CN107541527A - 一种治疗复发性hsk的双基因靶向治疗系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双基因靶向治疗系统rdHSV1‑IFNγ‑siRNA的构建方法，具体方法为：删除单纯疱疹病毒HSV1中ICP4、ICP34.5和ICP27基因，突变VP16基因，得到复制缺陷型载体rdHSV1；对LAT基因靶序列进行筛选、靶位证实，做出siRNA核苷酸序列，其序列由序列表中的SEQ ID NO:2所示；将IFNγ基因序列与siRNA序列分别连入穿梭质粒，与复制缺陷型载体rdHSV1进行同源重组，获得双基因靶向治疗系统rdHSV1‑IFNγ‑siRNA；本发明针对HSK目前亟待解决的病毒潜伏感染和复发问题，利用目前最先进的HSV病毒载体作为工具，建立了一种针对HSV病毒潜伏标志基因LAT基因和活化病毒的双基因靶向疗法，特异性定位到病毒潜伏部位进行基因沉默和干预治疗。

Description

一种治疗复发性HSK的双基因靶向治疗系统

【技术领域】

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种治疗复发性HSK的双基因靶向治疗系统。

【背景技术】

单纯疱疹病毒性角膜炎(Herpes Simplex Keratitis,HSK)是最常见的病毒性角膜炎，在角膜病中发病率和致盲率均居首位。该病由于单纯疱疹病毒(Herpes SimplexVirus,HSV)潜伏感染于人三叉神经节及角膜组织，容易复发，重症病例迁延不愈，最终失明。单纯疱疹病毒(HSV)对人的感染性很强。20岁以上的成年人中，血清抗体阳性率达90％，原发感染仅见于对本病毒无免疫力的儿童，多为6个月至5岁的小儿。原发感染后病毒终生潜伏于体内待机再发。继发感染多见于5岁以上儿童和成人。一些非特异性刺激如感冒、发热、疟疾、感情刺激、月经、日晒、应用糖皮质激素、退翳及创伤等都可能成为复发的诱因。目前该病发病机制不明，传统药物治疗副作用大，机体易产生耐药，手术治疗也难以解决复发，使其成为眼科世界性难题。

【发明内容】

本发明的目的是提供一种治疗复发性HSK的双基因靶向治疗系统，以解决单纯疱疹病毒性角膜炎易复发、难治愈的问题。

本发明采用以下技术方案：一种双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA，至少包含复制缺陷型载体rdHSV1、来自于人血液淋巴细胞的IFNγ基因序列、siRNA核苷酸序列。

进一步地，复制缺陷型载体rdHSV1通过将单纯疱疹病毒HSV1中的ICP4、ICP34.5和ICP27基因删除，突变VP16基因而得到。

进一步地，IFNγ基因序列由序列表中的SEQ ID NO:1所示。

进一步地，siRNA核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO:2所示。

还包括一种复制缺陷型载体rdHSV1，通过将单纯疱疹病毒HSV1中的ICP4、ICP34.5和ICP27基因删除，突变VP16基因而得到。

还包括一种来自于人血液淋巴细胞的IFNγ基因序列，其序列由序列表中的SEQID NO:1所示：

SEQ ID NO：1

GCTTATGAAATATACAAGTTATATCTTGGCTTTTCAGCTCTGCATCGTTTTGGGTTCTCTTGGCTGTTACTGCCAGGACCCATATGTAAAAGAAGCAGAAAACCTTAAGAAATATTTTAATGCAGGTCATTCAGATGTAGCGGATAATGGAACTCTTTTCTTAGGCATTTTGAAGAATTGGAAAGAGGAGAGTGACAGAAAAATAATGCAGAGCCAAATTGTCTCCTTTTACTTCAAACTTTTTAAAAACTTTAAAGATGACCAGAGCATCCAAAAGAGTGTGGAGACCATCAAGGAAGACATGAATGTCAAGTTTTTCAATAGCAACAAAAAGAAACGAGATGACTTCGAAAAGCTGACTAATTATTCGGTAACTGACTTGAATGTCCAACGCAAAGCAATACATGAACTCATCCAAGTGATGGCTGAACTGTCGCCAGCAGCTAAAACAGGGAAGCGAAAAAGGAGTCAGATGCTGTTTCAAGGTCGAAGAGCATCCCAGTAACTCGAGTCTAGAGGGCCCTATTCTATAGTGTCACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCGTGGCAGGATGCTTTCGGGGATCGGTGGTCAGGCAGCCCGGGCCGCGGCTCTGTGGTTAACACCAGAGCCTGCCCAACATGGCACCCCACTCCCACGCACCCCACTCCCACGAACCCCACTCCACGCACCCCACTCCAAGCACCCCACTTCCAGCACCCACTCCAGACCCACTCCAGAACCCCACTCCAAGACCCCAATTCCAAGATCCCGGAACA TTCAACACAG ACAGGGAAAA AATCT。

还包括一种siRNA核苷酸序列，其序列有序列表中的SEQ ID NO:2所示：

SEQ ID NO:2

TACGACAGCA CATCCTCAGA TAGTT。

还包括将双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA治疗复发性单纯疱疹病毒性角膜炎的用途。

还包括一种双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA的构建方法，具体方法为：

删除单纯疱疹病毒HSV1中ICP4、ICP34.5和ICP27基因，突变VP16基因，得到复制缺陷型载体rdHSV1；

对LAT基因靶序列进行筛选、靶位证实，做出一条siRNA核苷酸序列，其序列由序列表中的SEQ ID NO:2所示；

分离人血液淋巴细胞，接种HSV1病毒诱导入IFNγ基因，提取淋巴细胞总RNA，反转cDNA，获取IFNγ基因序列，其序列由序列表中的SEQ ID NO:1所示；

将IFNγ基因序列与siRNA序列分别连入穿梭质粒，与复制缺陷型载体rdHSV1进行同源重组，获得双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA。

本发明的有益效果是：本发明针对HSK目前亟待解决的病毒潜伏感染和复发问题，首次将研究深入到基因水平，利用目前最先进的HSV病毒载体作为工具，建立了一种针对HSV病毒潜伏标志基因LAT基因和活化病毒的双基因靶向疗法，特异性定位到病毒潜伏部位进行基因沉默和干预治疗。这将为有效抑制病毒潜伏感染、解决HSK复发瓶颈提供新思路、新方法，为进一步临床防控HSK奠定基础，也将具有重要的理论创新意义和良好的临床应用前景。

本发明通过改造单纯疱疹病毒HSV，制备出HSV1复制缺陷型病毒载体并使其携带抗病毒活性的干扰素γ基因(IFNγ)及促使LAT基因沉默的siRNA，建立一种双基因靶向治疗系统(rdHSV1-IFNγ-siRNA)，利用HSV1病毒嗜神经的特点，病毒载体可将双基因药物沿神经通路靶向地从眼角膜输送到病毒潜伏部位三叉神经节，达到精准、高效的治疗效果，彻底解决单纯疱疹病毒性角膜炎潜伏感染、反复发作的难题。

【附图说明】

图1为本发明中复制缺陷型载体rdHSV1的骨架结构示意图；

图2为IFNγ基因序列与siRNA序列连入的穿梭质粒的同源重组过程图；

图3为rdHSV1的载体骨架与穿梭质粒重组构建的双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA过程及结构示意图；

图4为Western blot鉴定IFNγ结果图；

图5为免疫组化检测三叉神经节中IFNγ水平图；

图6为免疫组检测结果表达图；

图7为siRNA对LATmRNA的沉默干扰作用的鉴定效果图；

图8为Western blot检测LAT蛋白的表达图。

【具体实施方式】

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明公开了一种双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA，如图2、图3所示，该双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA的构建方法如下：

删除单纯疱疹病毒HSV1中ICP4、ICP34.5和ICP27基因，使其不能复制，突变VP16基因，改造为HSV 1764 4-/27+/RL1+骨架病毒，如图1所示，使之成为复制缺陷型载体rdHSV1，其中，单纯疱疹病毒HSV1购于北京诺赛基因组研究中心有限公司。

分离人血液淋巴细胞(购于生工生物工程(上海)股份有限公司)，接种HSV1病毒诱导入IFNγ基因，提取淋巴细胞总RNA，反转cDNA，获取IFNγ基因序列，其序列具体为：

GCTTATGAAATATACAAGTTATATCTTGGCTTTTCAGCTCTGCATCGTTTTGGGTTCTCTTGGCTGTTACTGCCAGGACCCATATGTAAAAGAAGCAGAAAACCTTAAGAAATATTTTAATGCAGGTCATTCAGATGTAGCGGATAATGGAACTCTTTTCTTAGGCATTTTGAAGAATTGGAAAGAGGAGAGTGACAGAAAAATAATGCAGAGCCAAATTGTCTCCTTTTACTTCAAACTTTTTAAAAACTTTAAAGATGACCAGAGCATCCAAAAGAGTGTGGAGACCATCAAGGAAGACATGAATGTCAAGTTTTTCAATAGCAACAAAAAGAAACGAGATGACTTCGAAAAGCTGACTAATTATTCGGTAACTGACTTGAATGTCCAACGCAAAGCAATACATGAACTCATCCAAGTGATGGCTGAACTGTCGCCAGCAGCTAAAACAGGGAAGCGAAAAAGGAGTCAGATGCTGTTTCAAGGTCGAAGAGCATCCCAGTAACTCGAGTCTAGAGGGCCCTATTCTATAGTGTCACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCGTGGCAGGATGCTTTCGGGGATCGGTGGTCAGGCAGCCCGGGCCGCGGCTCTGTGGTTAACACCAGAGCCTGCCCAACATGGCACCCCACTCCCACGCACCCCACTCCCACGAACCCCACTCCACGCACCCCACTCCAAGCACCCCACTTCCAGCACCCACTCCAGACCCACTCCAGAACCCCACTCCAAGACCCCAATTCCAAGATCCCGGAACATTCAACACAGACAGGGAAAAAATCT。

运用计算机生物信息学，利用ThermoFisher Scientific公司的BLOCK-iT^TM RNAiDesigner软件，并根据siRNA设计原则，对LAT基因靶序列进行筛选、

靶位证实，设计出一条siRNA序列，具体序列具体为：

No.	Start	Sequences(DNA)	Region	GC(％)
					1	171	TACGACAGCACATCCTCAGATAGTT	ORF	44

将IFNγ基因序列与siRNA序列分别连入穿梭质粒(购于北京诺赛基因组研究中心有限公司)，穿梭质粒包含HSV1LAT基因同源序列，如图2所示，可与rdHSV1载体进行同源重组。如图3所示，将两种穿梭质粒和HSV 17644-/27+/RL1+骨架病毒共转染补偿细胞系获得双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA。

双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA的鉴定：

双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA滴度及标准病毒HSV SM44滴度测定。用DMEM维持液(购于美国Hyclone公司)10倍系列稀释双基因靶向治疗系统，并接种单层细胞，对照孔和感染双基因靶向治疗系统孔维持液。5％CO₂，37℃细胞培养箱培养。每天用倒置显微镜观察并记录治疗系统致细胞病变效应(CPE)的孔数，当细胞病变不再发展时，用Reed-Muench公式计算TCID₅₀，按照Reed-Muench方法计算出TCID50为10^-6.3/0.1ml,即将病毒稀释10^6.3倍接种100μl可使50％的细胞发生病变。

双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA感染vero细胞及IFNγ的Western blot鉴定。培养单层vero细胞，接种100TCID₅₀的双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA，室温吸附1h后进行培养，培养12、24、36、48、60、72h后，vero细胞分别收集到离心管中，3000r/min离心10min，裂解细胞，进行Western blot鉴定，如图4所示，Western blot鉴定说明接种后12—48小时IFNγ表达量逐渐升高，48小时时达到峰值，60-72小时逐渐降低。

双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA体内靶向定位效果的观察：

双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA在三叉神经节靶向定位的观察。各组大鼠接种5μl 2×10⁶pfu的双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA，角膜接种后2d、4d、8d、16d、32d和40d观察角膜形成病变，刮片确诊后分别处死大鼠、分离三叉神经节，检测IFNγ的定位与表达，观察治疗系统逆向进入三叉神经节的情况，检测结果如图5、图6所示，结果显示rdHSV1-IFNγ-siRNA免疫大鼠后，大鼠三叉神经节中IFNγ的表达量随免疫时间的延长而增加，在第21天达到上限，这说明rdHSV1-IFNγ-siRNA系统可以在大鼠三叉神经节中高效的表达IFNγ。

实时定量RT-PCR检测LAT mRNA：

提取三叉神经节的总RNA并定量，反转录为cDNA，使用SYBR Green I定量PCR试剂盒(购于生工生物工程(上海)股份有限公司)利用RT-PCR的方法扩增LAT mRNA，以β-actin为内对照。

LAT mRNA的PCR扩增引物序列为：

Forward:5’-GGCTCCATCGCCTTTCCT-3’，

Reverse:5’-AAGGGAGGGAGGAGGGTACTG-3’；

β-actin mRNA的PCR扩增引物序列为：

Forward:5’-GTTGCTATCCAGGCTGTG-3’，

Reverse:5’-TGTCCACGTCACACTTCA-3’；

计算出定量的结果，并根据β-actin结果标准化定量结果以鉴定siRNA对LAT mRNA的沉默干扰作用，结果如图7所示，RT-PCR结果显示，大鼠三叉神经节中LAT基因的表达水平随着时间逐渐降低，到免疫后21天时达到了最低量，这说明siRNA有效抑制了LAT基因的表达。

Western blot检测LAT的蛋白表达情况：

使用组织组织裂解液裂解三叉神经节匀浆组织细胞，变性，12000r/min离心15min，用Bradford方法定量蛋白，使用Western blot方法检测LAT蛋白的表达情况，结果如图8所示，Western blot结果显示，LAT蛋白的表达水平随着时间逐渐降低，到免疫后21天时达到了最低量，这说明siRNA有效抑制了LAT蛋白的表达。

另外，本发明中删除单纯疱疹病毒HSV1中ICP4、ICP34.5和ICP27基因，使其不能复制，突变VP16基因，改造为HSV 1764 4-/27+/RL1+骨架病毒，使之成为复制缺陷型载体rdHSV1；

克隆出了IFNγ基因，该基因不同于胞外表达的常规蛋白，属于一种分泌表达型蛋白，本发明突破了IFNγ基因难以克隆表达的技术难题；

成功构建了双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA，该系统携带IFNγ及能够沉默LAT基因的siRNA，并证实其可高效靶向定位于大鼠三叉神经节。

本发明针对HSV在三叉神经节潜伏感染、复发这一难题，利用HSV病毒载体嗜神经的特性，将基因药物靶向地从角膜靶向地带到三叉神经节，在潜伏部位针对病毒潜伏和复发两个环节展开基因治疗，针对不同目的、靶标设计并联合应用于HSK的新思路在国内外尚未见文献报道。

提供HSK双基因靶向治疗方法和治疗新材料，把沉默潜伏基因LAT的siRNA及具有抗病毒、抗炎作用的IFNγ相结合，组成双基因治疗融合体，并插入到HSV复制缺陷型病毒载体的HSK双基因治疗方法是HSK防治研究的新颖技术方法，国内外文献尚未见报道。

针对潜伏基因和复发病毒双基因治疗效果将优于单一基因治疗，并在三叉神经节部位发挥防治效应，构建的双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA在国内外尚属首次报道。

序列表

<110> 陕西省眼科研究所

<120> 一种治疗复发性HSK的双基因靶向治疗系统

<141> 2017-10-25

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1005

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

gcttatgaaa tatacaagtt atatcttggc ttttcagctc tgcatcgttt tgggttctct 60

tggctgttac tgccaggacc catatgtaaa agaagcagaa aaccttaaga aatattttaa 120

tgcaggtcat tcagatgtag cggataatgg aactcttttc ttaggcattt tgaagaattg 180

gaaagaggag agtgacagaa aaataatgca gagccaaatt gtctcctttt acttcaaact 240

ttttaaaaac tttaaagatg accagagcat ccaaaagagt gtggagacca tcaaggaaga 300

catgaatgtc aagtttttca atagcaacaa aaagaaacga gatgacttcg aaaagctgac 360

taattattcg gtaactgact tgaatgtcca acgcaaagca atacatgaac tcatccaagt 420

gatggctgaa ctgtcgccag cagctaaaac agggaagcga aaaaggagtc agatgctgtt 480

tcaaggtcga agagcatccc agtaactcga gtctagaggg ccctattcta tagtgtcacc 540

taaatgctag agctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg 600

tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct 660

aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg 720

gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcgtggca ggatgctttc 780

ggggatcggt ggtcaggcag cccgggccgc ggctctgtgg ttaacaccag agcctgccca 840

acatggcacc ccactcccac gcaccccact cccacgaacc ccactccacg caccccactc 900

caagcacccc acttccagca cccactccag acccactcca gaaccccact ccaagacccc 960

aattccaaga tcccggaaca ttcaacacag acagggaaaa aatct 1005

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

tacgacagca catcctcaga tagtt 25

Claims (9)

1.一种双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA，其特征在于，至少包含复制缺陷型载体rdHSV1、来自于人血液淋巴细胞的IFNγ基因序列、siRNA核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA，其特征在于，所述复制缺陷型载体rdHSV1通过将单纯疱疹病毒HSV1中的ICP4、ICP34.5和ICP27基因删除，突变VP16基因而得到。

3.如权利要求1或2所述的双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA，其特征在于，所述IFNγ基因序列由序列表中的SEQ ID NO:1所示。

4.如权利要求3所述的双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA，其特征在于，所述siRNA核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO:2所示。

5.一种复制缺陷型载体rdHSV1，其特征在于，通过将单纯疱疹病毒HSV1中的ICP4、ICP34.5和ICP27基因删除，突变VP16基因而得到。

6.一种来自于人血液淋巴细胞的IFNγ基因序列，其特征在于，其序列由序列表中的SEQ ID NO:1所示。

7.一种siRNA核苷酸序列，其特征在于，其序列有序列表中的SEQ ID NO:2所示。

8.将权利要求1所述的双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA治疗复发性单纯疱疹病毒性角膜炎的用途。

9.一种权利要求1所述的双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA的构建方法，其特征在于，具体方法为：

删除单纯疱疹病毒HSV1中ICP4、ICP34.5和ICP27基因，突变VP16基因，得到复制缺陷型载体rdHSV1；

对LAT基因靶序列进行筛选、靶位证实，做出一条siRNA核苷酸序列，其序列由序列表中的SEQ ID NO:2所示；

分离人血液淋巴细胞，接种HSV1病毒诱导入IFNγ基因，提取淋巴细胞总RNA，反转cDNA，获取IFNγ基因序列，其序列由序列表中的SEQ ID NO:1所示；

将IFNγ基因序列与siRNA序列分别连入穿梭质粒，与复制缺陷型载体rdHSV1进行同源重组，获得双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA。