CN1075483A - 控制细胞增殖的妊娠因子 - Google Patents

Abstract

本发明涉及哺乳动物妊娠期间正常表达的基本 纯化的因子，它可用于控制细胞的增殖。本发明特别 提供了增殖因子和抗增殖因子。抗增殖因子可用于 限制不希望有的细胞增殖，例如用于治疗癌症。增殖 因子可用于增强细胞增殖，例如用于治疗不育症。

Description

本发明涉及基本纯化的，在哺乳动物妊娠期正常表达的因子，它可以用于控制细胞的增殖。本发明尤其提供了增殖因子和抗增殖因子。抗增殖因子可用于限制不期望有的细胞增殖，例如，用于治疗癌症。增殖因子可用于增加细胞增殖，例如，用于治疗不育症。

人类妊娠分为两个发育阶段，即胚胎期和胎儿期。前者从受孕到第8周末，后者从8周后持续到分娩。胚胎期的特点是实际上所有基本结构发生，胎儿期则是这些结构进行生长并变得更为精细（参见Moore，1977，in“The  Developing  Human”，第二版，W.B.Saunders  Company，Philadelphia）。因此，正是在胚胎期发育的孕体处于最大的变动之中，它通过无数的变化重新创建了人类的蓝图，并为其生存建立起必需的母体联系。

在胚胎期的初期，受精卵或合子经过大量的细胞有丝分裂形成一个含有约15个小细胞的球体，称为桑椹胚，桑椹胚进入子宫，并出现了内囊腔，因而变为胚泡。胚泡由三部分组成：（1）内细胞团，可以产生胚胎;（2）胚泡腔;（3）外细胞层，也称为滋养层。在受孕后约5或6天，胚泡粘附到子宫的子宫内膜上皮，滋养层细胞侵入子宫壁。

与此同时，活性侵蚀的滋养层侵入子宫内膜基质，并且，胚泡逐步为子宫内膜包埋（同前著者，第33页）。滋养层分化为细胞滋养层和合胞体滋养层两种类型。合胞体滋养层与发育中的胚胎邻接，并成为没有可清楚辨别的细胞界限的多核原生质团（同前著者，第34页）。大约在第9天，合胞体滋养层中出现了被称为腔隙的分离空间，并不断为含有母体血液和分泌液的液体所填充。这些液体或胚胎淋巴向发育中的胚胎供给营养，标志着子宫胎盘循环的开始。最终，子宫内膜成为胎盘的母体部分，滋养层成为胎盘的胎儿部分（同前著者，第36页）。

一旦早期的胎盘循环建立起来，胚胎就开始以惊人的速度发育。到第20天，脑和脊髓开始形成。大约到22天，胚胎心脏开始跳动。到第27天，肢芽已经出现。第30天，眼和鼻子形成。第40天，手臂可进行肘部弯曲，早期的手指和耳朵出现，且胚胎仅有1公分长。

这一快速发育时期是通过至今仍不完全了解的细胞分裂和分化的精细调节程序完成的。对有关胚胎发育起始或终止标志的兴趣促使人们分析与胎盘、胚胎或胎儿组织相关的激素和细胞分裂素（cytokines）。这类研究的部分结果简要列举于下文。

两种已有过详细记载的胎盘蛋白产物是：（1）人绒毛膜促性腺激素（hCG）;（2）人绒毛生长生乳素（hCS），也称为人胎盘生乳素（hPL）（同前著者，第105页）。hCG由滋养层产生，具有防止黄体：一种产生孕酮的卵巢结构变性的作用。妊娠早期直到受孕的第8周，循环的hCG水平呈线性增加，到受孕9周至10周之间，hCG水平保持不变，此后开始下降，一直持续到分娩期。这一分泌形式被认为是正常滋养层发育的重要指征。实际上如果循环hCG水平持续增加达孕10周以上，就应怀疑滋养层瘤形成，如葡萄胎（Delf，1957，Obstet.Gynecol.9∶1）。另一方面，hCG水平过早地处于维持期和下降，一般表明早孕失败（Aspillaga  et  al.，1982，Am.J.Obstet.Gynecol.47∶903）。

Yoshida（日本专利No.59078694，1984年5月7日）报道了对胎儿或胎盘组织中被钴激活的一种物质的鉴定，该物质具有抑制形成致癌性蛋白的酶的作用。

日本专利No.2215730（1990年8月28日）报道了从人胎盘中分离细胞分裂素转化生长因子β（TGF-β）。

Massague（J.Biol.Chem.258：13614-13620，1983）报道了类似转化生长因子的表皮生长因子能与人胎盘膜上表皮生长因子受体结合。

Roberts等人（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：119-123，1985）报道了TGF-β可以从人胎盘及其它组织中分离得到。并观察到细胞对β-TGF的反应呈现双重性，即β-TGF可以刺激鼠或纤维细胞的可逆性转化，也可以通过增加细胞循环的时间来抑制正常大鼠肾成纤维细胞和人肿瘤细胞的依赖于固定点生长。

Letnansky（Immunology.175∶68，1987）报道了能特异性抑制肿瘤细胞增殖的牛胎盘蛋白的分离和特性。经SDS-PAGE推测，这种称为蜕膜抑制因子（DIF）的蛋白质分子量为约60KD。

Barnea等人（Placenta  10∶331-334，1989）报道，人胎盘提取物在头三个月能调节胎盘功能。他们观察到，特定组织的提取物能够增加或者减小hCG的分泌。尤其是发现胚胎肺的水提取物对胎盘移植体分泌hCG的产量减少了2倍。一种分子量小于8000道尔顿的蛋白质可能作为其中的活性因子，但没有纯化该因子。

Plowman等人（Mol.Cell.Biol.10∶1969-1981，1990）报道了已分离出了编码细胞分裂素amphire  gulin（AR）的基因。该细胞分裂素在进化上与表皮生长因子和α-转化生长因子（α-TGF）相关。已经观察到AR是能够起双重生长调节作用的含84个氨基酸的蛋白，它既能促进正常上皮细胞的生长，又能抑制某些癌细胞系的生长。在人胎盘和卵巢中发现能表达有效量的编码AR的RNA。预测缺乏信号肽的非糖基化AR前体的分子量为约25，942D。

在进一步了解发育的控制过程中，除了上述激素和细胞分裂素以外，一些证据还提示在哺乳动物的滋养层和胚胎之间存在相互依赖关系，羊和大鼠的胎儿死亡会导致胎盘生乳素分泌的减少（Ramsay  et  al.，Biol.Neonate  47：42，1985;Albrecht  et  al.，Endocrinol.107∶766，1984;Taylor  et  al.，Res.Vet.Sci.35∶22，1984;Robertson  et  al.，Endocrinol.114∶22，1984）。Barnea等人（同前）通过检查稀释的器官提取物在体外对hCG分泌的影响研究了胚胎内脏器官作为滋养层的功能调节剂的可能性，并发现某些馏份有抑制hCG作用。这似乎说明发育中的胚胎并不完全受控于其生长环境，相反，胚胎本身在妊娠生理学中也发挥了积极的作用。

本发明提供了可用于控制细胞增殖的妊娠因子。这至少是部分基于发现了几个由发育胚胎产生的因子，妊娠期间它们在形成调节细胞增殖和分化的校正和平衡系统中似乎发挥着重要作用。

在特定的实施方案中，本发明提供了分子量小于约10，000D，最好是小于约6，500-7，000D的基本纯化的蛋白质，它在哺乳动物的胚胎中表达产生，具有对某些癌细胞和某些胚胎细胞的抗增殖作用。这种被称为JDK蛋白的蛋白质能对被测试的所有癌细胞系发挥抗增殖作用，并发现它能防止肿瘤形成和提高用纤维肉瘤细胞接种的裸鼠的存活。本发明的抗增殖性妊娠蛋白可用于预防和治疗癌症，它还可以用作避孕剂防止受孕。

在另外的实施方案中，本发明提供了分子量小于约3，000D的基本纯化的蛋白质，它在哺乳动物胚胎组织中表达产生，对桑椹胚细胞有增殖作用。进一步还观察到，本发明这种被称为GPA-1的妊娠增殖因子能增加胚盘移植体人绒毛膜促性腺激素的分泌，从而促使桑椹胚发育为胚泡。并使之易于植入。在其它实施方案中，本发明提供了称为GPA-2的第二种妊娠增殖因子，其分子量大于20，000D。这些增殖因子可用于治疗不育症和/或低增殖性疾病。

附图说明：

图1表示从脊髓中得到的分子量小于8，000的馏份的HPLC分析结果，图中显示的是三个主带。

图2表示从脊髓中得到的分子量小于10，000的馏份的PAGE分析结果。

图3为溢流装置。其中的数字代表下列含义：

1、生长室：放置被培养的组织。

2、管道系统：硅氧烷允许气体到达管道系统。

3、热/气交换器：维持生长室内和周围的热环境。

4、气体输送：通过用所需气体灌注该系统完成。

5、进气：（5%CO₂，95%空气）。

6、热水入口：（37℃）。

7、出水口：加热交换器后的水出口。

8、开：起动泵。

9、最小值：0.01毫升/分钟

10、最大值：3毫升/分钟

11、方向：轻淡箭头的方向指示液体通过蠕动泵管道的方向。

12、流速：从00＞99表示正常泵出率的百分比。

13、此处：增加另外一个蠕动泵用以添加GnRH或一些其它因子。

14、主管道的分支。

15、培养基池。

16、蠕动泵。

图4：A.提取物中分子量＜8，000的馏份对胎盘移植体分泌hCG的抑制效应收集每2.4分钟输出的样本馏份，并按顺序编号。

B.提取物中分子量＜8，000的馏份对胎盘移植体分泌hCG的抑制效应。

C.相同于（B）中的样本在加热灭活后丧失了对hCG分泌的抑制能力。

图5.总提取物在不同稀释度下对胎盘移植体分泌hCG的抑制能力。所用提取物于0.05MTris-HclPMSF-DTT（PH7.4）稀释1/20，1/200和1/2000。用缓冲液作为对照。

图6.提取物中分子量小于8，000的馏份对癌细胞系增殖的抑制活性。以用缓冲液处理的培养物中的细胞数作对照。

图7.增加分子量＜8，000馏分蛋白的剂量产生的作用用对MCF-7增殖的抑制百分率表示

图8.胚胎提取物对体外小鼠胚胎发育的抑制效应。

A.到达桑椹胚期的未经处理的对照胚胎的百分率。

B.表现出孵化/粘连的未经处理对照胚胎的百分率。

图9.不同分子量的提取物馏份对用纤维肉瘤接种的裸鼠存活的影响，其中：

馏份1相当于分子量＜3，000;

馏份2相当于分子量＜30，000;

馏份3相当于分子量＜8，000;

馏份4相当于分子量＜10，000;

馏份5相当于分子量＜100，000;

馏份6相当于经缓冲液处理的对照。

图10.胚胎提取物中分子量＜3，000的馏份可提高胎盘移植体分泌hCG。

图11.分子量小于3，000D，与增殖活性相关的馏份的HPLC分析结果。

本发明提供了可用于控制细胞增殖的妊娠因子。它所基于，至少是部分基于的理论是，妊娠的进行，打个比方说，就象可逆性癌症一样。孕体的产物与癌症相似，可以侵入、渗透到循环系统并进行转移，可以表达类似的表面抗原并分泌某种癌相关性物质，如甲胎蛋白和癌胚抗原。而且，孕体与肿瘤一样，不会被机体排斥，但对保证其生存的母体相当有害。与肿瘤不相同的是，与妊娠相关的侵蚀性和耐受性在几乎所有时间里都是可逆的。

本发明的目的之一是分离出控制胚胎发育而使胚胎的增殖，侵入和分化基本上不损害母体的因子。已经发现了几种由胚胎产生因子在胚胎发育过程中起重要作用。本发明的不同实施例涉及这类因子及其用途，例如，用于治疗肿瘤和不育症，或者作为避孕剂。

为了清楚地描述而不是作为限制，本发明将分成以下几个部分进行详细说明：

（ⅰ）妊娠抗增殖因子的制备;

（ⅱ）妊娠增殖因子的制备;

（ⅲ）本发明的抗体;

（ⅳ）妊娠因子在肿瘤治疗中的应用;

（ⅴ）妊娠因子在控制不育症中的应用;

（ⅵ）本发明的其它应用。

5.1.妊娠抗增殖因子的制备

本发明提供了一种包含于哺乳动物胚胎组织提取物中的妊娠抗增殖因子，其分子量小于约10，000D。具体地说，该因子的分子量为约6，500～7，000D，称为JDK。

妊娠抗增殖因子JDK可以从任何适宜的哺乳动物胚胎中制得。因为胚胎的大小将影响所用单个器官的鉴别和分离的难易，所以最希望用的胚胎是得自较大的哺乳动物，例如但不限于人类，非人类灵长动物，马，牛，羊或猪等。如果在经正当的许可后可以从人体获得胚胎，那么所得胚胎可以是选择性或自发性流产的产物。

进一步还要求处于发育阶段的胚胎的快速发育正在发生或刚刚开始逐渐减弱。例如，对于人类，所希望用的是怀孕6周到孕9周期间的胚胎。对于非人类动物，最好用相当于人类孕6周到孕9周时期的胚胎。

胚胎的任何器官都可以选用。在本发明的最佳实施方案中，优先选用脑、脊髓（例如神经元）或肾上腺。内脏器官，如肺，肝或肾也是合乎需要的。

本发明的妊娠抗增殖因子JDK可以根据以下具体的，非限定性实施方案进行制备。

将胚胎组织捣碎，置入含10mM二硫苏糖醇（DTT）和2mM苯甲磺酰氟（PMSF）的冷Tris-HCl（PH7.4）中，然后于冰上超声处理约60秒，再以约2400rpm离心约10分钟去除细胞碎片。例如，起始量为50mg的胚胎组织可以在约1ml缓冲液中处理，产生约1ml的上清液。然后根据分子量的不同，应用例如Filtron  system  Omega  Cell（Biolab），直径为30mm，在通氮气的条件下将从离心物质中获取的上清液分离成不同的馏份。含分子量小于10，000D的馏份是需要得到的，最好用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进一步纯化该馏份。将所得的相应于分子量为约3，000～8，000D，最好是6，500～7，000D的凝胶部分与其余凝胶分离开，经洗脱产生妊娠抗增殖因子JDK。另外，该馏份也可用在下文6.1.3.部分描述的HPLC进行进一步纯化，如图1所示，上述过程可产生所期望的三条主带。

因此，本发明提供了一种基本纯化的蛋白质，其分子量小于10，000D，最好是约6，500～7，000D，它在哺乳动物的胚胎组织中正常表达，对某些肿瘤细胞和某些胚胎细胞有抗增殖作用。事实是哺乳动物的胚胎中“正常表达”的产物并不同于所描述的蛋白质的基本纯化形式，因为没有正常地（如自然地）产生基本纯化形式的蛋白质。

本发明进一步提供了如上文所述的基本纯化的蛋白质，即相当于由图1所示的色谱分析中峰Ⅰ，峰Ⅱ或峰Ⅲ组成的蛋白质。

本发明的妊娠增殖因子或JDK也可以用现有技术中的其它已知方法制得，包括但不限于化学合成或DNA重组技术。而且，本发明提供了JDK的片段或衍生物的制备和应用，包括通过化学法，重组DNA或蛋白酶活性产生片段，以及通过诸如糖基化、磷酸化、去磷酸化或将任何化合物与JDK或其片段进行化学连接而获取衍生物。本发明还提供了一种与JDK至少有70%同源性的相关蛋白，但它只在非人类胚胎中正常表达。

至少可以测出部分JDK蛋白的序列，如此所得的氨基酸序列可用以推测出寡核苷酸探针，后者可直接用于筛选重组DNA文库，或用于聚合酶链反应中以获得编码JDK的核苷酸序列。用标准技术将这些序列插入到合适的表达载体系统中进行大量表达。此外，JDK可经化学合成方法或本领域内已知的其它方法生产。

5.2.妊娠增殖因子的制备

本发明提供了一种称为GPA-1的妊娠增殖因子，它存在于胚胎组织提取物中，分子量小于约3，000D，最好是约1，500～2，000D。除了要求胚胎是处于相应于人孕6周的发育期外，上文中5.1.部分所介绍的合适胚胎组织来源均可以选用。

可根据以下本发明具体的、非限定性实施方案制备GPA-1。将胚胎组织捣碎，置于含10mM二硫苏糖醇（DTT）和2mM苯甲磺酰氟（PMSF）的冷Tris-HCl（PH7.4）中，然后于冰上超声处理约60秒，再以2400rpm离心约10分钟除去细胞碎片。例如，称得初量为50mg的胚胎组织，可于约1ml缓冲液中处理，产生约1ml上清液。将离心后获得的上清根据分子量的不同，应用例如Filtron  System  Omega  Cell（Biolab），直径30mm，在通氮气的条件下分离出不同的馏份。含分子量小于3，000D的馏份是希望得到的。这一馏份最好用聚丙烯酰胺凝胶作进一步的纯化。将对应于分子量小于3，000D的凝胶部分与其余的凝胶分离开来，经洗脱产生妊娠增殖因子GPA-1。参见下文的第8部分。

鉴此，本发明提供了一种基本纯化的GPA-1蛋白质，其分子量小于约3，000D，并在哺乳动物胚胎组织中正常表达，对桑椹胚细胞有增殖效应。在优选实施方案中，该蛋白的分子量大于1，400D，在最优选的实施方案中，其分子量为约2，000D。在胎盘移植体中GPA-1可以增加hCG的分泌，以及促使桑椹胚发育成胚泡，还能有利于移植。

本发明进一步提供了称为GPA-2的第二种妊娠增殖因子，其分子量大于20，000。

5.3.本发明的抗体

根据本发明，妊娠增殖因子（如GPA-1和GPA-2）和妊娠抗增殖因子（如JDK）或其活性片段或其衍生物可作为免疫原制备抗体。

为了提高产生免疫反应的可能性，可对妊娠因子的氨基酸序列进行分析，以鉴定出与提高免疫原性有关的分子部分。例如，用计算机分析氨基酸序列以鉴定表面抗原决定簇。此外，可以比较所推导出的不同种的妊娠因子的氨基酸序列，鉴别相对的非同源区域;这些非同源区更可能具有种间交叉的免疫原性。

为了制备直接针对本发明抗原的单克隆抗体，可以应用任何通过连续培养细胞系生产抗体分子的技术。例如，由Kohler和Milstein（Nature  256∶495-497，1975）首创的杂交瘤技术，以及trioma技术、人B细胞杂交瘤技术（Kozbor  et  al.，Immunology  Today4∶72，1983）和EBV杂交瘤技术生产人单克隆抗体（Cole  et  al，1985，in“Monoclonal  Antibodies  and  Cancer  Therapy，”Alan  R.Liss，Inc.p77-96）等都在本发明的范围之内。

单克隆抗体可以是人单克隆抗体或嵌合性人-鼠（或其它种）单克隆抗体。人单克隆抗体可以用本领域内已知的许多方法制备（例如：Teng  et  al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80∶7308-7312;Kozbor  et  al.，1983，Immunology  Today  4∶72-79;Olsson  et  al.，1982，Meth.Enzymol.92∶3-16）。所制备的嵌合性抗体分子可含有鼠抗原结合区和人的不变区（Morrison  et  al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81∶6851;Takeda  et  al.，1985，Nature  314∶452）。

现有技术中已知的各种方法都可以用于生产针对本发明抗原的抗原决定簇的多克隆抗体，为了制备抗体，可通过注射抗原或其片段或其衍生物来免疫接种不同的宿主动物，这些动物包括但不限于兔、小鼠、大鼠等。多种佐剂可用以增强免疫反应，根据宿主的种类不同，所用佐剂包括但不限于弗氏佐剂（完全和不完全）、矿物胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磷脂，普卢兰多元醇、聚阴离子、肽类、油性乳化剂，锁眼

血蓝蛋白，二硝基苯酚以及可能用于人体的佐剂如BCG（卡介苗）和棒状杆菌。

抗体分子可用已知技术纯化，如用免疫吸附或免疫亲和层析法，色谱法如HPLC（高效液体色谱）或者将上述方法结合起来应用等。

含有分子独特型的抗体片段可用已知技术生产。例如，这类片段包括但不限于经胃蛋白酶消化抗体分子产生的F（ab′）₂片段;经还原F（ab′）₂片段的二硫键产生的Fab′片段;以及用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子所得的2Fab或Fab片段。

5.4.妊娠因子在肿瘤治疗中的应用

本发明提供了一种抑制肿瘤细胞增殖的方法，它包括将所说的肿瘤细胞暴露于有效浓度的妊娠抗增殖因子（JDK）中。在本发明的优选实施方案中，妊娠抗增殖因子是按上文5.1.部分描述过的基本纯化的蛋白质或其同类物。

本发明提供的对肿瘤患者的治疗方法包括给患者施用结合了合适药用载体的有效剂量的妊娠抗增殖因子JDK。在本发明的优选实施方案中，妊娠抗增殖因子是如上文5.1.部分描述的基本纯化的蛋白质。

本发明可用以抑制各种类型肿瘤细胞的增殖以治疗许多不同种肿瘤。在下文第7部分的例证中观察到，JDK对所有试验的肿瘤细胞系均有抑制增殖的作用，这表明JDK无论在体外还是体内都有广谱的抑制活性。据此，本发明可用于抑制产生于任何组织的肿瘤细胞，它包括但不限于乳房、骨髓、淋巴系统、卵巢、肾、肺、脑、肠、胃、食管、胰、脊髓、粘膜、胚细胞、骨、肌肉、皮肤（如黑色素瘤）等等。本发明可用于治疗产生于患者体内任何组织的肿瘤，它包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、肾癌、肺癌、脑肿瘤、肠癌、骨髓瘤、淋巴系统的肿瘤、胃癌、食管癌、胰腺癌、脊髓瘤、粘膜肿瘤、胚细胞肿瘤、骨瘤、肌肉瘤、皮肤瘤（如黑色素瘤），绒毛膜癌等。

JDK的有效浓度可以定义为在下文  第7部分所给出的条件下抑制相应于未处理对照的10%的MCF-7细胞增殖的任何浓度。在用于治疗患者的JDK的有效量定义为能在所治疗的组织中产生有效浓度的JDK的剂量。

根据本发明的治疗方法，JDK可经任何已知途径施用，它包括但不限于通过静脉内、皮下、肌内注射至肿瘤内，或通过其它局部注射、鼻内、眼内、腹膜内或口服给药等。而且，JDK还可以与抗体等其它分子联用或与磁珠联用以形成靶释放。JDK可以通过固态或半固态植入物形式施用，如缓释植入物。JDK可以掺入到微胶囊、微球体或脂质体中使用。此外，JDK还可以与抗体等其它分子联用或与磁珠联用以形成靶释放，如果是口服给药的话，就需要提供一种防止JDK在胃中变性的介质。

根据本发明，使合适的药用载体是对人体相对无毒性的，并能维持JDK的活性。合适的载体包括但不限于水、盐水、磷酸缓冲盐液、葡萄糖等。

5.5妊娠因子在控制生育力中的应用

根据本发明，妊娠抗增殖因子（如JDK）可用作避孕剂，而妊娠增殖因子（如GPA-1和/或GPA-2）可用于增强生育力和保护早孕。

本发明提供了一种避孕方法，它包括给雌性受治疗者施用结合了合适药用载体的有效量的妊娠抗增殖因子JDK。在本发明的优选实施方案中，妊娠抗增殖因子JDK是一种基本纯化的蛋白质。

本发明进一步还提供了一种增强受治疗者生育力的方法，包括给受治疗者施用有效量的结合了合适药用载体的妊娠增殖因子如GPA-1和/或GPA-2。在本发明的优选实施方案中，妊娠增殖因子是基本纯化的蛋白质。

受治疗者可以是任何人或非人类哺乳动物。本发明对生育力的促进作用尤其可用于改善家畜的生育力。

在涉及避孕的实施例中，规定的妊娠抗增殖因子的有效量是指，施用该剂量后至少在受治疗者的部分生殖器官中所能达到的浓度相当于在第7.1.3.部分所描述的条件下，使相当于未处理对照的约50%的小鼠胚胎桑椹胚的发育受到抑制所需的浓度。

在涉及生育力的实施例中，规定的妊娠增殖因子的有效量是指施用该剂量后在受治疗者的至少部分生殖器官中达到的浓度相当于在下文第8部分所描述的条件下，使发育成胚泡的桑椹胚数目至少增加相当于未治疗对照组的50%所需的浓度。

生育力控制因子可经如上文第5.4部分所描述的本领域中已知的方法施用。

根据本发明，可以用的合适药用载体对于宿主相对是无毒性的，并能保持所用因子的活性，包括上文第5.4.部分中所述的载体。

在本发明更进一步的实施方案中，针对妊娠增殖因子（例如GPA-1和/或GPA-2）的抗体可用于避孕方法中。本发明提供了一种避孕方法。它包括给雌性受治疗者施用与妊娠增殖因子结合的有效量抗体。在另外的实施方案中，本发明提供的避孕方法包括用一种含有妊娠增殖因子的免疫原制剂免疫接种雌性受治疗者。这类免疫原组合物可含有一种佐剂，如弗氏完全佐剂，并希望含有与免疫原化合物结合的妊娠增殖因子，或含有从不用于被免疫的受治疗者的物种中获得的妊娠增殖因子。应该注意的是，这种免疫接种可导致不可逆的避孕。

5.6本发明的其它应用

在本发明的其它实施方案中，妊娠抗增殖因子可用于治疗细胞增殖的增强引起的紊乱，包括但不限于恶化前的状态，瘢痕疙瘩，Von  Recklinghausen病，家族性息肉病，良性瘤（例如乳腺瘤），自身免疫性疾病如风湿性关节炎等等。

在本发明进一步的实施方案中，妊娠增殖因子（例如GPA-1和/或GPA-2）可用于治疗细胞增殖减弱的疾病，例如，歇火性（burntout）骨髓增殖紊乱，恶性贫血，Sjogren′s综合症等。妊娠增殖因子也可用于处理需要增强细胞增殖的情况。例如，用于替代被梗塞，感染，损伤或暴露于毒剂所损害的细胞（例如，心肌梗塞形成后的心肌，因梗塞、感染、损伤或暴露于毒剂而损害或丧失的神经系统组织，被疾病或暴露于毒剂而损害的骨髓、被损害或丧失的皮肤如烧伤病人）。在本发明具体的，非限定性实施方案中，妊娠增殖因子可用于促进肝脏再生。在本发明另外一个具体的非限定性实施方案中，妊娠增殖因子可用于使被移植的组织易于掺入到受治疗者中。在本发明又一个具体的非限定性实施方案中，妊娠增殖因子可用于促进伤口愈合和/或毛发生长。

本发明的妊娠因子可在体内或体外应用。例如，但不限于，GPA-1和/或GPA-2可用于促进培养的细胞或组织生长。

6.实施例  妊娠抗增殖因子JDK的制备

6.1.  材料和方法

6.1.1.  提取

在获经允许后，无菌条件下从中止怀孕的孕体中将孕9周的人胚胎同其它胎儿产物分离，并根据试验者的最后一次月经期以及顶臀长度的测量值来验证孕龄，其实验误差为±3天，胚胎器从胚胎上解剖下来，并用解剖显微镜鉴别，然后置于冰上。以后的所有步骤均在4℃下进行。

包括肺、肝、肾、肾上腺和/或神经器官如脊髓和脑的内脏器官置于0.5MTris-HCl缓冲液（pH7.4），10mM二硫苏糖醇（DTT）和2mM苯甲磺酰氟（PMSF）中于冰上超声处理，然后离心（2，400rpm×10分钟）进行提取。用乙醇提取会导致产物活性降低约3倍。

6.1.2  不同分子量馏份的制备

利用Filtron  System  Omega  Cell（Biolab  Labs，直径30mm），在通氮气的条件下，利用含DTT和PMSF的PBS缓冲液将由上文（A）中从胚胎脊髓获得的提取物通过不同分子量（M.W）的滤膜进行过滤。每1ml提取物与30ml缓冲液过滤。将收集的提取物冻干，沉淀悬浮于蒸馏水中，贮于-20℃。

制备下列馏份：＜100，000，＜30，000，＜10，000，＜8，000和＜3，000（所用的“＜”符号为常规用法，指的是馏份的分子量小于所说的分子量）。用Barnea和Kaplan描述的溢流模型（J.Clin.Endocrinal.Metab.69∶215-217，1989）测定所有馏份对胚胎移植体产生HCG的调节能力（参见下文第7部分）。仅发现分子量小于10，000的馏份具有生物活性。

6.1.3  高压液相色谱分析

用Hitachi HPLC装置和25cmRP-18柱于25℃对分子量小于8，000的脊髓提取物馏份进行高压液相色谱（HPLC）分析。样本置于水中，用40%H₂O，60%CH₃OH以1ml/分钟的流速进行洗脱。

约50mg组织于含有10^-3MPMSF和2mMDTT的0.5ml 0.2MTris-HCl缓冲液中（pH7.4）作超声处理后离心（20，000rpm），所得上清液用0.2μm的滤器过滤。往已用相同缓冲液平衡过的HPLC柱（Superdex 75HR10/30，LKB，Pharmacia）中上样（16mg蛋白质（335μl）/ml）。在0.5ml/分的流速时收集每份0.5ml的样本，应用前一直冻存于-70℃。用已知分子量的蛋白质停留时间来估计不同馏份的分子量。

6.1.4  聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

用12.5%的凝胶对分子量小于10，000的馏份作聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。应用标准技术将所得凝胶用考马斯亮蓝染色。

6.2  结果和讨论

将根据上文所述制备的不同胚胎器官的提取物按分子量不同进行分离，仅发现分子量小于10，000D的馏份能改变胎盘移植体HCG的产量。

对分子量小于8，000的馏份进行HPLC分析所见到的三个峰显示于图1中。同样，对来自脊的分子量小于10，000的馏份作PAGE分析，如图2所示，三条主带出现于分子量约3，000～8，000D之间。进一步的HPLC分析表明，称为JDK的妊娠抗增殖因子的分子量显示为约6.43KD。

7.实施例  JDK对胎盘移植体分泌HCG的抑制效应，对肿瘤细胞的抗增殖作用和对胚胎发育的抑制作用

7.1  材料和方法

7.1.1  对根据分子量不同分离的提取物抑制胚胎移植体分泌hCG的分析

为了测定抑制活性，按照Barnea和Kaplan（1989，J.Clin.Endocrinol.69∶215-217）描述的方法，用带有一个多通道蠕动泵的溢流装置（Accusyst，Endotronics，St.Paul.MN）（图3）和馏份收集器（272型），ISCO，Durham，NC）对人绒毛膜性腺激素（hCG）的分泌进行短期动力学研究。将胚盘移植体（200-300mg湿重）置于培养室中，通入含5%CO₂和95%空气的气体，在37℃用18mMHEPES/DMEM溶液洗涤。以每分钟脉冲一次的速度将相应于特定分子量馏份的样本上样，从而在平行条件下对所有馏分进行分析。实验进行120分钟。第2.4分钟从溢流设备的洗脱液中收集1ml样品，进行放射免疫试验检测hCG。在这批实验中，以一个管道作对照，4个作试验管道。在给定的时间间隔期，将所测试馏分水溶液的一分钟脉冲传送到连有数字流量计（Ismatech.DD.Chicago，IL）的蠕动泵中。那些在脉冲加样后引起hCG分泌发生显著变化的馏份被认为是“活性样体”。

7.1.2  测试JDK对癌细胞系的作用活性

将用于试验的细胞系（从美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland得到），一种乳腺细胞系MCF-7（保藏号为HTB22），一种乳腺细胞系HBL-40（保藏号为HTB124）与SV40病毒接触。所用其它细胞系包括肾细胞系CRL和卵巢细胞系GNL。

在含10-15%胎牛血清的RPMI-1640中培养细胞，0.5ml体积中浓度为10，000细胞/ml。培养在37℃，95%空气/5% CO₂的气体中进行。从分子量小于8，000和小于10，000的馏份中提取10～50微升样品，相当于蛋白质浓度为0.2～1.0μg/ml加入到上述培养物中以估测剂量效应。每一种细胞系用2个对照培养物。第一个为未经处理的培养物，第二个对照培养物中加入了50μlTris-HCl。提取物仅在实验开始时加到培养物中。3～5天后，用自动细胞计数器计算细胞数目。

7.1.3  JDK在体外对胚胎发育影响的分析

ICR株小鼠得自Charles  River实验室。

雌性小鼠（鼠龄为6～7周）与雄性小鼠（鼠龄为10～12周）交配。72小时后杀死雌性小鼠，通过用HAM-F1冲洗输卵管而取出桑椹胚期的胚胎。然后，将胚胎置入含10%新生索的血清的EBSS培养基中，维持于潮湿的，含95%空气/5%CO₂的气体中。为了对滋养层发育进行研究，事先将培养皿用1mm厚的胶原包被。

7.1.4  提取物片段对用纤维肉瘤接种的裸鼠存活影响的分析

用亚致死性X射线辐射处理成年Balb/c小鼠，损害其形成免疫反应的能力。用经皮下接种了纤维肉瘤细胞系的10⁵个细胞的小鼠进行实验。每个实验用5只小鼠，并用5只没有接种的小鼠作为实验对照。此外，在肿瘤接种后，马上给被接种的小鼠注射如上文所述获得的不同分子量馏份的蛋白样物质50μl（约1μg/ml）。然后，将动物置于无菌环境中，任意喂食，每周检查一次。3周后杀死小鼠，检查是否存在肿瘤。

7.2  结果和讨论

7.2.1  含有分子量小于10，000D的提取物馏份分子抑制胎盘移植体HCG的分泌

当胎盘移植体暴露于分子量分别为＜100，000，＜30，000，＜10，000，＜8，000，＜3，000D的胚胎提取物馏份时，观察到只有分子量小于10，000D的那些馏份能抑制hCG分泌。分子量小于10，000D的馏份显示出了比分子量小于8，000的馏份更低的抑制活性，而分子量＜3，000的馏份表现出了刺激活性。

图4A显示提取物抑制hCG分泌的能力。如图4B和图4C所示，短时间脉冲分子量小于8，000的馏份对hCG分泌的抑制能力（图4B）于57℃热灭活而丧失（图4C），这表明JDK具有热不稳定性。

图5说明经1/2000稀释的提取物（相应蛋白质浓度约为100ng/ml），仍能达到相对于对照组50%的抑制效应。

7.2.2  JDK体外抑制癌细胞系的生长

将分子量＜8，000和＜10，000的胚胎提取物馏份50μl等份样本加入到上述MCF-7，CRL，HBL-40和GNL的细胞培养物中，到第3～5天末对每一个处理的培养物中的细胞计数，并与未经处理的对照培养物的细胞数（表示为100%）和只加入缓冲液的培养物（缓冲液对照）的细胞数进行比较。

如下文的表Ⅰ所示，用分子量＜8，000的馏份处理的MCF-7培养物中的细胞数是对照的11%，表明了89%的生长抑制。另一个实验中，在分子量为6.428KD提取物馏分存在下培养仅3天后，细胞增殖受到了10%（P＜0.05）的显著抑制。同样处理下列培养物：（ⅰ）CRL，所得细胞数为对照的63%，表明37%的抑制;（ⅱ）HBL-40，所得细胞数是对照的3%，表明97%的抑制;（ⅲ）GNL，所得细胞数为对照的23%，表明77%的抑制。有意义的是，分子量＜10，000的馏份仅对MCF-7培养物表现出了明显的抑制。这反映出有能够限制活性馏份对其它细胞系发挥作用的化合物存在。

类似实验的其它结果示于图6中。在这一实验中，提取物对CRL细胞系比对示于表Ⅰ的实验中的CRL细胞系有更显著的效应;这可能是提取物本身的异质性或每次实验前细胞的增殖状态的作用。

下文的表Ⅱ和图7说明了分子量＜8，000的提取物馏份对培养的MCF-7细胞抗增殖效应的剂量依赖性。当使用蛋白浓度相当于0.2μg/ml的10μl提取物时，可检测出细胞数目的减小。应用相当于蛋白浓度为1.0μg/ml的50μl提取物时，细胞数减少达最大。

表Ⅱ

处理  减少的百分数目

未处理的对照  0

缓冲液对照  3

10μl<8,000提取物(蛋白浓度0.2μg/ml)  36

25μl<8,000提取物(蛋白浓度0.5μg/ml)  52

50μl<8,000提取物(蛋白浓度1.0μg/ml)  89

7.2.3  提取物JDK对小鼠体外胚胎发育的抑制效应

如图8所示，用分子量小于8，000的提取物馏分的JDK处理过的小鼠胚胎与未经处理的对照胚胎相比发育不正常。经提取物处理的胚胎达到桑椹胚阶段的数目仅是未处理对照的12%（图8A），经提取物处理的显示孵化/粘连（由光镜检测）的胚胎数目，仅是未处理对照的7%（图8B）。这与JDK的抗增殖活性一致，而且是JDK作为避孕剂的佐证。

7.2.4  用JDK处理接种过纤维肉瘤的裸鼠显示出存活性得到改

善和肿瘤形成减少

给30只裸鼠接种纤维肉瘤细胞，并把它们等分为5只小鼠一组，共6组。5只未接种的小鼠作为阴性对照。其中一组接过种的小鼠仅用Tris-HCl缓冲液处理，其余的5组小鼠分别用分子量＜3，000;＜8，000;＜8，000;＜10，000;＜30，000的提取物馏份50μl（约1μg/ml）处理。如表Ⅲ所示，在用分子量＜8，000的馏分处理组中5只小鼠均没发生肿瘤。另外一个含有无肿瘤形成动物的实验组是接受分子量＜8，000馏份处理的组（5只小鼠中有2只无肿瘤形成）。在其余的组中，肿瘤发生于接种部位。

表Ⅲ

处理  没有肿瘤形成

不处理(对照)  5/5

PBS缓冲液  0/5

<3,000  0/5

<8,000  5/5

<8,000  2/5

<10,000  0/5

<30,000  0/5

在一类似的实验中，对接种了纤维肉瘤的小鼠然后不经处理或用不同分子量的提取物馏份处理后的存活情况进行了为期3周的评价，三周之后以小鼠存活数来测定存活情况。接种了肿瘤细胞的小鼠在接受了相当于分子量＜8，000的提取物馏分3处理后所显示出的存活情况与那些未经肿瘤接种的小鼠的存活相当。

8.  实施例  活性妊娠增殖因子的制备

8.1  材料和方法

8.1.1  含妊娠增殖剂提取物的制备

于含10mMDTT和2mMPMSF的冷Tris-HCl（PH7.4）中捣碎胚胎脊髓，将捣碎的组织置于冰上超声处理约1分钟，然后以约2400rpm离心10分钟，得到分子量＜3，000的馏份。在通氮气条件下利用Filtron  System  Omega  Cell（Biolab）测量离心得到的上清液中分子的大小，收集分子量＜3，000D的馏份。

8.1.2  小鼠胚胎的制备

ICR一株小鼠得自Charles River Laboratory。雌性小鼠（鼠龄为6～7周）与雄性小鼠（鼠龄为10～12周）交配。约72小时后杀死雌性小鼠，用HAM-F、冲洗输卵管取出桑椹胚期胚胎。然后将胚胎置于含10%新生索血清的EBSS培养基中，并保持于潮湿、含95%空气/5%CO₂的气体环境。为了进行滋养层发育的研究，培养皿预先用1mm厚的胶原包被。

8.1.3  提取物对胎盘移植体分泌HCG的作用的分析

用上文第7.1.1部分描述的溢流装置评估分子量＜3，000的提取物对胎盘移植体分泌hcG的影响。

8.1.4  高效液相色谱分析

HPLC分析按第6.1.3部分所述进行。见图11。

8.2  结果和讨论

8.2.1  GPA-1引起胎盘移植体分泌hCG增加

已观察到，提取物中含有称为GPA-1蛋白的、分子量＜3，000的馏份能够增加胎盘移植体hCG的分泌。正常情况下，hCG是由胎盘移植体以相对稳定的频率自发脉动式分泌的。当分子量＜3，000的馏份通过溢流装置以每分钟一次的脉冲施用于胚胎移植体时，可观察到hCG的分泌有显著增加（如图10）。这可由记录了用分子量＜3，000馏份处理的溢流装置的通道的曲线下面积相对于对照通道增加了4倍加以证实。相反，没有观察到分子量＜100，000，＜50，000和＜30，000的馏份对hCG分泌的影响。值得注意的是，用57℃热灭活30分钟的分子量＜3，000的馏份处理移植体对hCG分泌没有影响。此外，用活性炭/葡聚糖（也用于提取类固醇）提取的馏份也丧失了活性。

8.2.2  GPA-1促进桑椹胚的发育

用分子量＜3，000馏份（GPA）处理并发育成熟形成胚泡的桑椹胚数比仅用缓冲液处理的桑椹胚形成胚泡的数目多3倍。这一结果见于用10μlGPA-1（蛋白质含量约为0.2μg/ml）处理桑椹胚的情况。进行为期48小时的检测发现。将胚胎暴露于含50μlGPA-1的馏份可看到通过两个相对于对照的因素中的一个而提高了胚泡的存活性。

热灭活的GPA-1对桑椹胚的发育没有影响。

8.2.3GPA-1促进滋养层的发育

当用胶原包被的培养皿研究滋养层的发育情况时，发现由正常对照在24小时内达到的同等发育水平在经含有GPA-1馏份处理的胚胎仅在14小时内就能达到。这一发育变化包括滋养层粘连到胶原表面和分化的滋养层细胞透入胶原中。这一在体外被GPA-1所加速的过程相应于体内的植入过程。这表明GPA-1可使植入变得容易，因此增强了人类的生育力。

说明书中引用的各种公开文献全部引为参考文献。

Claims (35)

1、一种基本纯化的蛋白质，其分子量小于约10，000D，并在哺乳动物胚胎组织中正常表达，对某些癌细胞有抗增殖作用。

2、一种基本纯化的蛋白质，其分子量小于约10，00D，并在哺乳动物胚胎组织中正常表达，对某些胚胎细胞有抗增殖作用。

3、权利要求1的基本纯化蛋白质，其分子量为约6，300～6，600D。

4、权利要求2的基本纯化蛋白质，其分子量为约6，300～6，600D。

5、权利要求1的基本纯化蛋白质，它对应于图1中色谱的峰Ⅰ所包含的蛋白质。

6、权利要求1的基本纯化蛋白质，它对应于图1中色谱的峰Ⅱ所包含的蛋白质。

7、权利要求1的基本纯化蛋白质，它对应于图1中色谱的峰Ⅲ所包含的蛋白质。

8、一种具有由下列方法制备的蛋白质特性的基本纯化的蛋白质，其中的方法包括：

（a）从哺乳动物胚胎中分离内脏器官或神经器官或同时分离上述两种器官，置于含10mM二硫苏糖醇和2mM苯甲磺酰氟的Tris-HCl（pH7.4）中于冰上超声处理，接着于2400rpm离心10分钟，并收集上清液;

（b）从上清液中筛选分子量小于10，000D的分子至一个馏份;

（c）用RP-18柱对馏份进行高压液相色谱分析，所用的洗脱缓冲液是40%水和60%甲醇的混合物;

（d）收集来自HPLC柱中相应于图1中峰Ⅰ的物质。

9、一种具有由下列方法制备的蛋白质特性的基本纯化蛋白质，其中方法包括：

（a）从哺乳动物胚胎中分离内脏器官或神经器官或同时分离上述两种器官，置于含10mM二硫苏糖醇和2mM苯甲磺酰氟的磷酸缓冲盐水（pH7.4）中，于冰上超声处理，再于2，400rpm离心10分钟，收集上清液;

（b）从上清液中选择分子量低于10，000D的那些分子至一个馏份中;

（c）用RP-18柱对馏份进行高压液相色谱分析，所用的洗脱缓冲液是40%水和60%甲醇的混合物;

（d）收集来自HPLC柱的相应于图1中峰Ⅱ的物质。

10、一种具有某种蛋白质特征的基本纯化蛋白质的制备方法，它包括：

（a）从哺乳动物胚胎中分离内脏器官或神经器官或同时分离上述两种器官，置于含10mM二硫苏糖醇和2mM苯甲磺酰氟的磷酸缓冲盐水（pH7.4）中，于冰上超声处理，再以2400rpm离心10分钟，收集上清液;

（b）从上清液中选择那些分子量小于10，000D的分子至一馏份中;

（c）用RP-18柱对馏份进行高压液相色谱分析，所用的洗脱缓冲液是40%水和60%甲醇的混合物;

（d）收集来自HPLC柱的相应于图1中峰Ⅲ的物质。

11、一种抑制癌细胞增殖的方法，它包括将所说的细胞暴露于有效浓度的权利要求1的基本纯化蛋白质。

12、一种抑制癌细胞增殖的方法，它包括将所说的细胞暴露于有效浓度的权利要求3的基本纯化蛋白质。

13、一种抑制癌细胞增殖的方法，它包括将所说的细胞暴露于有效浓度的权利要求5的基本纯化蛋白质。

14、一种抑制癌细胞增殖的方法，它包括将所说的细胞暴露于有效浓度的权利要求6的基本纯化蛋白质。

15、一种抑制癌细胞增殖的方法，它包括将所说的细胞暴露于有效浓度的权利要求7的基本纯化蛋白质。

16、一种治疗癌症患者的方法，它包括给患者施用有效量的结合了合适药用载体的权利要求1的基本纯化蛋白质。

17、一种治疗癌症患者的方法，它包括给患者施用有效量的结合了合适药用载体的权利要求3的基本纯化蛋白质。

18、一种治疗癌症患者的方法，它包括给患者施用有效量的结合了合适药用载体的权利要求5的基本纯化蛋白质。

19、一种治疗癌症患者的方法，它包括给患者施用有效量的结合了合适药用载体的权利要求6的基本纯化蛋白质。

20、一种治疗癌症患者的方法，它包括给患者施用有效量的结合了合适药用载体的权利要求7的基本纯化蛋白质。

21、根据权利要求16的方法，其中的患者患有乳腺癌。

22、根据权利要求16的方法，其中的患者患有卵巢癌。

23、根据权利要求16的方法，其中的患者患有肾癌。

24、一种抑制癌细胞增殖的方法，它包括将所说的细胞暴露于由下述方法制备的提取物：

（a）于冰上超声处理下列物质的混合物：（ⅰ）得自哺乳动物胚胎的内脏器官或神经器官或上述两种器官的混合物，（ⅱ）一种生理相容性溶液;

（b）于约2400rpm离心经超声处理的产物约10分钟，收集上清液;

（c）选择分子量小于约10，000D的上清液部分，与合适的药用载体结合。

25、一种避孕方法，它包括给雌性受治疗者施用有效量的结合了适宜药用载体的权利要求1的基本纯化蛋白质。

26、一种避孕方法，它包括给雌性受治疗者施用有效量的结合于适宜药用载体的权利要求3的基本纯化蛋白质。

27、一种避孕方法，它包括给雌性受治疗者施用有效量的结合了适宜药用载体的权利要求5的基本纯化蛋白质。

28、一种避孕方法，它包括给雌性受治疗者施用有效量的结合了适宜药用载体的权利要求6的基本纯化蛋白质。

29、一种避孕方法，它包括给雌性受治疗者施用有效量的结合了合适药用载体的权利要求7的基本纯化蛋白质。

30、一种基本纯化的蛋白质，其分子量小于3，000D，并在哺乳动物胚胎组织中正常表达，对桑椹胚细胞具有增殖作用。

31、一种基本纯化的蛋白质，其分子量小于3，000D，并在哺乳动物胚胎组织中正常表达，能促进桑椹胚发育成胚泡。

32、一种基本纯化的蛋白质，其分子量小于3，000D，并在哺乳动物胚胎组织中正常表达，能增加胎盘移植体分泌人绒毛膜性腺激素。

33、一种改善受治疗者生育力的方法，它包括给受治疗者施用有效量的权利要求30的基本纯化蛋白质，该蛋白质结合了适宜的药用载体。

34、权利要求1的基本纯化的蛋白质，它在人胚中正常表达。

35、一种基本纯化的蛋白质，它在非人类胚胎中正常表达，该蛋白质与权利要求34的基本纯化的蛋白质至少约70%同源。

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