CN107523645A - 一种口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法 - Google Patents

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CN107523645A CN201710988312.1A CN201710988312A CN107523645A CN 107523645 A CN107523645 A CN 107523645A CN 201710988312 A CN201710988312 A CN 201710988312A CN 107523645 A CN107523645 A CN 107523645A
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Abstract

本发明涉及一种口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法，属于生物检测技术领域。该方法首先配制含有变形链球菌的人工唾液，并针对口含型产品的使用特点，采用人工唾液模拟口含型烟草制品的使用过程，并对唾液的变形链球菌含量进行荧光定量PCR分析，从而考察在使用口含型烟草制品前后唾液中的变形链球菌含量的变化，为口含型烟草制品的口腔健康提供参考。本发明可以添加不同含量的变形链球菌，模拟不同人口腔中变形链球菌含量不同的实际情况，从而给予全方位的指导。

Description

一种口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法。
背景技术
龋病被世界卫生组织(WHO)列为严重危害人类健康的流行性感染性疾病之一，是在细菌等多种因素共同作用下，牙齿硬组织发生的慢性、进行性、破坏性疾病。致龋的因素包括：细菌、食物、宿主和作用时间等。口腔内细菌种类甚多，其中主要是厌氧菌和兼性厌氧菌，包括链球菌属、乳杆菌属和放线菌属等。变形链球菌在口腔中检出率高，接近90％，是主要的致龋菌，它通过黏附、产酸和耐酸等致使牙体硬组织破坏，从而导致龋齿的形成。
口含型无烟气烟草制品是一种湿润的烟草粉末制品，起源于19世纪瑞典。瑞典口含烟产品呈现细的颗粒状，含水量通常在40％以上，含水量低于40％的半干制品也有售。产品放在上唇与牙龈之间，使用时不需要唾出唾液，有散装和袋装产品。在产品使用的过程中，产品对人口腔健康的影响是一个重要考察指标。目前的烟草制品仅针对产品本身进行一些物理化学指标的检测，而对人口腔中的微生物影响研究较少，尤其是针对口腔中变形链球菌的研究未曾涉及。因此如何克服现有技术的不足是目前生物检测技术领域亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法，该方法首先配制含有变形链球菌的人工唾液，并针对口含型产品的使用特点，采用人工唾液模拟口含型烟草制品的使用过程，并对唾液的变形链球菌含量进行荧光定量PCR分析，从而考察在使用口含型烟草制品前后唾液中的变形链球菌含量的变化，为口含型烟草制品的口腔健康提供参考。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法，包括如下步骤：
步骤(1)，配制人工唾液，并向人工唾液中添加变形链球菌，使变形链球菌在人工唾液中的量为1*104-1*106CFU/mL，得到含变形链球菌的人工唾液；
步骤(2)，采用步骤(1)得到的含变形链球菌的人工唾液对口含烟烟草制品进行提取，提取多次，分别收集提取液；
步骤(3)，将步骤(2)收集到的各提取液与步骤(1)的含变形链球菌的人工唾液一起放入厌氧培养箱于37℃下进行共培养；之后分别提取各培养液中的变形链球菌DNA，同时提取变形链球菌的标准菌株原始DNA；
步骤(4)，以浓度梯度稀释10倍的变形链球菌的标准菌株原始DNA作为模板进行荧光定量PCR分析，之后绘制变形链球菌荧光定量PCR标准曲线；
同时，分别以各培养液中的变形链球菌DNA作为模板进行荧光定量PCR分析，空白对照模板采用灭菌双蒸水，根据标准曲线计算各培养液中的变形链球菌DNA的含量；
其中，荧光定量PCR分析所使用的上游引物为5’-gcctacagctcagagatgctattct-3’；下游引物为5’-gccatacaccactcatgaattga-3’；探针为FAM-tggaaatgacggtcgccgttatgaa-TAMRA。
进一步，优选的是，步骤(2)的具体方法为：
向口含烟烟草制品0.8-1.2g中注入步骤(1)的含变形链球菌的人工唾液于37℃下恒温震荡进行提取，提取多次，每次提取所用的含变形链球菌的人工唾液10mL，每次提取时间为5min，分别收集提取液。
进一步，优选的是，所述的震荡速度为150-300rpm；提取次数为3次。
进一步，优选的是，步骤(3)的具体方法为：
(3.1)共培养：取步骤(2)收集到的各提取液与步骤(1)的含变形链球菌的人工唾液，每种液体均分为3等份，分别放入厌氧培养箱于37℃下进行共培养，每种液体3等份的培养时间分别为0h、2h、6h三个时间段；
(3.2)培养液中的变形链球菌DNA的提取：取出步骤(3.1)的培养后的培养液在4℃离心，去上清液，再加入微生物PCR裂解液，混合均匀后，置于75-85℃下热变性15min，然后再次离心，取上清液，即得到培养液中的变形链球菌DNA；所述的微生物PCR裂解液的加入体积为培养液体积的5％；
(3.3)变形链球菌的标准菌株原始DNA的提取：取与步骤(3.2)所使用的相同体积的微生物PCR裂解液，加入变形链球菌的标准菌株至浓度为107CFU/mL，在75-85℃下热变性15min，然后离心，取上清液，即得到变形链球菌的标准菌株原始DNA；
所述的微生物PCR裂解液为Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR。
进一步，优选的是，(3.2)中培养液的离心的转速为11000-12000r/min，时间为10min；热变性后离心的转速为800-1000r/min，时间为1min。
进一步，优选的是，(3.3)中热变性后离心的转速为800-1000r/min，时间为10s。
进一步，优选的是，在进行荧光定量PCR分析前需要对变形链球菌的标准菌株原始DNA、各培养液中的变形链球菌DNA的纯度判定，判定方法是：将待测样品的DNA分别在波长260nm、280nm下测定的光密度值；当在波长260nm下光密度值与在波长280nm下光密度值的比值为1.7～1.9时，表明纯度合格，能进行荧光定量PCR分析，反之，则表明纯度不合格，不能进行荧光定量PCR分析。
进一步，优选的是，步骤(4)的具体方法为：
向变形链球菌的标准菌株原始DNA中加入体积是变形链球菌的标准菌株原始DNA体积9倍的水，并充分混匀，再依次做10倍浓度梯度稀释，共稀释6次，作为标准曲线模板；
取各培养液中的变形链球菌DNA与无菌水按1:8体积比例稀释后作为测试样品模板；
采用灭菌双蒸水作为空白对照模板；
荧光定量PCR反应体系：
荧光定量PCR试剂盒中的Master Mix(2X)Kit 10μL，共20μL；
荧光定量PCR反应条件为：预变性95℃下5min，变性95℃下15s，退火/延伸60℃下1min，进行45个循环；
之后绘制变形链球菌荧光定量PCR标准曲线，并根据标准曲线计算各时间点培养液中变形链球菌含量。
进一步，优选的是，荧光定量PCR分析检测时，每个样本检测均重复三次，取其平均值进行计算。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明提供了一种口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法，为口含型烟草制品对口腔健康的影响提供参考。本发明采用了荧光定量PCR方法对唾液中变形链球菌进行分析，可实时定量跟踪唾液中微生物含量的变化，保证了试验的准确性及高效性。同时设计了3个动态唾液采集点及咀嚼后3个共培养时间段，动态唾液采集点以模拟人在使用口含型烟草制品时的动态过程，共培养时间段以模拟人在咀嚼后的口腔静态过程，使检测更为全面精确。本发明可以添加不同含量的变形链球菌，模拟不同人口腔中变形链球菌含量不同的实际情况，从而给予全方位的指导。
附图说明
图1是实时荧光定量PCR检测变形链球菌标准曲线图；
图2是各提取液中变形链球菌检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明实施例中所采用的变形链球菌的标准菌株购自广东省微生物菌种保藏中心；
本发明实施例中口含型烟草制品为Snus General White Mini Portion，SWEDISH。
本发明空白对照模板采用灭菌双蒸水是为了校正标准曲线的基线值。
Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR购自宝生物工程(大连)有限公司，说明书参见网址http://www.docin.com/p-317504172.html。
本发明所采用的荧光定量PCR试剂盒购自KAPA PROBE FAST qPCR。
本发明配制人工唾液按本技术领域的常规方法配制即可。
实施例1
一种口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法，包括如下步骤：
步骤(1)，配制人工唾液，并向人工唾液中添加变形链球菌，使变形链球菌在人工唾液中的量为1*104CFU/mL，得到含变形链球菌的人工唾液；
步骤(2)，采用步骤(1)得到的含变形链球菌的人工唾液对口含烟烟草制品进行提取，提取多次，分别收集提取液；具体方法为：
向口含烟烟草制品0.8g中注入步骤(1)的含变形链球菌的人工唾液于37℃下恒温震荡进行提取，震荡速度为150rpm，提取2次，每次提取所用的含变形链球菌的人工唾液9mL，每次提取时间为4min，分别收集提取液；
步骤(3)，将步骤(2)收集到的各提取液与步骤(1)的含变形链球菌的人工唾液一起放入厌氧培养箱于37℃下进行共培养；之后分别提取各培养液中的变形链球菌DNA，同时提取变形链球菌的标准菌株原始DNA；具体方法为：
(3.1)共培养：取步骤(2)收集到的各提取液与步骤(1)的含变形链球菌的人工唾液，每种液体均分为3等份，分别放入厌氧培养箱于37℃下进行共培养，每种液体3等份的培养时间分别为0h、2h、6h三个时间段；
(3.2)培养液中的变形链球菌DNA的提取：取出步骤(3.1)的培养后的培养液在4℃离心，去上清液，再加入微生物PCR裂解液，混合均匀后，置于75℃下热变性15min，然后再次离心，取上清液，即得到培养液中的变形链球菌DNA；所述的微生物PCR裂解液的加入体积为培养液体积的5％；
(3.3)变形链球菌的标准菌株原始DNA的提取：取与步骤(3.2)所使用的相同体积的微生物PCR裂解液，加入变形链球菌的标准菌株至浓度为107CFU/mL，在75℃下热变性15min，然后离心，取上清液，即得到变形链球菌的标准菌株原始DNA；
所述的微生物PCR裂解液为Lysis Buffer for Microorganism to DirectPCR；
步骤(4)，以浓度梯度稀释10倍的变形链球菌的标准菌株原始DNA作为模板进行荧光定量PCR分析，之后绘制变形链球菌荧光定量PCR标准曲线；
同时，分别以各培养液中的变形链球菌DNA作为模板进行荧光定量PCR分析，空白对照模板采用灭菌双蒸水，根据标准曲线计算各培养液中的变形链球菌DNA的含量；
其中，荧光定量PCR分析所使用的上游引物为5’-gcctacagctcagagatgctattct-3’；下游引物为5’-gccatacaccactcatgaattga-3’；探针为FAM-tggaaatgacggtcgccgttatgaa-TAMRA；具体方法为：
向变形链球菌的标准菌株原始DNA中加入体积是变形链球菌的标准菌株原始DNA体积9倍的水，并充分混匀，再依次做10倍浓度梯度稀释，共稀释6次，作为标准曲线模板；
取各培养液中的变形链球菌DNA与无菌水按1:8体积比例稀释后作为测试样品模板；
采用灭菌双蒸水作为空白对照模板；
荧光定量PCR反应体系：
荧光定量PCR试剂盒中的Master Mix(2X)Kit 10μL，共20μL；
荧光定量PCR反应条件为：预变性95℃下5min，变性95℃下15s，退火/延伸60℃下1min，进行45个循环；
之后绘制变形链球菌荧光定量PCR标准曲线，并根据标准曲线计算各时间点培养液中变形链球菌含量。
在进行荧光定量PCR分析前需要对变形链球菌的标准菌株原始DNA、各培养液中的变形链球菌DNA的纯度判定，判定方法是：将待测样品的DNA分别在波长260nm、280nm下测定的光密度值；当在波长260nm下光密度值与在波长280nm下光密度值的比值为1.7～1.9时，表明纯度合格，能进行荧光定量PCR分析，反之，则表明纯度不合格，不能进行荧光定量PCR分析。
其中，(3.2)中培养液的离心的转速为11000r/min，时间为10min；热变性后离心的转速为800r/min，时间为1min。(3.3)中热变性后离心的转速为800r/min，时间为10s。
实施例2
一种口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法，包括如下步骤：
步骤(1)，配制人工唾液，并向人工唾液中添加变形链球菌，使变形链球菌在人工唾液中的量为1*106CFU/mL，得到含变形链球菌的人工唾液；
步骤(2)，采用步骤(1)得到的含变形链球菌的人工唾液对口含烟烟草制品进行提取，提取多次，分别收集提取液；具体方法为：
向口含烟烟草制品1.2g中注入步骤(1)的含变形链球菌的人工唾液于37℃下恒温震荡进行提取，震荡速度为300rpm，提取3次，每次提取所用的含变形链球菌的人工唾液10mL，每次提取时间为5min，分别收集提取液；
步骤(3)，将步骤(2)收集到的各提取液与步骤(1)的含变形链球菌的人工唾液一起放入厌氧培养箱于37℃下进行共培养；之后分别提取各培养液中的变形链球菌DNA，同时提取变形链球菌的标准菌株原始DNA；具体方法为：
(3.1)共培养：取步骤(2)收集到的各提取液与步骤(1)的含变形链球菌的人工唾液，每种液体均分为3等份，分别放入厌氧培养箱于37℃下进行共培养，每种液体3等份的培养时间分别为0h、2h、6h三个时间段；
(3.2)培养液中的变形链球菌DNA的提取：取出步骤(3.1)的培养后的培养液在4℃离心，去上清液，再加入微生物PCR裂解液，混合均匀后，置于85℃下热变性15min，然后再次离心，取上清液，即得到培养液中的变形链球菌DNA；所述的微生物PCR裂解液的加入体积为培养液体积的5％；
(3.3)变形链球菌的标准菌株原始DNA的提取：取与步骤(3.2)所使用的相同体积的微生物PCR裂解液，加入变形链球菌的标准菌株至浓度为107CFU/mL，在85℃下热变性15min，然后离心，取上清液，即得到变形链球菌的标准菌株原始DNA；
所述的微生物PCR裂解液为Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR；
步骤(4)，以浓度梯度稀释10倍的变形链球菌的标准菌株原始DNA作为模板进行荧光定量PCR分析，之后绘制变形链球菌荧光定量PCR标准曲线；
同时，分别以各培养液中的变形链球菌DNA作为模板进行荧光定量PCR分析，空白对照模板采用灭菌双蒸水，根据标准曲线计算各培养液中的变形链球菌DNA的含量；
其中，荧光定量PCR分析所使用的上游引物为5’-gcctacagctcagagatgctattct-3’；下游引物为5’-gccatacaccactcatgaattga-3’；探针为FAM-tggaaatgacggtcgccgttatgaa-TAMRA；具体方法为：
向变形链球菌的标准菌株原始DNA中加入体积是变形链球菌的标准菌株原始DNA体积9倍的水，并充分混匀，再依次做10倍浓度梯度稀释，共稀释6次，作为标准曲线模板；
取各培养液中的变形链球菌DNA与无菌水按1:8体积比例稀释后作为测试样品模板；
采用灭菌双蒸水作为空白对照模板；
荧光定量PCR反应体系：
荧光定量PCR试剂盒中的Master Mix(2X)Kit 10μL，共20μL；
荧光定量PCR反应条件为：预变性95℃下5min，变性95℃下15s，退火/延伸60℃下1min，进行45个循环；
之后绘制变形链球菌荧光定量PCR标准曲线，并根据标准曲线计算各时间点培养液中变形链球菌含量。
在进行荧光定量PCR分析前需要对变形链球菌的标准菌株原始DNA、各培养液中的变形链球菌DNA的纯度判定，判定方法是：将待测样品的DNA分别在波长260nm、280nm下测定的光密度值；当在波长260nm下光密度值与在波长280nm下光密度值的比值为1.7～1.9时，表明纯度合格，能进行荧光定量PCR分析，反之，则表明纯度不合格，不能进行荧光定量PCR分析。
其中，(3.2)中培养液的离心的转速为12000r/min，时间为10min；热变性后离心的转速为1000r/min，时间为1min。(3.3)中热变性后离心的转速为1000r/min，时间为10s。
荧光定量PCR分析检测时，每个样本检测均重复三次，取其平均值进行计算。
实施例3
一种口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法，包括如下步骤：
步骤(1)，配制人工唾液，并向人工唾液中添加变形链球菌，使变形链球菌在人工唾液中的量为1*105CFU/mL，得到含变形链球菌的人工唾液，编号为1#液体；
步骤(2)，采用步骤(1)得到的含变形链球菌的人工唾液对口含烟烟草制品进行提取，提取多次，分别收集提取液；具体方法为：
向口含烟烟草制品1g中注入步骤(1)的含变形链球菌的人工唾液于37℃下恒温震荡进行提取，震荡速度为200rpm，提取3次，每次提取所用的含变形链球菌的人工唾液10mL，每次提取时间为5min，分别收集提取液，编号为2#、3#、4#液体；
步骤(3)，将步骤(2)收集到的各提取液与步骤(1)的含变形链球菌的人工唾液一起放入厌氧培养箱于37℃下进行共培养；之后分别提取各培养液中的变形链球菌DNA，同时提取变形链球菌的标准菌株原始DNA；具体方法为：
(3.1)共培养：取步骤(2)收集到的2#、3#、4#液体与步骤(1)的含变形链球菌的人工唾液1#液体，每种液体均分为3等份，分别放入厌氧培养箱于37℃下进行共培养，每种液体3等份的培养时间分别为0h、2h、6h三个时间段；
(3.2)培养液中的变形链球菌DNA的提取：取出步骤(3.1)的培养后的培养液1mL置于无菌1.5mL EP管中在4℃离心，去上清液，再加入50μL微生物PCR裂解液于EP管中，混合均匀后，置于80℃下热变性15min，然后再次离心，取上清液，即得到培养液中的变形链球菌DNA；
(3.3)变形链球菌的标准菌株原始DNA的提取：取50μL微生物PCR裂解液于灭菌的1.5mL离心管中，加入变形链球菌的标准菌株至浓度为107CFU/mL，在80℃下热变性15min，然后离心，取上清液，即得到变形链球菌的标准菌株原始DNA；
所述的微生物PCR裂解液为Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR；
步骤(4)，以浓度梯度稀释10倍的变形链球菌的标准菌株原始DNA作为模板进行荧光定量PCR分析，之后绘制变形链球菌荧光定量PCR标准曲线；
同时，分别以各培养液中的变形链球菌DNA作为模板进行荧光定量PCR分析，空白对照模板采用灭菌双蒸水，根据标准曲线计算各培养液中的变形链球菌DNA的含量；
其中，荧光定量PCR分析所使用的上游引物为5’-gcctacagctcagagatgctattct-3’；下游引物为5’-gccatacaccactcatgaattga-3’；探针为FAM-tggaaatgacggtcgccgttatgaa-TAMRA；具体方法为：
取变形链球菌的标准菌株原始DNA 5μL加入45μL水，并充分混匀，再依次做10倍浓度梯度稀释，共稀释6次，作为标准曲线模板；
取各培养液中的变形链球菌DNA与无菌水按1:8体积比例稀释后作为测试样品模板；
采用灭菌双蒸水作为空白对照模板；
荧光定量PCR反应体系：
荧光定量PCR试剂盒中的Master Mix(2X)Kit 10μL，共20μL；
荧光定量PCR反应条件为：预变性95℃下5min，变性95℃下15s，退火/延伸60℃下1min，进行45个循环；
之后绘制变形链球菌荧光定量PCR标准曲线，并根据标准曲线计算各时间点培养液中变形链球菌含量。
在进行荧光定量PCR分析前需要对变形链球菌的标准菌株原始DNA、各培养液中的变形链球菌DNA的纯度判定，判定方法是：将待测样品的DNA分别在波长260nm、280nm下测定的光密度值(optical density，OD)；当在波长260nm下光密度值与在波长280nm下光密度值的比值为1.7～1.9时(OD260与OD280比值为1.7～1.9)，表明纯度合格，能进行荧光定量PCR分析，反之，则表明纯度不合格，不能进行荧光定量PCR分析。
其中，(3.2)中培养液的离心的转速为11500r/min，时间为10min；热变性后离心的转速为900r/min，时间为1min。(3.3)中热变性后离心的转速为900r/min，时间为10s。
荧光定量PCR分析检测时，每个样本检测均重复三次，取其平均值进行计算。
结果如图1、表1和图2所示，表1是各提取液中变形链球菌的检测结果。
其中，标准曲线为y＝-4.215log(x)+42.39，r2＝0.9964；之后将各时间点培养液的Ct值代入到标准曲线中，求得对应的变形链球菌含量。
表1
注：单位为CFU/mL，M±SD。
通过表1和图2，使用口含型烟草制品后的唾液中变形链球菌含量变化大不大，但生长速度有所降低，其中2#液体降低最为显著，这可能是由于口含型烟草制品提取物具有抑制变形链球菌生长的作用。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表如表2所示。
表2
引物及探针 序列5’-3’
Forward primer 5-’gcctacagctcagagatgctattct-3’(SEQ ID NO.1)
Reverse primer 5’-gccatacaccactcatgaattga-3’(SEQ ID NO.2)
探针 FAM-tggaaatgacggtcgccgttatgaa-TAMRA(SEQ ID NO.3)
序列表
<110> 云南中烟工业有限责任公司
<120> 一种口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
gcctacagct cagagatgct attct 25
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
gccatacacc actcatgaat tga 23
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
tggaaatgac ggtcgccgtt atgaa 25

Claims (9)

1.一种口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），配制人工唾液，并向人工唾液中添加变形链球菌，使变形链球菌在人工唾液中的量为1*104-1*106CFU/mL，得到含变形链球菌的人工唾液；
步骤（2），采用步骤（1）得到的含变形链球菌的人工唾液对口含烟烟草制品进行提取，提取多次，分别收集提取液；
步骤（3），将步骤（2）收集到的各提取液与步骤（1）的含变形链球菌的人工唾液一起放入厌氧培养箱于37℃下进行共培养；之后分别提取各培养液中的变形链球菌DNA，同时提取变形链球菌的标准菌株原始DNA；
步骤（4），以浓度梯度稀释10倍的变形链球菌的标准菌株原始DNA作为模板进行荧光定量PCR分析，之后绘制变形链球菌荧光定量PCR标准曲线；
同时，分别以各培养液中的变形链球菌DNA作为模板进行荧光定量PCR分析，空白对照模板采用灭菌双蒸水，根据标准曲线计算各培养液中的变形链球菌DNA的含量；
其中，荧光定量PCR分析所使用的上游引物为5’-gcctacagctcagagatgctattct-3’；下游引物为5’-gccatacaccactcatgaattga-3’；探针为FAM-tggaaatgacggtcgccgttatgaa-TAMRA。
2.根据权利要求1所述的口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法，其特征在于，步骤（2）的具体方法为：
向口含烟烟草制品0.8-1.2g中注入步骤（1）的含变形链球菌的人工唾液于37℃下恒温震荡进行提取，提取多次，每次提取所用的含变形链球菌的人工唾液10mL，每次提取时间为5min，分别收集提取液h。
3.根据权利要求2所述的口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法，其特征在于，所述的震荡速度为150-300 rpm；提取次数为3次。
4.根据权利要求2所述的口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法，其特征在于，步骤（3）的具体方法为：
（3.1）共培养：取步骤（2）收集到的各提取液与步骤（1）的含变形链球菌的人工唾液，每种液体均分为3等份，分别放入厌氧培养箱于37℃下进行共培养，每种液体3等份的培养时间分别为0h、2h、6h三个时间段；
（3.2）培养液中的变形链球菌DNA的提取：取出步骤（3.1）的培养后的培养液在4℃离心，去上清液，再加入微生物PCR裂解液，混合均匀后，置于75-85℃下热变性15min，然后再次离心，取上清液，即得到培养液中的变形链球菌DNA；所述的微生物PCR裂解液的加入体积为培养液体积的5%；
（3.3）变形链球菌的标准菌株原始DNA的提取：取与步骤（3.2）所使用的相同体积的微生物PCR裂解液，加入变形链球菌的标准菌株至浓度为107 CFU/mL，在75-85℃下热变性15min，然后离心，取上清液，即得到变形链球菌的标准菌株原始DNA；
所述的微生物PCR裂解液为Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR。
5.根据权利要求4所述的口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法，其特征在于，（3.2）中培养液的离心的转速为11000-12000r/min，时间为10min；热变性后离心的转速为800-1000r/min，时间为1min。
6.根据权利要求4所述的口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法，其特征在于，（3.3）中热变性后离心的转速为800-1000r/min，时间为10s。
7.根据权利要求1或4所述的口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法，其特征在于，在进行荧光定量PCR分析前需要对变形链球菌的标准菌株原始DNA、各培养液中的变形链球菌DNA的纯度判定，判定方法是：将待测样品的DNA分别在波长260nm、280nm下测定的光密度值；当在波长260nm下光密度值与在波长280nm下光密度值的比值为1.7~1.9时，表明纯度合格，能进行荧光定量PCR分析，反之，则表明纯度不合格，不能进行荧光定量PCR分析。
8.根据权利要求4、5或6所述的口含型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法，其特征在于，步骤（4）的具体方法为：
向变形链球菌的标准菌株原始DNA中加入体积是变形链球菌的标准菌株原始DNA体积9倍的水，并充分混匀，再依次做10倍浓度梯度稀释，共稀释6次，作为标准曲线模板；
取各培养液中的变形链球菌DNA与无菌水按1:8体积比例稀释后作为测试样品模板；
采用灭菌双蒸水作为空白对照模板；
荧光定量PCR反应体系：
上游引物200 nmol/L 0.175 μL、
下游引物200 nmol/L 0.175μL、
探针250 nmol/L 0.175μL、
无菌水 1.475 μL、
模板 8 μL、
荧光定量PCR试剂盒中的Master Mix (2X) Kit 10 μL，共20 μL；
荧光定量PCR反应条件为：预变性95℃下5min，变性95℃下15s，退火／延伸60℃下1min，进行45个循环；
之后绘制变形链球菌荧光定量PCR标准曲线，并根据标准曲线计算各时间点培养液中变形链球菌含量。
9.根据权利要求8所述的胶基型烟草制品对变形链球菌影响的检测方法，其特征在于，荧光定量PCR分析检测时，每个样本检测均重复三次，取其平均值进行计算。
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