CN107603992A - 一种突变的艾杜糖‑2‑硫酸酯酶基因及其在检测黏多糖贮积症ⅱ型疾病中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种突变的艾杜糖‑2‑硫酸酯酶基因及其在检测黏多糖贮积症Ⅱ型疾病中的用途。本发明在一个4代黏多糖贮积症Ⅱ型家系中检测到患者及其弟弟的IDS基因第3外显子出现一个错义突变，即X染色体上X:14950340 7位点由A突变为C，引起编码的氨基酸由酪氨酸变为丝氨酸。患者母亲为突变杂合个体，其余表型正常女性中检测到个体携带相同基因杂合突变，正常男性均未发生该位点的突变。因此，本发明提出了一个与黏多糖贮积症Ⅱ型相关的IDS致病基因突变位点：X:149503407A>C。本发明的提出丰富了黏多糖贮积症Ⅱ型致病基因突变谱，为阐明黏多糖贮积症的发病机制以及针对该病的基因诊断性芯片的设计具有重要意义。

Description

一种突变的艾杜糖-2-硫酸酯酶基因及其在检测黏多糖贮积 症Ⅱ型疾病中的用途

技术领域

本发明涉及罕见遗传病黏多糖贮积症Ⅱ型的致病基因IDS突变位点及其在基因诊断中的应用。本发明属于医学基因诊断领域。

背景技术

黏多糖贮积症(mucopolysaccharidosis，MPS)是一组溶酶体累积病，是由于溶酶体水解酶缺陷，造成酸性黏多糖(葡糖氨基聚糖)降解受阻，黏多糖在体内积聚而引起一系列临床症状。黏多糖是结缔组织间的主要成分，包括透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸类肝素和硫酸角质素，这些多糖都是直链杂多糖，可同时与一条蛋白质肽链结合，聚合成更大的分子。正常溶酶体中含有许多种糖苷酶，其中有10种参与葡糖氨基聚糖链的降解过程，它们中任何一种糖苷酶的缺陷都会造成葡糖氨基聚糖链分解障碍而在溶酶体内积聚，并自尿中排出。黏多糖贮积症患者由于过多的黏多糖贮积于骨、软骨等组织或器官内，从而影响到这些组织或器官的正常发育，多余的黏多糖从尿中排出，发生一系列的临床症状和影像学表现。

黏多糖贮积症属先天性或原发性代谢异常综合征。根据尿糖中所含酸性黏多糖的种类，相关个别酶缺乏和活性低下的种类以临床表现和影像学表现的不同，黏多糖贮积症分为7大类型，每一型又分为2～4个亚型。其中黏多糖贮积症Ⅰ、IV型最为常见且较具特征性，而尤以Ⅰ型最典型，为黏多糖贮积症的原型。

黏多糖贮积症Ⅱ型(MPSⅡ，OMIM309900)，又称Hunter综合征，是一种X连锁隐性遗传病，其发病率约为1/132,000个男婴。该病是由于溶酶体内的艾杜糖-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase，IDS)基因突变，使艾杜糖-2-硫酸酯酶缺陷，导致分解不完全的硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素大量贮积于全身各种脏器和组织中，一部分可随尿液排出体外。该病临床表现多样，病情的发展具有进行性加重的特点。重型患者一般2～4岁起病，临床表现为智力落后、侏儒身材、面容丑陋、多发性骨骼畸形、肝脾肿大、心脏病变、少年期死亡等。轻型患者一般10岁前发病，临床症状较轻且寿命一般不受影响。黏多糖贮积症Ⅱ型常表现为一种X连锁隐性遗传方式，分子遗传学分析表明，黏多糖贮积症Ⅱ型患者的不同症状是由不同的IDS基因突变位点决定的。IDS基因位于Xq28，包含9个外显子，mRNA长度为7639bp，编码肽链长度为550aa(GRCh38.p7；NM_000202.7；NP_000193.1)。在距离IDS基因约20kb的位置，存在1个假基因IDS2，其外显子2、3和内含子6的碱基组成与IDS基因有高度同源性，这也是IDS基因易发生突变的一个重要原因。

自1990年Wilson等首次发现IDS基因突变以来，至今已报道各类突变超过300种(http://www.hgmd.org)，绝大多数突变位于IDS基因外显子2、3、5、7、8和9，包括无义突变、错义突变、拼接位点突变、小的插入、缺失、重排等，其中的大部分突变属于“私人突变”，只有极少数突变具有种族或地域的特异性。

本发明通过收集黏多糖贮积症Ⅱ型家系信息，绘制系谱判断遗传方式，通过对患者及家系其他成员外周血基因组DNA提取、外显子测序技术及对候选致病基因突变位点的PCR扩增及Sanger测序，确认致病基因突变位点。然后针对家系其他患者和正常人进行该位点的检测，确认突变位点是否为导致该家族出现黏多糖贮积症Ⅱ型的致病原因。本发明对阐明黏多糖贮积症Ⅱ型的发病机制，丰富黏多糖贮积症Ⅱ型的致病基因突变谱，及建立这种罕见遗传病基因诊断方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的与黏多糖贮积症Ⅱ型相关的致病基因IDS的突变位点及其在基因诊断中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

1、收集黏多糖贮积症患者家系

与临床医院合作，按照知情同意的原则，针对黏多糖贮积症患者、家系个体及对照人群队列进行生物资源的收集，包括外周血、手术组织废弃物等生物样本，以及基本信息及临床资料包括生化指标、影像学数据等。

绘制家系图谱，判断黏多糖贮积症在家族中的遗传方式。

2、尿液黏多糖检测

收集晨尿，采用甲苯胺蓝呈色法对患者尿液进行检测。同时用正常人晨尿做对照。尿斑处呈紫蓝色环状或点状为阳性，正常人尿斑无色为阴性。

3、细胞学检查

黏多糖贮积症可在末梢血或骨髓的淋巴细胞和中性粒细胞内见有大小不等、形态各异的深紫色黏多糖颗粒，即Reilly小体，对诊断有辅助价值。

4、基因诊断DNA分析粘多糖贮积症致病基因突变

通过对黏多糖贮积症Ⅱ型患者及家系其他成员外周血基因组DNA提取、外显子测序技术获得候选致病基因突变位点。对候选致病基因突变位点设计引物，对患者及家系其他成员进行PCR扩增及Sanger测序，比对分析，确认致病基因突变位点。

在上述研究的基础上，本发明在一个4代黏多糖贮积症Ⅱ型家系中检测到患者(先证者)及其患者弟弟的IDS基因第3外显子出现一个错义突变，即X染色体上，X:149503407位点由A突变为C，引起编码的IDS的氨基酸由酪氨酸(Tyr)变为丝氨酸(Ser)(GRCh38.p7；NM_000202.7；NP_000193.1)。其母亲为突变杂合个体。而其余正常人均未发生该位点的突变。

因此，本发明提出了一种与黏多糖贮积症Ⅱ型相关的突变的艾杜糖-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase，IDS)基因，相较于Gene bank登录号为NM_000202.7的未突变的艾杜糖-2-硫酸酯酶基因，突变后的艾杜糖-2-硫酸酯酶基因的第3外显子含有一个错义突变位点X:149503407A>C。以及一种与黏多糖贮积症Ⅱ型相关的突变的艾杜糖-2-硫酸酯酶，相较于Gene bank登录号为NP_000193.1的未突变的艾杜糖-2-硫酸酯酶，突变后的艾杜糖-2-硫酸酯酶含有p.Y108S氨基酸突变位点。

进一步的，本发明还提出了所述的突变的艾杜糖-2-硫酸酯酶基因以及突变的艾杜糖-2-硫酸酯酶在制备检测黏多糖贮积症Ⅱ型疾病试剂中的用途。

更进一步的，本发明还提出了，一种用于检测黏多糖贮积症Ⅱ型的PCR引物组合物，其由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。以及所述的PCR引物组合物在制备检测黏多糖贮积症Ⅱ型疾病试剂中的用途。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

1、提出了一种新的黏多糖贮积症Ⅱ型致病基因突变位点，丰富了致病基因突变谱，为阐明黏多糖贮积症的发病机制以及针对本病的基因诊断性芯片的设计提供了新数据，可用于携带者筛查和产前基因诊断。

2、该突变位点的发现可以对其家系后代进行优生优育指导，并可以作为黏多糖贮积症这种罕见的严重的隐性遗传病的携带者筛查和产前诊断筛查位点，用于群体的优生优育的指导。

附图说明

图1是一个4代X连锁隐性黏多糖贮积症Ⅱ型家系；

其中，黑色箭头示先证者；黑色符号表示受累状态；斜线表示已过世；

图2是甲苯胺蓝呈色法检测患者尿液黏多糖呈阳性；

其中，左侧为脱色前尿斑；右侧为脱色后尿斑；

图3是细胞学检测在患者血涂片中性粒细胞和淋巴细胞中可见Reilly小体；

图4是受累个体Ⅳ3的PCR产物测序图，从该结果可以看出受累个体Ⅳ3的IDS基因第3外显子X:149503407位点A突变为C；

图5是受累个体Ⅳ4的PCR产物测序图，从该结果可以看出受累个体Ⅳ4的IDS基因第3外显子X:149503407位点A突变为C；

图6是受累个体母亲Ⅲ5的PCR产物测序图，从该结果可以看出受累个体母亲III5的IDS基因第3外显子X:149503407位点为A/C杂合子；

图7是受累个体父亲Ⅲ4的PCR产物测序图，从该结果可以看出受累个体父亲III4的IDS基因第3外显子X:149503407位点为碱基A。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

1、收集黏多糖贮积症Ⅱ型患者家系

按照知情同意的原则，收集一个北方地区4代黏多糖贮积症Ⅱ型(MSPⅡ)家系，先证者Ⅳ3，男性，23岁，主要表现为生长发育迟缓、面容丑陋、颈短、耳大、鼻梁塌、嘴唇肥厚；骨骼发育异常，头部颅骨凹凸不平、手臂屈曲、弓形足；肝硬化、脾大、脾功能亢进、食管胃底静脉曲张、脐疝、左侧腹股沟斜疝；主动脉瓣畸形；听力障碍；智力正常。患儿父母表型均正常，非近亲结婚。绘制系谱(图1)。收集样本包括家系中4名患者(Ⅳ3、Ⅳ4、Ⅲ19、Ⅲ32)和37名正常个体(Ⅱ2、Ⅱ4、Ⅱ5、Ⅱ7、Ⅱ8、Ⅱ12、Ⅱ13、Ⅱ14、Ⅲ4、Ⅲ5、Ⅲ7、Ⅲ8、Ⅲ9、Ⅲ12、Ⅲ17、Ⅲ18、Ⅲ20、Ⅲ26、Ⅲ27、Ⅲ29、Ⅲ30、Ⅲ31、Ⅲ32、Ⅲ34、Ⅲ35、Ⅲ38、Ⅲ39、Ⅳ5、Ⅳ7、Ⅳ11、Ⅳ12、Ⅳ14、Ⅳ16、Ⅳ18、Ⅳ20、Ⅳ21、Ⅴ1)的外周血等样本、手术组织废弃物等生物样本，以及相关基本信息及临床资料等，并予以编号。

2、判断黏多糖贮积症Ⅱ型患者家系遗传方式

对家系系谱进行遗传学分析，男性患病，女性为携带者，疾病在家族中呈现X连锁隐性遗传方式。

可以判定女性个体Ⅱ4、Ⅱ8、Ⅱ14、Ⅲ5、Ⅳ14为肯定携带者，其儿子患病几率为1/2，其女儿为携带者的可能性为1/2。因此Ⅱ4的女儿Ⅲ3和Ⅲ7，Ⅱ8的女儿Ⅲ17为携带者的几率为1/2。推断Ⅱ4、Ⅱ8、Ⅱ14的母亲Ⅰ2为肯定携带者，Ⅰ2的其他女儿Ⅱ2、Ⅱ12和Ⅱ18为携带者的几率为1/2，为可能携带者。这些可能携带者下一代已有育儿及再生育仍有发病风险存在，不能排除女性个体Ⅲ3、Ⅲ7、Ⅲ17、Ⅲ27、Ⅲ29、Ⅲ39、Ⅳ2、Ⅳ16、Ⅳ21为携带者的可能性，以及婴儿Ⅳ16为患者的可能性。

3、尿液黏多糖检测

收集家系核心成员4名(Ⅲ4、Ⅲ5、Ⅳ3、Ⅳ4)晨尿，采用甲苯胺蓝呈色法对患者尿液进行检测。同时用正常个体8名晨尿做对照。

收集晨尿，用吸液管将尿液0.1ml，一滴一滴地滴于滤纸上，使成6cm左右圆斑；将已吹干的尿斑滤纸浸于0.2％甲苯胺蓝染液(甲苯胺蓝1g加蒸馏水100ml，再取该液5ml加丙酮20ml即成)染色45s，取出吹干，将上述已吹干的染色尿斑滤纸浸于10％醋酸中(冰醋酸10ml加蒸馏水90ml)浸泡4min脱色，重复脱色一次或两次，空气中干燥。同时用正常个体晨尿做对照。

结果见图2，患者尿斑处呈现紫蓝色环状为阳性，正常个体尿斑无色为阴性。可见Ⅳ3和Ⅳ4为甲苯胺蓝染色阳性。

4、细胞学检查

黏多糖贮积症可在末梢血或骨髓的淋巴细胞和中性粒细胞内见有大小不等、形态各异的深紫色黏多糖颗粒，即Reilly小体，对诊断有辅助价值。

采集EDTA抗凝血，取100μl于1.5ml EP管中，取20μl血液于玻片靠磨砂面一端，用另一张玻片迅速把血液推到玻片另一端。镜下观察血细胞密度。甲醇固定2min后，用流水冲去甲醇。吉姆萨染液用PBS 1:9稀释，染色10min，流水冲去吉姆萨染液浮色。显微镜下观察血涂片淋巴细胞胞质中是否可见到紫色深染颗粒，即Reilly小体。

结果见图3，患者Ⅳ3外周血血涂片中中性粒细胞胞质中可见到紫色深染颗粒，即Reilly小体。正常个体(Ⅲ9)中外周血血涂片中中性粒细胞胞质未见到紫色深染颗粒。

5、基因诊断DNA分析粘多糖贮积症致病基因突变

将患者外周血基因组DNA提取送北京诺禾致源科技股份有限公司进行全外显子测序，获得候选致病基因IDS第3外显子突变位点X:149503407A>C(GRCh38.p7)，突变后的IDS第3外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。对候选致病基因突变位点设计引物，引物为：5’-TCAGACACCACAAACCAAGAGAAC-3’(SEQ ID NO.1)和3’-ATGGGGATAAGCTGGTGAGGTC-5’(SEQID NO.2)。对患者及家系其他个体进行PCR扩增，反应条件为95℃，3min；95℃，30s，61.4℃，30s，72℃，1min，30个循环；72℃，5min；产物大小974bp。之后PCR产物送北京擎科新业生物技术有限公司(Tsingke Biological Technology)进行Sanger测序，比对分析，发现在患者(Ⅳ3、Ⅳ4)中出现IDS基因突变位点，其母亲Ⅲ5为IDS第3外显子相应碱基位置A/C双峰颠换，其父亲Ⅲ4相应碱基位置A，未发生突变，如图4-7所示。该突变位点导致IDS基因编码改变c.323A>C；p.Y108S，编码蛋白第108位酪氨酸变为丝氨酸(NM_000202.7；NP_000193.1)。

其他个体中男性患者Ⅲ19和Ⅲ32为该基因位点突变，其他正常男性为正常基因位点。女性肯定携带者个体Ⅱ4、Ⅱ8、Ⅱ14、Ⅲ5为该基因位点杂合突变。女性可能携带者个体Ⅱ2、Ⅱ12、Ⅲ7和Ⅲ17为携带该基因位点杂合突变。其他女性个体为正常基因位点。

6、遗传学再发风险分析

由遗传学分析和基因检测结果筛查到表型正常女性Ⅱ2、Ⅱ12、Ⅲ7、Ⅲ17和Ⅳ14为携带该基因位点杂合突变，可以判定为肯定携带者。由此应该对育龄女性Ⅲ7再生育，及幼儿Ⅳ14婚育时进行遗传咨询和产前基因检测，以防有患儿出生。即肯定携带者生育时选择正常基因位点男性胎儿，可以防止致病基因在家族中继续传递。

表型正常女性Ⅲ27、Ⅲ29和Ⅲ39为该基因正常位点。可以排除其已育儿Ⅳ16、Ⅳ20和Ⅳ21为患者和携带者的可能，及其后代再有患儿出生的可能性。

由此致病基因突变位点的发现，可以对其家系中后代个体进行基因检测，以判断是否为携带者，及再生育患儿发病风险，并可进行产前诊断，对其进行优生优育指导。对丰富MPSⅡ的致病基因突变谱，及建立基因诊断方法具有重要意义。

序列表

<110> 哈尔滨医科大学

<120> 一种突变的艾杜糖-2-硫酸酯酶基因及其在检测黏多糖贮积症Ⅱ型疾病中的用途

<130> KLPI170557

<160> 3

<170> PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

tcagacacca caaaccaaga gaac 24

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

atggggataa gctggtgagg tc 22

<210> 3

<211> 178

<212> DNA

<213> mutated IDS exon3

<400> 3

caagcagtgt gcgccccgag ccgcgtttct ttcctcactg gcaggagacc tgacaccacc 60

cgcctgtacg acttcaactc ctcctggagg gtgcacgctg gaaacttctc caccatcccc 120

cagtacttca aggagaatgg ctatgtgacc atgtcggtgg gaaaagtctt tcaccctg 178

Claims (6)

1.一种与黏多糖贮积症Ⅱ型相关的突变的艾杜糖-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase，IDS)基因，其特征在于，相较于Gene bank登录号为NM_000202.7的未突变的艾杜糖-2-硫酸酯酶基因，突变后的艾杜糖-2-硫酸酯酶基因的第3外显子含有一个错义突变位点X:149503407A>C。

2.一种与黏多糖贮积症Ⅱ型相关的突变的艾杜糖-2-硫酸酯酶，其特征在于，相较于Gene bank登录号为NP_000193.1的未突变的艾杜糖-2-硫酸酯酶，突变后的艾杜糖-2-硫酸酯酶含有p.Y108S氨基酸突变位点。

3.权利要求1所述的突变的艾杜糖-2-硫酸酯酶基因在制备检测黏多糖贮积症Ⅱ型疾病试剂中的用途。

4.权利要求3所述的突变的艾杜糖-2-硫酸酯酶在制备检测黏多糖贮积症Ⅱ型疾病试剂中的用途。

5.一种用于检测黏多糖贮积症Ⅱ型的PCR引物组合物，其特征在于，由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

6.权利要求5所述的PCR引物组合物在制备检测黏多糖贮积症Ⅱ型疾病试剂中的用途。