CN107557431A - 一种可视化检测s1核酸酶的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可视化检测S1核酸酶的试剂盒，该试剂盒包括：1)具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸‑Cu(II)复合物溶液；2)3,3’,5,5’‑四甲基联苯胺‑乙醇溶液；3)过氧化氢水溶液；4)pH为4.0的缓冲溶液；5)1xS1核酸酶缓冲液，所述1xS1核酸酶缓冲液包括30mM pH为4.6的乙酸钠‑乙酸缓冲溶液,280mM氯化钠水溶液和1mM的硫酸锌水溶液。利用本发明的试剂盒能方便的用于S1核酸酶的测定，其灵敏度高、选择性好、操作简便，且直观可视，价格低廉。
Description
技术领域
本发明属于纳米技术和生物检测领域，具体的是涉及一种可视化检测S1核酸酶的试剂盒。
背景技术
S1核酸酶，来源于稻谷曲霉(Aspergillusoryzae)，是一种高度单链特异的核酸内切酶，在最适的酶催反应条件下，降解单链脱氧核糖核酸或核糖核酸，产生带5'-磷酸的单核苷酸或寡核苷酸。它在诸多领域中都起到重要作用，例如生物技术和药理学以及很多涉及脱氧核糖核酸复制、脱氧核糖核酸重组、脱氧核糖核酸修复、分子克隆和聚合酶链式反应等重要的生物学领域。[Analytical Methods.2015,7,5600–5605]因此，建立一种快速、灵敏、直观的S1核酸酶检测方法是至关重要的。
到目前为止，S1核酸酶的检测方法有光致发光法、荧光光谱法等。[ACSAppl.Mater.Interfaces.2016,8,827-833]但是在这些方法中，光致发光法的重复性较差，并且由于对核酸酶有一定的损伤率从而限制了他们在实际样品中的应用；[中国专利201110245341.1]公开了一种利用荧光光谱检测核酸酶的方法，但是该方法不可视，并且需要对核酸进行化学修饰，使得该方法具有一定的复杂性。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种可视化检测S1核酸酶的试剂盒。
本发明的第二个目的是提供另一种可视化检测S1核酸酶的试剂盒。
本发明的技术方案概述如下：
一种可视化检测S1核酸酶的试剂盒，包括：
1)具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液；
2)3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液；
3)过氧化氢水溶液；
4)pH为4.0的缓冲溶液；
5)1xS1核酸酶缓冲液，所述1xS1核酸酶缓冲液包括30mM pH为4.6的乙酸钠-乙酸缓冲溶液,280mM氯化钠水溶液和1mM的硫酸锌水溶液。
具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液是用下述方法制成：将5-200μL浓度为5-200μM的脱氧核糖核酸水溶液、20-150μL 0.2-1.5M氯化钠水溶液、10-100μL 10-100mM pH为3.0-9.0的缓冲液混合，加水至300μL得到脱氧核糖核酸缓冲溶液，再加入2-15μL浓度为0.4mM-3mM二价铜离子水溶液，在20-40℃下震荡混合2～10min，在20-40℃下静置0.5-4h，得到具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液。
脱氧核糖核酸序列优选为：
Gm，其中m＝4～200；
(TG4)n；(T2G3)n；(T3G2)n；(AG4)n；(A2G3)n；(A3G2)n；AG2(T2AG2)n；TG2(TA2G2)n；AG3(T2AG3)n；TG3(TA2G3)n；AG4(T2AG4)n；TG4(TA2G4)n；其中n＝1～40。
3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液的浓度为0.01-5mM，所述过氧化氢水溶液的浓度为0.01-3M。
pH为4.0的缓冲溶液优选2-(N-吗啡啉)乙磺酸-氢氧化锂缓冲液、磷酸二氢钠-磷酸缓冲液、磷酸二氢钾-磷酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，所述pH为4.0的缓冲溶液的浓度为10-100mM。
另一种可视化检测S1核酸酶的试剂盒，包括：
1)具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液；
2)亚甲基蓝水溶液；
3)过氧化氢水溶液；
4)pH为11.0的缓冲溶液；
5)1xS1核酸酶缓冲液，所述1xS1核酸酶缓冲液包括30mM pH为4.6的乙酸钠-乙酸缓冲溶液,280mM氯化钠水溶液和1mM的硫酸锌水溶液。
具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液是用下述方法制成：将5-200μL浓度为5-200μM的脱氧核糖核酸水溶液、20-150μL 0.2-1.5M氯化钠水溶液、10-100μL 10-100mM pH为3.0-9.0的缓冲液混合，加水至300μL得到脱氧核糖核酸缓冲溶液，再加入2-15μL浓度为0.4mM-3mM二价铜离子水溶液，在20-40℃下震荡混合2～10min，在20-40℃下静置0.5-4h，得到具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液。
脱氧核糖核酸序列为：
Gm，其中m＝4～200；
(TG4)n；(T2G3)n；(T3G2)n；(AG4)n；(A2G3)n；(A3G2)n；AG2(T2AG2)n；TG2(TA2G2)n；AG3(T2AG3)n；TG3(TA2G3)n；AG4(T2AG4)n；TG4(TA2G4)n；其中n＝1～40。
亚甲基蓝水溶液的浓度为0.1μM-300μM，所述过氧化氢水溶液的浓度为0.01-3M。
pH为11.0的缓冲溶液优选为磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液、磷酸氢二钾-氢氧化钠缓冲液、硼酸-氢氧化钠缓冲溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钠缓冲液，所述pH为11.0的缓冲溶液浓度为10-100mM。
利用本发明的试剂盒能方便的用于S1核酸酶的测定，其灵敏度高、选择性好、操作简便，且直观可视，价格低廉。
附图说明
图1是实施例1中制备的具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液的质谱图；
图2是实施例2中制备的具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液的质谱图；
图3是实施例3中制备的具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液的质谱图；
图4是实施例1、2和3中过氧化氢水溶液浓度为0.125M，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺乙醇溶液浓度为0.25mM的紫外动力学曲线图；
图5是实施例1中过氧化氢水溶液浓度为0.125M，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺乙醇溶液浓度为0.25mM，S1核酸酶的浓度分别为0U/mL、0.01U/mL、0.03U/mL、0.05U/mL、0.07U/mL、0.1U/mL、0.5U/mL、1U/mL、5U/mL、10U/mL、20U/mL，反应30min后紫外652nm处吸收值的点图；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但不对本发明作任何限制。
实施例1
具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液的制备方法：将60μL浓度为100μM的AG3(T2AG3)3水溶液、100μL 0.4M氯化钠水溶液、60μL 50mM pH为7.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸-氢氧化锂缓冲液混合，加水至300μL得到脱氧核糖核酸缓冲溶液，再加入8μL浓度为1mM氯化铜水溶液，在25℃下震荡混合6min，在35℃下静置1h，得到具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液。
测定脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液的过氧化物酶活性：
在4mL比色皿中，加入300μL实施例1获得的具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液、750μL 40mM pH为4.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸-氢氧化锂缓冲液、38.2μL9.8M过氧化氢水溶液和30μL 25mM 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺乙醇溶液，加入三蒸水使终体积为3000μL，混合反应30min，采用紫外分光光度计扫描652nm处紫外吸收的动力学图谱。(见图4)
用电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪(ESI MS)表征了该复合物溶液中AG3(T2AG3)3和Cu2+的结合情况。(见图1)
实施例2
一种具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液的制备方法，包括如下步骤：
将20μL浓度为150μM的AG3(T2AG3)3水溶液、60μL 0.5M氯化钠水溶液、75μL 40mMpH为6.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液混合，加水至300μL得到脱氧核糖核酸缓冲溶液，再加入2μL浓度为3mM硝酸铜的水溶液，30℃下震荡混合5min，在30℃下静置1.5h，得到具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液。
测定过氧化物酶活性的方法同实施例1。(见图4)
用电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪(ESI MS)表征了该复合物溶液中AG3(T2AG3)3和Cu2+的结合情况。(见图2)
实施例3
一种具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液的制备方法，包括如下步骤：
将150μL浓度为10μM的AG3(T2AG3)3水溶液、30μL 1M氯化钠水溶液、50μL 60mM pH为4.0的磷酸二氢钾-磷酸缓冲液混合，加水至300μL得到脱氧核糖核酸缓冲溶液，再加入15μL浓度为0.4mM硫酸铜的水溶液，35℃下震荡混合4min，在25℃下静置3h，得到具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液。
测定过氧化物酶活性的方法同实施例1。(见图4)
用电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪(ESI MS)表征了该复合物溶液中AG3(T2AG3)3和Cu2+的结合情况。(见图3)
实施例4
一种具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液的制备方法，包括如下步骤：
将5μL浓度为200μM的AG3(T2AG3)40水溶液、150μL 0.2M氯化钠水溶液、100μL 10mMpH为3.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，加水至300μL得到脱氧核糖核酸缓冲溶液，再加入15μL浓度为0.4mM醋酸铜的水溶液，40℃下震荡混合2min，在20℃下静置4h，得到具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液。
测定过氧化物酶活性的方法同实施例1，测得的反应30min后652nm处的紫外吸收值见表1。
实施例5
一种具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液的制备方法，包括如下步骤：
将200μL浓度为5μM的AG3(T2AG3)水溶液、20μL 1.5M氯化钠水溶液、10μL 100mM pH为9.0的磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液混合，加水至300μL得到脱氧核糖核酸缓冲溶液，再加入15μL浓度为0.4mM氯化铜的水溶液，20℃下震荡10min混合均匀，在40℃下静置0.5h，得到具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液。
测定过氧化物酶活性的方法同实施例1，测得的反应30min后652nm处的紫外吸收值见表1。
用G4、G200、TG4、(TG4)40、T2G3、(T2G3)40、T3G2、(T3G2)40、AG4、(AG4)40、A2G3、(A2G3)40、A3G2、(A3G2)40、AG2(T2AG2)、AG2(T2AG2)40、TG2(TA2G2)、TG2(TA2G2)40、TG3(TA2G3)、TG3(TA2G3)40、AG4(T2AG4)、AG4(T2AG4)40、TG4(TA2G4)、TG4(TA2G4)40分别替换实施例1中的AG3(T2AG3)3，其它同实施例1，都可以获得具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液，并用同实施例1相同的方法测定相应的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液的过氧化物酶活性，测得的反应30min后652nm处的紫外吸收值见表1，其过氧化物酶活性与对照2μM Cu2+相比(反应30min后652nm处的紫外吸收值为0.102，见图4)，具有显著性差异。
表1
结论：本发明的方法制备的具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液，且反应速率快，催化活性较高。
实施例6
一种可视化检测S1核酸酶的试剂盒，包括：
1)实施例1制备的具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液；
2)0.25mM 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液；
3)0.125M过氧化氢水溶液；
4)10mM pH为4.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸-氢氧化锂缓冲液；
5)1xS1核酸酶缓冲液，所述1xS1核酸酶缓冲液包括30mM pH为4.6的乙酸钠-乙酸缓冲溶液,280mM氯化钠水溶液和1mM的硫酸锌水溶液。
利用实施例6的试剂盒检测S1核酸酶：
在11个4mL比色皿中，均加入300μL实施例1制备的具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液和30μL 1xS1核酸酶缓冲液，再加入15μL S1核酸酶水溶液，浓度分别为0U/mL、0.01U/mL、0.03U/mL、0.05U/mL、0.07U/mL、0.1U/mL、0.5U/mL、1U/mL、5U/mL、10U/mL、20U/mL，再向11个比色皿中加入750μL 10mM pH为4.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸-氢氧化锂缓冲液、38.2μL 0.125M过氧化氢水溶液、30μL 0.25mM 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液，最后加入三蒸水使终体积为3000μL，混合反应30min；
采用紫外分光光度计记录反应30min的652nm处的吸收值，得到不同浓度的S1核酸酶在652nm处的吸光度的点图，并且A652吸光度数值与S1核酸酶浓度在0～0.07U/mL具有很好的线性关系，其校准曲线A652＝1.17252–1.48689[S1Nuclease]。(见图5)
实验证明，本实施例的试剂盒能够用于S1核酸酶含量的测定，对于S1核酸酶检测限为0.012U/mL。
实施例7
一种可视化检测S1核酸酶的试剂盒，包括：
1)实施例4制备的具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液；
2)0.01mM 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液；
3)0.01M过氧化氢水溶液；
4)50mM pH为4.0的磷酸二氢钠-磷酸缓冲液；
5)1xS1核酸酶缓冲液，同实施例6；
测定方法同实施例6
实验证明，本实施例的试剂盒能够用于S1核酸酶含量的测定，对于S1核酸酶检测限为0.025U/mL。
实施例8
一种可视化检测S1核酸酶的试剂盒，包括：
1)实施例5制备的具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液；
2)5mM 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液；
3)3M过氧化氢水溶液；
4)100mM pH为4.0的磷酸二氢钾-磷酸缓冲液；
5)1xS1核酸酶缓冲液，同实施例6；
测定方法同实施例6
实验证明，本实施例的试剂盒能够用于S1核酸酶含量的测定，对于S1核酸酶检测限为0.019U/mL。
实验证明，用三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液替代本实施例的磷酸二氢钾-磷酸缓冲液，其它同本实施例，可以获得一种可视化检测S1核酸酶的试剂盒。
实施例9
一种可视化检测S1核酸酶的试剂盒，包括：
1)实施例1制备的具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液；
2)30μM亚甲基蓝水溶液；
3)0.1M过氧化氢水溶液；
4)10mM pH为11.0的磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液；
5)1xS1核酸酶缓冲液，同实施例6；
利用实施例9的试剂盒检测S1核酸酶：
在11个4mL比色皿中，均加入300μL实施例1制备的具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液和30μL 1xS1核酸酶缓冲液，再加入15μL S1核酸酶水溶液，浓度分别为0U/mL、0.01U/mL、0.03U/mL、0.05U/mL、0.07U/mL、0.1U/mL、0.5U/mL、1U/mL、5U/mL、10U/mL、20U/mL，再向11个比色皿中加入750μL 10mM pH为11.0的磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液、30.6μL 0.1M过氧化氢水溶液、30μL 30μM亚甲基蓝水溶液，最后加入三蒸水使终体积为3000μL，混合反应30min；
实验证明，本实施例的试剂盒能够用于S1核酸酶含量的测定，对于S1核酸酶检测限为0.014U/mL。
实施例10
一种可视化检测S1核酸酶的试剂盒，包括：
1)实施例4制备的具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液；
2)0.1μM亚甲基蓝水溶液液；
3)0.01M过氧化氢水溶液；
4)50mM pH为11的4-羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钠缓冲液；
5)1xS1核酸酶缓冲液，同实施例6；
测定方法同实施例9
实验证明，本实施例的试剂盒能够用于S1核酸酶含量的测定，对于S1核酸酶检测限为0.026U/mL。
实施例11
一种可视化检测S1核酸酶的试剂盒，包括：
1)实施例5制备的具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液；
2)300μM亚甲基蓝水溶液；
3)3M过氧化氢水溶液；
4)100mM pH为11.0的硼酸-氢氧化钠缓冲液；
5)1xS1核酸酶缓冲液，同实施例6；
测定方法同实施例9
实验证明，本实施例的试剂盒能够用于S1核酸酶含量的测定，对于S1核酸酶检测限为0.018U/mL。
实验证明，用磷酸氢二钾-氢氧化钠缓冲液替代本实施例的硼酸-氢氧化钠缓冲液，其它同本实施例，可以获得一种可视化检测S1核酸酶的试剂盒。
Claims (10)
1.一种可视化检测S1核酸酶的试剂盒，其特征包括：
1)具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液；
2)3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液；
3)过氧化氢水溶液；
4)pH为4.0的缓冲溶液；
5)1xS1核酸酶缓冲液，所述1xS1核酸酶缓冲液包括30mM pH为4.6的乙酸钠-乙酸缓冲溶液,280mM氯化钠水溶液和1mM的硫酸锌水溶液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是所述具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液是用下述方法制成：将5-200μL浓度为5-200μM的脱氧核糖核酸水溶液、20-150μL 0.2-1.5M氯化钠水溶液、10-100μL 10-100mM pH为3.0-9.0的缓冲液混合，加水至300μL得到脱氧核糖核酸缓冲溶液，再加入2-15μL浓度为0.4mM-3mM二价铜离子水溶液，在20-40℃下震荡混合2～10min，在20-40℃下静置0.5-4h，得到具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征是所述脱氧核糖核酸序列为：
Gm，其中m＝4～200；
(TG4)n；(T2G3)n；(T3G2)n；(AG4)n；(A2G3)n；(A3G2)n；AG2(T2AG2)n；TG2(TA2G2)n；AG3(T2AG3)n；TG3(TA2G3)n；AG4(T2AG4)n；TG4(TA2G4)n；其中n＝1～40。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是所述3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液的浓度为0.01-5mM，所述过氧化氢水溶液的浓度为0.01-3M。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是所述pH为4.0的缓冲溶液为2-(N-吗啡啉)乙磺酸-氢氧化锂缓冲液、磷酸二氢钠-磷酸缓冲液、磷酸二氢钾-磷酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，所述pH为4.0的缓冲溶液的浓度为10-100mM。
6.一种可视化检测S1核酸酶的试剂盒，其特征包括：
1)具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液；
2)亚甲基蓝水溶液；
3)过氧化氢水溶液；
4)pH为11.0的缓冲溶液；
5)1xS1核酸酶缓冲液，所述1xS1核酸酶缓冲液包括30mM pH为4.6的乙酸钠-乙酸缓冲溶液,280mM氯化钠水溶液和1mM的硫酸锌水溶液。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征是所述具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液是用下述方法制成：将5-200μL浓度为5-200μM的脱氧核糖核酸水溶液、20-150μL 0.2-1.5M氯化钠水溶液、10-100μL 10-100mM pH为3.0-9.0的缓冲液混合，加水至300μL得到脱氧核糖核酸缓冲溶液，再加入2-15μL浓度为0.4mM-3mM二价铜离子水溶液，在20-40℃下震荡混合2～10min，在20-40℃下静置0.5-4h，得到具有过氧化物酶活性的脱氧核糖核酸-Cu(II)复合物溶液。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征是所述脱氧核糖核酸序列为：
Gm，其中m＝4～200；
(TG4)n；(T2G3)n；(T3G2)n；(AG4)n；(A2G3)n；(A3G2)n；AG2(T2AG2)n；TG2(TA2G2)n；AG3(T2AG3)n；TG3(TA2G3)n；AG4(T2AG4)n；TG4(TA2G4)n；其中n＝1～40。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征是所述亚甲基蓝水溶液的浓度为0.1μM-300μM，所述过氧化氢水溶液的浓度为0.01-3M。
10.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征是所述pH为11.0的缓冲溶液为磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液、磷酸氢二钾-氢氧化钠缓冲液、硼酸-氢氧化钠缓冲溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钠缓冲液，所述pH为11.0的缓冲溶液浓度为10-100mM。
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Cited By (1)
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2017
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