CN107574252A - 一种用于快速鉴定鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的pcr检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种用于快速鉴定鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒。所述试剂盒中包括SPUL_2694基因检测引物对，所述SPUL_2694基因检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。本发明的试剂盒能用于快速高通量鉴定鸡白痢/鸡伤寒沙门菌，可作为沙门菌传统血清学分型的辅助方法，并为鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的监测与实验室诊断提供了一种简单快速、灵敏性高的新方法。

Description

一种用于快速鉴定鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种用于快速鉴定鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒。

背景技术

沙门菌病是公共卫生学上有重要意义的传染病之一，其病原沙门菌属于肠杆菌科，蛋、家畜和肉制品是主要传播媒介，可引起多种畜禽疾病，造成全身性败血症和肠炎。鸡白痢和鸡伤寒分别是由鸡白痢沙门菌(Salmonella Pullorum)和鸡伤寒沙门菌(Salmonella Gallinarum)引起的。鸡白痢沙门菌，又称雏沙门菌，可引起禽的鸡白痢(pullorum disease)，多侵害3周龄以内幼雏，发病率和病死率较高；对日龄较大的青年鸡也可致病和致死，成年鸡亦可被感染，常导致母鸡产蛋减少，生殖道畸形，体质量下降，也导致孵化率和出雏率明显下降且可长期带毒与排毒。禽伤寒(fowl typhoid)是因感染鸡伤寒沙门菌而导致的急性或慢性败血性禽类传染病，表现出腹泻、厌食、精神不振等症状，鸡伤寒沙门菌对雏鸡、成年鸡均可致病，以引起贫血、白细胞增多、出血为特征。在全球范围内影响着养鸡业的发展，在我国颇为严重。因而，鸡白痢/鸡伤寒沙门菌是我国养鸡业中危害严重的细菌，能引起严重的经济损失。目前，根据Kauffman-White(K-W)血清型分型方法，依据沙门菌菌体抗原及鞭毛抗原的不同，沙门菌目前的血清型有2600种以上，我国已报道了292种不同的血清型，分属于35个O群。

沙门菌血清型的鉴定主要是通过细菌分离血清型鉴定、生化鉴定等传统方法，但过程繁琐、费力、耗时，需4-7天才能完成，而且有些沙门菌血清型难以区分。因此，迫切需要一种高效、快速的检测方法用于沙门菌的鉴定，及时发现鸡白痢/鸡伤寒沙门菌，这对鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的有效防控意义重大。

发明内容

针对现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于快速鉴定鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒及其制备和应用。

为了实现上述目的及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供SPUL_2694在制备或筛选鸡白痢/鸡伤寒沙门菌检测试剂中的用途。

将SPUL_2694用于制备鸡白痢/鸡伤寒沙门菌检测试剂，是指将SPUL_2694作为基于检测SPUL_2694含量的鸡白痢/鸡伤寒沙门菌检测试剂的标准品或阳性对照，用于SPUL_2694的检测。

将SPUL_2694用于筛选鸡白痢/鸡伤寒沙门菌检测试剂，是指将SPUL_2694作为检测靶标应用于鸡白痢/鸡伤寒沙门菌检测试剂的筛选。在本发明的一些实施方式中，基于所述的SPUL_2694的基因序列，筛选特异性针对SPUL_2694的PCR扩增引物对从而作为鸡白痢/鸡伤寒沙门菌检测试剂。

本发明的第二方面，提供一种用于快速鉴定鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括SPUL_2694基因检测引物对，所述SPUL_2694基因检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。

本发明的试剂盒采用PCR检测技术进行SPUL_2694基因检测，根据扩增及检测情况可判断检测对象是否属于鸡白痢/鸡伤寒沙门菌。因此，引物对的设计是本发明试剂盒的关键。

基于本发明所述试剂盒是采用PCR技术来进行检测的，所以试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：双蒸水(ddH₂O)、2×Taq Master Mix、样品基因组DNA提取试剂等常用PCR反应试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。

本发明的试剂盒，可以是含有独立包装的引物对，也可以是含有配置好的含有引物对的PCR检测液。

所述PCR检测液可自行配置，也可直接以市售的不含引物对的通用PCR检测液加入引物对获得。例如，所述试剂盒中还可以含有双蒸水(ddH₂O)、2×Taq Master Mix。加入本发明的引物对、待检样本DNA提取物或者样本菌液即可获得PCR反应体系。

优选地，所述试剂盒中还可含有阳性对照。所述阳性对照为含有鸡白痢/鸡伤寒沙门菌SPUL_2694基因表达的DNA样本。

优选地，所述试剂盒中还可含有阴性对照。所述阴性对照可为非鸡白痢/鸡伤寒沙门菌SPUL_2694基因表达的DNA样本。

本发明的第三方面，提供了前述用于快速鉴定鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)提取样品基因组DNA；

(2)加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有前述SPUL_2694基因检测引物对；

(3)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；

(4)PCR反应结束后，分析结果。

优选地，所述方法为非疾病诊断目的的方法。

步骤(1)中，提取样品基因组DNA为现有技术。

优选地，步骤(3)中，PCR反应的条件设置为：(a)94℃5min；(b)94℃45s；(c)58.8℃30s；(d)72℃2min 37s，步骤(b)～(d)循环25次；(e)72℃10min。

本发明的第三方面，提供了前述试剂盒在制备SPUL_2694基因检测产品中的用途。

优选地，所述检测产品用于检测和筛选鸡白痢/鸡伤寒沙门菌。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过广泛而深入的研究，首次报道鸡白痢/鸡伤寒沙门菌存在SPUL_2694基因，即鸡白痢/鸡伤寒沙门菌含有2619bp核苷酸序列的SPUL_2694基因，以特异性引物通过PCR技术验证了SPUL_2694基因在不同血清型沙门菌及其它细菌中的分布。本发明的试剂盒能用于快速高通量的鉴定鸡白痢/鸡伤寒沙门菌，可作为沙门菌传统血清学分型的辅助方法，并为鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的监测与实验室诊断提供了简单快速、重复性好的新方法。

附图说明

图1：为在NCBI全基因组数据库中Blastn搜索SPUL_2694基因；其中，“Description”为含有SPUL_2694基因的细菌名称，“Query cover”为搜索到的基因占目标基因全长的覆盖比率，“Ident”为SPUL_2694基因核苷酸序列的相似性。

图2：为PCR鉴定SPUL_2694基因在非沙门菌中的分布和片段大小图片；其中，泳道M为：DL5000 Marker；泳道C79-13、RKS5078为：SPUL_2694基因片段(2619bp处有目的条带)；17220、17253、H37Rv、H6、D6、E7、9-36、3、8、11、12、C1916、C1917为：非SPUL_2694基因片段(无目的条带)；C79-13、RKS5078为鸡白痢沙门菌，17220、17253、H37Rv为结核分支杆菌，H6、D6、E7为单核细胞增生李斯特菌，9-36、3为空肠弯曲菌，8、11、12为结肠弯曲菌，C1916、C1917为大肠杆菌。

图3：为PCR鉴定SPUL_2694基因在不同血清型沙门菌中的分布和片段大小图片；其中泳道M为：DL2000 Marker；泳道C79-13、S06004、RKS5078、SG9为SPUL_2694基因片段(2619bp处有目的条带)；C50041、H7、C7、F10、J093、G11、C10、B1、A2、D1、T4、A6为非SPUL_2694基因片段(无目的条带)；C79-13、S06004、RKS5078为鸡白痢沙门菌，SG9为鸡伤寒沙门菌，C50041为肠炎沙门菌，H7、C7为鼠伤寒沙门菌，F10为德尔卑沙门菌，J093为汤普逊沙门菌，G11为伦敦沙门菌，C10为罗森沙门菌，B1、A2为彻斯特沙门菌，D1、T4为印第安纳沙门菌，A6为巴基斯坦沙门菌。

图4：为PCR鉴定SPUL_2694基因在不同血清型沙门菌中的分布和片段大小图片；其中，泳道M为：DL2000 Marker；图中所有泳道均为非SPUL_2694基因片段(无目的条带)；T10N3为罗森沙门菌，50093为甲型副伤寒沙门菌，GS3-1为纽波特沙门菌，GE-2为波茨坦沙门菌，T7N1阿贡纳沙门菌，T6N1为婴儿沙门菌，SL5928为都柏林沙门菌，Y1为鸭沙门菌，F10、N4、Z11为肠炎沙门菌。

图5：为PCR鉴定SPUL_2694基因在彻斯特沙门菌中的分布和片段大小图片；其中，泳道M为：DL2000 Marker；图中所有泳道均为非SPUL_2694基因片段(无目的条带)；1-8均为彻斯特沙门菌。

图6：为PCR鉴定鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒灵敏度；其中，泳道M为：DL2000 Marker；泳道1-9为鸡白痢沙门菌RKS5078基因组，浓度依次为403ng/μL、40.3ng/μL、4.03ng/μL、403pg/μL、40.3pg/μL、4.03pg/μL、403fg/μL、40.3fg/μL、4.03fg/μL。

图7：为PCR鉴定鸡场分离的1～17株沙门菌样品中的鸡白痢/鸡伤寒沙门菌，其中，泳道M为：DL2000 Marker；泳道1～17为鸡场分离的沙门菌；可扩增出2619bp目的条带的泳道6、7、12和15均为鸡白痢/鸡伤寒沙门菌。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1生物信息学方法鉴定SPUL_2694基因的分布

在NCBI中使用Blastn在线比对软件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在全基因组数据库中搜索SPUL_2694基因，搜索结果表明所有鸡白痢/鸡伤寒沙门菌中含有SPUL_2694基因，且基因长度为2619bp的核苷酸序列，其中彻斯特沙门菌在本文中进行PCR鉴定，结果显示并不能扩增出目的条带；其他两种血清型为甲型副伤寒沙门菌、Java沙门菌，两者均不是禽源沙门菌，故对鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的鉴定无影响。生物信息学鉴定结果显示SPUL_2694特异性良好，可用于建立鉴定鸡白痢/鸡伤寒沙门菌PCR方法(图1)。

鸡白痢/鸡伤寒沙门菌SPUL_2694核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：

ATGAAGATTGATATTCTAAGTAGTGACGGTATCCATGCCTCAGAAAAGGAAGCAATTAAGAGGATGGTAGAAGTTTTCAATGCATCTAGTTTTAGCCAAAAATGGCATGGCTATGCTGGTTTCATGATGATGGATACAACTTATAGAGATCGAGAGATTGATTTAGTTCTTCTGACGCATGATAGACTCCTAATCGTGGAGCTTAAAAAGTGGCGCGGAAAAATTGAACCAATGCATGATCATTGGTTACGTGATGGTGATGACATGGGACGTTCACCAGTTAAAGTCCTTGCCGATAAGTGGAAAATTTTATCATCAAAGATTAAAACTCGTCTAAGTGCGCCAGCAACAGAAGTATACATTGATTACAGAGTTGTCATGTGTGGGAGTGCTGACTTTTCTGAAATTCCAGAAGATGAAAAATCATTTGTATGTACACTTGAACAGTTTTTAAAAATTGCCAAATCTGGGGGGTACCAAGGCGAATTTGGTCCACAAAAAGCGCGTAAGCCTTGTGAATATTTGCAGGTGTTCACACCATTTTTTAGAGGTAAGGATTTCAAGCCTTCAAGTTTTTCATTCAATAATTTCCAAATTGTTGGAGAAGCAACTTTTCCTCATCCTGATGGATTGTACAAAGAATACAAATCTGTCAAAAAAGATGACCAACGACATGAAGCATTATTAAGGCGATGGGATTTCTCAGCATTATCTGGCATAGCCGATACTATTGATGAACGAGCCCGTATAGCATTGCGAGAGCATAAAGTTCTAGGTTTCATTCATGAGCAAAATGAACAACTTGATAGCGTAGTTTTGCAACCTCTATCGCATCCAACTCGAGATGATATAGATGCTGACTTCTGTGAACTATATAGACTACCGTCGAGACAATTAAGACTTAATGAATTCATTCAACGTTTTGGTGAAGATCTAGAGTTCTGTGAAAGGGTTAACTTTGTAAAGGTACTTTTATCCCACGCAGCCGATTTACATGACTTGGGCGTTGCTCATCGGGATATTAGCGATCATACTATTTGGTTAGAACGGCCATCTAAAATATCTATATCAGGTTTCCTGACCGCATATTTTCCTGAATTAGGAACAGTTGGTTCTCTTCGTGATCAGCTTCGTGCAAGCAAAACTATTTTACCTGAGGATTCCGAAATTGGACAAGGTGAAGCGAGCGATCCATTCCGTAGAGATGTTTATTTATTGGCTGTAGTTATACATCATATTTTATTTTTACAAGCCCCCAAGCAAGAAGACTCTTTATTTGTTTGGAATAGTCCAACTGATTTTGAAGTTGATCCACAACTTAGCACTTGGTTTGAAACTGCTTTGGATTTAATTCCCGCAGGTCGATTTTCAGATGCGCGAACGATGCTTAATTCGTTTAATACCTTATCTTTAGGATATCCGGAAAAAACAGGTATTGACTTACGTAGATTCGAGCCTTATCGAAGTGAGTTGATTCCAATGGTTATTTATCCTATTGAGGAAAATATAAAGCAGGGCATAAGTCATTTATATAAATCGACTTTTTCTGGTGAGAGTGTTTCGGTTAAAGTATGGTATGGGCGGAAACCAGATATAAAGCGACCGGAAGAGGCTTTACAACTTCAGAATTTTCTCGATAAAGCTCGCCTAATAAAATCCCAGCCCTGTTCTTCTCTTGCTGAAGTTATTGATTTTGGTATTTCAGATGCAGGAACCTATTTAGTCCAAAAATGGTTGAATGGGGAATTCCTAAATGACGCTGTCAAATCATGTCATGTTGGTCGTGAATTGATATTACTATGCAAAAAAATAGTTAGGGCAGTCTTACATTTACATGCTATGCAATTACAACATGGGGATCTGCACCCTAACAATATTCTAATAGAAGTGGGAGATGTTCGCTTCATTGATGCACTTGATATACCTTGTTCAGGTGTGAATATAATATTCACTCCTGCATATGTACCTACAGATTACGAATCTTTGCCTATGGAGGAACGTGATTGCTACGCTGTGGCCAAAGTGTGTAATGAGATTTTAGAACACGACGTTAACTGGGAAGGGATTGATCCATCAGCTTTACTTAATGAGATCAGAAGTTGTATGGGGCGGGATTTTAAAATTTATTCTCTTGACCGAATAAATGATGAAATAGAGATGTTAATCAACCCTCCACAAATAAATGAGGGAGTGAGGTTGTCAGTATTAATGAGGCAACTGACCTCCAGCCAGAAATTAATAAATGACAATGGTGTATACCATATCAGTATTAGTGAAGAACGAGTCCGTTCGCCAAAGCAGCAGCCTCATATTATCGTAGCTTTTGCCGGAGTACGTAAACAGTTACAAATCTATCTTAAAGCGACCCAATTAGATTTTGCATTTTTACGAACTAAAGATATAGCCCATAGCTTATTTGTACGAATGGCATCACAAGCCATTACACAACTCGAAGCTAATATACTATTCGAACCCTCATCCGCGGATGACCCTAGCAAGTTATTAGAACATGTAAAAAAATACCTGAGGTTATCTCTGCAATATCGAGAATTCAGAATAGAATTCTCGGTGGCGATTTTTCTTCTGATGAGGAAGAAATTGAGAACTCAGAAACTTTAA。

实施例2试剂盒的制备

引物设计与合成：以SPUL_2694基因为模板，设计并分析引物，并根据基因组DNA序列情况，从中选择最佳检测用引物对，其核苷酸序列如下表1所示：

表1

上述引物对可单独包装，也可以配成PCR检测液。所述PCR检测液中，上述引物对的量采用本领域技术人员所知悉的常规用量即可。

也就是说，本发明的试剂盒，可以是含有上述独立包装的引物对，也可以是含有配置好的含有引物对的PCR检测液。

进一步地，所述试剂盒还可以含有双蒸水(ddH₂O)、2×Taq Master Mix、样品基因组DNA提取试剂等。

实施例3试剂盒检测鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的特异性鉴定

采用实施例2所述试剂盒中的引物，以不同血清型沙门菌和其它细菌的基因组分别为模板，PCR方法鉴定SPUL_2694基因在不同细菌中的分布特点。

PCR反应体系为(25μL)：9.5μL双蒸水(ddH₂O)，12.5μL 2×Taq Master Mix，SPUL_2694-F 1μL，SPUL_2694-R 1μL，模板1μL。

PCR程序为(a)94℃5min；(b)94℃45s；(c)58.8℃30s；(d)72℃2min 37s，步骤(b)～(d)循环25次；(e)72℃10min。

PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，PCR电泳结果表明所有以鸡白痢/鸡伤寒沙门菌基因组为模板的泳道中均有2619bp目的条带(图2，图3)，而其它血清型的沙门菌没有扩增出条带(图2，图3，图4，图5)，表明以实施例2所述试剂盒中特定的SPUL_2694扩增引物，可以通过PCR方法快速鉴定未知细菌是否为鸡白痢/鸡伤寒沙门菌。

实施例4试剂盒检测鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的灵敏性鉴定

采用实施例2所述试剂盒中的引物，将鸡白痢沙门菌RKS5078基因组依次10倍稀释，以稀释的基因组为模板，鉴定试剂盒检测鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的灵敏性。

PCR反应体系为(25μL)：9.5μL双蒸水(ddH₂O)，12.5μL 2×Taq Master Mix，SPUL_2694-F 1μL，SPUL_2694-R 1μL，模板1μL。

PCR程序为(a)94℃5min；(b)94℃45s；(c)58.8℃30s；(d)72℃2min 37s，步骤(b)～(d)循环25次；(e)72℃10min。

PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，PCR电泳结果表明基于SPUL_2694基因的PCR检测试剂盒可检测4.03pg/μL的鸡白痢沙门菌基因组(图6)。

实施例5试剂盒在鸡场的应用

采用实施例2中试剂盒，检测17株鸡场分离的沙门菌，可快速准确地检测出鸡白痢/鸡伤寒沙门菌。具体步骤如下：

1)沙门菌的分离

本试验中样品采自江苏某鸡场，样品的采集、增菌及沙门菌的分离和生理生化鉴定参考现有技术中已建立方法(Li Y,et al.Food Control,2016；Cai Y,et al.Int JFood Microbiol,2016)，本次试验共分离鉴定了17株沙门菌。

2)PCR方法检测样本中鸡白痢/鸡伤寒沙门菌

将15株沙门菌分别接种到LB液体培养基中，37℃180rpm过夜培养，次日，以基因组为模板扩增SPUL_2694基因，PCR反应体系为(25μL)：9.5μL双蒸水(ddH₂O)，12.5μL 2×TaqMaster Mix，SPUL_2694-F 1μL，SPUL_2694-R 1μL，模板1μL。PCR程序为(a)94℃5min；(b)94℃45s；(c)58.8℃30s；(d)72℃2min 37s，步骤(b)～(d)循环25次；(e)72℃10min。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，可扩增出2619bp的SPUL_2694目的条带的细菌则为鸡白痢/鸡伤寒沙门菌。结果显示17株沙门菌中共有4株含2619bp的SPUL_2694目的条带，分别是泳道6、7、12和15(图7)，这些即为鸡白痢/鸡伤寒沙门菌。

3)沙门菌的传统血清型鉴定

本次试验分离的17株沙门菌的血清型鉴定参考现有技术中已建立方法(Li Y,etal.Food Control,2016；Cai Y,et al.Int J Food Microbiol,2016)，血清型鉴定结果表明17株沙门菌中共有4株鸡白痢沙门菌，分别为泳道6、7、12和15，PCR检测结果与血清型鉴定结果完全一致。

在本实施例中，采用传统血清型鉴定方法，将17株沙门菌中的鸡白痢/鸡伤寒沙门菌筛选出来，至少需要2天的时间。而本发明实施例2的PCR检测试剂盒，仅需3个小时，即可将17株沙门菌中的鸡白痢/鸡伤寒沙门菌准确筛选出来，且PCR鉴定结果与血清型鉴定结果完全吻合，正确率为100％。

综上所述，本发明试剂盒相较于传统血清型鉴定方法的优势：

传统沙门菌血清型鉴定方法常将细菌的菌体抗原、鞭毛抗原及荚膜抗原作为血清分型的依据，多以玻片凝集法进行。根据Kauffman-White(K-W)血清型分型方法，沙门菌可分为2659种血清型，鉴定时需质量保证且种类齐全的上百种血清，同时，也要求具备一定的经验及准确的判断能力的实验者，至少需要两天的时间，并且其结果是通过肉眼进行判断是否存在凝集现象，因而可能存在人为误差；而本发明试剂盒的检测方法操作简单，成本非常低，且对细菌的存在形式没有要求(单菌落、冻存菌液或新鲜菌液均可)，整个鉴定过程在三小时内即可完成(包含PCR和琼脂糖凝胶电泳)，且准确率达到100％。因此，本发明的一种用于快速鉴定鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒，有利于简化沙门菌鉴定的传统步骤，在为大量样本中筛选鸡白痢/鸡伤寒沙门菌提供了一种快速鉴定的新方法。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种用于快速鉴定鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒

<130> 174769

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cggggtacca tgaagattga tattctaagt agtg 34

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccggaattct taaagtttct gagttctcaa tttc 34

<210> 3

<211> 2619

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaagattg atattctaag tagtgacggt atccatgcct cagaaaagga agcaattaag 60

aggatggtag aagttttcaa tgcatctagt tttagccaaa aatggcatgg ctatgctggt 120

ttcatgatga tggatacaac ttatagagat cgagagattg atttagttct tctgacgcat 180

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aaatcatttg tatgtacact tgaacagttt ttaaaaattg ccaaatctgg ggggtaccaa 480

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attcatgagc aaaatgaaca acttgatagc gtagttttgc aacctctatc gcatccaact 840

cgagatgata tagatgctga cttctgtgaa ctatatagac taccgtcgag acaattaaga 900

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accgcatatt ttcctgaatt aggaacagtt ggttctcttc gtgatcagct tcgtgcaagc 1140

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agagatgttt atttattggc tgtagttata catcatattt tatttttaca agcccccaag 1260

caagaagact ctttatttgt ttggaatagt ccaactgatt ttgaagttga tccacaactt 1320

agcacttggt ttgaaactgc tttggattta attcccgcag gtcgattttc agatgcgcga 1380

acgatgctta attcgtttaa taccttatct ttaggatatc cggaaaaaac aggtattgac 1440

ttacgtagat tcgagcctta tcgaagtgag ttgattccaa tggttattta tcctattgag 1500

gaaaatataa agcagggcat aagtcattta tataaatcga ctttttctgg tgagagtgtt 1560

tcggttaaag tatggtatgg gcggaaacca gatataaagc gaccggaaga ggctttacaa 1620

cttcagaatt ttctcgataa agctcgccta ataaaatccc agccctgttc ttctcttgct 1680

gaagttattg attttggtat ttcagatgca ggaacctatt tagtccaaaa atggttgaat 1740

ggggaattcc taaatgacgc tgtcaaatca tgtcatgttg gtcgtgaatt gatattacta 1800

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ctgcacccta acaatattct aatagaagtg ggagatgttc gcttcattga tgcacttgat 1920

ataccttgtt caggtgtgaa tataatattc actcctgcat atgtacctac agattacgaa 1980

tctttgccta tggaggaacg tgattgctac gctgtggcca aagtgtgtaa tgagatttta 2040

gaacacgacg ttaactggga agggattgat ccatcagctt tacttaatga gatcagaagt 2100

tgtatggggc gggattttaa aatttattct cttgaccgaa taaatgatga aatagagatg 2160

ttaatcaacc ctccacaaat aaatgaggga gtgaggttgt cagtattaat gaggcaactg 2220

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Claims (10)

1.SPUL_2694在制备或筛选鸡白痢/鸡伤寒沙门菌检测试剂中的用途。

2.一种用于快速鉴定鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括SPUL_2694基因检测引物对，所述SPUL_2694基因检测引物对包括核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有双蒸水(ddH₂O)、2×Taq Master Mix、样品基因组DNA提取试剂中的一种或多种。

4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有阳性对照或阴性对照中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为鸡白痢/鸡伤寒沙门菌SPUL_2694基因表达的DNA样本。

6.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照可为非鸡白痢/鸡伤寒沙门菌的DNA样本。

7.如权利要求1～6任一权利要求所述的检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)提取样品基因组DNA；

(2)加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有前述SPUL_2694基因检测引物对；

(3)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；

(4)PCR反应结束后，分析结果。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法为非疾病诊断目的的方法。

9.如权利要求1～6任一权利要求所述的检测试剂盒在制备SPUL_2694基因检测产品中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述检测产品用于检测和筛选鸡白痢/鸡伤寒沙门菌。