CN1075211A - 一种病毒抗原条及制备方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种病毒免疫学诊断用载有单一 病毒抗原带的硝酸纤维膜抗原条，和其制备方法，以 及其在诊断人逆转录病毒、肝炎病毒、疱疹病毒感染 上的用途。

Description

本发明涉及病毒免疫学诊断领域一种载有单一抗原带的硝酸纤维膜抗原条，其制备方法，以及其在检测人血清中对所载抗原的特异性抗体的用途。

随着医学科学的进步，许多疾病被陆续征服，使病毒性疾病对人类危害日益突出。新的病毒不断被发现，有的如人免疫缺陷病毒（艾滋病毒、HIV）引起的艾滋病已造成全球性灾难。在我国许多病毒性感染的流行十分严重，严重危害我国人民健康。其中各型肝炎病毒的感染人数及所引起的病毒性肝炎病例均居世界首位;各种疱疹病毒的感染也十分严重，造成婴幼儿感染和性病，特别是EB病毒是引起我国南方鼻咽癌的病因;艾滋病毒已在我国吸毒人群、性乱错人员和归国人员中发现并有日益增加的趋势，临床艾滋病病例时有发生。目前，对这些病毒尚无有效的治疗和预防药物，其中大多数病毒的疫苗尚未研究成功，预防和控制这些病毒感染的流行和传播的主要手段是及时诊断出感染者，切断传播途径。

病毒感染的诊断常用免疫学方法诊断血清中对病毒抗原的特异性抗体，较为常用的方法有酶免疫法、凝集法和印迹或打点法。这些方法的基础即载有病毒抗原的载体有几种，但都有各自的缺陷和局限。其中最常用的聚乙烯塑料小孔虽可载各种抗原，但使用时对其他条件要求较高。凝集试验用的血球、明胶等材料本身存在自凝现象。在硝酸纤维膜上打点或印迹对抗原纯度要求很高，有些病毒抗原无法使用。基因工程表达的病毒抗原是目前病毒免疫学诊断中最常用的抗原，其中往往有很多细菌蛋白，国际上通常用柱层析法进行纯化，会损失大量抗原，使抗原成本十分昂贵，提高了试剂成本和价格。上述的免疫学诊断方法中酶免疫法虽然敏感性和特异性较高，但检测时需要严格的条件和昂贵的仪器，在检测小批量样品时浪费很大。凝集试验和打点试验的特异性较差，而印迹试验尚无法常规应用。

本发明的目的：提供一种载有单一抗原带的硝酸纤维膜抗原条，作为载体检测人血清中对所载抗原的特异性抗体。

本发明的目的是这样实现的：将单一病毒抗原用聚丙烯酰胺凝胶电泳与细菌蛋白分离并形成细带;切下分子量标记和边缘部分凝胶，加热至90-100℃用考马斯亮蓝液染色3-10分钟，通电2-3A电流5-10分钟，观察蛋白带型以确定所需蛋白的位置，然后切割成小条。这种载有单一病毒抗原带的硝酸纤维膜抗原条上所载的病毒抗原为下列病毒的基因工程抗原之一：（1）人逆转录病毒：人免疫缺陷病毒1、2型（艾滋病毒、HIV-1    HIV-2），成人T淋巴细胞白血病病毒1、2型（HTLV-1、HTLV-2）。（2）肝炎病毒：甲型肝炎病毒（HAV），乙型肝炎病毒（HBV），丙型肝炎病毒（HCV），丁型肝炎病毒（HDV），戊型肝炎病毒（HEV）。（3）疱疹病毒：单纯疱疹病毒1、2型（HSV-1、HSV-2），EB病毒，巨细胞病毒（CMV）。

上述抗原条可用于检测人血清中对所载抗原的特异性抗体以诊断病毒感染，其方法为：先将抗原条与血清样品孵育，进行洗涤后与结合物孵育，再次洗涤后加入底物液显色，终止后用肉眼观察结果、抗原条中间出现颜色带为阳性、无色为阴性。整个试验根据要求可长可短。

本发明有以下优点：（1）抗原条稳定，易于保存、运输和在现场使用;（2）制备方法很简单快速地高度纯化病毒基因工程抗原，降低了抗原成本，可用于纯化多种病毒抗原;（3）抗原条用于病毒免疫学诊断可检测各种批量样品，具有很高的敏感性和特异性，对辅助条件无特殊要求，既可进行常规检测，又可进行快速检测。

以下是本发明的实施例。

实施例一、艾滋病毒1型（HIV-1）抗原条的制备

1.抗原：基因工程重组的HIV-1包膜基因（env）编码的gp41蛋白，其分子量18KD，中国预防医学科学院病毒学研究所艾滋病毒研究室出产。

2.抗原分离：用聚丙烯酰胺电泳分离抗原与细菌蛋白。

电泳用液配方如下：

Sol    A：Tris    12.1g

H2O    100ml    PH调至8.5，

Sol    C：Acrylamide    28g

DADT    0.725g

H2O    100ml    过滤，4℃棕色瓶保存

Sol    D：1M    Tris-Hcl（PH7.0）    19.2ml

20%    SDS    0.8ml

AMPER：Ammonium    persulfate    1.4g

H2O    100ml

TEMED：-20℃保存，

1%    Agar    2g

1MTris-Hcl    PH8.5    75ml

H2O    125ml

20%    SDS    1ml

电泳液：Tris    15g

甘氨酸    72g

20%SDS    25ml

H2O    5000ml    调PH至8.5

样品缓冲液：3%    蔗糖

2%    SDS

5%    2-巯基乙醇

20mM    Tris-HCl    PH7.0

溴酚蓝

电泳胶安装方法如下：

（1）将玻璃板洗净，擦干后装板，用1%Agar封边

（2）配分离胶：

胶浓度

7.5%    10%    15%

Sol  A    7.5ml    7ml    7.5ml

Sol  C    5.22ml    6.96ml    10.44ml

H2O    6.69ml    4.95ml    1.47ml

AMPER    0.5ml    0.5ml    0.5ml

混匀后除气（抽气泵）后加入0.1ml    20%SDS及5-10ul的TEMED混匀。

（3）将胶装入两板之间，胶长约为板高的0.5-0.7

（4）配浓缩胶：

Sol    C：1.275ml

Sol    D：1.5ml

H2O：8.625ml

AMPER：0.6ml

TEMED：6ul（加胶之前加）

（5）待分离胶凝固后，加入浓缩胶，放好齿板。

电泳方法如下：

（1）胶凝后，取出齿板。

（2）用样品缓冲液溶解样品，煮沸五分钟。

（3）冷却后加样，小齿加入分子量标记。

（4）加入电泳液，接通电源（11-15MA）。待溴酚蓝跑至胶下缘时（12-16小时）关闭电源，取下胶板。

3.抗原纯化：将带有特异抗原的凝胶带定位切下、转移到硝酸纤维膜上。定位方法如下：

（1）染色：切下分子量标记和凝胶边缘部分，放在染色液中，加热到90-100℃后放置3-10分钟。

染色液配方：甲醇    15-45ml

冰乙酸    10-30ml

考马斯亮兰R250或G250    100-500mg

双蒸水    至100ml

（2）脱色：将染色后的凝胶条放在脱色液中，取5-10层用脱色液浸湿的滤纸放在电转仪的阳极碳板上，将凝胶条铺于滤纸上，再取2-5层用脱色液浸湿的滤纸放在其上，盖上阴极碳板，接通电流至2-3A，5-10分钟。

脱色液配方：甲醇    5-25ml

冰乙醇    5-10ml

双蒸水    至100ml

（3）切割：取下凝胶条，观察蛋白带型，确定所需蛋白位置，按此位置切下未经染色的凝胶上蛋白带。

转移用液配方如下：

Sol.C：Tris    36.3g

甲醇    200ml

DDW    至1000ml

Sol.B：Tris    3.03g

甲醇    200ml

  DDW    至1000ml

Sol.A：6-氨基己酸    5.2g

Tris    5.81g

SDS    0.375g

甲醇    200ml

DDW    至1000ml

转移方法如下：

（1）取六层滤纸，用Sol.C液浸透，置于阳极碳板上。

（2）Sol.B液浸透六层滤纸，覆于前六层滤纸上。

（3）将硝酸纤维膜覆于滤纸上。

（4）胶体平置于硝酸纤维膜上。

（5）将用Sol.A液体浸透的六层以上滤纸覆盖于胶上。

（6）加阴极碳板，接通电源3mA/cm，1-2hr后关闭电源，取下硝酸纤维膜。

（7）用封闭液（PBS（0.01M    PH7.4）-0.2%Tween-20.3%牛血清白蛋白）4℃过夜封闭。

4.抗原条制备：将封闭后的条带干燥后切成宽1-5mm长0.8-4cm规格，用双面胶带粘于10-32孔软塑料板的小槽中，每槽一条，将抗原板封好，-20℃干燥保存。

实施例二、HIV-1抗原条用于检测HIV-1抗体

将根据实施例一所述制备的抗原板作为抗原载体进行HIV-1抗体检测，同时用国际上用于HIV-1抗体确认实验的美国Bio-Rad公司出产的蛋白印迹试剂（商品名：Novapath    Immunoblot）作对照。

抗原条检测方法如下：

（1）每槽加稀释液200ul，将血清样品和对照10ul加在槽内，室温15分钟。

（2）洗液漂洗，每槽加300ul，1分钟后吸去，重复4次。

（3）每槽加酶标抗体100ul，室温10分钟，漂洗如2。

（4）每槽加入300ml显色液，室温2分钟，倒掉显色液，加蒸馏水漂洗。

（5）沥干后肉眼观察结果。

结果判断：

阳性：小条中央出现深褐色条带，阴性：小条无色。

阳性结果应重复一遍，仍为阳性则判为阳性。阴性结果不必重复。

进口试剂按使用说明书进行操作，两种方法结果见下表。

蛋白印迹法

阳性    阴性    总数

本发明检测阳性数    163    0    163

本发明检测阴性数    0    327    327

总数    163    327    500

实施例三、HIV-1抗原条与进口试剂现场比较

将按实施例一制备的抗原条配备其他试剂，按实施例二的方法在北京和兰州的艾滋病毒检测实验室进行现场检测，同时用国内最常用的HIV-1检测进口初筛试剂即日本Fujirebio公司Serodia明胶凝集试剂和英国Wellcome公司的Recombinant    Wellcozyme酶标法试剂进行比较，进口试剂按其使用说明书进行操作，各试剂的阳性结果用原试剂再重复一次以评价其稳定性和重复性，结果见下表。

阳性数

数目    本发明    日本    英国

1    2    1    2    1    2

HIV-1感染者血清    87    87    87    87    87    87    87

正常人血清    1429    0    6    6    35    1

实施例四、丁型肝炎病毒（HDV）抗原条制备

HDV抗原为中国预防医学科学院病毒学研究所肝炎病毒研究室出产的基因工程重组抗原，按实施例一的1、2、3步骤进行制备，然后将封闭后的条带干燥后切成宽1-5mm长0.8-4cm规格，放2-8℃保存。

实施例五、HDV抗原检测血清中HDV抗体

用实施例四制备的HDV抗原条，按以下步骤检测人血清中HDV抗体：

（1）将抗原条放入槽内，加样品稀释液100ul，血清样品和对照10ul加在糟内，室温60分钟。

（2）洗液漂洗，每槽加300ul，1分钟后吸去，重复4次。

（3）每槽加酶标抗体100ul，室温60分钟，漂洗如2。

（4）每槽加入300ml显色液，室温3分钟，倒掉显色液，加蒸馏水漂洗。

（5）沥干后肉眼观察结果。小条中央出现深褐色条带为阳性，小条无色为阴性。阳性结果应重复一遍，仍为阳性则判为阳性。阴性结果不必重复

实施例六、EB病毒抗原条的制备

基因工程重组EB抗原早期抗原由中国预防医学科学院病毒学研究所肿瘤病毒研究室出产，按实施例一步骤进行制备而成。

实施例七、EB病毒抗原检测血清中EB病毒抗体

用实施例六制备的EB病毒抗原条，按以下步骤检测人血清中EB抗体：

（1）将抗原条放入槽内，加入1∶50稀释血清样品和对照100，室温60分钟。

（2）洗液漂洗，每槽加300ul，1分钟后吸去，重复6次。

（3）每槽加酶标抗体100ul，室温30分钟，漂洗如2。

（4）每槽加入300ml显色液，室温5分钟，倒掉显色液，加蒸馏水漂洗。

（5）沥干后肉眼观察结果。小条中央出现深褐色条带为阳性，小条无色为阴性。阳性结果应重复一遍，仍为阳性则判为阳性。阴性结果不必重复。

Claims (6)

1、一种载有单一抗原带的硝酸纤维膜抗原条。

2、根据权利要求1所述的抗原条所载的单一抗原为以下病毒的基因工程抗原之一：

（1）人逆转录病毒：人免疫缺陷病毒1、2型（艾滋病毒、HLV-1、HLV-2），成人T淋巴细胞白血病病毒1、2型（HTLV-1、HTLV-2）。

（2）肝炎病毒：甲型肝炎病毒（HAV），乙型肝炎病毒（HBV），丙型肝炎病毒（HCV），丁型肝炎病毒（HDV），戊型肝炎病毒（HEV）。

（3）疱疹病毒：单纯疱疹病毒1、2型（HSV-1、HSV-2），EB病毒，巨细胞病毒（CMV）。

3、一种载有单一抗原带的硝酸纤维膜抗原条用以下方法制备：

（1）将单一病毒抗原用聚丙烯酰胺凝胶电泳与细菌蛋白分离并形成细带。

（2）切下分子量标记和边缘部分的凝胶，加热至90-100℃用考马斯亮蓝液染色3-10分钟，通电2-3A电流5-10分钟，观察蛋白带型以确定所需蛋白的位置，切下未染色部分凝胶中该位置凝胶。

（3）将切下的凝胶带转移到硝酸纤维膜上，然后切割成小条。

4、根据权利要求3所述的抗原条件所载的单一抗原为以下病毒的基因工程抗原之一：

（1）人逆转录病毒：人免疫缺陷病毒1、2型（艾滋病毒，HLV-1、HLV-2），成人T淋巴细胞白血病病毒1、2型（HTLV-1、HTLV-2）。

（2）肝炎病毒：甲型肝炎病毒（HAV），乙型肝炎病毒（HBV），丙型肝炎病毒（HCV），丁型肝炎病毒（HDV），戊型肝炎病毒（HEV）。

（3）疱疹病毒：单纯疱疹病毒1、2型（HSV-1、HSV-2），EB病毒，巨细胞病毒（CMV）。

5、根据权利要求1和3所述的抗原条是用于检测人血清中对所载抗原的特异性抗体以诊断病毒感染。

6、根据权利要求5所述的抗原条所载的单一抗原为以下病毒的基因工程抗原之一：

（1）人逆转录病毒：人免疫缺陷病毒1、2型（艾滋病毒、HLV-1、HLV-2），成人T淋巴细胞白血病病毒1、2型（HTLV-1、HTLV-2）。

（2）肝炎病毒：甲型肝炎病毒（HAV），乙型肝炎病毒（HBV），丙型肝炎病毒（HCV），丁型肝炎病毒（HDV），戊型肝炎病毒（HEV）。

（3）疱疹病毒：单纯疱疹病毒1、2型（HSV-1、HSV-2），EB病毒，巨细胞病毒（CMV）。