素细胞的细长臂，它们从这个地方被转移至角质化细胞。在正常条件下，黑素体覆盖角质化细胞的上部分并且保护它们免受遗传损伤。根据来自角质化细胞(keranocyte)的信号，一个黑素细胞供应黑色素至大约36个角质化细胞。它们还调节黑色素产生和黑素细胞的复制。人具有不同的肤色，这主要是因为它们的黑素细胞产生不同量和种类的黑色素。人肤色的遗传机制主要受到酪氨酸酶的调节，其形成皮肤、眼睛和头发色调(hair shade)的颜色。肤色的区别也归因于皮肤中黑素体的大小和分布的区别。

不管是生物种族(bioethnic)背景或者肤色如何，一些种类的不均匀色素沉着影响大多数人。皮肤与正常的相比可以显得更淡或更暗，或者根本缺乏色素沉着。可能存在斑点和不均匀区域，褐色至灰色变色的斑块(patch)，或雀斑。除了血液相关病症比如黄疸、胡萝卜素色素沉着、或银质沉着病之外，皮肤色素沉着紊乱通常由于身体产生太多或太少黑色素而发生。

在本领域中存在研发用于减少、或预防或逆转哺乳动物对象比如人中皮肤色素沉着增加的新型组合物和方法的需要。在非限制性实施方式中，这样的组合物和方法对于治疗或预防与着色过度相关联的皮肤紊乱或疾病将是有用的。在非限制性实施方式中，这样的组合物和方法对于治疗或预防与妊娠相关联的皮肤紊乱或疾病将是有用的。本发明满足了这种需要。

发明内容

本发明提供了一种化合物，或其盐、溶剂化物、互变异构体、对映异构体或非对映异构体。本发明进一步提供了一种药物组合物，其包括至少一种药学上可接受的运载体和本发明的至少一种化合物。本发明进一步提供了减少、或预防或逆转哺乳动物对象中皮肤色素沉着增加的方法。本发明进一步提供了用于减少、或预防或逆转哺乳动物对象中皮肤色素沉着增加的试剂盒。

在某些实施方式中，本发明的化合物或分子是

其中：R₁选自H和C₁-C₃烷基；R₂选自H和C₁-C₃烷基；键a是单或双键；R₃选自H和卤代。

在某些实施方式中，该化合物或分子，或其盐、溶剂化物、互变异构体、对映异构体或非对映异构体是G-15(rel-(3aS,4S,9bR)-4-(6-溴苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)-3a,4,5,9b-四氢-3H-环戊并[c]喹啉)。在其它实施方式中，该化合物或分子，或其盐、溶剂化物、互变异构体、对映异构体或非对映异构体不是G-15。

在某些实施方式中，该化合物或分子，或其盐、溶剂化物、互变异构体、对映异构体或非对映异构体是G-36(rel-(3aS,4R,9bR)-4-(6-溴苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)-8-异丙基-3a,4,5,9b-四氢-3H-环戊并[c]喹诺酮)。在其它实施方式中，该化合物或分子，或其盐、溶剂化物、互变异构体、对映异构体或非对映异构体不是G-36。

在某些实施方式中，该化合物或分子，或其盐、溶剂化物、互变异构体、对映异构体或非对映异构体是CH2P4(rel-(8S,9S,10S,13S,14S,17S)-17-乙酰基-13-甲基-10-乙烯基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊并[a]菲-3(2H)-酮)。在其它实施方式中，该化合物或分子，或其盐、溶剂化物、互变异构体、对映异构体或非对映异构体不是CH2P4。

在某些实施方式中，(I)中的R₁是H或2-丙基。在其它实施方式中，(I)中的R₂是H或甲基。在又其它实施方式中，(I)中的键a是双键。在又其它实施方式中，(I)中的键a是单键。在又其它实施方式中，R₃选自H、F、Cl和Br。

在某些实施方式中，化合物为选自下列的至少一种：

在某些实施方式中，药物组合物被配制用于外用或经皮施用。在其它实施方式中，药物组合物不包括G-15。在又其它实施方式中，药物组合物不包括G-36。在又其它实施方式中，药物组合物不包括CH2P4。在又其它实施方式中，药物组合物进一步包括至少一种阻光剂(sun-blocking agent)。在又其它实施方式中，药物组合物进一步包括至少一种防晒霜。

在某些实施方式中，方法包括给对象施用治疗有效量的选自下列的至少一种化合物：(i)不结合至典型的核雌激素受体(canonical nuclear estrogen receptor)的GPER拮抗剂，和(ii)不结合至典型的核孕酮受体的PAQR7激动剂。

在某些实施方式中，对象是人。

在某些实施方式中，典型的核雌激素受体包括选自ERα和ERβ的至少一种。

在某些实施方式中，典型的核孕酮受体包括选自PR-A和PR-B的至少一种。

在某些实施方式中，化合物是GPER1拮抗剂。

在某些实施方式中，对象遭受选自下列的至少一种病症：与口服避孕药使用、妊娠和女性的内源雌激素相关联的色素改变；日光性着色斑；痤疮；湿疹；化学品、太阳和热烧伤疤痕；狼疮；牛皮癣；肉样瘤病；糠疹；持久性变色红斑；发疱病；药物反应；扁平苔癣；和其它炎性皮肤损伤。

在某些实施方式中，化合物外用地或经皮地被施用至对象。在又其它实施方式中，化合物被配制为用于外用或经皮施用的药物组合物。在又其它实施方式中，药物组合物进一步包括至少一种阻光剂。在又其它实施方式中，药物组合物进一步包括防晒霜。在又其它实施方式中，药物组合物基本上不含皮肤漂白剂。

在某些实施方式中，化合物为选自G-15、G-36和CH2P4的至少一种。

在某些实施方式中，试剂盒包括本发明的至少一种化合物和/或药物组合物。在其它实施方式中，试剂盒进一步包括外用地或经皮地将至少一种药物组合物施用至对象的使用说明。

附图说明

出于说明本发明的目的，在附图中描绘了本发明的某些实施方式。但是，本发明不限于附图中描绘的实施方式的精确布置和手段。

图1包括图解妊娠相关的色素沉着紊乱的一组图像。图像A-C描绘患有黑斑病的患者的色素沉着紊乱。图像D描绘具有色素分界线的患者。图像E和F描绘母亲的典型黑线。图像G描绘儿童的典型黑线。

图2A-2G包括图解人黑素细胞中黑色素产生的一组示意图和柱状图。图2A包括人黑素细胞稳态的经典调控的示意图。图2B包括图解黑色素产生以剂量依赖性方式响应于αMSH的柱状图。图2C包括图解黑色素产生以剂量依赖性方式响应于雌激素的柱状图。图2D包括图解利用媒介、αMSH或雌激素处理的黑素细胞产生黑色素的柱状图。图2E包括图解黑色素产生以剂量依赖性方式响应于孕酮(P4)的柱状图。图2F包括图解使用iPS衍生的雌性黑素细胞的黑色素产生响应于雌激素和孕酮的柱状图。图2G包括图解使用中年人面部黑素细胞的黑色素产生响应于雌激素和孕酮的柱状图。对于每个实验N＝3生物学复制。误差线表示±s.d.，*p<0.05。

图3A-3F包括图解雌激素和孕酮相互地调控黑色素合成的发现的一组图像和柱状图。图3A包括图解利用雌激素(E2)处理的——与媒介处理的对照相比——原代人黑素细胞的黑色素含量的柱状图。图3B包括图解利用媒介或雌激素处理的器官型皮肤(organotypicskin)的Fontana-Masson(黑色素)染色的柱状图和图像。相对黑色素含量在图的底部的柱状图中图解。图3C包括图解利用媒介或雌激素处理的器官型皮肤的MITF(小眼畸形相关的转录因子)免疫组织化学的柱状图和图像。黑素细胞群体密度在图的底部的柱状图中图解。图3D包括图解利用孕酮(P4)处理的——与媒介相比——原代人黑素细胞的黑色素含量的柱状图。图3E包括图解利用孕酮或媒介处理的器官型皮肤组织的Fontana-Masson(黑色素)染色的柱状图和图像。相对黑色素含量在图的底部的柱状图中图解。图3F包括图解利用媒介或孕酮处理的器官型皮肤组织的MITF免疫组织染色的柱状图和图像。黑素细胞群体密度在图的底部的柱状图中图解。对于每个实验N＝3生物学复制。误差线表示±s.d.，*p<0.05，比例尺＝50μm。

图4A-4H包括图解雌激素和孕酮通过非经典受体进入经典黑色素产生途径的发现的一组图像和柱状图。图4A包括图解来自雌激素处理的黑素细胞的cAMP ELISA的柱状图。图4B包括证明在雌激素处理后经典黑色素途径调节物的改变的一组蛋白质印迹图像。图4C包括图解来自孕酮处理的黑素细胞的cAMP ELISA的柱状图。图4D包括证明在孕酮处理后经典黑色素途径调节物的改变的一组蛋白质印迹图像。图4E包括图解来自同时利用雌激素和孕酮处理的黑素细胞的黑色素分析的柱状图。图4F包括MCF7细胞和黑素细胞中雌激素和孕酮受体的一组蛋白质印迹图像。图4G包括图解转导有对照shRNA或靶向GPER的shRNA的黑素细胞的黑色素含量的柱状图。细胞利用媒介或者雌激素处理。图4H包括图解在转导有对照shRNA或靶向PAQR7的shRNA的黑素细胞上执行的黑色素分析的柱状图。细胞利用媒介或者孕酮处理。对于每个实验N＝3生物学复制。误差线表示±s.d.，*p<0.05。

图5A-5H包括图解黑素细胞中的激素受体的一组柱状图和表格。图5A包括图解如通过qRT-PCR测定的MCF7细胞和黑素细胞中的经典激素受体的相对基因表达的柱状图。Ct值被标准化为肌动蛋白，并且相对于MCF7细胞中的雄激素受体(AR)的表达设置。图5B包括图解人黑素细胞中经典和非经典雌激素和孕酮受体的RPKM值的表格，按照惯例，RPKM值>1表示基因表达。图5C包括图解GPER以及孕酮和AdipoQ受体7(PAQR7)的表达显示为1/Ct值的柱状图。图5D包括相对于黑素细胞中的表达水平显示的——如通过qRT-PCR测定的——黑素细胞、成纤维细胞和角质化细胞中GPER和PAQR7转录物的相对表达的柱状图。图5E包括图解显示靶向GPER的两种发夹的mRNA敲低效率的qRT-PCR的柱状图。图5F包括图解显示靶向PAQR7的两种发夹的mRNA敲低效率的qRT-PCR的柱状图。图5G包括图解转导有具有靶向GFP或GPER的指导RNA的LentiCRISPRV2的黑素细胞的黑色素含量的一组柱状图。细胞利用媒介或雌激素处理。图5H包括图解转导有具有靶向GFP或PAQR7的指导RNA的LentiCRISPRV2的黑素细胞的黑色素含量的一组柱状图。细胞利用媒介或孕酮处理。误差线表示±s.d.，*p<0.05。

图6是图解黑色素合成响应于百日咳毒素(PTX)、孕酮(P4)或二者的柱状图。对于每个实验N＝3生物学复制。误差线表示±s.d.，*p<0.05。

图7A-7B包括图解黑色素产生通过性类固醇类似物——当前临床应用中的GPER激动剂——改变的发现的一组柱状图。图7A是图解黑色素产生响应于他莫西芬(TMX)的柱状图。图7B是图解黑色素产生响应于炔雌醇(EE2)的柱状图。对于每个实验N＝3生物学复制。误差线表示±s.d.，*p<0.05。

图8包括图解在选择性GPER拮抗剂G-15或G-36的存在下利用媒介、GPER激动剂或雌激素处理的黑色细胞的黑色素产生的柱状图。对于每个实验N＝3生物学复制。误差线表示±s.d.，*p<0.05。

图9A-9B包括图解靶向PAQR7的特异性激动剂对黑色素产生的作用的一组柱状图。图9A包括图解黑色素产生响应于CH2P4——一种特异性PAQR7激动剂——的柱状图。图9B包括在慢病毒转导有对照shRNA或者靶向PAQR7的shRNA的黑素细胞上进行的黑色素分析的柱状图。这些细胞利用媒介或CH2P4处理。对于每个实验N＝3生物学复制。误差线表示±s.d.，*p<0.05。

图10A-10C包括图解GPER信号传导足以改变器官型人组织中的黑色素产生的发现的一组图像和柱状图。图10A包括图解利用媒介(左)或CH2P4(右)处理的器官型皮肤的一组图像。图10B包括利用媒介或CH2P4处理的器官型皮肤的Fontana-Masson(黑色素)染色的一组图像和柱状图。黑色素含量的定量在右边图解。图10C包括图解利用媒介或CH2P4处理的器官型皮肤的MITF免疫组织染色的一组图像和柱状图。黑素细胞群体密度的定量在右边图解。对于每个实验N＝3生物学复制。误差线表示±s.d.，*p<0.05，比例尺＝50μm。

图11包括在本文中讨论的选择的生物学途径的示意图。

具体实施方式

在一方面，本发明涉及出乎意料的发现：本发明的化合物调节哺乳动物对象比如人中的皮肤色素沉着。在某些实施方式中，本发明的化合物治疗或预防对象中的皮肤着色过度。在其它实施方式中，本发明的化合物治疗或预防早老症的皱纹和/或变色。在又其它实施方式中，本发明的组合物在不暴露于皮肤漂白产品和/或DNA损伤UV辐射的情况下出于审美益处调节皮肤颜色。在又其它实施方式中，本发明的组合物有助于逆转或最小化雌激素相关的皮肤改变(比如，例如，皮肤的变黑、皮肤斑点的出现等)——其可能例如在妊娠期间和/或在利用雌激素或其类似物的治疗性处理期间发生。

人妊娠和口服避孕药使用通常与改变的表皮色素沉着相关联，并且这暗示了循环激素的改变可以调控黑素细胞稳态。但是，介导这些作用的特异性激素、受体和下游途径尚不明确。

如本文所证明的，17β-雌二醇(雌激素)的生理学相关水平促进皮肤色素产生，而孕酮具有相反的作用。改变的黑色素产生与cAMP——一种哺乳动物色素沉着的已知调节物——的平行改变相关联。正常的原代黑素细胞不表达经典的雌激素和孕酮受体(ER/PR)。本研究证明了黑素细胞表达非典型的甾类激素受体G蛋白偶联雌激素受体1(GPER1)，以及孕酮和AdipoQ受体7(PAQR7)。这些蛋白质的慢病毒介导的CRISPR-Cas9消融阻断雌激素和孕酮的色素作用，这暗示雌激素和孕酮分别通过非典型的受体GPER1和PAQR7相互地影响色素沉着，以调控人黑素细胞稳态。在某些方面，这些受体和它们相关的信号传导途径元件的调节在表皮色素沉着的紊乱中具有治疗实用性。

本文中利用遗传缺失以及特异性药理学激动剂和拮抗剂二者呈现的结果建立了雌激素和孕酮分别通过非经典激素受体GPER和PAQR7的激活影响人黑素细胞色素产生(图11)。在一个非限制性方面，使用选择性激动剂或拮抗剂的这些受体的特异性激活足以增加或减少色素合成，避免在其它细胞类型中经典雌激素和孕酮受体激活的潜在不期望的作用。GPER和PAQR7在角质化细胞或成纤维细胞中具有降低的表达，与非特异性地激活所有细胞中的腺苷酸环化酶的毛喉素相比，其应当限制对感兴趣细胞的药物作用。

在非限制性实施方式中，G-15和G-36是GPER拮抗剂，并且不结合至典型的核ER。在某些实施方式中，典型的核ER包括ERα和/或ERβ。

在非限制性实施方式中，CH2P4是PAQR7激动剂并且不结合至典型的核PR。在某些实施方式中，典型的核PR包括PR-A和/或PR-B。

在一方面，特异性GPER拮抗剂和PAQR7激动剂代表用于正常化表皮色素沉着的紊乱的有用的、新型种类的治疗剂。无数的遗传和获得病症包括普通的痛苦——比如痤疮、湿疹、白癜风、紫外线(UV)辐射暴露、外伤和妊娠——与皮肤色素沉着的变更——其可以是广泛的和持久的——相关联。

在某些非限制性实施方式中，本文中描述的靶向受体(一种或多种)可以阻止皮肤免受早老症的皱褶和变色，并且还在不暴露于DNA损伤UV辐射或有毒的皮肤漂白剂的情况下出于审美益处调节肤色。

本发明不应当被解释为限于本文叙述的化合物或其任何类似物。在某些实施方式中，本发明涵盖充当针对GPER的拮抗剂并且不结合至典型的核雌激素受体的任何化合物。在其它实施方式中，本发明涵盖充当针对PAQR7的激动剂并且不结合至典型的核孕酮受体的任何化合物。

定义

如本文所使用，下列术语中的每个具有与其在该部分中相关联的含义。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语通常具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。通常，本文中使用的命名法和细胞培养、分子遗传学和化学中的实验室程序是本领域中公知的和通常采用的那些。

如本文所使用，术语“19-CH2P4”或“CHP4”指的是rel-(8S,9S,10S,13S,14S,17S)-17-乙酰基-13-甲基-10-乙烯基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊并[a]菲-3(2H)-酮)，或其盐、溶剂化物、对映异构体或非对映异构体。

如本文所使用，冠词“一个(a,an)”指的是一个或多于一个(即，至少一个)该冠词的语法对象。举例而言，“一个要素”意思是一个要素或多于一个要素。

如本文所使用，术语“αMSH”指的是α-促黑激素。

如本文所使用，术语“大约”将被本领域普通技术人员理解并且将在其被使用的背景下在一定程度上改变。如本文所使用，当提及可测量的值比如量、时段等时，术语“大约”意思是涵盖距规定值±20％或±10％、±5％、±1％或±0.1％的变化，因为这些变化适合于执行公开的方法。

如本文所使用，除非另有说明，单独或与其它术语组合使用的术语“烷氧基”意思是具有指定数目的碳原子的烷基，如本文别处所限定的，其经由氧原子连接至分子的剩余部分，比如，例如，甲氧基、乙氧基、1-丙氧基、2-丙氧基(或异丙氧基)以及更高级同系物和同分异构体。具体实例是(C₁-C₃)烷氧基，比如但不限于乙氧基和甲氧基。

如本文所使用，除非另有说明，术语“烷基”其自身或者作为另一取代基的一部分意思是具有指定的碳原子数目(即C₁-C₁₀意思是一至十个碳原子)的直链或支链烃并且包括直链、支链或环状取代基。实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基和环丙甲基。具体实施方式是(C₁-C₄)烷基，比如但不限于乙基、甲基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基和环丙甲基。

如本文所使用，术语“AR”指的是雄激素受体。

如本文所使用，术语“cAMP”指的是环腺苷酸。

如本文所使用，术语“CREB”指的是cAMP效应元件结合蛋白。

“疾病”是动物的健康状态，其中动物不能维持稳态，并且其中如果疾病不改善，则动物的健康继续恶化。相比之下，动物中的“紊乱”是如此健康状态：其中动物能够维持稳态，但是其中动物的健康状态与不存在紊乱的情况下的健康状态相比将是不利的。不治疗，紊乱不一定引起动物健康状态的进一步降低。

如本文所使用，术语“E2”指的是雌激素。

如本文所使用，术语“EE2”指的是炔雌醇。

如本文所使用，术语化合物的“有效量”或“治疗有效量”或“药学有效量”可交换地被用于指足以给被施用化合物的对象提供有益效果的化合物的量。

如本文所使用，术语“ER”指的是雌激素受体。

如本文所使用，术语“GPCR”指的是G蛋白偶联受体。

如本文所使用，术语“G15”或“G-15”指的是rel-(3aS,4R,9bR)-4-(6-溴苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)-2,3,3a,4,5,9b-六氢-1H-环戊并[c]喹诺酮，或其盐、溶剂化物、对映异构体或非对映异构体。

如本文所使用，术语“G36”或“G-36”指的是rel-(3aS,4R,9bR)-4-(6-溴苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)-8-异丙基-3a,4,5,9b-四氢-3H-环戊并[c]喹诺酮)，或其盐、溶剂化物、对映异构体或非对映异构体。

如本文所使用，术语“GPR30受体”(还被称为GPER1；CEPR；CMKRL2；DRY12；FEG-1；GPCR-Br；GPER；LERGU；LERGU2；LyGPR；或mER)指的是介导雌激素依赖性信号转导的7-跨膜(7TM)G蛋白偶联受体。GPR30是在内质网中发现的细胞内蛋白，其以高亲和力(6nM的K_d)结合雌激素并且介导快速细胞应答，包括细胞核中的钙动员和磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸产生。GPR30受体指的是所有类型的GPR30受体，不管在其中发现这样的受体的组织如何，并且指的是其任何变体，包括哺乳动物(比如人和兽医应用相关的家养的哺乳动物)的受体和其变体。已经被用于GPR30的其它名称包括CMKRL2、DRY12、FEG-1、GPCR-Br、LERGU、LERGU2、LyGPR、CEPR和MGC99678等。

如本文所使用，除非另有说明，术语“卤代”或“卤素”单独或作为另一取代基的一部分指的是氟、氯、溴或碘原子。

如本文所使用，“说明材料”包括出版物、记录物、图表或任何其它表达介质，其可以被用于在用于抑制或降低对象中的全身免疫应答的试剂盒中传达本发明的化合物、组合物、分析或方法的有效性。例如，本发明的试剂盒的说明材料可以贴至包含本发明的确定化合物、组合物、分析或方法的容器或者与包含确定化合物、组合物、分析或方法的容器一起被运送。可选地，说明材料可以与容器分开运送，意图是说明材料和化合物、组合物、分析或方法由接受者合作使用。

如本文所使用，术语“MC1R”指的是黑皮质素受体1。

如本文所使用，术语“MITF”指的是小眼畸形相关的转录因子。

如本文所使用，术语“调节”意思是，就与将本发明的化合物结合至在本发明中考虑的受体相关联的疾病状态或病症而言，直接地或间接地产生了病症或疾病状态的改善或减轻，在施用根据本发明的化合物之前，其是次佳的并且在许多情况下，是衰弱的并且甚至威胁生命。调节可以凭借激动剂活性、拮抗剂活性或混合的激动剂/拮抗剂活性(取决于受体位点)发生。

如本文所使用，术语“P4”指的是孕酮。

组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)或胸骨内注入或输注技术。

如本文所使用，术语“PAQR7”指的是孕酮和AdipoQ受体7。

如本文所使用，术语“药物组合物”或“组合物”指的是本发明内可用的至少一种化合物与其它化学成分比如运载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂的混合物。药物组合物促进化合物施用至有机体。本领域中存在施用化合物的多种技术，包括但不限于：静脉内、口服、气溶胶、肠胃外、眼部、肺部、颅内、经皮和外用施用。在某些实施方式中，施用包括外用施用。

如本文所使用，术语“药学上可接受的”涉及材料，比如运载体或稀释剂，其不消除组合物的生物学活性或性质，并且是相对无毒的，即该材料可以被施用至个体而不引起不期望的生物学作用或者不以有毒方式与包含其的组合物的任何成分相互作用。

如本文所使用，术语“药学上可接受的运载体”意思是药学上可接受的材料、组合物或运载体，比如液体或固体填料、稳定剂、分散剂、悬浮剂、稀释剂、赋形剂、增稠剂、溶剂或胶囊化材料，其参与携带或运输在本发明内有用的化合物至对象，使得其可以执行其预期功能。典型地，这些构建体可以从身体的一个器官或部分携带或运输至身体的另一个器官或部分。每种运载体在与制剂的其它成分——包括在本发明内有用的化合物——相容的意义上说必须是“可接受的”，并且对于对象是无害的。可以充当药学上可接受的运载体的材料的一些实例包括：糖类，比如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，比如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和其衍生物，比如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；西黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，比如可可油和栓剂蜡；油类，比如花生油、棉花籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；二醇类，比如丙二醇；多元醇，比如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，比如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，比如氢氧化镁和氢氧化铝；表面活性剂；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；和在药物制剂中使用的其它无毒的相容性物质。如本文所使用，“药学上可接受的运载体”也包括任何和所有包衣、抗菌剂和抗真菌剂、和吸收延迟剂等，其与在本发明内有用的化合物的活性是相容的并且对于对象是生理学上可接受的。补充性活性化合物也可以掺入组合物。“药学上可接受的运载体”可以进一步包括在本发明内有用的化合物的药学上可接受的盐。可以在用于实践本发明的药物组合物中包含的其它额外成分在本领域中是已知的并且例如在Remington’sPharmaceutical Sciences(Genaro,Ed.,Mack Publishing Co.,1985,Easton,PA)中描述，其通过引用被并入本文。

如本文所使用，语言“药学上可接受的盐”指的是由药学上可接受的无毒酸和/或碱制备的施用的化合物的盐，这些无毒酸和/或碱包括无机酸、无机碱、有机酸、有机碱、其溶剂化物(包括水合物)和包合物。

如本文所使用，化合物的“药学有效量”、“治疗有效量”或“有效量”是足以给施用该化合物的对象提供有益效果的化合物的量。

如本文所使用，术语“PR”指的是孕酮受体。

如本文所使用的术语“预防(prevent,preventing,prevention)”意思是避免或延迟与对象中的疾病或病症相关联的症状的发作，在施用药剂或化合物开始时对象还没有发展这样的症状。疾病、病症和紊乱在本文中可交换地使用。

如本文所使用的术语“特异性地结合”意思是第一分子优先地结合至第二分子(例如，特定受体或酶)，但是不一定仅结合至所述第二分子。

如本文所使用，术语“对象”和“个体”和“患者”可以可交换地使用并且可以指人或非人哺乳动物或鸟。非人哺乳动物包括例如家畜和宠物，比如羊、牛、猪、犬、猫和鼠科哺乳动物。在某些实施方式中，对象是人。

如本文所使用，术语“TMX”指的是他莫昔芬。

如本文所使用，“外用施用”或“外用应用”指的是施加至身体表面比如皮肤或粘膜的药物。

如本文所使用，术语“治疗”意思是降低患者或对象经历的症状的频率或者施用药剂或化合物以降低经历症状的严重程度。在任何个体情况下的适合治疗量可以由本领域普通技术人员使用常规实验确定。

如本文所使用，术语“治疗(treatment,treating)”被限定为出于治愈、痊愈、缓解、减轻、更改、补救、改善、改良或影响疾病或紊乱、疾病或紊乱的症状或者发展疾病或紊乱的可能性的目的，应用或施用治疗剂——即在本发明内有用的组合物(单独或与另一药剂组合)——至具有疾病或紊乱、疾病或紊乱的症状或者发展疾病或紊乱的可能性的对象，或者应用或施用治疗剂至来自这样的对象的分离组织或细胞系(例如，用于诊断或离体应用)。这样的治疗可以基于从药物基因组学领域获得的知识具体地调整或修改。

如本文所使用，术语“UV”指的是紫外线。

遍及本公开内容，本发明的各个方面可以以范围形式呈现。应当理解，以范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁并且不应当被解释为对本发明的范围的固定不变的限制。因此，范围的描述应当被视为已经具体地公开了在该范围内的所有可能的子范围以及单个数值。例如，范围比如从1到6的描述应当被视为已经具体地公开了子范围比如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及在该范围内的单个数字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范围的宽度如何，这都适用。

化合物和组合物

在一方面，本发明涵盖了结合至PAQR7，并且不结合至典型的核孕酮受体(PR)的化合物。在某些实施方式中，化合物是PAQR7激动剂。

在某些实施方式中，本发明的化合物，或其盐、溶剂化物、互变异构体、对映异构体或非对映异构体是CH2P4(也被称为19-CH2P4；rel-(8S,9S,10S,13S,14S,17S)-17-乙酰基-13-甲基-10-乙烯基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊并[a]菲-3(2H)-酮)：

在另一方面，本发明涵盖雌激素衍生物或其类似物，其结合至GPER，比如但不限于GPER1，并且不结合至典型的核雌激素受体(ER)。在某些实施方式中，雌激素衍生物或类似物是GPER拮抗剂。

在某些实施方式中，本发明的化合物，或其盐、溶剂化物、互变异构体、对映异构体或非对映异构体是式(I)的至少一种分子：其中：R₁选自H和C₁-C₃烷基；R₂选自H和C₁-C₃烷基；键a是单键或双键；R₃选自H和卤代；

在某些实施方式中，化合物不是G-15。在其它实施方式中，化合物不是G-36。在又其它实施方式中，化合物不是G-15或G-36。

在某些实施方式中，R₁选自H、甲基、乙基、1-丙基和2-丙基。在其它实施方式中，R₂是H或2-丙基。

在某些实施方式中，键a是双键。在其它实施方式中，键a是单键。

在某些实施方式中，R₂选自H、甲基、乙基、1-丙基和2-丙基。在某些实施方式中，R₂是H。

在某些实施方式中，R₃选自H、F、Cl、Br和I。在某些实施方式中，R₃是Br。

在某些实施方式中，化合物为选自下列的至少一种：

在某些实施方式中，化合物为选自下列的至少一种：

G15或G-15(rel-(3aS,4S,9bR)-4-(6-溴苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)-3a,4,5,9b-四氢-3H-环戊并[c]喹啉)：

G36或G-36(rel-(3aS,4R,9bR)-4-(6-溴苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)-8-异丙基-3a,4,5,9b-四氢-3H-环戊并[c]喹诺酮)：

rel-1-(2-((3aS,4S,9bR)-4-(6-溴苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)-3a,4,5,9b-四氢-3H-环戊并[c]喹啉-8-基)乙基)-3-(3-碘苯基)脲(在Ramesh,et al.,2010,J.Med.Chem.53:1004-1014中描述)：

rel-(3aS,4S,9bR)-4-(6-溴苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)-8-((E)-1-(2-(5-碘吡啶-2-基)亚肼基)乙基)-3a,4,5,9b-四氢-3H-环戊并[c]喹啉(在Ramesh,et al.,2010,J.Med.Chem.53:1004-1014中描述)：

在某些实施方式中，在本发明的方法内有用的化合物，或其盐、溶剂化物、对映异构体或非对映异构体为在美国专利申请公布号2008/0167334和US 2011/0092533中叙述的至少一种GPER拮抗剂，其全部内容通过引用以其全部被并入本文：

其中：

X＝N-、O、S或N-R，条件是当X是N-R并且R是键时，N与R¹一起形成5-7元任选地取代的杂环基团；

R是键、H、OH、NO₂、任选取代的C₁-C₆烃基(比如任选取代的烷基)、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环、任选取代的-C(O)-(C₁-C₆)烷基(酰胺)、任选取代的-C(O)-O-(C₁-C₆)烷基(尿烷)、任选取代的-C(O)-NH(C₁-C₆)烷基(脲)、任选取代的-C(O)-N(C₁-C₆)二烷基、任选取代的-C(O)-NH(芳基)、任选取代的-C(O)-N(二芳基)、任选取代的-C(O)-NH(杂芳基)、任选取代的-C(O)-N(二杂芳基)、任选取代的-C(O)-NH(杂环)或任选取代的-C(O)-N(二杂环)；

R¹、R²和R⁵每个独立地选自H、OH、NO₂、卤素、C₁-C₆任选取代的羧酸基团、任选取代的O-(C₁-C₆)烷基、任选取代的C₁-C₆烃基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环、任选取代的-C(O)-(C₁-C₆)烷基(酮)、任选取代的-C(O)-O-(C₁-C₆)烷基(酯)、任选取代的O-C(O)-(C₁-C₆)烷基(酯)、任选取代的-C(O)-NH(C₁-C₆)烷基(脲)、任选取代的-C(O)-N(C₁-C₆)二烷基、任选取代的-C(O)-NH(芳基)、任选取代的-C(O)-N(二芳基)、任选取代的-C(O)-NH(杂芳基)、任选取代的-C(O)-N(二杂芳基)、任选取代的-C(O)-NH(杂环)或任选取代的-C(O)-N(二杂环)；

R³和R⁴每个独立地选自H、OH、NO₂、卤素、C₁-C₆任选取代的羧酸基团、任选取代的O-(C₁-C₆)烷基、任选取代的C₁-C₆烃基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环、任选取代的-C(O)-(C₁-C₆)烷基(酮)、任选取代的-C(O)-O-(C₁-C₆)烷基(酯)、任选取代的O-C(O)-(C₁-C₆)烷基(酯)、任选取代的-C(O)-NH(C₁-C₆)烷基(脲)、任选取代的-C(O)-N(C₁-C₆)二烷基、任选取代的-C(O)-NH(芳基)、任选取代的-C(O)-N(二芳基)、任选取代的-C(O)-NH(杂芳基)、任选取代的-C(O)-N(二杂芳基)、任选取代的-C(O)-NH(杂环)或任选取代的-C(O)-N(二杂芳基)或R³和R⁴一起形成5或6元任选取代的碳环(其可以是饱和的或不饱和的)、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂环基团；

R⁶和R⁷每个独立地不存在或者选自H、OH、NO₂、卤素、C₁-C₆任选取代的羧酸基团、任选取代的O-(C₁-C₆)烷基、任选取代的C₁-C₆烃基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环、任选取代的-C(O)-(C₁-C₆)烷基(酮)、任选取代的-C(O)-O-(C₁-C₆)烷基(酯)、任选取代的O-C(O)-(C₁-C₆)烷基(酯)、任选取代的-C(O)-NH(C₁-C₆)烷基(脲)、任选取代的-C(O)-N(C₁-C₆)二烷基、任选取代的-C(O)-NH(芳基)、任选取代的-C(O)-N(二芳基)、任选取代的-C(O)-NH(杂芳基)、任选取代的-C(O)-N(二杂芳基)、任选取代的-C(O)-NH(杂环)或任选取代的-C(O)-N(二杂芳基)，或者R⁶和R⁷一起形成4、5、6或7元任选取代的碳环(其可以是饱和的或不饱和的)、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂环基团、或5至9元任选取代的碳环的或杂环的二环基团，条件是当R^7′和R^7″不存在时，R⁷也不存在；

R^6′为不存在、H、C₁-C₆任选取代的烃基基团(比如H、CH₃或CH₂CH₃)或与R⁶一起形成＝O；

R^7′为不存在、H、任选取代的烃基基团(比如H、CH₃或CH₂CH₃)或与R⁷一起形成＝O；

R^7″为不存在、H、OH、卤素、任选取代的O-(C₁-C₆)烷基、任选取代的C₁-C₆烃基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环、任选取代的-C(O)-(C₁-C₆)烷基(酮)、任选取代的-C(O)-O-(C₁-C₆)烷基(酯)、任选取代的O-C(O)-(C₁-C₆)烷基(酯)、任选取代的-C(O)-NH(C₁-C₆)烷基(脲)、任选取代的-C(O)-N(C₁-C₆)二烷基、任选取代的-C(O)-NH(芳基)、任选取代的-C(O)-N(二芳基)、任选取代的-C(O)-NH(杂芳基)、任选取代的-C(O)-N(二杂芳基)、任选取代的-C(O)-NH(杂环)或任选取代的-C(O)-N(二杂芳基)；

R^8′为不存在(当与R^8′连接的碳和与R⁶连接的碳形成任选的双键时)、H、CH₃或CH₂CH₃；

R¹⁰、R¹¹、R¹²和R¹³每个独立地为H、OH、NO₂、卤素、C₁-C₆任选取代的羧酸基团、任选取代的O-(C₁-C₆)烷基、任选取代的C₁-C₆烃基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环、任选取代的-C(O)-(C₁-C₆)烷基(酮)、任选取代的-C(O)-O-(C₁-C₆)烷基(酯)、任选取代的O-C(O)-(C₁-C₆)烷基(酯)、任选取代的-C(O)-NH(C₁-C₆)烷基(脲)、任选取代的-C(O)-N(C₁-C₆)二烷基、任选取代的-C(O)-NH(芳基)、任选取代的-C(O)-N(二芳基)、任选取代的-C(O)-NH(杂芳基)、任选取代的-C(O)-N(二杂芳基)、任选取代的-C(O)-NH(杂环)或任选取代的-C(O)-N(二杂芳基)；

R¹⁴为H、OH、NO₂、卤素、C₁-C₆任选取代的羧酸基团、任选取代的O-(C₁-C₆)烷基、任选取代的C₁-C₆烃基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂环、任选取代的-C(O)-(C₁-C₆)烷基(酮)、任选取代的-C(O)-O-(C₁-C₆)烷基(酯)、任选取代的O-C(O)-(C₁-C₆)烷基(酯)、任选取代的-C(O)-NH(C₁-C₆)烷基(脲)、任选取代的-C(O)-N(C₁-C₆)二烷基、任选取代的-C(O)-NH(芳基)、任选取代的-C(O)-N(二芳基)、任选取代的-C(O)-NH(杂芳基)、任选取代的-C(O)-N(二杂芳基)、任选取代的-C(O)-NH(杂环)或任选取代的-C(O)-N(二杂环)或者与连接至R⁷的碳一起形成5、6或7元任选取代的碳环(其可以是饱和的或不饱和的)、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂环；

Y是任选取代的(CH₂)_n基团，其中n是0、1或2，任选取代的＝CH-基团、C＝O基团、O、S、任选取代的N-(C₁-C₆)烷基、任选取代的N-芳基、任选取代的N-杂芳基、任选取代的N-杂环、任选取代的N-C(O)-(C₁-C₆)烷基、任选取代的N-C(O)-芳基、任选取代的N-C(O)-杂芳基、任选取代的N-C(O)-杂环；

Z是任选取代的(CH₂)_n基团，其中n是1或2，任选取代的＝CH-基团、C＝O基团、O、S、任选取代的N-(C₁-C₆)烷基、任选取代的N-芳基、任选取代的N-杂芳基、任选取代的N-杂环、任选取代的N-C(O)-(C₁-C₆)烷基、任选取代的N-C(O)-芳基、任选取代的N-C(O)-杂芳基、任选取代的N-C(O)-杂环。

本发明的化合物可以拥有一个或多个立体异构体，并且每个立体异构体可以以(R)或(S)构型独立地存在。在某些实施方式中，本文描述的化合物以光学活性或外消旋形式存在。本文描述的化合物涵盖外消旋的、光学活性的、区域异构的(regioisomeric)和立体异构的形式，或者具有在本文中描述的治疗上有用性质的其组合。光学活性形式的制备以任何适合的方式实现，包括但不限于利用重结晶技术拆分外消旋形式、从光学活性的起始物料合成、手性合成或使用手性固定相的色谱分离。在本文中通过外消旋式图解的化合物进一步代表两种对映异构体中的任一种或其混合物，或者在两个或多个手性中心存在的情况下，所有非对映异构体或者其混合物。

在某些实施方式中，本发明的化合物作为互变异构体存在。所有互变异构体包含在本文叙述的化合物的范围内。

本文描述的化合物也包括同位素标记的化合物，其中一个或多个原子被具有相同原子数，但是与通常在自然界中发现的原子质量或质量数不同的原子质量或质量数的原子代替。适合于包含在本文描述的化合物中的同位素的实例包括并且不限于²H、³H、¹¹C、¹³C、¹⁴C、³⁶Cl、¹⁸F、¹²³I、¹²⁵I、¹³N、¹⁵N、¹⁵O、¹⁷O、¹⁸O、³²P和³⁵S。在某些实施方式中，利用较重的同位素比如氘取代赋予较大的化学稳定性。同位素标记的化合物通过任何适合的方法制备或者通过使用适合的同位素标记的试剂代替另外采用的非标记的试剂的过程制备。

在某些实施方式中，本文描述的化合物通过其它方式标记，该其它方式包括但不限于使用发色团或荧光部分、生物发光标记物或者化学发光标记物。

在本文提供的所有实施方式中，适合的任选取代基的实例不意欲限制要求保护的发明的范围。本发明的化合物可以包含本文提供的任何取代基或取代基的组合。

在某些实施方式中，本发明进一步提供了包括本发明的至少一种化合物和至少一种药学上可接受的运载体的药物组合物。在其它实施方式中，药物组合物被配制用于外用和/或经皮应用。在本发明内考虑的化合物的外用制剂可以被用于皮肤增白，以及用于治疗与着色过度相关联的皮肤病症或疾病。这些病症或疾病包括但不限于痤疮；湿疹；化学品、太阳和热烧伤疤痕；狼疮；牛皮癣；肉样瘤病；糠疹；持久性变色红斑；发疱病；药物反应；扁平苔癣；或其它炎性皮肤损伤。

在某些实施方式中，本发明提供了包括至少一种阻光剂和本发明的至少一种化合物的外用制剂。在其它实施方式中，外用制剂包括配制的阻光或防晒霜和本发明的至少一种化合物。在又其它实施方式中，至少一种阻光剂允许免受由天然太阳光引起的UV光损伤，和本发明的一种或多种化合物允许皮肤增白。在又其它实施方式中，由本发明的至少一种化合物引起的黑色素产生进一步保护皮肤免受由天然太阳光引起的UV光损伤。在又其它实施方式中，外用制剂使免受UV-诱发的皮肤损伤和/或老化。

本发明还涉及在本文描述的发明的方法的任一种内有用的试剂盒。这样的试剂盒包括在本文描述的方法的任一种内有用的成分，包括例如，用于调节哺乳动物对象比如人中的皮肤色素沉着的组合物和方法，用于包含在本文别处描述的发明的实施方式中任一种的成分的一个或多个容器(例如，试管、细胞培养皿、细胞培养板、细胞培养瓶、细胞培养袋)，和说明材料。

盐

本文描述的化合物可以与酸或碱形成盐，并且这些盐包含在本发明中。术语“盐”包括在本发明的方法内有用的游离酸或碱的加成盐。术语“药学上可接受的盐”指的是具备在赋予药物应用的实用性的范围内的毒性概况的盐。在某些实施方式中，盐是药学上可接受的盐。尽管如此，药学上不可接受的盐可能具备性质比如高结晶度，其在实践本发明中具有实用性，比如例如在合成过程中的实用性、在纯化或配制在本发明的方法内有用的化合物中的实用性。

适合的药学上可接受的酸加成盐可以由无机酸或由有机酸制备。无机酸的实例包括硫酸盐、硫酸氢盐、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、碳酸、硫酸和磷酸(包括磷酸氢盐和磷酸二氢盐)。适合的有机酸可以选自脂肪族、脂环族、芳香族、芳脂族、杂环、羧酸和磺酸类的有机酸，其实例包括甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、葡糖酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、葡糖醛酸、马来酸、富马酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、氨茴酸、4-羟基苯甲酸、苯乙酸、扁桃酸、双羟萘酸(或帕莫酸)、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、泛酸、磺胺酸、2-羟乙基磺酸、三氟甲磺酸、对甲苯磺酸、环己基氨基磺酸、硬脂酸、海藻酸、β-羟基丁酸、水杨酸、半乳糖二酸、半乳糖醛酸、甘油磷酸和糖精(例如，糖精盐、蔗糖盐)。盐可以由相对于本发明的任何化合物数分之一、一或多于一摩尔当量的酸或碱组成。

本发明的适合的药学上可接受的碱加成盐包括例如铵盐和金属盐，包括比如碱金属、碱土金属和过渡金属盐，例如钙、镁、钾、钠和锌盐。药学上可接受的碱加成盐也包括由碱性胺制备的有机盐，该碱性胺比如，例如N,N’-二苄基乙烯-二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(或N-甲基葡糖胺)和普鲁卡因。所有这些盐可以通过例如将适合的酸或碱与化合物反应由相应的化合物制备。

方法

在一方面，本发明包括调节哺乳动物对象比如人中的皮肤色素沉着的方法。在某些实施方式中，本发明的方法治疗或预防对象中的皮肤着色过度。在其它实施方式中，本发明的方法促进对象的皮肤增白。在其它实施方式中，化合物外用地或经皮地被施用至对象。

在某些实施方式中，方法包括给对象施用治疗有效量的化合物，其结合至存在于黑素细胞上的非经典激素受体并且不结合至典型的性类固醇激素受体，比如雌激素和/或孕酮受体。在其它实施方式中，非经典激素受体包括PAQR7。在其它实施方式中，非经典激素受体包括GPER。在又其它实施方式中，非经典激素受体包括GPER1(还被称为GPR30)。在又其它实施方式中，化合物是GPER拮抗剂并且减少或预防皮肤色素沉着的进一步增加。在又其它实施方式中，化合物是PAQR7激动剂并且减少或预防皮肤色素沉着的进一步增加。

在某些实施方式中，对象遭受包括选自下列的至少一种的病症：与口服避孕药使用、妊娠和女性的内源雌激素相关联的色素改变(比如黑斑病和褐黄斑)；日光性着色斑；痤疮；湿疹；化学品、太阳和热烧伤疤痕；狼疮；牛皮癣；肉样瘤病；糠疹；持久性变色红斑；发疱病；药物反应；扁平苔癣；或其它炎性皮肤损伤。

制剂/施用

本发明的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的运载体和任何另外的成分的相对量将根据治疗的对象的身份、大小和条件改变。举例而言，组合物可以包括大约0.005％和大约100％(w/w)之间的活性剂，或其任何分数或倍数。

虽然本文提供的药物组合物的描述主要涉及适合于凭处方施用至人的药物组合物，但是本领域技术人员将理解这些组合物通常适合于施用至所有种类的动物。完全理解，修饰适合于施用至人的药物组合物从而致使这些组合物适合于施用至各种动物，并且具有普通技能的兽医药理学家可以仅利用普通实验——如果有的话——设计和执行这样的修饰。考虑施用本发明的药物组合物的对象包括但不限于人和其它灵长类、哺乳动物，包括商业相关的哺乳动物比如牛、猪、马、羊、猫和狗。

在某些实施方式中，包括在本发明内考虑的化合物的组合物使用一种或多种药学上可接受的赋形剂或运载体配制。在某些实施方式中，本发明的药物组合物包括治疗有效量的在本发明内考虑的至少一种化合物和药学上可接受的运载体。有用的药学上可接受的运载体包括但不限于甘油、水、盐水、乙醇和其它药学上可接受的盐溶液比如磷酸盐和有机酸的盐。这些和其它药学上可接受的运载体的实例在Remington’s PharmaceuticalSciences(1991,Mack Publication Co.,New Jersey)中描述。

运载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等)、其适合的混合物、和植物油。可以例如通过使用包衣比如卵磷脂，通过在分散的情况下维持需要的颗粒大小和通过使用表面活性剂，维持适当的流动性。微生物作用的阻止可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂实现，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，等渗剂，例如糖类、氯化钠或多元醇比如甘露醇和山梨醇包含在组合物中。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的药剂——例如单硬脂酸铝或明胶——带来。

制剂可以以与常规赋形剂即药学上可接受的有机或无机运载体物质的混合物采用，该运载体物质适合于口服、肠胃外、鼻部、静脉内、皮下、肠内、或本领域已知的任何其它适合的施用模式。在某些实施方式中，施用包括外用施用。药物组合物可以被灭菌并且如果需要与助剂混合，助剂例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压缓冲液的盐、着色剂、调味和/或芳香族物质等。在期望时，它们也可以与其它活性剂例如其它镇痛剂结合。

如本文所使用，“另外的成分”包括但不限于下列的一种或多种：赋形剂；表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；粒化和崩解剂；粘合剂；润滑剂；甜味剂；调味剂；着色剂；防腐剂；生理学上可降解的组合物比如明胶；水性媒介和溶剂；油性媒介和溶剂；悬浮剂；分散或湿润剂；乳化剂；缓和药；缓冲剂；盐；增稠剂；填料；乳化剂；抗氧化剂；抗生素；抗真菌剂；稳定剂；和药学上可接受的聚合或疏水材料。可以包含在本发明的药物组合物中的其它“另外的成分”在本领域中是已知的并且例如在Genaro,ed.(1985,Remington’s PharmaceuticalSciences,Mack Publishing Co.,Easton,PA)中描述，其通过引用被并入本文。

本发明的组合物可以包括按组合物的总重量计从大约0.005％至2.0％的防腐剂。防腐剂被用于阻止在暴露于环境中的污染物的情况下引起腐败。根据本发明的有用的防腐剂的实例包括但不限于选自苄醇、山梨酸、对羟基苯甲酸酯、咪脲和其组合的那些。说明性防腐剂是大约0.5％至2.0％苄醇和0.05％至0.5％山梨酸的组合。

组合物可以包括抑制化合物降解的抗氧化剂和螯合剂。一些化合物的选择的抗氧化剂是按组合物的总重量计在按重量计大约0.01％至0.3％的示例性范围内的BHT、BHA、α-生育酚和抗坏血酸，比如0.03％至0.1％范围内的BHT。例如，按组合物的总重量计，螯合剂以按重量计0.01％至0.5％的量存在。说明性螯合剂包括按组合物的总重量计在按重量计大约0.01％至0.20％重量范围内，或者0.02％至0.10％范围内的乙二胺四乙酸盐(例如乙二胺四乙酸二钠)和柠檬酸。螯合剂对螯合组合物中可能对制剂的保存期限有害的金属离子是有用的。虽然BHT和乙二胺四乙酸二钠分别是一些化合物的说明性抗氧化剂和螯合剂，但是其它适合的和等效的抗氧化剂和螯合剂可以替换，如本领域技术人员已知的。

包括在本发明内考虑的化合物的组合物可以每日几次频繁地施用至哺乳动物，或者其可以较不频繁地被施用，比如每日一次、每周一次、每两周一次、每月一次，或者甚至更不频繁地被施用，比如每几个月一次或者甚至一年一次或更少。

将理解，在非限制性实例中，可以以每天、每隔一天、每2天、每3天、每4天、或每5天施用每天给药的化合物的量。例如，在每隔一天施用的情况下，0.5-5mg每天剂量可以在在周一开始，在周三施用第一个随后的0.5-5mg每天剂量，在周五施用第二个随后的0.5-5mg每天剂量，以此类推。剂量的频率对于本领域技术人员将是容易明白的并且将取决于许多因素，比如但不限于正在治疗的疾病的类型和严重程度、动物的类型和年龄，等。

外用施用

外用施用药物的障碍是表皮的角质层。角质层是高抗性层，其由蛋白质、胆固醇、鞘酯类、游离脂肪酸和各种其它脂类组成，并且包括角质化的和活的细胞。限制化合物通过角质层的穿透率(通量)的因素之一是可以加载或施加至皮肤表面上的活性物质的量。每单位面积的皮肤施加的活性物质的量越大，皮肤表面和皮肤下层之间的浓度梯度越大，并且活性物质通过皮肤的扩散力也越大。因此，在所有其它因素相同的情况下，包含较大浓度活性物质的制剂与具有较小浓度的制剂相比更可能导致活性物质透过皮肤，并且其更多且速率更一致。

适合于外用施用的制剂包括但不限于液体或半液体制品比如擦剂，洗剂，水包油或油包水乳剂比如霜剂、药膏或糊剂、和溶液或悬浮液。这些制剂可以直接地或通过使用棉签、涂抹器、药刀等，以及以经皮补片的形式被施加至皮肤。在某些实施方式中，补片通过洗涤、摩擦、刮擦和/或擦洗皮肤最小化药物的损失。在其它实施方式中，补片增加药物通过皮肤的吸收，同时最小化皮肤暴露于药物。

例如，外用可施用的制剂可以包括大约0.005％至10％(w/w)活性成分，但是活性成分的浓度可以高达溶剂中活性成分的溶解极限。用于外用施用的制剂可以进一步包括本文描述的另外的成分中的一种或多种。

可以使用穿透增强剂。这些材料增加药物穿过皮肤的穿透率。本领域中的典型增强剂包括乙醇、甘油单月桂酸酯、PGML(聚乙二醇单月桂酸酯)、二甲基亚砜等。其它增强剂包括油酸、油醇、乙氧基二甘醇、月桂氮卓酮(laurocapram)、链烷羧酸、二甲基亚砜、极性脂质、或N-甲基-2-吡咯烷酮。

用于外用递送本发明的一些组合物的一种可接受的媒介可以包含脂质体。脂质体的组成和它们的用途在本领域中是已知的(例如美国专利号6,323,219)。

在可选实施方式中，本发明的药物组合物可以任选地与其它成分组合，其它成分比如佐剂、抗氧化剂、螯合剂、表面活性剂、发泡剂、湿润剂、乳化剂、增粘剂、缓冲剂、防腐剂等。在其它实施方式中，相对于缺乏穿透增强剂的组合物，穿透或穿透增强剂包含在组合物中并且对于改善活性成分经皮穿透进入和通过角质层是有效的。各种穿透增强剂对于本领域技术人员是已知的，包括油酸、油醇、乙氧基二甘醇、月桂氮卓酮、链烷羧酸、二甲基亚砜、极性脂质、或N-甲基-2-吡咯烷酮。在另一方面，组合物可以进一步包括水溶助剂，其起增加角质层结构的无序的功能，并且因而允许穿过角质层的运输增加。各种水溶助剂对于本领域技术人员是已知的，比如异丙醇、丙二醇或二甲苯磺酸钠。

本发明的外用活性药物组合物应当以对于实现期望改变有效的量施加。如本文所使用，“有效量”的意思应当是足以覆盖期望改变的皮肤表面的区域的量。活性化合物应当以如下量存在：按组合物的重量体积计从大约0.0001％至大约15％的量；或者以组合物的大约0.0005％至大约5％的量；或者以组合物的大约0.005％至大约1％的量。这些化合物可以是合成或天然来源的。

控释制剂和药物递送系统

本发明的药物组合物的控释或缓释制剂可以使用常规技术制造。在一些情况下，待使用的剂型可以提供为缓慢或控制释放其中的一种或多种活性成分，使用例如羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基体、凝胶、渗透膜、渗透性体系、多层包衣、微粒、脂质体、或微球或其组合以提供不同比例的期望的释放概况。对于本领域普通技术人员而言已知的适合的控释制剂——包括本文描述的那些——可以容易地选择用于与本发明的药物组合物一起使用。因而，本发明包含适合于外用施用的单一单位剂型，比如擦剂，洗剂，水包油或油包水乳剂比如霜剂、药膏或糊剂，经皮补片和适合于控释的溶液或悬浮液。

大多数控释药物产品具有改善药物疗法的共同目标，其超越由它们的非控制对应物实现的目标。理想地，在医学治疗中使用最佳设计的控释制品的特征在于以最小的时间量使用最少药物物质治愈或控制病症。控释制剂的优势包括药物活性的延长、降低的给药频率和增加的患者依从性。另外，控释制剂可以被用于影响起效时间或者其它特征，比如药物的血浓度，并且因而可以影响副作用的发生。

大多数控释制剂被设计为最初释放迅速地产生期望治疗效果的药物量，并且逐步地和连续地释放其它药物量以在延长时间段内维持该水平的治疗效果。为了维持药物在体内的这种恒定水平，药物必须以如下速率从剂型释放：其将顶替正在被代谢和从身体排泄的药物量。

活性成分的控释可以由各种诱导因素刺激，例如pH、温度、酶、水或其它生理学条件或化合物。在本发明背景下的术语“控释成分”在本文中被限定为一种或多种化合物，包括但不限于聚合物、聚合物基体、凝胶、渗透膜、脂质体或者微球或者促进活性成分的控释的其组合。

在某些实施方式中，本发明的制剂可以是，但不限于，短期的、快速补偿的(rapid-offset)、以及控释例如缓释、延迟释放和脉冲释放的制剂。

术语缓释以其常规意义被用于指在延长的时间段内提供逐步释放药物的药物制剂，并且该药物制剂可以——但不一定——导致在延长时间段内药物的基本上恒定的血浓度。时间段可以长达一个或多个月并且应当是与以推注形式施用的相同量的药剂相比更长的释放。

对于缓释，化合物可以利用为化合物提供缓释性质的适合聚合物或疏水材料配制。同样地，用于本发明的方法的化合物可以以微粒的形式施用，例如通过注射或者以圆片或者圆盘的形式通过植入。

在本发明的某些实施方式中，使用缓释制剂单独或与另一种药剂组合将本发明的化合物施用至患者。

术语延迟释放在本文中以其常规意义用于指在药物施用后的一些延迟之后提供药物的最初释放的药物制剂，并且该药物制剂可以——但不一定——包括大约10分钟多至大约12小时的延迟。

术语脉冲释放在本文中以其常规意义用于指在药物施用之后以产生药物的脉冲血浆概况的方式提供药物释放的药物制剂。

术语立即释放以其常规意义用于指在药物释放之后立即提供药物释放的药物制剂。

如本文所使用，短期指的是在药物施用之后多达并且包括大约8小时、大约7小时、大约6小时、大约5小时、大约4小时、大约3小时、大约2小时、大约1小时、大约40分钟、大约20分钟、或大约10分钟和其任何或所有全部或部分增量的任何时间段。

如本文所使用，快速补偿指的是在药物施用之后多达并且包括大约8小时、大约7小时、大约6小时、大约5小时、大约4小时、大约3小时、大约2小时、大约1小时、大约40分钟、大约20分钟、或大约10分钟和其任何或所有全部或部分增量的任何时间段。

仅仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或者能够确定本文描述的具体程序、实施方式、权利要求和实施例的众多等价物。这些等价物被视为在本发明的范围内并且由所附权利要求书覆盖。例如，应当理解，利用本领域公知的可选方案和仅使用常规实验，反应条件的改变在本发明的范围内，反应条件包括但不限于反应时间、反应体积/容积和实验试剂，比如溶剂、催化剂、压力、大气条件例如氮气氛、和还原/氧化剂。

将理解，在本文提供值和范围的地方，由这些值和范围包含的所有值和范围意欲包含在本发明的范围内。而且，落入这些范围内的所有值，以及值的范围的上限或下限也由本申请考虑。

下面的实施例进一步阐明了本发明的方面。但是，它们绝不是如本文陈述的发明的教导或公开内容的限制。

实施例

现在参照下面的实施例描述本发明。仅出于说明的目的提供这些实施例，并且本发明不限于这些实施例，而是包含由于本文提供的教导而变得显而易见的所有变化。

材料和方法

除非另有说明，所有细胞系、生物学材料、化学材料、试剂和树脂从供应商获得并且直接使用而无需纯化。

黑素细胞培养

原代黑素细胞提取自新废弃的外科人包皮样本。在分散酶中培育过夜之后，表皮与真皮分离并且用胰蛋白酶处理10分钟。细胞被沉淀并且平板接种在含有人黑素细胞生长补充物、以及1％青霉素和链霉素的选择性MC培养基254(Invitrogen)上。轻微着色的原代黑素细胞被用于分析雌激素和GPER激动剂效果的实验，并且重度着色的原代黑素细胞被用于分析黑色素产生中孕酮和PAQR7效果的实验。孕酮(P8783)、17β-雌二醇(E8875)和αMSH(M4135)购买自Sigma-Aldrich。G-15(14673)和G-36(14397)购买自Cayman Chemical。CH2P4(2085)购买自Axon Medchem。百日咳毒素购买自R&D systems(3097)。这些化合物被稀释为培养基254中的工作母液。

黑色素分析

将2x 10⁵个黑素细胞均匀地接种在6孔组织培养板上。细胞用媒介对照、性类固醇、激素衍生物或百日咳毒素处理4天。然后将细胞胰蛋白酶化、计数并且在300xg下旋转(spin down)5分钟。将所得到的细胞沉淀物溶解在1M NaOH中，并煮沸5分钟。所得到溶液的光学密度使用EMax酶标仪(Molecular Devices)在450nm下读取。吸光度被标准化为每个样品中细胞的数目，并且黑色素的相对量基于媒介处理的对照设定。对于组织黑色素分析，将组织称重，然后在1M NaOH中煮沸20分钟。旋转样品以消除不可溶物质，并且然后测量样品的光学密度并且标准化为组织的重量。

cAMP ELISA

使用Cyclic AMP XP Assay Kit(Cell Signaling Technology,#4339)，根据制造商指示对原代人黑素细胞进行cAMP ELISA。

蛋白质印迹分析和抗体

贴壁细胞用1μM剂量的E2和P4处理过夜，用DPBS洗涤一次，并且利用包含1X蛋白酶抑制剂(Roche)和1X磷酸酶抑制剂(Roche)的1％NP-40缓冲液(150mM NaCl，50mM Tris，pH7.5，1mM EDTA和1％NP-40)裂解。裂解物被定量(Bradford分析)、标准化、还原、变性(95℃)并且在4-15％Tris/甘氨酸凝胶(Bio-Rad)上通过SDS凝胶电泳分离。使用Semi-DryTransfer Cell(Bio-Rad)将分离的蛋白质转移至PVDF膜(Millipore)，在5％干奶中在TBS-T中封闭并用识别MITF(Cell Signaling Technology,#12590,1:1000)、pCREB(CellSignaling Technology,#9198,1:1000)、CREB(Cell Signaling Technology,#9104,1:1000)和β-肌动蛋白(Cell Signaling Technology,#3700,1:4000)的一次抗体探测。在利用适合的二次抗体培育之后，使用Luminata Crescendo Western HRP Substrate(Millipore)或ECL Western Blotting Analysis System(GE Healthcare)检测蛋白质。

黑色素染色

福尔马林固定的石蜡包埋的组织在5uM下切片并且在正电荷防脱载玻片(superfrost plus slide)(Fisher)上收集，并且经历黑色素的Fontana-Masson染色。简言之，切片被脱蜡、再水化并在下列溶液中培育：2.5％硝酸银水溶液持续10min、0.1％氯化金水溶液持续15min和5％硫代硫酸钠水溶液持续5min。蒸馏的去离子水被用于清洗并且除了硝酸银在60℃下以外在室温下进行培育。载玻片利用0.1％核固红Kernechtrot复染5min，脱水、清除并且使用MM24封固剂(Leica)盖片。所有染色试剂来自Polyscientific R&DCorporation。免疫组织化学

来自器官型组织的福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)人皮肤组织切片使用针对MITF(Leica Biosystems,NCL-L-MITF,1:15)的一次抗体进行MITF蛋白表达的染色。按照制造商的高温抗原解掩蔽技术方案在石蜡切片上进行免疫组织化学演示的染色。

黑色素染色的定量

来自器官型培养物的组织切片使用在本文别处描述的方法染色。在定量方面，简言之，代表性组织切片的20X显微照片图像使用Zeiss Axiophot显微镜获得。图像的tiff文件被保存并且转移至Adobe 在该处与Fontana-Masson染色和表皮复染对应的像素使用颜色选择工具进行选择。与单一特定颜色对应的图像然后使用FIJI(ImageJ)分析以测定每个样品中像素的数目。代表Fontana-Masson染色的像素的数目被标准化为总量表皮复染。表皮中Fontana-Masson染色的最终比率相对于媒介处理的对照中染色的量设定。定量RT/PCR

mRNA根据RNeasy Mini Kit方案(Qiagen)提取自黑素细胞，并且使用HighCapacity RNA-to cDNA试剂盒(Applied Biosystems)反转录至cDNA。得到的cDNA的定量PCR使用Power SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)和基因特异性引物——一式三份——在ViiA 7Real-Time PCR System(Life Technologies)上实施。

下列引物被用于检测；B-肌动蛋白正向：5’-CAT GTA CGT TGC TAT CCA GGC-3’(SEQ ID NO:1)；B-肌动蛋白反向：5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’(SEQ ID NO:2)；ER-A正向：5’-AAA GGT GGG ATA CGA AAA GAC C-3’(SEQ ID NO:3)；ER-A反向：5’-AGC ATC CAACAA GGC ACT GA-3’(SEQ ID NO:4)；ER-B正向：5’-GGC TGC GAG AAA TAA CTG CC-3’(SEQID NO:5)；ER-B反向：5’-AAT GCG GAC ACG TGC TTT TC-3’(SEQ ID NO:6)；PGR正向：5’-AGG TCT ACC CGC CCT ATC TC-3’(SEQ ID NO:7)；PGR反向：5’-AGT AGT TGT GCT GCC CTTCC-3’(SEQ ID NO:8)；AR正向：5’-GTG CTG TAC AGG AGC CGA AG-3’(SEQ ID NO:9)；AR反向：5’-GTC AGT CCT ACC AGG CAC TT-3’(SEQ ID NO:10)；GPER正向：5’-ACA GAG GGA AAACGA CAC CT-3’(SEQ ID NO:11)；GPER反向：5’-AAT TTT CAC TCG CCG CTT CG-3’(SEQ IDNO:12)；PAQR7正向：5’-GTG CAC TTT TAT ACC GTC TGC TT-3’(SEQ ID NO:13)；PAQR7反向：5’-CCT GGG CAG GGA GCT AAG AT-3’(SEQ ID NO:14)。使用2-[δ][δ]Ct方法测定相对表达，然后标准化为MCF7细胞中的AR受体转录物水平。

慢病毒载体

下列shRNA表达自GIPZ载体(Open Biosystems)：shPAR7.3(V3LHS_364596，5’-TGTGGTAGAGAAGAGCTGG-3’；SEQ ID NO:15)、shPAQR7.4(V3LHS_364598，AGAAGTGTGCCAAGGCACT；SEQ ID NO:16)、shGPER.1(V2LHS_132008，5’-TCCTTCTCCTCTTTAACTC-3’；SEQ ID NO:17)、shGPER.3(V3LHS_390319，5’-TGATGAAGTACAGGTCGGG-3’；SEQ ID NO:18)。

指导RNA使用在网站www dot genome-engineering dot org/上提供的软件工具设计。指导RNA随后根据伴随的方案被克隆入lentiCRISPRv2(Addgene#52961)。指导RNA序列如下：lentiCRISPR GFP，5’-GAA GTT CGA GGG CGA CAC CC-3’(SEQ ID NO:19)；lentiCRISPR GPER.1，5’-ACAGGCCGATCACGTACTGC-3’(SEQ ID NO:20)；lentiCRISPRGPER.2，5’-GAGCACCAGCAGTACGTGAT-3’(SEQ ID NO:21)；lentiCRISPR PAQR7.1，5’CGT ACATCT ATG CGG GCT AC-3’(SEQ ID NO:22)；lentiCRISPR PAQR7.5，5’-CGT GCG GAA ATAGAA GCG CC-3’(SEQ ID NO:23)。

非限制性示例性外用治疗

2％(w/v)化合物在DMSO中制备。将20μL该溶液每日施加至4周龄C57BL/6小鼠的右耳，其中媒介仅施加至该小鼠的左耳。这些研究在没有入选/排除标准——随机或盲选——的情况下进行。基于双重预期效果，该实验在3个生物学复制的情况下进行。

统计学分析

*表示在未配对的双尾学生T检验中小于0.05的P值。

实施例1：制备3-D器官型皮肤培养物

包含MC的器官型皮肤移植物使用先前详述方法的改进形式建立(Ridky,et al.,Nature Med.2010,16,1450-1455；Chudnovsky,et al.,Nature Gen.2005,37,745-749)。用于仅角质化细胞皮肤移植物的角质化细胞生长培养基(KGM)被替换为改良的黑素细胞异种移植物种子培养基(Melanocyte Xenograft Seeding Media)(MXSM)。MXSM是缺乏霍乱毒素的KGM和角质化细胞培养基50/50(Gibco)的1:1混合物，该角质化细胞培养基50/50包含2％FBS、1.2mM氯化钙、100nM Et-3(内皮素3)、10ng/mL rhSCF(重组人干细胞因子)和4.5ng/mLr-碱性FGF(重组碱性成纤维细胞生长因子)。将1.5x 10⁵个黑素细胞和5.0x 10⁵个角质化细胞悬浮在80μL MXSM中，接种至真皮上，并且在气液界面处在37℃下培育8天。

实施例2：雌激素和孕酮相互地调节黑色素合成

为了检查性类固醇是否直接影响黑色素合成，正常原代人黑素细胞用雌激素(17β-雌二醇)处理，其导致黑色素产生的剂量依赖性增加(图2C)。25nM雌激素被用于随后的实验，其为在妊娠中和末三个月期间观察到的医学相关浓度。4天之后，黑色素产生显著增加(208±27％)(图3A)。黑色素产生的改变在量级上与利用αMSH观察到的改变类似(图2B&2D)。这种促进黑色素的雌激素效果与黑色素合成中雌激素的参与一致。为了检查在完整人表皮的背景下雌激素对黑素细胞稳态的作用，利用正常的原代表皮角质化细胞和黑素细胞在天然基质和完整基膜的框架内建立构造上可靠的3-D器官型皮肤。在1周之后，雌激素处理的皮肤展示了黑色素含量的3倍增加(图3B)，而在总黑素细胞数目或密度方面没有任何增加(图3C)。

其它组织类型中的生理学雌激素作用通常通过同时暴露于孕酮——在妊娠期间显著增加的另一种性类固醇——平衡。为了确定该相互关系是否在黑素细胞中也是活跃的，细胞利用生理学水平的孕酮处理，其导致黑素细胞黑色素产生的剂量依赖性降低(图2E)。500nM的浓度被用于随后的实验，其为反映在妊娠末三个月期间观察到的水平。孕酮降低黑色素产生达到几乎一半(58±11.4％)，在培养(图3D)中和皮肤组织中(图3E)二者，而不影响总体黑素细胞数目(图3F)。

为了测定雌性细胞是否也同样地响应，雌性iPS来源的黑素细胞利用雌激素和孕酮处理。注意到与利用雄性细胞观察到的那些类似的响应(图2F)。

为了测定分离自除了包皮之外的身体部位的黑素细胞也类似地对性激素响应，来自成人面部皮肤的黑素细胞用雌激素和孕酮处理；观察到的响应类似于利用包皮黑素细胞观察到的那些类似(图2G)。

实施例3：原代人黑素细胞不表达核雌激素或孕酮受体(ER/PR)，并且经由改变的cAMP信号传导响应于性类固醇。

为了确定雌激素和孕酮介导它们的色素效应的机制，检查典型的色素产生途径的组成。观察到雌激素处理(图4A)后cAMP的增加。这暗示雌激素进入MC1R下游的典型的色素产生途径。与这一致，pCREB和MITF蛋白类似地被诱导(图4B)。相比之下，孕酮处理导致减少的色素产生，同时cAMP、pCREB和MITF相应减少(图4C-4D)。

不希望受任何理论的束缚，这些数据暗示雌激素、孕酮和α-MSH在腺苷酸环化酶的水平下汇聚于典型的黑色素产生途径以相互地调节黑色素合成。一致地，雌激素色素效应在生理学孕酮的存在下显著地衰减(图4E)。这很可能解释了遍及身体为什么没有观察到妊娠相关的着色过度，但是典型地限于特定区域，在这些区域中黑素细胞密度或UV辐射暴露是最高的，包括面部、生殖器和乳晕区(areolar region)。

当类固醇激素不预计为发信号通过MC1R时，其自然配体是肽激素αMSH，进行努力以鉴定雌激素和孕酮介导它们对黑色素合成的作用的特定受体。经典的雌激素(ER)和孕酮(PR)受体使用qRT-PCR在黑素细胞中没有检测到，尽管在MCF7ER/PR阳性乳腺细胞系中强健表达(图5A)。在原代人黑素细胞中的RNAseq未能检测到ER或PR转录物(图5B)。经由黑素细胞蛋白裂解物的蛋白质印迹没有检测到ER或PR蛋白，但是两种受体在MCF7提取物中是显而易见的(图4F)。

实施例4：黑素细胞中的性类固醇信号传导取决于非经典膜结合G蛋白偶联的性激素受体GPER。

由于MC1R是G蛋白偶联受体(GPCR)，假设可选的GPCR可以是介导色素效应的结合性激素。为了鉴定可能的候选者，分析来自原代人MC的全部转录组RNAseq数据以鉴定其它表达的GPCR。表达膜结合的G蛋白偶联的雌激素受体(GPER)(图5B)。也检测类似的非典型的G蛋白偶联的孕酮受体、孕酮和adipoQ受体7(图5B)。通过qRT-PCR分析原代人MC的GPER和PAQR7的表达，并且验证它们的表达(图5C)。显著地，GPER和PAQR7表达在其它皮肤细胞类型包括角质化细胞和成纤维细胞中显著地更低(图5D)。

shRNA介导的敲低被用于建立GPER和PAQR7介导MC中的性激素效应的必要性(图5E-5F)。使用两种独立发夹中任一种的GPER或PAQR7缺失完全消除了分别对雌激素和孕酮的黑素细胞色素响应(图4G-4H)。

为了验证这些结果，使用基于GPER或PAQR7的CRISPR-Cas9介导的基因破坏的互补性遗传途径，其还完全地分别阻断对雌激素和孕酮的色素响应(图5G-5H)。

PAQR7结合孕酮并且通过cAMP还原调节海鳟卵母细胞减数分裂的末期。在那个鱼系统中，PAQR7发信号通过包含抑制性G亚基(G_i)的G蛋白复合物。G_i亚基起抑制腺苷酸环化酶的功能，导致胞质cAMP的减少。为了检查该信号传导机制在哺乳动物中是否也是功能性的和相关的，原代人黑素细胞在百日咳毒素(PTX)——一种催化G_i亚基的ADP核糖基化的外毒素——的存在下利用孕酮处理。这种修饰阻止G_i与GPCR相互作用，并且因而阻止在GPCR配体结合之后它们的激活。利用PTX处理黑素细胞完全地阻断孕酮色素效应，这确立了孕酮发信号通过黑素细胞中的G_i亚基(图6)。PAQR7通过抑制性G_i亚基工作的发现是有趣的，因为其是在G蛋白信号传导的水平下主动抑制黑色素合成的黑素细胞细胞信号传导级联的第一个实例，与调节刺激性MC1R信号强度的经典限定的色素对照机制相反。在许多动物系统中，刺鼠蛋白经由物理地结合至MC1R并抑制αMSH刺激，而不是通过主动抑制机制降低色素产生。

实施例5：GPER的特异性激活改变人皮肤组织中的色素产生

为了完善确立雌激素和孕酮色素效应通过非经典性类固醇受体介导的这些遗传研究，具有对ER、PR、GPER或PQAR7的特异性激动剂活性的小分子类固醇类似物被利用。ER拮抗剂他莫昔芬与乳腺癌患者中黑斑病的发展相关联。该临床观察的机制基础先前是未知的并且是有些令人费解的，因为他莫昔芬阻断雌激素受体功能并且因而可能被预测为限制黑色素合成。但是，他莫昔芬充当GPER激动剂。他莫昔芬处理导致黑色素产生的剂量依赖性增加，水平比得上利用天然雌激素观察到的那些(图7A)，与GPER激活促进黑色素合成的模型一致。大多数口服避孕药包含雌激素成分的雌激素衍生物(炔雌醇)。利用炔雌醇处理原代人MC也导致黑色素产生的剂量依赖性增加，在相等浓度下与天然雌激素难以区分(图7B)。

进一步确立了GPER是黑素细胞雌激素受体，GPER激动剂(G-1；rel-1-[4-(6-溴-1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-3aR,4S,5,9bS-四氢-3H-环戊并[c]喹啉-8-基]-乙酮)和雌激素作用通过不具有对ER的抑制活性的两种特异性GPER拮抗剂G-15和G-36(图8)中的任一种阻断。为了确立PAQR7信号传导足以降低黑色素产生，使用特异性PAQR7激动剂Org OD-02(CH2P4)，其不结合PR。CH2P4引起黑色素产生的剂量依赖性、PAQR7依赖性降低(图9A-9B和10A-10C)。

实施例8：体内研究

将在本文别处生成的组织原位地(orthotopically)异种移植至免疫功能不全的小鼠，使得在体内分析人皮肤。激素被皮下或者外用施用以证明GPER介导激素诱导的色素沉着改变的必要性。特定激动剂的作用被评估。

为了证明这种机制不局限于包皮来源的黑素细胞，黑素细胞分离自各个身体部位和不同年龄、性别和种族的捐赠者。3-D器官型培养物利用来自这些来源的黑素细胞建立，并且评估GPER信号传导的必要性和充分性。

实施例9：评估GPER影响色素沉着的机制

为了分析雌激素和孕酮影响色素沉着的GPER下游机制，由受体激活的Gα亚基被鉴定。为了完成这个目标，使用激动剂促进的[³⁵S]GTPγS交换试验，接着免疫富集特异性G蛋白亚组。G蛋白偶联受体信号传导驱动Gα亚基上的鸟嘌呤核苷酸交换，转换GDP为GTP。[³⁵S]GTPγS是GTP的同位素的、不可水解的类似物。来自原代人黑素细胞的膜制剂被分离并且在[³⁵S]GTPγS的存在下利用GPER激动剂以及媒介对照刺激。接着，Gs和Gi亚基从样品免疫沉淀，并且使用闪烁分光计(scintillation spectrophotometer)测量[³⁵S]GTPγS结合。具有除去的GPER的黑素细胞在这些试验中被用作阴性对照。

Gs和Gi亚基二者影响腺苷酸环化酶活性，其起产生cAMP的功能。为了检查GPER调节G蛋白信号传导下游的典型的色素沉着途径的机制，在雌激素和孕酮的存在下使用cAMPELISA相对于媒介处理的对照分析腺苷酸环化酶活性。蛋白质印迹分析被用于检查pCREB和MITF相对于媒介处理的对照的下游改变。

本文引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容在此通过引用以其全部被并入本文。

虽然已经参照具体实施方式公开了本发明，但是显而易见的是本发明的其它实施方式和变化可以由本领域技术人员想到而不背离本发明的真实精神和范围。所附权利要求书意欲被解释为包括所有这些实施方式和等价变化。

序列表

<110> 宾夕法尼亚大学董事会

T·瑞基

C·娜塔莉

<120> 用于减少、或阻止或逆转哺乳动物对象中皮肤色素沉着增加的组合物和方法

<130> 046483-7122WO1(01137)

<150> US 62/143,597

<151> 2015-04-06

<150> US 62/216,792

<151> 2015-09-10

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成

<400> 1

catgtacgtt gctatccagg c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成

<400> 2

ctccttaatg tcacgcacga t 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成

<400> 3

aaaggtggga tacgaaaaga cc 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 化学合成

<400> 4

agcatccaac aaggcactga 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 化学合成

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ggctgcgaga aataactgcc 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成

<400> 6

aatgcggaca cgtgcttttc 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成

<400> 7

aggtctaccc gccctatctc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成

<400> 8

agtagttgtg ctgcccttcc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 化学合成

<400> 9

gtgctgtaca ggagccgaag 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 化学合成

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gtcagtccta ccaggcactt 20

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acagagggaa aacgacacct 20

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aattttcact cgccgcttcg 20

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gtgcactttt ataccgtctg ctt 23

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cctgggcagg gagctaagat 20

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<223> 化学合成

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agaagtgtgc caaggcact 19

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<211> 19

<212> DNA

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<223> 化学合成

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tccttctcct ctttaactc 19

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acaggccgat cacgtactgc 20

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gagcaccagc agtacgtgat 20

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<213> 人工序列

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<223> 化学合成

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cgtacatcta tgcgggctac 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 化学合成

<400> 23

cgtgcggaaa tagaagcgcc 20

Claims (28)

1.式(I)的化合物，或其盐、溶剂化物、互变异构体、对映异构体或非对映异构体：其中：

R₁选自H和C₁-C₃烷基；

R₂选自H和C₁-C₃烷基；

键a是单键或双键；

R₃选自H和卤代；

其中所述化合物不是G-15(rel-(3aS,4S,9bR)-4-(6-溴苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)-3a,4,5,9b-四氢-3H-环戊并[c]喹啉)或G-36(rel-(3aS,4R,9bR)-4-(6-溴苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)-8-异丙基-3a,4,5,9b-四氢-3H-环戊并[c]喹诺酮)。

2.权利要求1所述的化合物，其中(I)中的R₁是H或2-丙基。

3.权利要求1所述的化合物，其中(I)中的R₂是H或甲基。

4.权利要求1所述的化合物，其中(I)中的键a是双键。

5.权利要求1所述的化合物，其中(I)中的键a是单键。

6.权利要求1所述的化合物，其中R₃选自H、F、Cl和Br。

7.权利要求1所述的化合物，其是选自以下的至少一种：

8.一种药物组合物，其包括至少一种药学上可接受的运载体和选自下列的至少一种化合物：

式(I)的分子：

其中：

R₁选自H和C₁-C₃烷基；

R₂选自H和C₁-C₃烷基；

键a是单键或双键；

R₃选自H和卤代；

和CH2P4(rel-(8S,9S,10S,13S,14S,17S)-17-乙酰基-13-甲基-10-乙烯基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊并[a]菲-3(2H)-酮)，

或其盐、溶剂化物、互变异构体、对映异构体或非对映异构体。

9.权利要求8所述的药物组合物，其被配制用于外用或经皮施用。

10.权利要求8所述的药物组合物，其中所述化合物不包括G-15。

11.权利要求8所述的药物组合物，其中所述化合物不包括G-36。

12.权利要求8所述的药物组合物，进一步包括至少一种阻光剂。

13.权利要求8所述的药物组合物，进一步包括至少一种防晒霜。

14.一种减少、或预防或逆转哺乳动物对象中皮肤色素沉着增加的方法，所述方法包括给所述对象施用治疗有效量的选自下列的至少一种化合物：(i)不结合至典型的核雌激素受体的GPER拮抗剂，和(ii)不结合至典型的核孕酮受体的PAQR7激动剂。

15.权利要求14所述的方法，其中所述对象是人。

16.权利要求14所述的方法，其中(i)中的所述典型的核雌激素受体包括选自ERα和ERβ的至少一种。

17.权利要求14所述的方法，其中(ii)中的所述典型的核孕酮受体包括选自PR-A和PR-B的至少一种。

18.权利要求14所述的方法，其中(i)中的所述化合物是GPER1拮抗剂。

19.权利要求14所述的方法，其中所述对象遭受选自下列的至少一种病症：与口服避孕药使用、妊娠和女性的内源雌激素相关联的色素改变；日光性着色斑；痤疮；湿疹；化学品、太阳和热烧伤疤痕；狼疮；牛皮癣；肉样瘤病；糠疹；持久性变色红斑；发疱病；药物反应；扁平苔癣；和其它炎性皮肤损伤。

20.权利要求14所述的方法，其中所述化合物被外用或经皮施用至所述对象。

21.权利要求20所述的方法，其中所述化合物被配制为用于外用或经皮施用的药物组合物。

22.权利要求21所述的方法，其中所述药物组合物进一步包括至少一种阻光剂。

23.权利要求21所述的方法，其中所述药物组合物进一步包括防晒霜。

24.权利要求21所述的方法，其中所述药物组合物基本上不含皮肤漂白剂。

25.权利要求14所述的方法，其中所述化合物，或其盐、溶剂化物、互变异构体、对映异构体或非对映异构体为选自下列的至少一种：

式(I)的分子：

其中：

R₁选自H和C₁-C₃烷基；

R₂选自H和C₁-C₃烷基；

键a是单键或双键；

R₃选自H和卤代；

和CH2P4，

或其盐、溶剂化物、互变异构体、对映异构体或非对映异构体。

26.权利要求25所述的方法，其中(I)为选自下列的至少一种：

27.权利要求25所述的方法，其中所述化合物为选自G-15、G-36和CH2P4的至少一种。

28.一种用于减少、或预防或逆转哺乳动物对象中皮肤色素沉着增加的试剂盒，所述试剂盒包括：权利要求8-13中任一项所述的至少一种药物组合物；和用于外用或经皮施用所述至少一种药物组合物至所述对象的使用说明。