CN107530451A

CN107530451A - 用于天使人综合征的基因治疗方法的修饰的ube3a基因

Info

Publication number: CN107530451A
Application number: CN201680026461.3A
Authority: CN
Inventors: 凯文·罗恩·纳什; 埃德温·约翰·韦贝尔
Original assignee: University of South Florida
Current assignee: University of South Florida
Priority date: 2015-05-07
Filing date: 2016-05-09
Publication date: 2018-01-02
Also published as: PL3291843T3; EP4154914A1; WO2016179584A1; US20230277684A1; JP2018518946A; HUE062186T2; US11534500B2; CA2984629C; CA2984629A1; JP6841507B2; EP3291843A4; EP3291843A1; EP3291843B1; ES2947311T3; US20180104358A1

Abstract

天使人综合征(AS)是一种遗传病症，在每15,000个新生儿中发生一例。其特征是严重的智力迟钝、癫痫发作、说话困难和共济失调。造成AS的基因被发现是UBE3A，其编码泛素连接酶E6‑AP。该基因的独特特征是它以神经元特异性方式经历母本印记。在大多数AS病例中，在母本遗传的UBE3A基因中存在突变或缺失，但是其他病例是单亲源二体或该母本基因的错误甲基化的结果。虽然大多数以严重的智力迟钝为特征的人类病症涉及脑结构的异常，但是没有与AS相关的重大的解剖学变化。我们已经生成带有附加序列的Ube3a蛋白，所述附加序列应允许所述蛋白从细胞分泌和被邻近的神经元细胞摄取。这会向神经元中提供功能性E6‑AP蛋白并拯救疾病病理。

Description

用于天使人综合征的基因治疗方法的修饰的UBE3A基因

相关申请的交叉参考

本申请要求于2015年5月7日提交的题为“用于天使人综合征的基因治疗方法的修饰的UBE3A基因(Modified UBE3A Gene for a Gene Therapy Approach for AngelmanSyndrome)”的美国临时申请No.62/158,269的优先权，该临时申请通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及天使人综合征(Angelman syndrome)的治疗。更具体地，本发明提供了用于治疗天使人综合征的治疗方法和组合物。

背景技术

天使人综合征(AS)是一种影响神经元的遗传病症，估计每15,000个新生儿中约发生1例(Clayton-Smith，英国的天使人综合征临床研究：对82名患病个体的观察(Clinicalresearch on Angelman syndrome in the United Kingdom:observations on82affected individuals).Am J Med Genet.1993Apr 1；46(1)：12-5)，但是被诊断的AS病例的实际数量可能由于误诊而更高。

天使人综合征是一种连续的损害，其呈现出延迟和降低的智力和发育进展，特别是在语言和运动技能方面。具体来说，AS是通过很少或没有口头交流、有一些非口头交流、共济失调、以及包括频繁的发笑和微笑和兴奋的运动在内的性情来界定的。

更重的病例导致严重的智力迟钝、可能难以控制并通常在三岁年龄之前或之时开始的癫痫发作、频繁发笑(Nicholls，新的见解揭示了基因组印记中涉及的复杂机制(Newinsights reveal complex mechanisms involved in genomic imprinting).Am J HumGenet.1994May；54(5)：733-40)、脑过小(miroencephaly)和EEG异常。在严重的病例中，患者可能不会发展语言，或者可能只会使用5-10个单词。运动通常是呆笨的，并且走路通常伴有手摆动和僵硬的步态。患者通常有癫痫，尤其是在一生中的早期，并患有睡眠呼吸暂停，通常只能一次睡5个小时。他们是爱社交的并渴望人类接触。在一些病例中，皮肤和眼睛可能具有很少的色素或没有色素、有吸吮和吞咽问题、对热敏感、以及对水体的迷恋。UBE3A缺陷小鼠中的研究显示出长期突触可塑性的紊乱。天使人综合征目前不能治愈，并且治疗是姑息治疗。例如，抗惊厥药物用于减少癫痫发作，并且言语和物理治疗用于改善语言和运动技能。

基因UBE3A造成AS，并且它是独特的，因为它是人类印迹基因的小家族之一。在15号染色体上发现的UBE3A编码E6AP C末端蛋白(E6相关蛋白(E6AP))的同源物(HECT)(Kishino等，UBE3A/E6-AP突变引起天使人综合征(UBE3A/E6-AP mutations causeAngelman syndrome).Nat Gen.1997Jan 15.15(1)：70-3)。UBE3A在脑中经历空间定义的母本印记；因此，父本拷贝经由DNA甲基化而被沉默(Albrecht等，鼠天使人综合征基因Ube3a在海马和浦肯野神经元中的印记表达(Imprinted expression of the murine Angelmansyndrome gene，Ube3a，in hippocampal and Purkinje neurons).Nat Genet.1997Sep；17(1)：75-8)。因此，只有母本拷贝是活性的，父本染色体对脑的该区域中神经元的蛋白体具有很少影响或没有影响。因此，15号染色体中部分的失活、易位或缺失导致无补偿的功能丧失。一些研究表明，不当的E3-AP蛋白水平改变了天使人综合征患者的神经突接触(Tonazzini等，在纳米结构底物上泛素连接酶E3a(Ube3a)缺陷型海马神经元中受损的神经突接触引导(Impaired neurite contract guidance in ubuitin ligase E3a(Ube3a)-deficient hippocampal neurons on nanostructured substrates).Adv HealthcMater.2016Apr；5(7)：850-62)。

大多数天使人综合征病例(70％)通过合并了所述UBE3A基因的母本染色体的从15q11-q13的约4Mb的从头缺失而发生(Kaplan等，与15号染色体长臂中的缺失相关的临床异质性：3例新发病例报告及其可能的意义(Clinical heterogeneity associated withdeletions in the long arm of chromosome 15:report of 3new cases and theirpossible significance).Am J Med Genet.1987Sep；28(1)：45-53)，但它也可能由于母本拷贝的异常甲基化阻止其表达而发生(Buiting等，天使人和普拉德-威利综合征中遗传的微缺陷限定了15号人类染色体上的印记中心(Inherited microdeletions in theAngelman and Prader-Willi syndromes define an imprinting centre on humanchromosome 15).Nat Genet.1995Apr；9(4)：395-400；Gabriel等，转基因插入产生普拉德-威利和天使人综合征的遗传性染色体缺失小鼠模型(A transgene insertion creating aheritable chromosome deletion mouse model of Prader-Willi and Angelmansyndrome).Proc Natl Acad Sci U.S.A.1999Aug；96(16)：9258-63)或由于遗传了父本基因的两个拷贝的单亲源二体而发生(Knoll等，天使人和普拉德-威利综合征共有共同的15号染色体缺失，但该缺失的亲本起源不同(Angelman and Prader-Willi syndromes sharea common chromosome 15deletion but differ in parental origin of thedeletion).Am J Med Genet.1989Fed；32(2)：285-90；Malcolm等，天使人综合征中的单亲源父本二体(Uniparental paternal disomy in Angelman’s syndrome).Lancet.1991Mar23；337(8743)：694-7)。其余的AS病例通过母本染色体的各种UBE3A突变产生，或者他们被诊断为没有遗传原因(12-15UBE3A编码E6相关蛋白(E6-AP)泛素连接酶。E6-AP是一种E3泛素连接酶，因此它表现出对其蛋白质靶标的特异性，所述蛋白质靶标包括肿瘤抑制分子p53(Huibregtse等，细胞蛋白介导p53与16或18型人乳头瘤病毒的E6癌蛋白的结合(Acellular protein mediates association of p53with the E6oncoprotein of humanpapillomavirus types 16or18).EMBO J.1991Dec；10(13)：4129-35)、酵母DNA修复蛋白Rad23的人类同源物(Kumar等，鉴定到HHR23A是E6相关蛋白介导的泛素化的底物(Identification of HHR23A as a substrate for E6-associated protein-mediatedubiquitination).J Biol Chem.1999Jun 25；274(26)：18785-92)、E6-AP本身、以及最近鉴定到的靶标Arc(Nuber等，泛素-蛋白连接酶E6相关蛋白(E6-AP)用作其自身的底物(Theubiquitin-protein ligase E6-associated protein(E6-AP)serves as its ownsubstrate).Eur J Biochem.1998Jun 15；254(3)：643-9；Greer等，天使人综合征蛋白Ube3A通过泛素化arc来调节突触发育(The Angelman Syndrome protein Ube3Aregulates synapse Development by ubiquitinating arc).Cell.2010Mar 5；140(5)：704-16)。

轻度病例可能是由于染色体15q11-13处的UBE3A基因中的突变所致，该基因编码泛素途径的E6-AP泛素连接酶蛋白，而更严重的病例由15号染色体的较大缺失导致。通常，海马和小脑中UBE3A基因的损失导致天使人综合征，但是单一的功能丧失性突变也可能导致该病症。

与正常脑相比，小鼠和人AS脑的解剖学没有显示出重大变化，表明认知缺陷可能本质上是生物化学的而不是发育的(Jiang等，小鼠中天使人泛素连接酶的突变引起细胞质p53的增加以及情境学习和长时程增强作用的缺陷(Mutation of the Angelmanubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53and deficits ofcontextual learning and long-term potentiation).Neuron.1998Oct；21(4)：799-811；Davies等，脑中的印迹基因表达(Imprinted gene expression in the brain).NeurosciBiobehav Rev.2005May；29(3)：421–430)。使用的天使人综合征小鼠模型具有通过外显子2的无效突变引起的母本UBE3A基因的破坏(Jiang等，小鼠中天使人泛素连接酶的突变引起细胞质p53的增加以及情境学习和长时程增强作用的缺陷(Mutation of the Angelmanubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53and deficits ofcontextual learning and long-term potentiation).Neuron.1998Oct；21(4)：799-811)。该模型由于其在重演AS患者的主要表型特征中的能力而对AS研究领域极为有益。例如，AS小鼠具有诱导性癫痫发作、运动协调差、海马依赖性学习缺陷、和海马LTP中的缺陷。以前显示，AS小鼠模型中的认知缺陷与钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)的磷酸化状态异常相关(Weeber等，天使人智力迟钝综合征小鼠模型中海马的钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II的紊乱(Derangements of hippocampal calcium/calmodulin-dependentprotein kinase II in a mouse model for Angelman mental retardation syndrome).J Neurosci.2003Apr；23(7)：2634-44)。αCaMKII的激活性Thr²⁸⁶位点以及抑制性Thr³⁰⁵位点二者的磷酸化有显著增加，但总酶水平没有任何变化，导致其活性的总体下降。在突触后致密物处的CaMKII总量也有减少，表明活性CaMKII的量减少。在Thr³⁰⁵位点处具有阻止磷酸化的点突变的突变小鼠模型与AS小鼠杂交拯救了AS表型，即癫痫发作活性、运动协调、海马依赖性学习和LTP恢复到类似于野生型水平。因此，αCaMKII的出生后表达表明，AS小鼠模型的主要表型是由于出生后的生化改变而不是总体发育缺陷引起的(Bayer等，CaM激酶II同工型的发育性表达：遍在的γ-和δ-CaM激酶II是早期同工型并且在发育中的神经系统中最丰富(Developmental expression of the CaM kinase II isoforms:ubiquitousγ-andδ-CaM kinase II are the early isoforms and most abundant in the developingnervous system).Brain Res Mol Brain Res.1999Jun 18；70(1)：147-54)。

Ube3a的缺陷也在亨廷顿氏病(Huntington's disease)中有关联(Maheshwari等，亨廷顿氏病小鼠脑中Ube3a的缺陷增加了聚集体负荷并加速了疾病的病理(Deficeincy ofUbe3a in Huntington’s disease mice brain increases aggregate load andaccelerates disease pathology).Hum Mol Genet.2014Dec 1；23(23)：6235-45)。

Matentzoglu指出E6-AP具有与激素信号转导相关的非E3活性(Matentzoglu，EP2,724,721A1)。因此，施用类固醇如雄激素、雌激素和糖皮质激素用于治疗各种E6-AP病症，包括天使人综合征、自闭症、癫痫、普拉德-威利综合征(Prader-Willi syndrome)、宫颈癌、脆性X综合征和Ret综合征。Philpot建议利用拓扑异构酶抑制剂将沉默的基因去甲基化，从而纠正Ube3A的缺陷(Philpot等，P.G.Pub.US2013/0317018A1)。然而，在该领域的工作和提出的疗法，如同使用类固醇时那样，并没有解决潜在的病症，或在使用去甲基化合物的情况下可能导致其他病症，如自闭症。因此，需要的是以安全有效的方式解决UBE3A缺陷性病症的潜在原因的疗法。

发明内容

虽然大多数以严重的智力迟钝为特征的人类病症涉及脑结构的异常，但是没有与AS相关的重大的解剖学变化。已经生成的Ube3a蛋白含有附加的允许Ube3a从细胞分泌的细胞分泌序列和提供被邻近的神经元细胞摄取的细胞摄取序列。这向神经元中提供了功能性E6-AP蛋白，从而拯救了疾病病理。

因此，利用转录起始序列和被设置在所述转录起始序列下游的UBE构建体形成UBE3A载体。所述UBE构建体由UBE3A序列、分泌序列和细胞摄取序列形成。所述UBE3A序列的非限制性实例是SEQ ID No.1、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、15，SEQ IDNo.7的cDNA，SEQ ID No.14的cDNA，或同源序列。所述DNA序列的变化形式包括DNA三联体密码中的保守突变，如表中所示。在具体的变化形式中，所述UBE3A序列是小家鼠(musmusculus)UBE3A U82122.1、智人(homo sapiens)UBE3A变体1、变体2或变体3。所述分泌序列的非限制性实例是SEQ ID No.2、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10，SEQ IDNo.3的cDNA，或同源序列，以及所述DNA序列的包括前述保守突变的变化形式。所述细胞摄取序列的非限制性实例是SEQ ID No.4、SEQ ID No.11，SEQ ID No.5的cDNA，或同源序列。所述DNA序列的变化形式包括前述保守突变。在本发明的具体变化形式中，所述分泌序列被设置在所述UBE3A序列上游，并且更具体地，任选被设置在所述UBE3A序列上游和所述分泌序列下游。

下表基于官能团类别显示了冗余的三联体密码和对应的编码的氨基酸。

在本发明的一些变化形式中，所述转录起始序列是巨细胞病毒鸡-β肌动蛋白杂合启动子或人泛素c启动子。本发明任选包括增强子序列。所述增强子序列的非限制性实例是被设置在所述转录起始序列上游的巨细胞病毒立即早期增强子序列。所述载体任选也包括土拨鼠肝炎转录后调控元件。

在变化形式中，将所述载体插入到质粒例如基于重组腺相关病毒血清型2的质粒中。在具体的变化形式中，所述基于重组腺相关病毒血清型2的质粒缺乏DNA整合元件。所述基于重组腺相关病毒血清型2的质粒的非限制性实例是pTR质粒。

还提供了一种合成UBE3A载体的方法。将UBE3A构建体插入到具有转录起始序列的骨架质粒中，其中所述UBE3A构建体由UBE3A序列、分泌序列和细胞摄取序列形成。在一些变化形式中，将所述UBE3A构建体插入到所述转录起始序列下游。所述UBE3A序列的非限制性实例是SEQ ID No.1、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13，SEQ ID No.7的cDNA，或同源序列。所述DNA序列的变化形式包括DNA三联体密码中的保守突变，如表中所示。所述分泌序列的非限制性实例是SEQ ID No.2、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10，SEQ IDNo.3的cDNA，或同源序列，以及所述DNA序列的包括前述保守突变的变化形式。所述细胞摄取序列的非限制性实例是SEQ ID No.4、SEQ ID No.11，SEQ ID No.5的cDNA，或同源序列。所述DNA序列的变化形式包括前述保守突变。在本发明的具体变化形式中，所述分泌序列被设置在所述UBE3A序列的上游，并且更具体地，任选被设置在所述UBE3A序列上游和所述分泌序列下游。例如，将Ube3a基因克隆并框内融合到3'DNA序列(具有两个其它肽序列的N端)，信号肽和HIV TAT序列，将其克隆到重组腺相关病毒载体中，以在AS患者的脑和脊髓中表达分泌的E6-AP蛋白。所述UBE构建体任选通过用至少一种核酸内切酶切割所述骨架质粒并将所述UBE3A构建体连接到所述骨架质粒的切割末端来插入。

然后将所述载体任选插入到具有抗生素抗性基因的扩增宿主中，并经历对应于抗生素抗性基因的抗生素选择。然后将扩增宿主在含有所述抗生素选择的培养基中增殖，并收集增殖的扩增宿主。然后从所述扩增宿主中分离所述载体。在本发明的具体变化形式中，所述抗生素抗性基因是氨苄青霉素抗性基因，其中对应的抗生素选择是氨苄青霉素。

还提供了治疗UBE3A缺陷疾病例如天使人综合征、普拉德-威利综合征或亨廷顿氏病的方法。将如上所述的载体施用于患有UBE3A缺陷疾病的患者的脑以纠正所述UBE缺陷。所述载体任选通过注射来施用。非限制性实例包括海马内或脑室注射。在具体的变化形式中，所述载体被双侧注射。任选的剂量包括约5.55x 10¹¹基因组/克脑质量至约2.86x 10¹²基因组/克脑质量，或更具体地为5.55x 10¹¹至2.86x 10¹²基因组/克脑质量。剂量的非限制性实例是：5.55x 10¹¹基因组/克脑质量，5.75x 10¹¹基因组/克脑质量，5.8x 10¹¹基因组/克脑质量，5.9x 10¹¹基因组/克脑质量，6.0x 10¹¹基因组/克脑质量，6.1x 10¹¹基因组/克脑质量，6.2x 10¹¹基因组/克脑质量，6.3x 10¹¹基因组/克脑质量，6.4x 10¹¹基因组/克脑质量，6.5x 10¹¹基因组/克脑质量，6.6.x 10¹¹基因组/克脑质量，6.7x 10¹¹基因组/克脑质量，6.8x 10¹¹基因组/克脑质量，6.9.x 10¹¹基因组/克脑质量，7.0x 10¹¹基因组/克脑质量，7.1x 10¹¹基因组/克脑质量，7.2x 10¹¹基因组/克脑质量，7.3x 10¹¹基因组/克脑质量，7.4x10¹¹基因组/克脑质量，7.5x 10¹¹基因组/克脑质量，7.6x 10¹¹基因组/克脑质量，7.7x 10¹¹基因组/克脑质量，7.8x 10¹¹基因组/克脑质量，7.9x 10¹¹基因组/克脑质量，8.0x 10¹¹基因组/克脑质量，8.1x 10¹¹基因组/克脑质量，8.2x 10¹¹基因组/克脑质量，8.3x 10¹¹基因组/克脑质量，8.4x 10¹¹基因组/克脑质量，8.5x 10¹¹基因组/克脑质量，8.6x 10¹¹基因组/克脑质量，8.7x 10¹¹基因组/克脑质量，8.8x 10¹¹基因组/克脑质量，8.9x 10¹¹基因组/克脑质量，9.0x 10¹¹基因组/克脑质量，9.1x 10¹¹基因组/克脑质量，9.2x 10¹¹基因组/克脑质量，9.3x 10¹¹基因组/克脑质量，9.4x 10¹¹基因组/克脑质量，9.5x 10¹¹基因组/克脑质量，9.6x10¹¹基因组/克脑质量，9.7x 10¹¹基因组/克脑质量，9.80x 10¹¹基因组/克脑质量，1.0x 10¹²基因组/克脑质量，1.1x 10¹²基因组/克脑质量，1.2x 10¹²基因组/克脑质量，1.3x 10¹²基因组/克脑质量，1.4x 10¹²基因组/克脑质量，1.5x 10¹²基因组/克脑质量，1.6x 10¹²基因组/克脑质量，1.7x 10¹²基因组/克脑质量，1.8x 10¹²基因组/克脑质量，1.9x 10¹²基因组/克脑质量，2.0x 10¹²基因组/克脑质量，2.1x 10¹²基因组/克脑质量，2.2x 10¹²基因组/克脑质量，2.3x 10¹²基因组/克脑质量，2.40x 10¹²基因组/克脑质量，2.5x 10¹²基因组/克脑质量，2.6x 10¹²基因组/克脑质量，2.7x 10¹²基因组/克脑质量，2.75x 10¹²基因组/克脑质量，2.8x 10¹²基因组/克脑质量，或2.86x 10¹²基因组/克脑质量。

附图说明

为了更全面了解本发明，应该结合附图参考下面的详细描述，在所述附图中：

图1是来自用所指出的含有信号肽的GFP克隆转染的HEK293细胞的培养基上抗GFP抗体的斑点印迹。

图2是本发明中使用的小鼠UBE3A载体构建体的图谱。注出了主要基因。

图3是显示从质粒转染的HEK293细胞分泌的E6-AP蛋白的Western印迹。取自用细胞培养基转染的对照细胞的培养基(cnt txn)、取自Ube3a转染细胞的培养基(Ube3a txn)和取自未转染细胞的培养基(cnt untxn)在丙烯酰胺凝胶上跑胶并用抗E6-AP抗体染色。

图4是E6-AP蛋白的染色面积百分比的图。非转基因(Ntg)对照小鼠显示出正常小鼠脑中的Ube3a表达水平。天使人综合征小鼠(AS)显示出那些小鼠中的染色水平(又称背景染色)。将AAV4-STUb注射到AS小鼠的侧脑室中显示与AS小鼠相比，E6-AP蛋白染色的水平增加。n＝2

图5是非转基因小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像。GFP(绿色荧光蛋白)是不分泌的胞质蛋白质。这表明Ube3a正从室管膜细胞中释放并在实质中被摄取。

图6是非转基因小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像，显示了脑室系统(侧脑室(LV)，第三脑室)的更高放大倍数图像。GFP(绿色荧光蛋白)是不分泌的胞质蛋白质。这表明Ube3a正从室管膜细胞中释放并在实质中被摄取。

图7是未经注射的AS小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像。

图8是未经注射的AS小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像，显示了脑室系统(侧脑室(LV)，第三脑室)的更高放大倍数图像。

图9是用AAV4-STUb注射到侧脑室中的AS小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像。在室管膜细胞中能看到表达，但是在紧邻所述脑室的实质中也观察到染色(用箭头指示)。GFP(绿色荧光蛋白)是不分泌的胞质蛋白质。这表明Ube3a正从室管膜细胞中释放并在实质中被摄取。

图10是用AAV4-STUb注射到侧脑室中的AS小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像，显示了脑室系统(侧脑室(LV)，第三脑室)的更高放大倍数图像。在室管膜细胞中能看到表达，但是在紧邻所述脑室的实质中也观察到染色(用箭头指示)。GFP(绿色荧光蛋白)是不分泌的胞质蛋白质。这表明Ube3a正从室管膜细胞中释放并在实质中被摄取。

图11是用AAV4-STUb注射到侧脑室中的AS小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像。在AAV4-STUb递送后Ube3a表达的脑室系统(侧脑室(LV))的更高放大倍数图像。在室管膜细胞中能看到表达，但是在紧邻所述脑室的实质中也观察到染色(用箭头指示)。GFP(绿色荧光蛋白)是不分泌的胞质蛋白质。这表明Ube3a正从室管膜细胞中释放并在实质中被摄取。

图12是用AAV4-STUb注射到侧脑室中的AS小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像。在AAV4-STUb递送后Ube3a表达的脑室系统(第三脑室)的更高放大倍数图像。在室管膜细胞中能看到表达，但是在紧邻所述脑室的实质中也观察到染色(用箭头指示)。GFP(绿色荧光蛋白)是不分泌的胞质蛋白质。这表明Ube3a正从室管膜细胞中释放并在实质中被摄取。

图13是用GFP转染的非转基因小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像。用AAV4-GFP注射时没有观察到表达，其仅显示室管膜和脉络丛细胞的转导。GFP(绿色荧光蛋白)是不分泌的胞质蛋白质。这表明Ube3a正从室管膜细胞中释放并在实质中被摄取。

图14是用AAV4-STUb注射到侧脑室中的AS小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像。在AAV4-STUb递送后Ube3a表达的脑的矢状断面。

图15是用AAV4-STUb注射到侧脑室中的AS小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像。脑中侧脑室(LV)的矢状断面，显示了在AAV4-STUb递送后的Ube3a表达。

图16是用AAV4-STUb注射到侧脑室中的AS小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像。脑中第三脑室(3V)的矢状断面，显示了在AAV4-STUb递送后的Ube3a表达。

图17是用AAV4-STUb注射到侧脑室中的AS小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像。脑中侧脑室(LV)的内角(interior horn)的矢状断面，显示了在AAV4-STUb递送后的Ube3a表达。

图18是用AAV4-STUb注射到侧脑室中的AS小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像。脑中侧脑室(4V)的矢状断面，显示了在AAV4-STUb递送后的Ube3a表达。

图19是用AAV4-STUb注射到侧脑室中的AS小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像。脑中第四脑室(LV)的矢状断面，显示了在AAV4-STUb递送后的Ube3a表达。

图20是用AAV4-STUb注射到侧脑室中的AS小鼠中抗E6-AP抗体染色的显微图像。脑的矢状断面，AAV4-STUb递送后脑室系统在侧脑室(LV)、和(C)第3脑室(3V)上Ube3a表达的更高放大倍数图像。

图21是本发明中使用的人类UBE3A载体构建体的图谱。注出了主要基因。

图22是用hSTUb构建体转染的HEK293细胞裂解物的Western印迹。用抗E6AP抗体对蛋白质进行染色。

图23是用具有GDNF信号或胰岛素信号的hSTUb构建体转染的HEK293细胞的抗E6AP抗体的斑点印迹，显示胰岛素信号对于表达和分泌来说工作得更好。

图24是利用抗HA标签抗体证实胰岛素信号分泌的斑点印迹。

优选实施方式的详细描述

用在本文中时，未带具体数量的指称物包括复数指称物，除非上下文明确指明并非如此。因此，例如，对“多肽”的指称包括两种或更多种多肽的混合物等。

用在本文中时，“约”是指近似或接近，并且在所阐述的数值或范围的情形下，是指数值的±15％。

“施用”用于描述将本发明的化合物单独或与其它化合物组合递送给患者的过程。所述组合物可以用包括口服、肠胃外(指静脉内和动脉内以及其它适当的肠胃外途径)、鞘内、肌内、皮下、结肠、直肠和经鼻等在内的各种方式施用。这些病状中的每一种都可以利用本发明化合物的其它施用途径容易地处理，以治疗疾病或病状。如本领域所知，本发明的化合物和组合物获得治疗或预防效果的给药剂量是由患者的情况决定的。本文中患者的给药剂量可以通过本文中化合物或组合物的个体或单位剂量或通过组合或预先包装或预先配制的化合物或组合物剂量来实现。平均40g的小鼠具有重量为0.416g的脑，160g小鼠具有重量为1.02g的脑，250g小鼠具有重量为1.802g的脑。人脑的平均重量为1508克，其可用于指导实现本文所述的治疗所需或有用的治疗量。

本发明的药物组合物可根据用于制备药学上有用的组合物的已知方法来配制。此外，用在本文中时，短语“可药用载体”是指标准可药用载体中的任一种。所述可药用载体可包括稀释剂、佐剂和介质，以及植入物载体，和不与本发明的活性成分起反应的惰性、无毒性固体或液体填充剂、稀释剂或囊封材料。实例包括但不限于，磷酸盐缓冲盐水、生理盐水、水、和乳剂，例如油/水乳剂。载体可以是含有例如乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质，其合适的混合物，和植物油。制剂被描述在对本领域技术人员而言公知并容易得到的许多来源中。例如，雷明顿制药科学(Remington’sPharmaceutical Sciences)(Martin EW[1995]Easton Pennsylvania，Mack PublishingCompany，第19版)描述了可以结合本发明使用的制剂。

用在本文中时，“动物”是指被分类在动物界或后生动物界中的多细胞真核生物体。该术语包括但不限于哺乳动物。非限制性实例包括啮齿动物，哺乳动物，水生哺乳动物，家养动物如狗和猫，农场动物如绵羊、猪、牛和马，以及人类。在使用术语“动物”的情形中，设想了它也适用于任何动物。

用在本文中时，术语“同源”是指与目标序列具有至少80％的序列同一性、优选至少90％的序列同一性、更优选至少95％的序列同一性、并且甚至更优选至少98％的序列同一性的核苷酸序列。所述核苷酸序列中的变化形式可以是所述核苷酸序列中的保守突变，即编码相同氨基酸的三联体密码中的突变，如表中所见。

用在本文中时，术语“治疗有效量”是指足以导致天使人综合征或其他UBE3A相关病症或其一种或多种症状的改善、防止天使人综合征或其他UBE3A相关病症的进展、或引起天使人综合症或其他UBE3A相关病症的消退的治疗(例如治疗剂或载体)的量。

用在本文中时，“患者”用于描述治疗所施用的动物，优选人类，所述治疗包括使用本发明组合物的预防性治疗。

实施例1

为了测试分泌信号的功效，将GFP与人胰岛素、GDNF或IgK信号肽进行框内克隆。将所述构建体插入到pTR质粒中并转染到HEK293细胞(美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)，Manassas，VA)中。将HEK293细胞在含有10％FBS和1％Pen/Strep的Dulbecco's改良必需培养基(DMEM)中在37℃5％CO₂下生长，并在80％汇合时传代培养。

利用PEI转染法将所述载体(6孔板中2μg/孔)转染到所述细胞中。在转染前2天，将所述细胞在6孔板中用DMEM培养基以0.5x 10⁶个细胞/孔传代培养。转染前一天晚上更换培养基。将不含内毒素的dH₂O加热至约80℃，并溶解聚乙烯亚胺(Sigma-Aldrich Co.LLC，St.Louis，MO)。让所述溶液冷却至约25℃，并用氢氧化钠中和所述溶液。对于每个被转染的孔，将AAV4-STUb载体或阴性对照(仅培养基)以2μg比每200μL添加到无血清DMEM中，并向每个孔的混合物添加9μL的1μg/μL聚乙烯亚胺。将转染混合物在室温下温育15分钟，然后以210μL/孔添加到每个细胞孔中并温育48小时。

从每个培养物孔中收集培养基，并利用窄尖移液管将2μL点样到硝酸纤维素膜上。在样品干燥后，通过向所述膜施加含5％BSA的TBS-T并在室温下温育30分钟至1小时对所述膜进行封闭，然后将所述膜在室温下在BSA/TBS-T中与鸡抗GFP抗体(5μg/mL，Abcam PLC，Cambridge，UK；#ab13970)一起温育30分钟。将所述膜用TBS-T洗涤3次，每次洗涤5分钟。将所述膜与HRP偶联的抗鸡HRP偶联物第二抗体(Southern Biotechnology，Thermo FisherScientific，Inc.，Waltham，MA；#6100-05，1/3000)在室温下温育30分钟，然后用TBS-T洗涤所述膜三次，一次洗涤15分钟，随后每次洗涤5分钟。将所述膜在室温下用TBS洗涤5分钟，并与发光试剂(Millipore，Merck KGaA，Darmstadt，DE；#WBKLS0100)一起温育1分钟。将所述膜在GE Amersham成像仪600(General Electric，Fairfield，CA)上进行记录，如图1所示。

从图1可以看出，通过与未转染的对照细胞相比观察到，所有三种分泌信号均导致带有GFP标签的蛋白从细胞中释放。在所述三种分泌构建体中，IgK构建体显示出最高的分泌水平，但是GDNF构建体的克隆2确实类似地显示出带有GFP标签的蛋白的高分泌。

实施例2

利用pTR质粒产生小鼠-UBE3A载体构建体。小鼠(Mus musculus)UBE3A基因由下面的cDNA(U82122.1)形成：

将所述cDNA亚克隆并测序。将小鼠UBE3A基因(SEQ ID No.1)融合到编码分泌信号肽的DNA序列(SEQ ID No.2)和HIV TAT序列(SEQ ID No.4)。所述分泌信号肽具有DNA序列：

atg gcc ctg ttg gtg cac ttc cta ccc ctg ctg gcc ctg ctt gcc ctc tgggag ccc aaa ccc acc cag gct ttt gtc(SEQ ID No.2)，其编码蛋白质序列：

MALLVHFLPLLALLALWEPKPTQAFV(SEQ ID No.3)；

同时HIV TAT序列是：

tac ggc aga aag aag agg agg cag aga agg aga(SEQ ID No.4)，其编码蛋白质序列：

YGRKKRRQRRR(SEQ ID No.5)。

将SEQ ID No.1与SEQ ID No.2和SEQ ID No.4融合的构建体序列插入到pTR质粒中。利用Age I和Xho I核酸内切酶切割所述质粒，并利用连接酶连接所述构建体序列。所述载体含有AAV血清型2末端重复序列、CMV-鸡-β肌动蛋白杂合启动子和WPRE，如图2所示。所述重组质粒缺乏Rep和Cap元件，限制了所述质粒整合到宿主DNA中。

然后将所述载体(AAV4-STUb载体)转化到大肠杆菌(Escherichia coli)中(大肠杆菌(E.coli)，Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA；SURE2细胞)。简言之，将细胞在冰上平衡，并将1pg至500ng的所述载体添加到大肠杆菌，并使其温育约1分钟。将所述细胞在0.1cm比色皿中用BioRad Gene Pulser进行电穿孔(1.7V，200欧姆)。然后将所述大肠杆菌在培养基中生长60分钟，然后铺在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的琼脂上，例如ATCC培养基1065(美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA)。将大肠杆菌在含有氨苄青霉素的肉汤中增殖，以收集大量载体。

实施例3

在HEK293细胞(美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA)中测试实施例2中产生的构建体的小鼠载体特性。将HEK293细胞在含有10％FBS和1％Pen/Strep的Dulbecco's改良必需培养基(DMEM)中在37℃5％CO₂下生长，并在80％汇合时传代培养。

利用PEI转染法将所述载体(6孔板中2μg/孔)转染到所述细胞中。在转染前2天，将所述细胞在6孔板中以0.5x 10⁶个细胞/孔用DMEM培养基传代培养。转染前一天晚上更换培养基。将不含内毒素的dH₂O加热至约80℃，并溶解聚乙烯亚胺(Sigma-Aldrich Co.LLC，St.Louis，MO)。让所述溶液冷却至约25℃，并用氢氧化钠中和所述溶液。对于每个被转染的孔，将AAV4-STUb载体或阴性对照(仅培养基)以2μg比每200μL添加到无血清DMEM中，并向每个孔的混合物添加9μL的1μg/μl聚乙烯亚胺。将转染混合物在室温下温育15分钟，然后以210μL/孔添加到每个细胞孔中并温育48小时。

从AAV4-STUb载体转染的细胞、仅培养基转染的对照细胞和未转染的对照细胞收集培养基。对培养基进行Western印迹，并用0.4μg/ml的对人类和小鼠E6-AP具有反应性的兔抗E6-AP抗体(A300-351A，Bethyl Labs，Montgomery，TX)染色。用兔偶联的辣根过氧化物酶(Southern Biotechnology，Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA)进行二次偶联。结果通过密度计测量来确定，并显示用AAV4-STUb转染的HEK293细胞将E6-AP蛋白分泌到培养基中，如图3所示。

实施例4

转基因小鼠是通过杂交在母本UBE3A(Jiang等，小鼠中天使人泛素连接酶的突变引起细胞质p53的增加以及情境学习和长时程增强作用的缺陷(Mutation of theAngelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53anddeficits of contextual learning and long-term potentiation).Neuron.1998Oct；21(4)：799-811；Gustin等，啮齿动物中和天使人综合征的小鼠模型中Ube3a蛋白表达的组织特异性变化(Tissue-specific variation of Ube3a protein expression in rodentsand in a mouse model of Angelman syndrome).Neurobiol Dis.2010Sep；39(3)：283-91)；Heck等，Ube3a缺陷小鼠中小脑功能的分析揭示了新的基因型特异性行为(Analysisof cerebellar function in Ube3a-deficient mice reveals novel genotype-specific behaviors).Hum Mol Genet.2008Jul 15；17(14)：2181-9)和GABARB3中具有缺失的小鼠而形成的。将小鼠以12小时的日光循环笼养，自由进食和进水。用所述载体对三月龄小鼠进行处理。

将小鼠用异氟烷麻醉并放入立体定位装置(仅供小鼠用51725D数字立体定位仪(51725D Digital Just for Mice Stereotaxic Instrument)，Stoelting，Wood Dale，IL)中。在颅骨的中间作矢状切口并将周围的皮肤向后推以扩大开口。使用以下坐标来定位左和右海马：AP 22.7mm，L 62.7mm，和V 23.0mm。利用10mL的Hamilton注射器，小鼠在各脑半球中接受在10μL的20％甘露醇中浓度为1x10¹²基因组/mL的AAV4-STUb粒子(N＝2)或介质(10μL的20％甘露醇)的双侧海马内注射。将伤口用盐水清洗，并使用Vetbond(NC9286393Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)闭合。对照动物包括未注射的AS小鼠和同窝出生的野生型小鼠(n＝2)。将小鼠在干净的空笼中在温暖的加热垫上恢复，然后单独笼养直至处死。在实验过程中监测小鼠。

在处理后第30天，通过腹膜内注射商业安乐死溶液(0.22ml/kg)将小鼠安乐死。将动物安乐死后，收集CSF并用PBS灌注所述动物，取下脑。将脑在4％多聚甲醛溶液中固定过夜，然后在蔗糖溶液中低温保护。使用切片机将脑以25μm切片。

大多数重组腺相关病毒载体研究将载体直接注射到实质中，这通常导致有限的细胞转导(Li等，脑室内输注rAAV-1-EGFP导致成年大鼠脑的多个区域中的转导：与rAAV2和rAAV5载体的比较研究(Intra-ventricular infusion of rAAV-1-EGFP resulted intransduction in multiple regions of adult rat brain:a comparative study withrAAV2and rAAV5vectors).Brain Res.2006Nov 29；1122(1)：1-9)。然而，将分泌信号序列和TAT序列附加于所述Ube3A蛋白允许从转染的细胞分泌HECT蛋白(即，UBE3A)并由相邻的神经元摄取所述肽，从而允许注射到离散的部位中以用作对整个脑中其他部位的蛋白质供应。

将来自处死的小鼠的脑用切片机进行切片，并用抗E6-AP抗体(A300-351A，BethylLabs，Montgomery，TX)与生物素化的抗兔第二抗体(Vector Labs#AB-1000)对E6-AP蛋白进行染色。用ABC(Vector Labs)和DAB反应完成染色。将切片固定并用Zeiss Axio Scan显微镜进行扫描。利用IAE-NearCYTE图像分析软件(匹兹堡大学Starzl移植研究所(Universityof Pittsburgh Starzl Transplant Institute)，Pittsburgh，PA)对染色面积百分比进行定量。

非转基因(Ntg)对照小鼠显示出正常小鼠脑中的Ube3a表达水平，其为约40％，如图4所示。相比之下，天使人综合征小鼠(AS)显示出约25％的Ube3a蛋白染色水平。将AAV4-STUb载体插入到AS小鼠的侧脑室中显示所述载体将E6-AP的水平提高至约30-35％。

脑切片的免疫组织化学分析用区域特异性染色表明非转基因小鼠具有比较高水平的E6-AP，如图5和6所示。正如所料，在天使人综合征模型小鼠中，E6-AP的染色模式相似，但E6-AP的水平急剧降低，如图7和8所示。将小鼠UBE3A载体施用于天使人综合征模型小鼠确实提高了E6-AP的水平，但是没有达到非转基因小鼠的水平，如图9和10所示。侧脑室的详细分析显示，注射UBE3A载体导致所述载体被室管膜细胞摄取，如图11所示。然而，除了由室管膜细胞摄取UBE3A载体和表达E6-AP外，实质中的相邻细胞对于E6-AP也是阳性染色的，如图中通过箭头所示。此外，在更远端的位置例如第三脑室中观察到染色，如图12所示。这表明E6-AP正被转染的细胞分泌并被相邻的细胞成功摄取，证实该构建体可用于引入E6-AP并且所述E6-AP构建体可用作治疗剂来治疗全脑的E6-AP表达缺陷，例如天使人综合征。使用AAV4-GFP载体的对照处理没有表现出对照蛋白的摄取，如图13所示，因为仅转导了室管膜和脉络丛细胞。

天使人综合征模型小鼠的冠状断面的详细分析证实，施用UBE3A构建体提高了侧脑室内和周围的E6-AP水平，如图14至20所示。

实施例5

利用pTR质粒产生人类载体构建体。智人(Homo sapien)UBE3A基因由下面的cDNA(AH005553.1)形成：

MKRAAAKHLIERYYHQLTEGCGNEACTNEFCASCPTFLRMDNNAAAIKALELYKINAKLCDPHPSKKGASSAYLENSKGAPNNSCSEIKMNKKGARIDFKDVTYLTEEKVYEILELCREREDYSPLIRVIGRVFSSAEALVQSFRKVKQHTKEELKSLQAKDEDKDEDEKEKAACSAAAMEEDSEASSSRIGDSSQGDNNLQKLGPDDVSVDIDAIRRVYTRLLSNEKIETAFLNALVYLSPNVECDLTYHNVYSRDPNYLNLFIIVMENRNLHSPEYLEMALPLFCKAMSKLPLAAQGKLIRLWSKYNADQIRRMMETFQQLITYKVISNEFNSRNLVNDDDAIVAASKCLKMVYYANVVGGEVDTNHNEEDDEEPIPESSELTLQELLGEERRNKKGPRVDPLETELGVKTLDCRKPLIPFEEFINEPLNEVLEMDKDYTFFKVETENKFSFMTCPFILNAVTKNLGLYYDNRIRMYSERRITVLYSLVQGQQLNPYLRLKVRRDHIIDDALVRLEMIAMENPADLKKQLYVEFEGEQGVDEGGVSKEFFQLVVEEIFNPDIGMFTYDESTKLFWFNPSSFETEGQFTLIGIVLGLAIYNNCILDVHFPMVVYRKLMGKKGTFRDLGDSHPVLYQSLKDLLEYEGNVEDDMMITFQISQTDLFGNPMMYDLKENGDKIPITNENRKEFVNLYSDYILNKSVEKQFKAFRRGFHMVTNESPLKYLFRPEEIELLICGSRNLDFQALEETTEYDGGYTRDSVLIREFWEIVHSFTDEQKRLFLQFTTGTDRAPVGGLGKLKMIIAKNGPDTERLPTSHTCFNVLLLPEYSSKEKLKERLLKAITYAKGFGML(SEQ ID No.7)。

将所述cDNA亚克隆并测序。将UBE3A的变体1基因(SEQ ID No.6)融合到编码分泌信号肽的三个基因之一，所述三个基因是基于GDNF的：

ATGAAGTTATGGGATGTCGTGGCTGTCTGCCTGGTGCTGCTCCACACCGCGTCCGCC(SEQ IDNo.8)，

来自胰岛素蛋白的：

ATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGCTGCTGGCCCTCTGGGGACCTGACCCAGCCGCAGCC(SEQ ID No.9)，

或来自IgK的：

ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGT(SEQ IDNo.10)。

将所述构建体插入到hSTUb载体中，在CMV鸡-β肌动蛋白杂交启动子或人泛素c启动子下。存在土拨鼠肝炎转录后调控元件(WPRE)以增加表达水平。

然后将UBE3A分泌信号构建体与细胞摄取肽(细胞穿透肽)相连；

所述肽是HIV TAT序列

YGRKKRRQRRR(SEQ ID No.5)；或

HIV TATk序列

YARKAARQARA(SEQ ID No.11)。

然后利用实施例2中描述的热激法，将如图21所示的人类UBE3A载体转化到大肠杆菌中。所述转化的大肠杆菌在含有氨苄青霉素的肉汤中增殖，以选择所述载体并收集大量载体。

UBE3A的其它序列包括变体1、2或3，如下所示：

智人UBE3A变体1：

智人UBE3A变体2：

智人UBE3A变体3：

实施例6

在HEK293细胞(美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA)中测试人类载体特性，所述HEK293细胞在含有10％FBS和1％Pen/Strep的DMEM中在37℃5％CO₂下生长并在80％汇合时传代培养。

利用PEI转染法将所述载体(6孔板中2μg/孔)转染到所述细胞中。在转染前2天，将所述细胞在6孔板中用DMEM培养基以0.5x 10⁶个细胞/孔传代培养。转染前一天晚上更换培养基。将不含内毒素的dH₂O加热至约80℃，并溶解聚乙烯亚胺(Sigma-Aldrich Co.LLC，St.Louis，MO)。让所述溶液冷却至约25℃，并用氢氧化钠中和所述溶液。对于每个被转染的孔，将AAV4-STUb载体或阴性对照(仅培养基)以2μg比每200μL添加到无血清DMEM中，并向每个孔的混合物添加9μl的1μg/μl聚乙烯亚胺。将转染混合物在室温下温育15分钟，然后以210μL/孔添加到每个细胞孔中并温育48小时。通过从所述板上刮下细胞来收获细胞和培养基。然后将所述培养基和细胞以5000xg离心5分钟。

对于提取物的Western印迹，将细胞沉淀团重悬于50μL低渗缓冲液中，并通过三次反复冻融来裂解细胞。将15μL裂解物用Laemmli样品缓冲液加热，并在BioRad 4-20％丙烯酰胺凝胶上跑胶。利用TransBlot转移到硝酸纤维素膜上。用5％牛奶封闭所述印迹，并利用抗E6AP抗体检测蛋白质。

如图22所示，用所述构建体转染的细胞表达UBE3A基因，即E6-AP。此外，将该基因附加到各种分泌信号表现出基于所述分泌信号肽的混合结果。例如，使用基于GDNF分泌信号的构建体的转染表现出来自转染细胞的表达较少和没有可检测到的分泌，如图23所示。使用胰岛素分泌信号导致E6AP从转染细胞的中度分泌，以及在所述细胞内所述构建体的高表达。胰岛素信号分泌的结果利用带有HA标签的构建体来证实，如图24所示。

在前面的说明书中，所有公开的文件、行为或信息并不构成承认其任何组合的文件、行为或信息是公众可利用的、公众已知的、本领域一般知识的一部分、或者在优先权日时已知与解决任何问题相关的。

上面引用的所有出版物的公开内容各自以其整体通过引用明确地并入本文，与各自通过引用单独并入的程度相同。

虽然已经描述和说明了治疗UBE3A缺陷的方法的具体实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不偏离本发明的广义精神和原理的情况下，变化和修改是可能的。还要理解，权利要求书意图覆盖本文中描述的发明的所有上位和下位特征，以及作为语言问题可以被认为落在本发明的范围之间的所有发明范围陈述。

序列表

<110> 南佛罗里达大学

<120> 用于天使人综合征的基因治疗方法的修饰的UBE3A基因

<130> 1372.1055.PRWO

<141> 2016-05-09

<150> 62/158,269

<151> 2015-05-07

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2550

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 1

atgaagcgag cagctgcaaa gcatctaata gaacgctact accatcagtt aactgagggc 60

tgtggaaatg aggcctgcac gaatgagttt tgtgcttcct gtccaacttt tcttcgtatg 120

gataacaatg cagcagctat taaagccctt gagctttata aaattaatgc aaaactctgt 180

gatcctcatc cctccaagaa aggagcaagc tcagcttacc ttgagaactc aaaaggtgca 240

tctaacaact cagagataaa aatgaacaag aaggaaggaa aagattttaa agatgtgatt 300

tacctaactg aagagaaagt atatgaaatt tatgaatttt gtagagagag tgaggattat 360

tcccctttaa ttcgtgtaat tggaagaata ttttctagtg ctgaggcact ggttctgagc 420

tttcggaaag tcaaacagca cacaaaggag gaattgaaat ctcttcaaga aaaggatgaa 480

gacaaggatg aagatgaaaa ggaaaaagct gcatgttctg ctgctgctat ggaagaagac 540

tcagaagcat cttcttcaag gatgggtgat agttcacagg gagacaacaa tgtacaaaaa 600

ttaggtcctg atgatgtgac tgtggatatt gatgctatta gaagggtcta cagcagtttg 660

ctcgctaatg aaaaattaga aactgccttc ctgaatgcac ttgtatatct gtcacctaac 720

gtggaatgtg atttgacata tcataatgtg tatactcgag atcctaatta tctcaatttg 780

ttcattattg taatggagaa tagtaatctc cacagtcctg aatatctgga aatggcgttg 840

ccattatttt gcaaagctat gtgtaagcta ccccttgaag ctcaaggaaa actgattagg 900

ctgtggtcta aatacagtgc tgaccagatt cggagaatga tggaaacatt tcagcaactt 960

attacctaca aagtcataag caatgaattt aatagccgaa atctagtgaa tgatgatgat 1020

gccattgttg ctgcttcaaa gtgtttgaaa atggtttact atgcaaatgt agtgggaggg 1080

gatgtggaca caaatcataa tgaggaagat gatgaagaac ccatacctga gtccagcgaa 1140

ttaacacttc aggagcttct gggagatgaa agaagaaata agaaaggtcc tcgagtggat 1200

ccactagaaa ccgaacttgg cgttaaaact ctagactgtc gaaaaccact tatctccttt 1260

gaagaattca ttaatgaacc actgaatgat gttctagaaa tggacaaaga ttataccttt 1320

ttcaaagttg aaacagagaa caaattctct tttatgacat gtccctttat attgaatgct 1380

gtcacaaaga atctgggatt atattatgac aatagaattc gcatgtacag tgaaagaaga 1440

atcactgttc tttacagcct agttcaagga cagcagttga atccgtattt gagactcaaa 1500

gtcagacgtg accatattat agatgatgca ctggtccggc tagagatgat tgctatggaa 1560

aatcctgcag acttgaagaa gcagttgtat gtggaatttg aaggagaaca aggagtaatg 1620

agggaggcgt ttccaaagag ttttttcagt tgggttgtgg aggaaatttt taatccaaat 1680

attggtatgt tcacatatga tgaagctacg aaattatttt ggtttaatcc atcttctttt 1740

gaaactgagg gtcaggttta ctctgattgg catatcctgg gtctggctat ttacaataat 1800

tgtatactgg atgtccattt tcccatggtt gtatacagga agctaatggg gaaaaaagga 1860

acctttcgtg acttgggaga ctctcaccca gttttatatc agagtttaaa ggatttattg 1920

gaatatgaag ggagtgtgga agatgatatg atgatcactt tccagatatc acagacagat 1980

ctttttggta acccaatgat gtatgatcta aaagaaaatg gtgataaaat tccaattaca 2040

aatgaaaaca ggaaggaatt tgtcaatctc tattcagact acattctcaa taaatctgta 2100

gaaaaacaat tcaaggcatt tcgcagaggt tttcatatgg tgactaatga atcgccctta 2160

aaatacttat tcagaccaga agaaattgaa ttgcttatat gtggaagccg gaatctagat 2220

ttccaggcac tagaagaaac tacagagtat gacggtggct atacgaggga atctgttgtg 2280

attagggagt tctgggaaat tgttcattcg tttacagatg aacagaaaag actctttctg 2340

cagtttacaa caggcacaga cagagcacct gttggaggac taggaaaatt gaagatgatt 2400

atagccaaaa atggcccaga cacagaaagg ttacctacat ctcatacttg ctttaatgtc 2460

cttttacttc cggaatattc aagcaaagaa aaacttaaag agagattgtt gaaggccatc 2520

acatatgcca aaggatttgg catgctgtaa 2550

<210> 2

<211> 78

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 2

atggccctgt tggtgcactt cctacccctg ctggccctgc ttgccctctg ggagcccaaa 60

cccacccagg cttttgtc 78

<210> 3

<211> 26

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 3

Met Ala Leu Leu Val His Phe Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu

1 5 10 15

Trp Glu Pro Lys Pro Thr Gln Ala Phe Val

20 25

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> Human immunodefiency virus

<400> 4

tacggcagaa agaagaggag gcagagaagg aga 33

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> Human immunodeficiency virus

<400> 5

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 6

<211> 10893

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (122)..(122)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (340)..(340)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1145)..(1145)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1180)..(1180)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1257)..(1257)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (5410)..(5410)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (7624)..(7624)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (7644)..(7644)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (7647)..(7647)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (7741)..(7741)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (7836)..(7836)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 6

ggagtagttt actgagccac taatctaaag tttaatactg tgagtgaata ccagtgagta 60

cctttgttaa tgtggataac caatacttgg ctataggaag ttttttagtt gtgtgtttta 120

tnacacgtat ttgactttgt gaataattat ggcttataat ggcttgtctg ttggtatcta 180

tgtatagcgt ttacagtttc ctttaaaaaa catgcattga gttttttaat agtccaaccc 240

ttaaaataaa tgtgttgtat ggccacctga tctgaccact ttctttcatg ttgacatctt 300

taattttaaa actgttttat ttagtgctta aatcttgttn acaaaattgt cttcctaagt 360

aatatgtcta cctttttttt tggaatatgg aatattttgc taactgtttc tcaattgcat 420

tttacagatc aggagaacct cagtctgacg acattgaagc tagccgaatg taagtgtaac 480

ttggttgaga ctgtggttct tattttgagt tgccctagac tgctttaaat tacgtcacat 540

tatttggaaa taatttctgg ttaaaagaaa ggaatcattt agcagtaaat gggagatagg 600

aacataccta ctttttttcc tatcagataa ctctaaacct cggtaacagt ttactaggtt 660

tctactacta gatagataaa tgcacacgcc taaattctta gtctttttgc ttccctggta 720

gcagttgtag ggaaataggg aggttgagga aagagtttaa cagtctcaac gcctaccata 780

tttaaggcat caagtactat gttatagata cagagatgcg taataattag ttttcaccct 840

acagaaattt atattatact caagagtgaa agatgcagaa gcaaataatt tcagtcactg 900

aggtagaatg gtatccaaaa tacaatagta acatgaagga gtactggagt accaggtatg 960

caataggaat ctagtgtaga tggcagggaa gtaagagtgg ccaggaaatg ctaagttcag 1020

tcttgaaatg tgactgggaa tcaggcagct atcaactata agtcaaatgt ttacaagctg 1080

ttaaaaatga aatactgatt atgtaaaaga aaaccggatt gatgctttaa atagactcat 1140

tttcntaatg ctaattttta aaatgataga atcctacaan tcttagctgt aaaccttgtg 1200

atttttcagc tgttgtacta aacaacttaa gcacatatac catcagacaa gcccccntcc 1260

ccccttttaa accaaaggaa tgtatactct gttaatacag tcagtaagca ttgacattct 1320

ttatcataat atcctagaaa atatttatta actatttcac tagtcaggag ttgtggtaaa 1380

tagtgcatct ccattttcta cttctcatct tcatacacag gttaatcact tcagtgcttg 1440

actaactttt gccttgatga tatgttgagc tttgtacttg agagctgtac taatcactgt 1500

gcttattgtt tgaatgtttg gtacaggaag cgagcagctg caaagcatct aatagaacgc 1560

tactaccacc agttaactga gggctgtgga aatgaagcct gcacgaatga gttttgtgct 1620

tcctgtccaa cttttcttcg tatggataat aatgcagcag ctattaaagc cctcgagctt 1680

tataagatta atgcaaaact ctgtgatcct catccctcca agaaaggagc aagctcagct 1740

taccttgaga actcgaaagg tgcccccaac aactcctgct ctgagataaa aatgaacaag 1800

aaaggcgcta gaattgattt taaaggtaag atgttttatt ttcaattgag aattgttgcc 1860

tgaaaaccat gtgggagatt taaatgtatt agtttttatt tgttttttct tctgtgacat 1920

aaagacattt tgatatcgta gaaccaattt tttattgtgg taacggacag gaataataac 1980

tacattttac aggtctaatc attgctaatt agaagcagat catatgccaa aagttcattt 2040

gttaatagat tgatttgaac tttttaaaat tcttaggaaa aatgtattaa gtggtagtga 2100

atctccaaaa ctatttaaga gctgtattat gattaatcag tacatgacat attggttcat 2160

atttataatt aaagctatac attaatagat atcttgatta taaagaaagt ttaaactcat 2220

gatcttatta agagttatac attgttgaaa gaatgtaaaa gcatgggtga ggtcattggt 2280

ataggtaggt agttcattga aaaaaatagg taagcattaa attttgtttg ctgaatctaa 2340

gtattagata ctttaagagt tgtatatcat aaatgatatt gagcctagaa tgtttggctg 2400

ttttactttt agaacttttt gcaacagagt aaacatacat attatgaaaa taaatgttct 2460

cttttttcct ctgattttct agatgtgact tacttaacag aagagaaggt atatgaaatt 2520

cttgaattat gtagagaaag agaggattat tcccctttaa tccgtgttat tggaagagtt 2580

ttttctagtg ctgaggcatt ggtacagagc ttccggaaag ttaaacaaca caccaaggaa 2640

gaactgaaat ctcttcaagc aaaagatgaa gacaaagatg aagatgaaaa ggaaaaagct 2700

gcatgttctg ctgctgctat ggaagaagac tcagaagcat cttcctcaag gataggtgat 2760

agctcacagg gagacaacaa tttgcaaaaa ttaggccctg atgatgtgtc tgtggatatt 2820

gatgccatta gaagggtcta caccagattg ctctctaatg aaaaaattga aactgccttt 2880

ctcaatgcac ttgtatattt gtcacctaac gtggaatgtg acttgacgta tcacaatgta 2940

tactctcgag atcctaatta tctgaatttg ttcattatcg taatggagaa tagaaatctc 3000

cacagtcctg aatatctgga aatggctttg ccattatttt gcaaagcgat gagcaagcta 3060

ccccttgcag cccaaggaaa actgatcaga ctgtggtcta aatacaatgc agaccagatt 3120

cggagaatga tggagacatt tcagcaactt attacttata aagtcataag caatgaattt 3180

aacagtcgaa atctagtgaa tgatgatgat gccattgttg ctgcttcgaa gtgcttgaaa 3240

atggtttact atgcaaatgt agtgggaggg gaagtggaca caaatcacaa tgaagaagat 3300

gatgaagagc ccatccctga gtccagcgag ctgacacttc aggaactttt gggagaagaa 3360

agaagaaaca agaaaggtcc tcgagtggac cccctggaaa ctgaacttgg tgttaaaacc 3420

ctggattgtc gaaaaccact tatccctttt gaagagttta ttaatgaacc actgaatgag 3480

gttctagaaa tggataaaga ttatactttt ttcaaagtag aaacagagaa caaattctct 3540

tttatgacat gtccctttat attgaatgct gtcacaaaga atttgggatt atattatgac 3600

aatagaattc gcatgtacag tgaacgaaga atcactgttc tctacagctt agttcaagga 3660

cagcagttga atccatattt gagactcaaa gttagacgtg accatatcat agatgatgca 3720

cttgtccggg taagttgggc tgctagatta aaaacctaat aatggggata tcatgataca 3780

gttcagtgaa ttcattttaa aagtgactga aaaaaatgat accatatagc ataggaacac 3840

atggacattt ctgatcttat ataagtatta tacttttgtt gttcctgtgc aagtttatag 3900

atgtgttcta caaagtatcg gttgtattat ataatggtca tgctatcttt gaaaaagaat 3960

gggttttcta aatcttgaaa actaaatcca aagtttcttt cattcagaag agaatagagt 4020

gttggacaaa gaccagaaca agagaaatgt ggagataccc aataataagt gtggatgtgc 4080

agtcttgaac tgggagtaat ggtacagtaa aaccatacca taaaattata ggtagtgtcc 4140

aaaaaattcc atcgtgtaaa attcagagtt gcattattgt ggacttgaag aagcagttgt 4200

atgtgggacg gtatcgataa gcttgatatc gaattcctgc agcccggggg atccactagt 4260

gtggtaatta atactaagtc ttactgtgag agaccataaa ctgctttagt attcagtgta 4320

tttttcttaa ttgaaatatt taacttatga cttagtagat actaagactt aacccttgag 4380

tttctattct aataaaggac tactaatgaa caattttgag gttagacctc tactccattg 4440

tttttgctga aatgatttag ctgcttttcc atgtcctgtg tagtccagac ttaacacaca 4500

agtaataaaa tcttaattaa ttgtatgtta atttcataac aaatcagtaa agttagcttt 4560

ttactatgct agtgtctgtt ttgtgtctgt ctttttgatt atctttaaga ctgaatcttt 4620

gtcttcactg gctttttatc agtttgcttt ctgtttccat ttacatacaa aaagtcaaaa 4680

atttgtattt gtttcctaat cctactcctt gtttttattt tgtttttttc ctgatactag 4740

caatcatctt cttttcatgt ttatcttttc aatcactagc tagagatgat cgctatggaa 4800

aatcctgcag acttgaagaa gcagttgtat gtggaatttg aaggagaaca aggagttgat 4860

gagggaggtg tttccaaaga attttttcag ctggttgtgg aggaaatctt caatccagat 4920

attggtaaat acattagtaa tgtgattatg gtgtcgtatc atcttttgag ttagttattt 4980

gtttatctta ctttgtaaat attttcagct atgaagagca gcaaaagaag gatttggtat 5040

ggattaccca gaatcacaca tcatgactga atttgtaggt tttaggaact gatttgtatc 5100

actaatttat tcaaattctt ttatttctta gaaggaatat tctaatgaag gaaattatct 5160

ctttggtaaa ctgaattgaa agcactttag aatggtatat tggaacagtt ggagggattt 5220

ctttgctttt tgttgtctaa aaccatcatc aaactcacgg ttttcctgac ctgtgaactt 5280

caaagaacaa tggtttgaag agtattgaga gactgtctca caagtatgtc atgctcaaag 5340

ttcagaaaca ctagctgata tcacattaat taggtttatt tgctataaga tttcttgggg 5400

cttaatatan gtagtgttcc cccaaacttt ttgaactcca gaactctttt ctgccctaac 5460

agtagctact caggagctga ggcaggagaa ttgtttgaac ctaggaggca gaggttgcag 5520

tgagctgaga tcgtgccact ccagcccacc cctgggtaac agagcgagac tccatctcaa 5580

agaaaaaaat gaaaaattgt tttcaaaaat agtacgtgtg gtacagatat aagtaattat 5640

atttttataa atgaaacact ttggaaatgt agccattttt tgttttttta tgtttatttt 5700

tcagctatgg gtggataaag catgaatata acttttctta tgtgttagta gaaaattaga 5760

aagcttgaat ttaattaacg tatttttcta cccgatgcca ccaaattact tactacttta 5820

ttcctttggc ttcataaaat tacatatcac cattcacccc aatttatagc agatatatgt 5880

ggacattgtt ttctcaagtg ctaatataat agaaatcaat gttgcatgcc taattacata 5940

tattttaaat gttttatatg cataattatt ttaagtttat atttgtatta ttcatcagtc 6000

cttaataaaa tacaaaagta atgtattttt aaaaatcatt tcttataggt atgttcacat 6060

acgatgaatc tacaaaattg ttttggttta atccatcttc ttttgaaact gagggtcagt 6120

ttactctgat tggcatagta ctgggtctgg ctatttacaa taactgtata ctggatgtac 6180

attttcccat ggttgtctac aggaagctaa tggggaaaaa aggaactttt cgtgacttgg 6240

gagactctca cccagtaagt tctttgtcat ttttttaatt cagtctctta gattttattt 6300

aaatgcaaaa atttaattta tgtcaaaatt ttaaagtttt tgtttagaat ctttgttgat 6360

actcttatca ataagataaa aatgttttaa tctgaccgaa gtaccagaaa cacttaaaaa 6420

ctcaaagggg gacattttta tatattgctg tcagcacgaa gctttcgtaa gattgatttc 6480

atagagaagt gtttctaaac attttgtttg tgttttagtg aaatcttaag agataggtaa 6540

aaatcagagt agccctggct aagggtcttg gtagttacaa cgagtgtgcc tgctcctacc 6600

acccccaccc ccaccttgag acaccacaga atttctcata gagcacagtg tgaattctat 6660

tgctaaattg gtggtatggg gtttctcagc agagaatggg acatcacagt gactgacaat 6720

ctttctttta taggttggaa actatttggg ggactggagg gatactgtct acacttttta 6780

caatttttat tgataagatt tttgttgtct tctaagaaga gtgatataaa ttatttgttg 6840

tattttgtag ttctatggtg gcctcaattt accatttctg gttgctaggt tctatatcag 6900

agtttaaaag atttattgga gtatgaaggg aatgtggaag atgacatgat gatcactttc 6960

cagatatcac agacagatct ttttggtaac ccaatgatgt atgatctaaa ggaaaatggt 7020

gataaaattc caattacaaa tgaaaacagg aaggtaataa atgtttttat gtcacatttt 7080

gtctcttcat taacactttc aaagcatgta tgcttataat ttttaaagaa gtatctaata 7140

tagtctgtac aaaaaaaaaa caagtaacta agtttatgta aatgctagag tccacttttc 7200

taaatcttgg atataagttg gtatgaaagc acacagttgg gcactaaagc cccttttaga 7260

gaaagaggac atgaagcagg agatagttaa tagctaagtg tggttgtagt ataaagcaag 7320

aagcagggtg tttcttgtat taagctgtaa gcaggaacct catgattaag gtctttatca 7380

cagaacaaat aaaaattaca tttaatttac acatgtatat cctgtttgtg ataaaaatac 7440

atttctgaaa agtatacttt acgtcagatt tgggttctat tgactaaaat gtgttcatcg 7500

ggaatgggaa taacccagaa cataacaagc aaaaaattat gacaaatata tagtatacct 7560

ttaagaaaca tgtttatatt gatataattt tttgattaaa tattatacac actaagggta 7620

caangcacat tttcctttta tganttngat acagtagttt atgtgtcagt cagatacttc 7680

cacatttttg ctgaactgga tacagtaagc agcttaccaa atattctatg gtagaaaact 7740

nggacttcct ggtttgctta aatcaaatat attgtactct cttaaaacgg ttggcattta 7800

taaatagatg gatacatggt ttaaatgtgt ctgttnacat acctagttga gagaacctaa 7860

agaattttct gcgtctccag catttatatt cagttctgtt taatacatta tcgaaattga 7920

catttataag tatgacagtt ttgtgtatat ggccttttca tagcttaata ttggctgtaa 7980

cagagaattg tgaaattgta agaagtagtt ttctttgtag gtgtaaaatt gaatttttaa 8040

gaatattctt gacagtttta tgtatatggc cttttcatag cttaatattg gctataacag 8100

agaattgtga aattgttaag aagtaggtgt aaaattgaat ttttaagaat attcttgaat 8160

gtttttttct tggaaaaatt aaaaagctat gcagcccaat aacttgtgtt ttgtttgcat 8220

agcatattat aagaagttct tgtgattaat gttttctaca ggaatttgtc aatctttatt 8280

ctgactacat tctcaataaa tcagtagaaa aacagttcaa ggcttttcgg agaggttttc 8340

atatggtgac caatgaatct cccttaaagt acttattcag accagaagaa attgaattgc 8400

ttatatgtgg aagccgggta agaaagcagg tgtctgcaaa aagtcatgta tcgatttatt 8460

gtttgtaatg atacagtagt atagcagata actaagacat attttcttga atttgcagaa 8520

tctagatttc caagcactag aagaaactac agaatatgac ggtggctata ccagggactc 8580

tgttctgatt aggtgaggta cttagttctt cagaggaaga tttgattcac caaaggggtg 8640

tgtgattttg cttcagacct ttatctctag gtactaattc ccaaataagc aaactcacaa 8700

attgtcatct atatacttag atttgtattt gtaatataat caccattttt cagagctaat 8760

cttgtgattt atttcatgaa tgaagtgttg ttatatataa gtctcatgta atctcctgca 8820

tttggcgtat ggattatcta gtattcctca ctggttagag tatgcttact gctggttaga 8880

agataattaa aataaggcta ccatgtctgc aatttttcct ttcttttgaa ctctgcattt 8940

gtgaactgtt acatggcttc ccaggatcaa gcactttttg agtgaaatgg tagtctttta 9000

tttaattctt aagataatat gtccagatac atactagtat ttccatttta caccctaaaa 9060

aactaagccc tgaattctca cagaaagatg tagaggttcc cagttctatc tgcttttaaa 9120

caaatgccct tactactcta ctgtctactt ctgtgtacta catcatcgta tgtagttgtt 9180

tgcatttggg ccagttggtt ggggcagggg tctttttttc ttttgtccct taatctgtat 9240

cactttttcc tcccaaagtt gagttaaagg atgagtagac caggagaata aaggagaaag 9300

gataaataaa atatataccc aaaggcacct ggagttaatt tttccaaata ttcatttcag 9360

tctttttcaa ttcataggat tttgtctttt gctcattact gactgcataa tgtgattata 9420

ccatagttta aatagtcact tcctgttact acacacttgg gttttctcaa ttttttacta 9480

ttgtagtact aatattttac tatattgtaa tctaatccaa atttttacgt attcagagct 9540

gttcaggata aatttgcttg gaaattttta aatcaccaga agtgatacta tcctgataat 9600

taacttccaa gttgtctctt aatatagttt taatgcaaat cataagctta tgttagtacc 9660

agtcataatg aatgccaaac tgaaaccagt attgtatttt ttctcattag ggagttctgg 9720

gaaatcgttc attcatttac agatgaacag aaaagactct tcttgcagtt tacaacgggc 9780

acagacagag cacctgtggg aggactagga aaattaaaga tgattatagc caaaaatggc 9840

ccagacacag aaaggtaggt aattattaac ttgtgactgt atacctaccg aaaaccttgc 9900

attcctcgtc acatacatat gaactgtctt tatagtttct gagcacattc gtgattttat 9960

atacaaatcc ccaaatcata ttagacaatt gagaaaatac tttgctgtca ttgtgtgagg 10020

aaacttttaa gaaattgccc tagttaaaaa ttattatggg gctcacattg gtttggaatc 10080

aaattagtgt gattcattta cttttttgat tcccagcttg ttaattgaaa gccatataac 10140

atgatcatct atttagaatg gttacattga ggctcggaag attatcattt gattgtgcta 10200

gaatcctgtt atcaaatcat tttcttagtc atattgccag cagtgtttct aataagcatt 10260

taagagcaca cactttgcag tcttgtaaaa caggtttgag tattttctcc accttagagg 10320

aagttacttg acttctcagt gacctaacct ctaaagtgca tttactgatg tcctctctgt 10380

ggttttgttg tggaaagatt tagttaaatg aactgtaaga attcagtacc taaaatggta 10440

tctgttatgt agtaaaaact caatggatac agtatcttat catcgtcact agctttgagt 10500

aatttatagg ataaaggcaa cttggtagtt acacaacaaa aagtttatga tttgcattaa 10560

tgtatagttt gcattgcaga ccgtctcaac tatatacaat ctaaaaatag gagcatttaa 10620

ttctaagtgt atttcccatg acttacagtt ttcctgtttt tttccccttt tctctattta 10680

ggttacctac atctcatact tgctttaatg tgcttttact tccggaatac tcaagcaaag 10740

aaaaacttaa agagagattg ttgaaggcca tcacgtatgc caaaggattt ggcatgctgt 10800

aaaacaaaac aaaacaaaat aaaacaaaaa aaaggaagga aaaaaaaaga aaaaatttaa 10860

aaaattttaa aaatataacg agggataaat ttt 10893

<210> 7

<211> 852

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Met Lys Arg Ala Ala Ala Lys His Leu Ile Glu Arg Tyr Tyr His Gln

1 5 10 15

Leu Thr Glu Gly Cys Gly Asn Glu Ala Cys Thr Asn Glu Phe Cys Ala

20 25 30

Ser Cys Pro Thr Phe Leu Arg Met Asp Asn Asn Ala Ala Ala Ile Lys

35 40 45

Ala Leu Glu Leu Tyr Lys Ile Asn Ala Lys Leu Cys Asp Pro His Pro

50 55 60

Ser Lys Lys Gly Ala Ser Ser Ala Tyr Leu Glu Asn Ser Lys Gly Ala

65 70 75 80

Pro Asn Asn Ser Cys Ser Glu Ile Lys Met Asn Lys Lys Gly Ala Arg

85 90 95

Ile Asp Phe Lys Asp Val Thr Tyr Leu Thr Glu Glu Lys Val Tyr Glu

100 105 110

Ile Leu Glu Leu Cys Arg Glu Arg Glu Asp Tyr Ser Pro Leu Ile Arg

115 120 125

Val Ile Gly Arg Val Phe Ser Ser Ala Glu Ala Leu Val Gln Ser Phe

130 135 140

Arg Lys Val Lys Gln His Thr Lys Glu Glu Leu Lys Ser Leu Gln Ala

145 150 155 160

Lys Asp Glu Asp Lys Asp Glu Asp Glu Lys Glu Lys Ala Ala Cys Ser

165 170 175

Ala Ala Ala Met Glu Glu Asp Ser Glu Ala Ser Ser Ser Arg Ile Gly

180 185 190

Asp Ser Ser Gln Gly Asp Asn Asn Leu Gln Lys Leu Gly Pro Asp Asp

195 200 205

Val Ser Val Asp Ile Asp Ala Ile Arg Arg Val Tyr Thr Arg Leu Leu

210 215 220

Ser Asn Glu Lys Ile Glu Thr Ala Phe Leu Asn Ala Leu Val Tyr Leu

225 230 235 240

Ser Pro Asn Val Glu Cys Asp Leu Thr Tyr His Asn Val Tyr Ser Arg

245 250 255

Asp Pro Asn Tyr Leu Asn Leu Phe Ile Ile Val Met Glu Asn Arg Asn

260 265 270

Leu His Ser Pro Glu Tyr Leu Glu Met Ala Leu Pro Leu Phe Cys Lys

275 280 285

Ala Met Ser Lys Leu Pro Leu Ala Ala Gln Gly Lys Leu Ile Arg Leu

290 295 300

Trp Ser Lys Tyr Asn Ala Asp Gln Ile Arg Arg Met Met Glu Thr Phe

305 310 315 320

Gln Gln Leu Ile Thr Tyr Lys Val Ile Ser Asn Glu Phe Asn Ser Arg

325 330 335

Asn Leu Val Asn Asp Asp Asp Ala Ile Val Ala Ala Ser Lys Cys Leu

340 345 350

Lys Met Val Tyr Tyr Ala Asn Val Val Gly Gly Glu Val Asp Thr Asn

355 360 365

His Asn Glu Glu Asp Asp Glu Glu Pro Ile Pro Glu Ser Ser Glu Leu

370 375 380

Thr Leu Gln Glu Leu Leu Gly Glu Glu Arg Arg Asn Lys Lys Gly Pro

385 390 395 400

Arg Val Asp Pro Leu Glu Thr Glu Leu Gly Val Lys Thr Leu Asp Cys

405 410 415

Arg Lys Pro Leu Ile Pro Phe Glu Glu Phe Ile Asn Glu Pro Leu Asn

420 425 430

Glu Val Leu Glu Met Asp Lys Asp Tyr Thr Phe Phe Lys Val Glu Thr

435 440 445

Glu Asn Lys Phe Ser Phe Met Thr Cys Pro Phe Ile Leu Asn Ala Val

450 455 460

Thr Lys Asn Leu Gly Leu Tyr Tyr Asp Asn Arg Ile Arg Met Tyr Ser

465 470 475 480

Glu Arg Arg Ile Thr Val Leu Tyr Ser Leu Val Gln Gly Gln Gln Leu

485 490 495

Asn Pro Tyr Leu Arg Leu Lys Val Arg Arg Asp His Ile Ile Asp Asp

500 505 510

Ala Leu Val Arg Leu Glu Met Ile Ala Met Glu Asn Pro Ala Asp Leu

515 520 525

Lys Lys Gln Leu Tyr Val Glu Phe Glu Gly Glu Gln Gly Val Asp Glu

530 535 540

Gly Gly Val Ser Lys Glu Phe Phe Gln Leu Val Val Glu Glu Ile Phe

545 550 555 560

Asn Pro Asp Ile Gly Met Phe Thr Tyr Asp Glu Ser Thr Lys Leu Phe

565 570 575

Trp Phe Asn Pro Ser Ser Phe Glu Thr Glu Gly Gln Phe Thr Leu Ile

580 585 590

Gly Ile Val Leu Gly Leu Ala Ile Tyr Asn Asn Cys Ile Leu Asp Val

595 600 605

His Phe Pro Met Val Val Tyr Arg Lys Leu Met Gly Lys Lys Gly Thr

610 615 620

Phe Arg Asp Leu Gly Asp Ser His Pro Val Leu Tyr Gln Ser Leu Lys

625 630 635 640

Asp Leu Leu Glu Tyr Glu Gly Asn Val Glu Asp Asp Met Met Ile Thr

645 650 655

Phe Gln Ile Ser Gln Thr Asp Leu Phe Gly Asn Pro Met Met Tyr Asp

660 665 670

Leu Lys Glu Asn Gly Asp Lys Ile Pro Ile Thr Asn Glu Asn Arg Lys

675 680 685

Glu Phe Val Asn Leu Tyr Ser Asp Tyr Ile Leu Asn Lys Ser Val Glu

690 695 700

Lys Gln Phe Lys Ala Phe Arg Arg Gly Phe His Met Val Thr Asn Glu

705 710 715 720

Ser Pro Leu Lys Tyr Leu Phe Arg Pro Glu Glu Ile Glu Leu Leu Ile

725 730 735

Cys Gly Ser Arg Asn Leu Asp Phe Gln Ala Leu Glu Glu Thr Thr Glu

740 745 750

Tyr Asp Gly Gly Tyr Thr Arg Asp Ser Val Leu Ile Arg Glu Phe Trp

755 760 765

Glu Ile Val His Ser Phe Thr Asp Glu Gln Lys Arg Leu Phe Leu Gln

770 775 780

Phe Thr Thr Gly Thr Asp Arg Ala Pro Val Gly Gly Leu Gly Lys Leu

785 790 795 800

Lys Met Ile Ile Ala Lys Asn Gly Pro Asp Thr Glu Arg Leu Pro Thr

805 810 815

Ser His Thr Cys Phe Asn Val Leu Leu Leu Pro Glu Tyr Ser Ser Lys

820 825 830

Glu Lys Leu Lys Glu Arg Leu Leu Lys Ala Ile Thr Tyr Ala Lys Gly

835 840 845

Phe Gly Met Leu

850

<210> 8

<211> 57

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 8

atgaagttat gggatgtcgt ggctgtctgc ctggtgctgc tccacaccgc gtccgcc 57

<210> 9

<211> 72

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 9

atggccctgt ggatgcgcct cctgcccctg ctggcgctgc tggccctctg gggacctgac 60

ccagccgcag cc 72

<210> 10

<211> 60

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

<210> 11

<211> 11

<212> DNA

<213> Human immunodefiency virus

<400> 11

yarkaarqar a 11

<210> 12

<211> 2767

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 12

acagtatgac atctgatgct ggagggtcgc actttcacaa atgagtcagc tggtacatgg 60

ggttatcatc aatttttagc tcttctgtct gggagataca agtttggaag caatcttggg 120

gtacttaccc acaaggctgg tggagaccag atcaggagaa cctcagtctg acgacattga 180

agctagccga atgaagcgag cagctgcaaa gcatctaata gaacgctact accaccagtt 240

aactgagggc tgtggaaatg aagcctgcac gaatgagttt tgtgcttcct gtccaacttt 300

tcttcgtatg gataataatg cagcagctat taaagccctc gagctttata agattaatgc 360

aaaactctgt gatcctcatc cctccaagaa aggagcaagc tcagcttacc ttgagaactc 420

gaaaggtgcc cccaacaact cctgctctga gataaaaatg aacaagaaag gcgctagaat 480

tgattttaaa gatgtgactt acttaacaga agagaaggta tatgaaattc ttgaattatg 540

tagagaaaga gaggattatt cccctttaat ccgtgttatt ggaagagttt tttctagtgc 600

tgaggcattg gtacagagct tccggaaagt taaacaacac accaaggaag aactgaaatc 660

tcttcaagca aaagatgaag acaaagatga ggatgaaaag gaaaaagctg catgttctgc 720

tgctgctatg gaagaagact cagaagcatc ttcctcaagg ataggtgata gctcacaggg 780

agacaacaat ttgcaaaaat taggccctga tgatgtgtct gtggatattg atgccattag 840

aagggtctac accagattgc tctctaatga aaaaattgaa actgcctttc tcaatgcact 900

tgtatatttg tcacctaacg tggaatgtga cttgacgtat cacaatgtat actctcgaga 960

tcctaattat ctgaatttgt tcattatcgt aatggagaat agaaatctcc acagtcctga 1020

atatctggaa atggctttgc cattattttg caaagcgatg agcaagctac cccttgcagc 1080

ccaaggaaaa ctgatcagac tgtggtctaa atacaatgca gaccagattc ggagaatgat 1140

ggagacattt cagcaactta ttacttataa agtcataagc aatgaattta acagtcgaaa 1200

tctagtgaat gatgatgatg ccattgttgc tgcttcgaag tgcttgaaaa tggtttacta 1260

tgcaaatgta gtgggagggg aagtggacac aaatcacaat gaagaagatg atgaagagcc 1320

catccctgag tccagcgagc tgacacttca ggaacttttg ggagaagaaa gaagaaacaa 1380

gaaaggtcct cgagtggacc ccctggaaac tgaacttggt gttaaaaccc tggattgtcg 1440

aaaaccactt atcccttttg aagagtttat taatgaacca ctgaatgagg ttctagaaat 1500

ggataaagat tatacttttt tcaaagtaga aacagagaac aaattctctt ttatgacatg 1560

tccctttata ttgaatgctg tcacaaagaa tttgggatta tattatgaca atagaattcg 1620

catgtacagt gaacgaagaa tcactgttct ctacagctta gttcaaggac agcagttgaa 1680

tccatatttg agactcaaag ttagacgtga ccatatcata gatgatgcac ttgtccggct 1740

agagatgatc gctatggaaa atcctgcaga cttgaagaag cagttgtatg tggaatttga 1800

aggagaacaa ggagttgatg agggaggtgt ttccaaagaa ttttttcagc tggttgtgga 1860

ggaaatcttc aatccagata ttggtatgtt cacatacgat gaatctacaa aattgttttg 1920

gtttaatcca tcttcttttg aaactgaggg tcagtttact ctgattggca tagtactggg 1980

tctggctatt tacaataact gtatactgga tgtacatttt cccatggttg tctacaggaa 2040

gctaatgggg aaaaaaggaa cttttcgtga cttgggagac tctcacccag ttctatatca 2100

gagtttaaaa gatttattgg agtatgaagg gaatgtggaa gatgacatga tgatcacttt 2160

ccagatatca cagacagatc tttttggtaa cccaatgatg tatgatctaa aggaaaatgg 2220

tgataaaatt ccaattacaa atgaaaacag gaaggaattt gtcaatcttt attctgacta 2280

cattctcaat aaatcagtag aaaaacagtt caaggctttt cggagaggtt ttcatatggt 2340

gaccaatgaa tctcccttaa agtacttatt cagaccagaa gaaattgaat tgcttatatg 2400

tggaagccgg aatctagatt tccaagcact agaagaaact acagaatatg acggtggcta 2460

taccagggac tctgttctga ttagggagtt ctgggaaatc gttcattcat ttacagatga 2520

acagaaaaga ctcttcttgc agtttacaac gggcacagac agagcacctg tgggaggact 2580

aggaaaatta aagatgatta tagccaaaaa tggcccagac acagaaaggt tacctacatc 2640

tcatacttgc tttaatgtgc ttttacttcc ggaatactca agcaaagaaa aacttaaaga 2700

gagattgttg aaggccatca cgtatgccaa aggatttggc atgctgtaaa acaaaacaaa 2760

acaaaat 2767

<210> 13

<211> 5276

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 13

agccagtcct cccgtcttgc gccgcggccg cgagatccgt gtgtctccca agatggtggc 60

gctgggctcg gggtgactac aggagacgac ggggcctttt cccttcgcca ggacccgaca 120

caccaggctt cgctcgctcg cgcacccctc cgccgcgtag ccatccgcca gcgcgggcgc 180

ccgccatccg ccgcctactt acgcttcacc tctgccgacc cggcgcgctc ggctgcgggc 240

ggcggcgcct ccttcggctc ctcctcggaa tagctcgcgg cctgtagccc ctggcaggag 300

ggcccctcag ccccccggtg tggacaggca gcggcggctg gcgacgaacg ccgggatttc 360

ggcggccccg gcgctccctt tcccggcctc gttttccgga taaggaagcg cgggtcccgc 420

atgagccccg gcggtggcgg cagcgaaaga gaacgaggcg gtggcgggcg gaggcggcgg 480

gcgagggcga ctacgaccag tgaggcggcc gccgcagccc aggcgcgggg gcgacgacag 540

gttaaaaatc tgtaagagcc tgattttaga attcaccagc tcctcagaag tttggcgaaa 600

tatgagttat taagcctacg ctcagatcaa ggtagcagct agactggtgt gacaacctgt 660

ttttaatcag tgactcaaag ctgtgatcac cctgatgtca ccgaatggcc acagcttgta 720

aaagagagtt acagtggagg taaaaggagt ggcttgcagg atggagaagc tgcaccagtg 780

ttattggaaa tcaggagaac ctcagtctga cgacattgaa gctagccgaa tgaagcgagc 840

agctgcaaag catctaatag aacgctacta ccaccagtta actgagggct gtggaaatga 900

agcctgcacg aatgagtttt gtgcttcctg tccaactttt cttcgtatgg ataataatgc 960

agcagctatt aaagccctcg agctttataa gattaatgca aaactctgtg atcctcatcc 1020

ctccaagaaa ggagcaagct cagcttacct tgagaactcg aaaggtgccc ccaacaactc 1080

ctgctctgag ataaaaatga acaagaaagg cgctagaatt gattttaaag atgtgactta 1140

cttaacagaa gagaaggtat atgaaattct tgaattatgt agagaaagag aggattattc 1200

ccctttaatc cgtgttattg gaagagtttt ttctagtgct gaggcattgg tacagagctt 1260

ccggaaagtt aaacaacaca ccaaggaaga actgaaatct cttcaagcaa aagatgaaga 1320

caaagatgaa gatgaaaagg aaaaagctgc atgttctgct gctgctatgg aagaagactc 1380

agaagcatct tcctcaagga taggtgatag ctcacaggga gacaacaatt tgcaaaaatt 1440

aggccctgat gatgtgtctg tggatattga tgccattaga agggtctaca ccagattgct 1500

ctctaatgaa aaaattgaaa ctgcctttct caatgcactt gtatatttgt cacctaacgt 1560

ggaatgtgac ttgacgtatc acaatgtata ctctcgagat cctaattatc tgaatttgtt 1620

cattatcgta atggagaata gaaatctcca cagtcctgaa tatctggaaa tggctttgcc 1680

attattttgc aaagcgatga gcaagctacc ccttgcagcc caaggaaaac tgatcagact 1740

gtggtctaaa tacaatgcag accagattcg gagaatgatg gagacatttc agcaacttat 1800

tacttataaa gtcataagca atgaatttaa cagtcgaaat ctagtgaatg atgatgatgc 1860

cattgttgct gcttcgaagt gcttgaaaat ggtttactat gcaaatgtag tgggagggga 1920

agtggacaca aatcacaatg aagaagatga tgaagagccc atccctgagt ccagcgagct 1980

gacacttcag gaacttttgg gagaagaaag aagaaacaag aaaggtcctc gagtggaccc 2040

cctggaaact gaacttggtg ttaaaaccct ggattgtcga aaaccactta tcccttttga 2100

agagtttatt aatgaaccac tgaatgaggt tctagaaatg gataaagatt atactttttt 2160

caaagtagaa acagagaaca aattctcttt tatgacatgt ccctttatat tgaatgctgt 2220

cacaaagaat ttgggattat attatgacaa tagaattcgc atgtacagtg aacgaagaat 2280

cactgttctc tacagcttag ttcaaggaca gcagttgaat ccatatttga gactcaaagt 2340

tagacgtgac catatcatag atgatgcact tgtccggcta gagatgatcg ctatggaaaa 2400

tcctgcagac ttgaagaagc agttgtatgt ggaatttgaa ggagaacaag gagttgatga 2460

gggaggtgtt tccaaagaat tttttcagct ggttgtggag gaaatcttca atccagatat 2520

tggtatgttc acatacgatg aatctacaaa attgttttgg tttaatccat cttcttttga 2580

aactgagggt cagtttactc tgattggcat agtactgggt ctggctattt acaataactg 2640

tatactggat gtacattttc ccatggttgt ctacaggaag ctaatgggga aaaaaggaac 2700

ttttcgtgac ttgggagact ctcacccagt tctatatcag agtttaaaag atttattgga 2760

gtatgaaggg aatgtggaag atgacatgat gatcactttc cagatatcac agacagatct 2820

ttttggtaac ccaatgatgt atgatctaaa ggaaaatggt gataaaattc caattacaaa 2880

tgaaaacagg aaggaatttg tcaatcttta ttctgactac attctcaata aatcagtaga 2940

aaaacagttc aaggcttttc ggagaggttt tcatatggtg accaatgaat ctcccttaaa 3000

gtacttattc agaccagaag aaattgaatt gcttatatgt ggaagccgga atctagattt 3060

ccaagcacta gaagaaacta cagaatatga cggtggctat accagggact ctgttctgat 3120

tagggagttc tgggaaatcg ttcattcatt tacagatgaa cagaaaagac tcttcttgca 3180

gtttacaacg ggcacagaca gagcacctgt gggaggacta ggaaaattaa agatgattat 3240

agccaaaaat ggcccagaca cagaaaggtt acctacatct catacttgct ttaatgtgct 3300

tttacttccg gaatactcaa gcaaagaaaa acttaaagag agattgttga aggccatcac 3360

gtatgccaaa ggatttggca tgctgtaaaa caaaacaaaa caaaataaaa caaaaaaaag 3420

gaaggaaaaa aaaagaaaaa atttaaaaaa ttttaaaaat ataacgaggg ataaattttt 3480

ggtggtgata gtgtcccagt acaaaaaggc tgtaagatag tcaaccacag tagtcaccta 3540

tgtctgtgcc tcccttcttt attggggaca tgtgggctgg aacagcagat ttcagctaca 3600

tatatgaaca aatcctttat tattattata attatttttt tgcgtgaaag tgttacatat 3660

tctttcactt gtatgtacag agaggttttt ctgaatattt attttaaggg ttaaatcact 3720

tttgcttgtg tttattactg cttgaggttg agccttttga gtatttaaaa aatatatacc 3780

aacagaacta ctctcccaag gaaaatattg ccaccatttg tagaccacgt aaccttcaag 3840

tatgtgctac ttttttgtcc ctgtatctaa ctcaaatcag gaactgtatt ttttttaatg 3900

atttgctttt gaaacttgaa gtcttgaaaa cagtgtgatg caattactgc tgttctagcc 3960

cccaaagagt tttctgtgca aaatcttgag aatcaatcaa taaagaaaga tggaaggaag 4020

ggagaaattg gaatgtttta actgcagccc tcagaacttt agtaacagca caacaaatta 4080

aaaacaaaaa caactcatgc cacagtatgt cgtcttcatg tgtcttgcaa tgaactgttt 4140

cagtagccaa tcctctttct tagtatatga aaggacaggg atttttgttc ttgttgttct 4200

cgttgttgtt ttaagtttac tggggaaagt gcatttggcc aaatgaaatg gtagtcaagc 4260

ctattgcaac aaagttagga agtttgttgt ttgtttatta taaacaaaaa gcatgtgaaa 4320

gtgcacttaa gatagagttt ttattaatta cttacttatt acctagattt taaatagaca 4380

atccaaagtc tccccttcgt gttgccatca tcttgttgaa tcagccattt tatcgaggca 4440

cgtgatcagt gttgcaacat aatgaaaaag atggctactg tgccttgtgt tacttaatca 4500

tacagtaagc tgacctggaa atgaatgaaa ctattactcc taagaattac attgtatagc 4560

cccacagatt aaatttaatt aattaattca aaacatgtta aacgttactt tcatgtacta 4620

tggaaaagta caagtaggtt tacattactg atttccagaa gtaagtagtt tcccctttcc 4680

tagtcttctg tgtatgtgat gttgttaatt tcttttattg cattataaaa taaaaggatt 4740

atgtattttt aactaaggtg agacattgat atatcctttt gctacaagct atagctaatg 4800

tgctgagctt gtgccttggt gattgattga ttgattgact gattgtttta actgattact 4860

gtagatcaac ctgatgattt gtttgtttga aattggcagg aaaaatgcag ctttcaaatc 4920

attgggggga gaaaaaggat gtctttcagg attattttaa ttaatttttt tcataattga 4980

gacagaactg tttgttatgt accataatgc taaataaaac tgtggcactt ttcaccataa 5040

tttaatttag tggaaaaaga agacaatgct ttccatattg tgataaggta acatggggtt 5100

tttctgggcc agcctttaga acactgttag ggtacatacg ctaccttgat gaaagggacc 5160

ttcgtgcaac tgtagtcatc ttaaaggctt ctcatccact gtgcttctta atgtgtaatt 5220

aaagtgagga gaaattaaat actctgaggg cgttttatat aataaattcg tgaaga 5276

<210> 14

<211> 875

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

Met Glu Lys Leu His Gln Cys Tyr Trp Lys Ser Gly Glu Pro Gln Ser

1 5 10 15

Asp Asp Ile Glu Ala Ser Arg Met Lys Arg Ala Ala Ala Lys His Leu

20 25 30

Ile Glu Arg Tyr Tyr His Gln Leu Thr Glu Gly Cys Gly Asn Glu Ala

35 40 45

Cys Thr Asn Glu Phe Cys Ala Ser Cys Pro Thr Phe Leu Arg Met Asp

50 55 60

Asn Asn Ala Ala Ala Ile Lys Ala Leu Glu Leu Tyr Lys Ile Asn Ala

65 70 75 80

Lys Leu Cys Asp Pro His Pro Ser Lys Lys Gly Ala Ser Ser Ala Tyr

85 90 95

Leu Glu Asn Ser Lys Gly Ala Pro Asn Asn Ser Cys Ser Glu Ile Lys

100 105 110

Met Asn Lys Lys Gly Ala Arg Ile Asp Phe Lys Asp Val Thr Tyr Leu

115 120 125

Thr Glu Glu Lys Val Tyr Glu Ile Leu Glu Leu Cys Arg Glu Arg Glu

130 135 140

Asp Tyr Ser Pro Leu Ile Arg Val Ile Gly Arg Val Phe Ser Ser Ala

145 150 155 160

Glu Ala Leu Val Gln Ser Phe Arg Lys Val Lys Gln His Thr Lys Glu

165 170 175

Glu Leu Lys Ser Leu Gln Ala Lys Asp Glu Asp Lys Asp Glu Asp Glu

180 185 190

Lys Glu Lys Ala Ala Cys Ser Ala Ala Ala Met Glu Glu Asp Ser Glu

195 200 205

Ala Ser Ser Ser Arg Ile Gly Asp Ser Ser Gln Gly Asp Asn Asn Leu

210 215 220

Gln Lys Leu Gly Pro Asp Asp Val Ser Val Asp Ile Asp Ala Ile Arg

225 230 235 240

Arg Val Tyr Thr Arg Leu Leu Ser Asn Glu Lys Ile Glu Thr Ala Phe

245 250 255

Leu Asn Ala Leu Val Tyr Leu Ser Pro Asn Val Glu Cys Asp Leu Thr

260 265 270

Tyr His Asn Val Tyr Ser Arg Asp Pro Asn Tyr Leu Asn Leu Phe Ile

275 280 285

Ile Val Met Glu Asn Arg Asn Leu His Ser Pro Glu Tyr Leu Glu Met

290 295 300

Ala Leu Pro Leu Phe Cys Lys Ala Met Ser Lys Leu Pro Leu Ala Ala

305 310 315 320

Gln Gly Lys Leu Ile Arg Leu Trp Ser Lys Tyr Asn Ala Asp Gln Ile

325 330 335

Arg Arg Met Met Glu Thr Phe Gln Gln Leu Ile Thr Tyr Lys Val Ile

340 345 350

Ser Asn Glu Phe Asn Ser Arg Asn Leu Val Asn Asp Asp Asp Ala Ile

355 360 365

Val Ala Ala Ser Lys Cys Leu Lys Met Val Tyr Tyr Ala Asn Val Val

370 375 380

Gly Gly Glu Val Asp Thr Asn His Asn Glu Glu Asp Asp Glu Glu Pro

385 390 395 400

Ile Pro Glu Ser Ser Glu Leu Thr Leu Gln Glu Leu Leu Gly Glu Glu

405 410 415

Arg Arg Asn Lys Lys Gly Pro Arg Val Asp Pro Leu Glu Thr Glu Leu

420 425 430

Gly Val Lys Thr Leu Asp Cys Arg Lys Pro Leu Ile Pro Phe Glu Glu

435 440 445

Phe Ile Asn Glu Pro Leu Asn Glu Val Leu Glu Met Asp Lys Asp Tyr

450 455 460

Thr Phe Phe Lys Val Glu Thr Glu Asn Lys Phe Ser Phe Met Thr Cys

465 470 475 480

Pro Phe Ile Leu Asn Ala Val Thr Lys Asn Leu Gly Leu Tyr Tyr Asp

485 490 495

Asn Arg Ile Arg Met Tyr Ser Glu Arg Arg Ile Thr Val Leu Tyr Ser

500 505 510

Leu Val Gln Gly Gln Gln Leu Asn Pro Tyr Leu Arg Leu Lys Val Arg

515 520 525

Arg Asp His Ile Ile Asp Asp Ala Leu Val Arg Leu Glu Met Ile Ala

530 535 540

Met Glu Asn Pro Ala Asp Leu Lys Lys Gln Leu Tyr Val Glu Phe Glu

545 550 555 560

Gly Glu Gln Gly Val Asp Glu Gly Gly Val Ser Lys Glu Phe Phe Gln

565 570 575

Leu Val Val Glu Glu Ile Phe Asn Pro Asp Ile Gly Met Phe Thr Tyr

580 585 590

Asp Glu Ser Thr Lys Leu Phe Trp Phe Asn Pro Ser Ser Phe Glu Thr

595 600 605

Glu Gly Gln Phe Thr Leu Ile Gly Ile Val Leu Gly Leu Ala Ile Tyr

610 615 620

Asn Asn Cys Ile Leu Asp Val His Phe Pro Met Val Val Tyr Arg Lys

625 630 635 640

Leu Met Gly Lys Lys Gly Thr Phe Arg Asp Leu Gly Asp Ser His Pro

645 650 655

Val Leu Tyr Gln Ser Leu Lys Asp Leu Leu Glu Tyr Glu Gly Asn Val

660 665 670

Glu Asp Asp Met Met Ile Thr Phe Gln Ile Ser Gln Thr Asp Leu Phe

675 680 685

Gly Asn Pro Met Met Tyr Asp Leu Lys Glu Asn Gly Asp Lys Ile Pro

690 695 700

Ile Thr Asn Glu Asn Arg Lys Glu Phe Val Asn Leu Tyr Ser Asp Tyr

705 710 715 720

Ile Leu Asn Lys Ser Val Glu Lys Gln Phe Lys Ala Phe Arg Arg Gly

725 730 735

Phe His Met Val Thr Asn Glu Ser Pro Leu Lys Tyr Leu Phe Arg Pro

740 745 750

Glu Glu Ile Glu Leu Leu Ile Cys Gly Ser Arg Asn Leu Asp Phe Gln

755 760 765

Ala Leu Glu Glu Thr Thr Glu Tyr Asp Gly Gly Tyr Thr Arg Asp Ser

770 775 780

Val Leu Ile Arg Glu Phe Trp Glu Ile Val His Ser Phe Thr Asp Glu

785 790 795 800

Gln Lys Arg Leu Phe Leu Gln Phe Thr Thr Gly Thr Asp Arg Ala Pro

805 810 815

Val Gly Gly Leu Gly Lys Leu Lys Met Ile Ile Ala Lys Asn Gly Pro

820 825 830

Asp Thr Glu Arg Leu Pro Thr Ser His Thr Cys Phe Asn Val Leu Leu

835 840 845

Leu Pro Glu Tyr Ser Ser Lys Glu Lys Leu Lys Glu Arg Leu Leu Lys

850 855 860

Ala Ile Thr Tyr Ala Lys Gly Phe Gly Met Leu

865 870 875

<210> 15

<211> 2970

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 15

tttttccgga taaggaagcg cgggtcccgc atgagccccg gcggtggcgg cagcgaaaga 60

gaacgaggcg gtggcgggcg gaggcggcgg gcgagggcga ctacgaccag tgaggcggcc 120

gccgcagccc aggcgcgggg gcgacgacag gttaaaaatc tgtaagagcc tgattttaga 180

attcaccagc tcctcagaag tttggcgaaa tatgagttat taagcctacg ctcagatcaa 240

ggtagcagct agactggtgt gacaacctgt ttttaatcag tgactcaaag ctgtgatcac 300

cctgatgtca ccgaatggcc acagcttgta aaagatcagg agaacctcag tctgacgaca 360

ttgaagctag ccgaatgaag cgagcagctg caaagcatct aatagaacgc tactaccacc 420

agttaactga gggctgtgga aatgaagcct gcacgaatga gttttgtgct tcctgtccaa 480

cttttcttcg tatggataat aatgcagcag ctattaaagc cctcgagctt tataagatta 540

atgcaaaact ctgtgatcct catccctcca agaaaggagc aagctcagct taccttgaga 600

actcgaaagg tgcccccaac aactcctgct ctgagataaa aatgaacaag aaaggcgcta 660

gaattgattt taaagatgtg acttacttaa cagaagagaa ggtatatgaa attcttgaat 720

tatgtagaga aagagaggat tattcccctt taatccgtgt tattggaaga gttttttcta 780

gtgctgaggc attggtacag agcttccgga aagttaaaca acacaccaag gaagaactga 840

aatctcttca agcaaaagat gaagacaaag atgaagatga aaaggaaaaa gctgcatgtt 900

ctgctgctgc tatggaagaa gactcagagg catcttcctc aaggataggt gatagctcac 960

agggagacaa caatttgcaa aaattaggcc ctgatgatgt gtctgtggat attgatgcca 1020

ttagaagggt ctacaccaga ttgctctcta atgaaaaaat tgaaactgcc tttctcaatg 1080

cacttgtata tttgtcacct aacgtggaat gtgacttgac gtatcacaat gtatactctc 1140

gagatcctaa ttatctgaat ttgttcatta tcgtaatgga gaatagaaat ctccacagtc 1200

ctgaatatct ggaaatggct ttgccattat tttgcaaagc gatgagcaag ctaccccttg 1260

cagcccaagg aaaactgatc agactgtggt ctaaatacaa tgcagaccag attcggagaa 1320

tgatggagac atttcagcaa cttattactt ataaagtcat aagcaatgaa tttaacagtc 1380

gaaatctagt gaatgatgat gatgccattg ttgctgcttc gaagtgcttg aaaatggttt 1440

actatgcaaa tgtagtggga ggggaagtgg acacaaatca caatgaagaa gatgatgaag 1500

agcccatccc tgagtccagc gagctgacac ttcaggaact tttgggagaa gaaagaagaa 1560

acaagaaagg tcctcgagtg gaccccctgg aaactgaact tggtgttaaa accctggatt 1620

gtcgaaaacc acttatccct tttgaagagt ttattaatga accactgaat gaggttctag 1680

aaatggataa agattatact tttttcaaag tagaaacaga gaacaaattc tcttttatga 1740

catgtccctt tatattgaat gctgtcacaa agaatttggg attatattat gacaatagaa 1800

ttcgcatgta cagtgaacga agaatcactg ttctctacag cttagttcaa ggacagcagt 1860

tgaatccata tttgagactc aaagttagac gtgaccatat catagatgat gcacttgtcc 1920

ggctagagat gatcgctatg gaaaatcctg cagacttgaa gaagcagttg tatgtggaat 1980

ttgaaggaga acaaggagtt gatgagggag gtgtttccaa agaatttttt cagctggttg 2040

tggaggaaat cttcaatcca gatattggta tgttcacata cgatgaatct acaaaattgt 2100

tttggtttaa tccatcttct tttgaaactg agggtcagtt tactctgatt ggcatagtac 2160

tgggtctggc tatttacaat aactgtatac tggatgtaca ttttcccatg gttgtctaca 2220

ggaagctaat ggggaaaaaa ggaacttttc gtgacttggg agactctcac ccagttctat 2280

atcagagttt aaaagattta ttggagtatg aagggaatgt ggaagatgac atgatgatca 2340

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aagagagatt gttgaaggcc atcacgtatg ccaaaggatt tggcatgctg taaaacaaaa 2940

caaaacaaaa taaaacaaaa aaaaggaagg 2970

Claims

1.一种UBE3A载体，其包含：

转录起始序列；

被设置在所述转录起始序列下游的UBE3A序列，其中所述UBE3A序列是SEQ ID No.1、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15，SEQ ID No.7的cDNA，SEQ IDNo.14的cDNA，或同源序列；

被设置在所述转录起始序列下游的分泌序列，其中所述分泌序列是SEQ ID No.2、SEQID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10，SEQ ID No.3的cDNA，或同源序列；和

被设置在所述转录起始序列下游的细胞摄取序列，其中所述细胞摄取序列是SEQ IDNo.4、SEQ ID No.11，SEQ ID No.5的cDNA，或同源序列。

2.权利要求1的载体，其中所述转录起始序列是巨细胞病毒鸡-β肌动蛋白杂合启动子、或人泛素c启动子。

3.权利要求2的载体，其还包含被设置在所述转录起始序列上游的巨细胞病毒立即早期增强子序列。

4.权利要求1的载体，其还包含土拨鼠肝炎转录后调控元件。

5.权利要求1的载体，其还包含质粒，其中所述质粒是基于重组腺相关病毒血清型2的质粒，并且其中所述基于重组腺相关病毒血清型2的质粒缺乏DNA整合元件。

6.权利要求5的载体，其中所述基于重组腺相关病毒血清型2的质粒是pTR质粒。

7.权利要求1的载体，其中所述分泌序列被设置在所述UBE3A序列上游。

8.权利要求1的载体，其中所述细胞摄取序列被设置在所述UBE3A序列上游和所述分泌序列下游。

9.一种合成UBE3A载体的方法，其包含：

提供骨架质粒；

其中所述骨架质粒具有转录起始序列；

形成UBE3A构建体，其还包含：

提供UBE3A序列，其中所述UBE3A序列是SEQ ID No.1、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQID No.13、SEQ ID No.15，SEQ ID No.7的cDNA，SEQ ID No.14的cDNA，或同源序列；

将分泌序列附加于所述UBE3A序列，其中所述分泌序列是SEQ ID No.2、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10，SEQ ID No.3的cDNA，或同源序列；以及

将细胞摄取序列附加于所述XXX，其中所述细胞摄取序列是SEQ ID No.4、SEQ IDNo.11，SEQ ID No.5的cDNA，或同源序列；

将所述UBE3A构建体插入到所述转录起始序列下游。

10.权利要求9的方法，其还包含：

将所述载体插入到扩增宿主中；

使所述扩增宿主经历抗生素选择；

其中所述骨架质粒具有抗生素抗性基因；

将所述扩增宿主在含有所述抗生素选择的培养基中增殖；

收集增殖的扩增宿主；以及

从所述扩增宿主中分离所述载体。

11.权利要求10的方法，其中所述抗生素抗性基因是氨苄青霉素抗性基因，并且其中所述抗生素选择是氨苄青霉素选择。

12.权利要求9的方法，其还包含：

用至少一种核酸内切酶切割所述骨架质粒；以及

将所述UBE3A构建体连接到所述骨架质粒的切割末端。

13.权利要求9的方法，其中所述质粒是基于重组腺相关病毒血清型2的质粒，并且其中所述基于重组腺相关病毒血清型2的质粒缺乏DNA整合元件。

14.一种治疗UBE3A缺陷疾病的方法，其包含：

向患有UBE3A缺陷疾病的患者的脑施用载体，其中所述载体包含：

转录起始序列；

被设置在所述转录起始序列下游的分泌序列，其中所述分泌序列是SEQ ID No.2、SEQID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10，SEQ ID No.3的cDNA，或同源序列；

被设置在所述转录起始序列下游的细胞摄取序列，其中所述细胞摄取序列是SEQ IDNo.4、SEQ ID No.11，SEQ ID No.5的cDNA，或同源序列；并且

其中所述UBE3A缺陷疾病是天使人综合征、普拉德-威利综合征或亨廷顿氏病。

15.权利要求14的方法，其中向脑施用载体包含将所述载体注射到脑中。

16.权利要求15的方法，其中所述载体被注射到海马或脑室中。

17.权利要求16的方法，其中所述载体被双侧注射。

18.权利要求14的方法，其中所述载体以约5.55x10¹¹基因组/克脑质量至约2.86x10¹²基因组/克脑质量施用。

19.权利要求14的方法，其中所述载体以5.55x10¹¹基因组/克脑质量至2.86x10¹²基因组/克脑质量、2.86x10¹²基因组/克脑质量、2.40x10¹²基因组/克脑质量、9.80x10¹¹基因组/克脑质量或5.55x10¹¹基因组/克脑质量施用。