CN1075442C - 聚苯乙烯作为基底的生物敏感膜及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，在疏水性载体表面上结合一层聚苯乙烯薄膜组成生物敏感膜。其制备方法包括：在去离子水形成的平静液面上滴加聚苯乙烯氯仿溶液，待氯仿挥发后聚苯乙烯在空气/水界面形成均匀薄层，通过水平粘附的方法将该薄层转移到疏水性的载体表面。本发明不但工艺简单，成本低廉，有利于推广，而且它可以作为很好的受体蛋白载体，用此蛋白载体组成的表面等离激光生物传感器的生物酸感膜，其测量精度至少比酶联免疫检测高两个数量级。
Description
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及生物敏感膜的制备方法。
生物敏感膜是生物传感器用于生物大分子相互作用研究时受体大分子的载体。敏感膜的性质与其表面装配的受体分子数量和活性直接相关，并最终影响传感器的检测精度。而且，敏感膜的制做成本也关系到生物传感技术能否广泛应用。以表面等离激元共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)生物传感器为例，此前SPR敏感膜主要是盖玻片上直接溅射金膜，由于金膜会使多种蛋白失活，严重影响测量精度，甚至不能检测很多蛋白间的相互作用而导致实验无法进行或产生错误。因而此方法已逐渐淘汰，取而代之的是金膜上偶联葡聚糖作为基底的敏感膜制备方法。使用前将葡聚糖活化，然后将蛋白分子化学偶联到基底表面。这种方法蛋白失活少，基本避免了非特异性吸附，可以很好地用于生物大分子相互作用的研究。然而，它们制做不便、成本高昂、不易保存，影响了广泛应用。鉴于以上原因，开发一种经济实惠、方便实用的生物敏感膜成为一项亟待解决的课题。
本发明的目的在于为克服已有技术的不足之处，提出一种聚苯乙烯生物敏感膜及其制备方法，不但工艺简单，成本低廉，有利于推广，而且它可以作为很好的受体蛋白载体，其SPR测量精度至少比酶联免疫检测(ELISA)高两个数量级。
本发明提出的聚苯乙烯生物敏感膜，其特征在于在疏水性载体表面上结合一层聚苯乙烯薄膜而成。所说的疏水性载体表面为经疏水化处理的盖玻片、硅片表面，盖玻片上溅射的金膜表面等。
本发明提出的聚苯乙烯生物敏感膜的制备方法，包括以下步骤：
1) 在槽中灌注一定量的去离子水形成平静液面；
2) 然后在液面上滴加适当浓度的聚苯乙烯氯仿溶液，静置；
3) 待氯仿缓慢挥发后聚苯乙烯在空气/水界面形成均匀薄层；
4) 将疏水性载片水平下降粘附于空气/水界面的聚苯乙烯薄层上，然后垂直提起，
从而把聚苯乙烯薄层转移到疏水性的载体表面。晾干，4℃保存备用。所说的
聚苯乙烯氯仿溶液浓度为0.2-0.5mg/ml。所说的转移次数至少为两次。
具体过程如图1所示。
本发明在比较不同浓度的聚苯乙烯氯仿溶液在气液界面的铺展过程发现，溶液在界面的铺展速率与其浓度成反比，溶液中的氯仿在溶液铺展过程中不断挥发，氯仿完全挥发后溶液铺展将停止。浓度大于0.5mg/ml的溶液因氯仿完全挥发时间早于完全铺展时间，导致聚苯乙烯不能均匀铺展于气液界面。而浓度低于0.2mg/ml的溶液要形成同样的聚苯乙烯膜需要加入的量更多。因此，本发明选用浓度为0.2-0.5mg/ml的聚苯乙烯氯仿溶液。
滴加时用微量进样器多点逐滴缓慢加入，应避免液滴过大沉下水面。滴加结束后静置待氯仿完全挥发即可进行转移。
实验结果表明，水平转移一次覆盖率约为60％，水平转移两次覆盖率可达90％。两次水平转移后聚苯乙烯薄层基本覆盖载体表面，本发明工艺中转移次数至少为两次。
本发明通过聚苯乙烯生物敏感膜的制备工艺介绍和比较聚苯乙烯敏感膜为受体蛋白载体的SPR测量和酶联免疫检测的结果，可以得出如下结论：
第一．聚苯乙烯生物敏感膜制备工艺简单，成本低廉，有利于推广。
第二．利用聚苯乙烯生物敏感膜为受体蛋白载体的SPR测量精度至少比酶联免疫检测高两个数量级。因而，聚苯乙烯敏感膜用于SPR测量是完全可行的，它可以作为很好的受体蛋白载体。
附图简要说明：
图1为本发明聚苯乙烯敏感膜制备工艺示意图。
图2为本实施例聚苯乙烯生物敏感膜制备工艺流程图。
图3为本实施例转移聚苯乙烯薄膜前后的SPR图谱。
图4为本实施例转移聚苯乙烯薄膜前后的表面等离激光显微镜(SPM)照片，其中图4a为裸金膜、图4b为水平转移一次、图4c为水平转移两次的表面等离激光显微镜照片。
图5为本发明所测兔抗人免疫球蛋白G(IgG)抗血清稀释102400x时的ΔθSPR随时间变化图。
图6为本发明不同浓度兔抗人免疫球蛋白G抗血清的测试结果(SPR与酶联免疫检测ELISA比较)，其中，6a为ELISA的测试结果，6b为SPR的测试结果。
本发明的一个较佳实施例结合附图详细说明如下：
本实施例聚苯乙烯生物敏感膜制备工艺是在直径为8cm的圆柱形槽中滴加溶液，在加入溶液的体积约200μl时聚苯乙烯将铺满整个气液界面(聚苯乙烯面密度为0.8-2μg/cm2)。滴加时用微量进样器多点逐滴缓慢加入，应避免液滴过大沉下水面。滴加结束后静置约5分钟，待氯仿完全挥发即可进行转移。其工艺流程如图1所示，包括以下步骤：1．在槽中加入一定量的去离子水形成平静液面；2．在液面上用微量进样器逐滴加入浓度为0.5mg/ml的聚苯乙烯氯仿溶液，直至每平方厘米液面上加入的聚苯乙烯2μg；3．槽静置，待氯仿缓慢挥发后(约5分钟)苯乙烯在空气/水界面形成均匀薄层；4．将疏水性载片水平下降粘附于空气/水界面的聚苯乙烯薄层上，然后垂直提起，将聚苯乙烯薄层转移到疏水性的载体表面，重复转移一次；5．置于干燥容器中晾干，4℃保存备用。
图3为本实施例转移聚苯乙烯薄膜前后的SPR图谱(横轴代表入射角度θ，单位0.001°；纵轴代表反射光强，单位(A/D)unit)。实线为裸金膜(水平转移前)的SPR曲线，点划线为水平转移一次后的SPR曲线，虚线为水平转移两次后的SPR曲线。水平转移一次得到的聚苯乙烯敏感膜与裸金膜相比，θSPR增大约0.4°，水平转移两次后θSPR增大约0.7°。
图4本实施例转移聚苯乙烯薄膜前后的SPM照片。从左至右依次为裸金膜(图4a)、水平转移一次(图4b)、水平转移两次(图4c)的表面等离激光显微镜照片。三次均在裸金膜的SPR共振角测量，因而裸金膜的表面等离激光显微镜图象绝大部分为暗区，由于聚苯乙烯的吸附，SPR共振角发生变化，表面等离激光显微镜图象亮区随吸附量增加而增多。中间一张照片的亮区约占60％，所以水平转移一次覆盖率为60％，同样可知水平转移两次覆盖率约为90％。
本发明所述的聚苯乙烯生物敏感膜使用举例说明如下：
类似酶联免疫检测的使用过程，可先在样品池中加入0.1M碳酸盐(NaHCO3)缓冲液(pH9.6)让聚苯乙烯膜稳定一段时间。加入受体蛋白溶液，用碳酸盐缓冲液清洗样品池，测定蛋白吸附量。由于受体蛋白不能完全覆盖整个聚苯乙烯敏感膜，为了避免配体蛋白的非特异性吸附，因而需要在加入配体蛋白前用与敏感膜吸附作用强且对所测受体配体相互作用无影响的过饱和蛋白溶液封闭裸露的敏感膜。常用的蛋白为明胶和牛血清清蛋白(BSA)。封闭后用磷酸盐(PBS)缓冲液清洗样品池。最后加入配体蛋白，用磷酸盐缓冲液清洗样品池，测定与受体蛋白作用的配体蛋白量。
本发明通过测试比较利用聚苯乙烯敏感膜的SPR仪和酶联免疫方法测定相同样品的灵敏度来确定聚苯乙烯敏感膜的性能。
选定的样品为人免疫球蛋白G和兔抗人免疫球蛋白G抗血清。先吸附上人免疫球蛋白G，然后测试不同浓度的兔抗人免疫球蛋白G抗血清，确定可以检测的抗血清最小浓度。
图5为所测兔抗人免疫球蛋白G抗血清稀释102400x时的ΔθSPR随时间变化图(横轴代表时间，单位200s；纵轴代表ΔθSPR，单位0.001°)，图中符号分别代表以下操作。
A：加入0.1M碳酸盐缓冲液
B：加入人免疫球蛋白G溶液
C：用0.1M碳酸盐清洗
D：0.3％明胶封闭
E：磷酸盐缓冲液清洗
F：加入兔抗人免疫球蛋白G抗血清溶液
G：磷酸盐缓冲液清洗图6为不同浓度兔抗人免疫球蛋白G抗血清的测试结果(SPR与酶联免疫检测比较)，其中图6a为兔抗人免疫球蛋白G抗血清不同稀释倍数的酶联免疫测试结果(横轴代表1n(兔抗人免疫球蛋白G稀释倍数)；纵轴代表490nm吸光度)，图6b为SPR测试结果(横轴代表1n(兔抗人免疫球蛋白G稀释倍数)；纵轴代表ΔθSPR，单位0.1°)。图6a中◆表示ELISA检测，+表示对照组实验。在抗血清稀释约105倍时检测组和对照组的点可明显分开，稀释倍数更大时两组点不易分辨，所以酶联免疫可检测兔抗人免疫球蛋白G抗血清稀释105倍时与人免疫球蛋白G的相互作用。图6b中抗血清稀释107倍后仍有可分辨的θSPR变化，所以SPR可以检测到稀释约107-108倍的抗血清。
Claims (3)
1．一种聚苯乙烯生物敏感膜，其特征在于在疏水性载体表面上结合一层聚苯乙烯薄膜而成。
2．如权利要求1所述的聚苯乙烯生物敏感膜，其特征在于所说的疏水性载体表面为经疏水化处理的盖玻片、硅片表面，盖玻片上溅射的金膜表面之一种。
3．一种如权利要求1所述的聚苯乙烯生物敏感膜的制备方法，包括以下步骤：
1)在槽中灌注一定量的去离子水形成平静液面；
2)然后在液面上滴加适当浓度的聚苯乙烯氯仿溶液，所说的聚苯乙烯氯仿溶液浓度为0.2-0.5mg/ml，静置；
3)待氯仿缓慢挥发后聚苯乙烯在空气/水界面形成均匀薄层；
4)将疏水性载片水平下降粘附于空气/水界面的聚苯烯薄层上，然后垂直提起，从而把聚苯乙烯薄层转移到载体表面，所说的转移次数至少为两次；
5)晾干备用。
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