CN107515208B

CN107515208B - 一种基于荧光淬灭的好氧生物膜内部溶解氧检测方法及专用标定装置和测定装置

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Publication number: CN107515208B
Application number: CN201710827647.5A
Authority: CN
Inventors: 周鑫根
Original assignee: Zhejiang Urban & Rural Planning Design Institute
Current assignee: Zhejiang Urban & Rural Planning Design Institute
Priority date: 2017-09-14
Filing date: 2017-09-14
Publication date: 2023-08-04
Anticipated expiration: 2037-09-14
Also published as: CN107515208A

Abstract

一种基于荧光淬灭的好氧生物膜内部溶解氧检测方法及专用标定装置和测定装置，属于污水处理技术领域。包括以下步骤：1）将金属络合物作为荧光剂固定至纳米级载体上，获得溶解氧纳米探针；2）将探针导入生物膜内部，通过检测生物膜内部探针荧光发射强度值，确定水中不同溶解氧条件下，生物膜内部溶解氧含量分布。上述检测方法及专用装置，通过将纳米探针导入生物膜内部，检测生物膜内部探针荧光发射强度值确定溶解氧在生物膜内部含量分布，为生物膜内部传质研究及确定反应器不同运行阶段曝气强度提供理论与技术支持，具有操作简便，结果稳定，检测成本低的特点。

Description

一种基于荧光淬灭的好氧生物膜内部溶解氧检测方法及专用标定装置和测定装置

技术领域

本发明属于污水处理技术领域，具体为一种基于荧光淬灭的好氧生物膜内部溶解氧检测方法及专用标定装置和测定装置。

背景技术

近年来中国环境状况公报显示，我国水体环境总氮污染日趋严重，总氮超标所导致的湖泊藻类爆发及沿海“赤潮”频频发生。但我国大部分传统活性污泥法污水处理厂工艺仍不具有高效的总氮去除能力，污水处理厂尾水总氮达标排放成为迫切需要解决的问题。近年对城镇污水处理厂出水一级标准中，增加了总氮的控制（《城镇污水处理厂污染物排放标准》GB18918-2002）。因此，污水处理厂除了控制COD及氨氮达标外，必须考虑工艺对总氮的脱除。

总氮的去除要求在好氧条件下由硝化菌将氨氮转化为硝酸盐氮后，进一步通过反硝化菌作用，在缺氧条件下将硝酸盐转化为氮气，实现尾水中总氮的去除。现有活性污泥工艺主要通过调节不同反应区溶解氧含量，形成厌氧/缺氧/好氧的功能分区，完成硝化-反硝化的过程，实现总氮的脱除。但与此同时，传统活性污泥法存在的脱氮除磷工艺复杂稳定性差、抗冲击负荷能力弱、剩余污泥产量高、占地面积大等问题是污水厂良性发展的制约因素。

生物膜法作为一种微生物固着型生长的污水处理工艺，具有功能互营的菌群、由外向内的好氧-缺氧分区及高浓度的生物量，在抗负荷冲击、污水总氮去除及剩余污泥减量等方面具有明显技术优势及良好应用前景。其原理利用了生物膜结构具有由外向内的好氧-缺氧区，为反硝化脱氮微生物群落提供了合适的生存环境，从而在无需额外设置反硝化段的条件下，在生物膜外层实现硝化作用（氨氮被氧化成硝态氮），在内部实现反硝化（硝态氮被还原成氮气），即在生物膜中实现了同步硝化反硝化（SND）。工艺占地小，操作简单，稳定性及处理效果较好。

生物膜内部的溶解氧分布对生物膜反应器的运行效率及稳定性具有重要意义。当反应器溶解氧含量过高时，过量的溶解氧渗透进入生物膜内部缺氧区，破坏缺氧-好氧共存的菌落分布，抑制同步脱氮反应进行，导致反硝化受抑制，总氮去除效果降低。另一方面，溶解氧过低会导致生物膜内部溶解氧不足时，生物膜内层形成厌氧区，促进厌氧产酸菌增殖。这种产酸菌降低了体系pH，导致生物膜中作为骨架的EPS框架结构受损（β-多糖被溶解），造成生物膜的大量脱落。

生物膜内部的溶解氧分布与生物膜厚度、微生物活性及基质浓度有关。已有研究指出，饱食阶段微生物以溶解性有机物为碳源，具有较高的生长速率，从而需要消耗更多的DO，此时溶解氧传质深度大大降低；而在饥饿阶段，微生物通过降解内碳源（PHB等）进行异化作用，细胞活性降低，需氧量减少，所需的DO要小于饱食阶段，溶解氧传质深度加大。尤其是当COD完全氧化，游离氨完全氨化后，氧气能完全渗入颗粒，抑制反应器反硝化效果。由此可见，基于生物膜内溶解氧分布调节反应器曝气强度，能有效强化SND效率，不仅提升了反应器污染物去除效率，同时具有节能的意义。

但如何测定生物膜内部的溶解氧分布，从而调控适宜的曝气强度是研究难点。由于生物膜厚度微小，常规技术难以测定生物膜内部的溶解氧分布情况。传统的微电极探针虽可测定生物膜内部溶解氧，但探针价格昂贵操作难度大、且插入对生物膜造成破坏无法重复实验，难以获得动态溶解氧分布动力学数据，限制了生物膜内部传质研究及反应器曝气强度的确立。因此，开发一种经济便捷的生物膜内部的溶解氧无损动态检测方法具有现实意义。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明目的在于设计提供一种基于荧光淬灭的好氧生物膜内部溶解氧检测方法及专用标定装置和测定装置的技术方案，通过将纳米探针导入生物膜内部，检测生物膜内部探针荧光发射强度值确定溶解氧在生物膜内部含量分布，为生物膜内部传质研究及确定反应器不同运行阶段曝气强度提供理论与技术支持，具有操作简便，结果稳定，检测成本低的特点。

所述的一种基于荧光淬灭的好氧生物膜内部溶解氧检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将金属络合物作为荧光剂固定至纳米级载体上，获得溶解氧纳米探针；

2）将探针导入生物膜内部，通过检测生物膜内部探针荧光发射强度值，确定水中不同溶解氧条件下，生物膜内部溶解氧含量分布。

所述的一种基于荧光淬灭的好氧生物膜内部溶解氧检测方法，其特征在于具体包括TiO₂-SiO₂纳米级载体制备、荧光剂在载体上的附着、溶解氧纳米探针的标定、溶解氧纳米探针在生物膜上附着、生物膜内溶解氧测定方法5个步骤；

1）TiO₂-SiO₂纳米级载体制备：取Q1 体积汰酸丁酯，3 Q1体积的正硅酸乙酯，10 Q1体积的异丙醇完全混合20-40 min后，逐滴加水至混合液形成凝胶态，750-850℃灼烧1.5-2.5h，灼烧后形成TiO₂-SiO₂纳米级载体，其表观为乳白色轻质固体，具有均匀多孔网络结构，粒径为80-200 nm；

2）荧光剂在载体上的附着：将一定体积的荧光剂加入制备的TiO₂-SiO₂纳米级载体中，采用涡旋振荡器低速混合9-11h后，去除上清液，用100%乙醇溶液清洗3次去除剩余荧光剂，在75-85℃烘干，获得溶解氧纳米探针；

3）溶解氧纳米探针的标定：在标定装置中，通过向水中通入不同氧分压的混合气体，调节水中溶解氧含量，测定不同溶解氧条件下荧光强度，对溶解氧纳米探针进行标定；

4）溶解氧纳米探针在生物膜上附着：将生物膜样品用去离子水清洗3次后，加入浓度为1-3 mg/L溶解氧纳米探针，用涡旋振荡器低速混合10-30 min后，用去离子水清洗3次去除未附着的溶解氧纳米探针；

5）生物膜内溶解氧测定方法：在测定装置中，采用共聚焦激光扫描显微镜读取生物膜内荧光强度，结合溶解氧纳米探针标准曲线，测定水中不同溶解氧条件下生物膜内溶解氧变化。

所述的一种基于荧光淬灭的好氧生物膜内部溶解氧检测方法，其特征在于步骤1）中：混合时间为25-30 min，灼烧温度780-800℃，灼烧时间1.8-2h，粒径为100-150 nm。

所述的一种基于荧光淬灭的好氧生物膜内部溶解氧检测方法，其特征在于步骤2）中：采用涡旋振荡器低速混合10h，烘干温度为78-80℃。

所述的一种基于荧光淬灭的好氧生物膜内部溶解氧检测方法，其特征在于步骤4）中：浓度为2 mg/L溶解氧纳米探针，用涡旋振荡器低速混合15-20min。

所述的一种基于荧光淬灭的好氧生物膜内部溶解氧检测方法的专用标定装置，其特征在于步骤3）中溶解氧纳米探针的标定装置，包括计算机系统、荧光光度计、氮气供气装置、氧气供气装置，氮气供气装置、氧气供气装置分别通过铜管与稳压室连通，稳压室上设置排气阀门，其两根连接铜管上分别设置氮气气体流量计、氧气气体流量计，稳压室连接稳压室流量计并与测量室通过单向阀连接；测量室为自制的比色皿，其另一端采用单向阀排空；采用荧光光度计测定不同溶解氧条件下荧光信号，并记录在计算机系统中；

使用时，在测量室中加入2 mL浓度为1-3 mg/L 的溶解氧纳米探针，根据荧光剂条件设定荧光光度计激发波长和吸收波长；开启稳压室排气阀门，调节氮气气体流量计、氧气气体流量计，向混合池内通入一定N₂与O₂，通过控制N₂与O₂比例获得氧分压从低至高的混合气体；待稳压室内气压稳定后，关闭排气阀，缓慢打开稳压室流量计，将混合气体注入测量室，气速45-50 ml／s，通气4-6min使测量室内水样溶解氧含量达到稳定后，关闭单向阀，采用荧光光度计测定不同溶解氧条件下荧光信号，并记录在计算机系统中，通过测定不同溶解氧条件下荧光信号，可获得溶解氧纳米探针标准曲线。

所述的一种基于荧光淬灭的好氧生物膜内部溶解氧检测方法的专用测定装置，其特征在于步骤5）中该生物膜内溶解氧的测定装置，包括计算机系统、共聚焦激光扫描显微镜、测量室、氮气供气装置、氧气供气装置，共聚焦激光扫描显微镜与计算机系统配合连接，氮气供气装置、氧气供气装置分别通过铜管与稳压室连通，稳压室上设置排气阀门，其两根连接铜管上分别设置氮气气体流量计、氧气气体流量计，稳压室连接稳压室流量计并与混合室通过单向阀连接，混合室设置混合室排气阀门；混合室与测量室配合连接，其连接管路上设置测量室单向进水阀门，测量室出口与废液收集罐连接，其连接管路上设置单向出水阀门；

使用时，将样本置于载玻片上放入测量室内，开启稳压室排气阀门，调节氮气气体流量计、氧气气体流量计向稳压室内通入一定N₂与O₂，通过控制N₂与O₂比例获得氧分压从低至高的混合气体，待稳压室内气压稳定后，关闭排气阀门，缓慢打开混合室排气阀门及稳压室流量计，将混合气体注入混合室，气速45-50 ml／s，通气4-6 min使混合室内水样溶解氧含量达到稳定后，关闭混合室排气阀门；缓慢开启测量室单向进水阀门和单向出水阀门，混合池中的水样被导入测量池，废液由废液收集罐收集；然后关闭测量室单向进水阀门和单向出水阀门，用共聚焦激光扫描显微镜测定荧光信号并记录在计算机系统中；通过测定不同溶解氧条件下荧光信号，结合溶解氧纳米探针标准曲线，可获得不同溶解氧条件下生物膜内溶解氧分布及变化。

上述一种基于荧光淬灭的好氧生物膜内部溶解氧检测方法及专用标定装置和测定装置，该发明基于某些特定金属络合物（如钌多吡啶络合物）受一定波长光激发后可发射荧光，而氧对其荧光具有猝灭作用，即其发光对氧分子有敏感响应；其原理是当激发单重态的络合物分子与三线态³O₂相碰撞时，三线态³O₂可以与单重态络合物分子发生反应形成单重态氧¹O₂及三重态的络合物分子，将能量传递给氧分子而使发射光产生猝灭，其能量以热能的形式辐射消耗；将特定金属络合物固定至纳米级载体上，并通过标定制定淬灭标线，可获得溶解氧纳米探针；在不同氧含量条件下对溶解氧纳米探针进行标定，并制作标准曲线；然后将探针导入生物膜内部，通过检测生物膜内部探针荧光发射强度值，参照探针标准曲线，可确定水中不同溶解氧条件下，生物膜内部溶解氧含量分布；该方法操作简便，结果稳定，检测成本低，为生物膜内部传质研究及确定反应器曝气强度提供理论与技术支持。

附图说明

图1为溶解氧纳米探针的标定装置示意图；

图2为生物膜内溶解氧测定装置示意图；

图3为本发明反应器中的好氧颗粒污泥；

图4为水中溶解氧为1.0 mg/L时颗粒污泥内部溶解氧分布图（发亮区域为荧光信号）；

图5为水中溶解氧为5.0 mg/L时颗粒污泥内部溶解氧分布图（发亮区域为荧光信号）。

具体实施方式

以下结合说明书附图对本发明作进一步说明。发明所述的一种基于荧光淬灭的生物膜内部溶解氧检测方法，包括纳米级载体制备、荧光剂在载体上的附着、溶解氧纳米探针的标定、溶解氧纳米探针在生物膜上附着及生物膜内溶解氧测定方法5个步骤。

1）纳米级载体制备：取2 ml汰酸丁酯，6 ml的正硅酸乙酯，20 ml的异丙醇完全混合30 min后，逐滴加水至混合液形成凝胶态，800℃灼烧2h。灼烧后形成TiO₂-SiO₂纳米级载体，其表观为乳白色轻质固体，具有均匀多孔网络结构，粒径为127±12 nm。

2）荧光剂在载体上的附着：在5 mg制备的TiO₂-SiO₂纳米级载体中加入50 ml浓度为5*10^-4mol/L的联吡啶钌乙醇溶液中，涡旋振荡器低速混合10h后，去除上清液，用100%乙醇溶液清洗3次去除剩余联吡啶钌，在80℃烘干，获得溶解氧纳米探针。

3）所述的溶解氧纳米探针的标定装置，包括计算机系统12、荧光光度计9、氮气供气装置1、氧气供气装置2，氮气供气装置1、氧气供气装置2分别通过铜管与稳压室5连通，稳压室5上设置排气阀门6，其两根连接铜管上分别设置氮气气体流量计3、氧气气体流量计4，稳压室5连接稳压室流量计7并与测量室10通过单向阀8连接；测量室10为自制的比色皿，其另一端采用单向阀11排空；采用荧光光度计9测定不同溶解氧条件下荧光信号，并记录在计算机系统12中；

使用时，在测量室10中加入2 mL浓度为1-3 mg/L 的溶解氧纳米探针，根据荧光剂条件设定荧光光度计9激发波长和吸收波长；开启稳压室排气阀门6，调节氮气气体流量计3、氧气气体流量计4，向混合池内通入一定N₂与O₂，通过控制N₂与O₂比例获得氧分压从低至高的混合气体；待稳压室5内气压稳定后，关闭排气阀6，缓慢打开稳压室流量计7，将混合气体注入测量室10，气速45-50 ml／s，通气4-6min使测量室内水样溶解氧含量达到稳定后，关闭单向阀8，采用荧光光度计9测定不同溶解氧条件下荧光信号，并记录在计算机系统12中，通过测定不同溶解氧条件下荧光信号，可获得溶解氧纳米探针标准曲线。

4）溶解氧纳米探针在生物膜上附着，其特征在于将生物膜样品用去离子水清洗3次后，加入浓度为2 mg/L溶解氧纳米探针，用涡旋振荡器低速混合20 min后，用去离子水清洗3次去除未附着的溶解氧纳米探针。

5）生物膜内溶解氧测定，采用共聚焦激光扫描显微镜读取生物膜内荧光强度，结合溶解氧纳米探针标准曲线，测定水中不同溶解氧条件下生物膜内溶解氧变化。

该生物膜内溶解氧的测定装置，包括计算机系统12、共聚焦激光扫描显微镜19、测量室16、氮气供气装置1、氧气供气装置2，共聚焦激光扫描显微镜19与计算机系统12配合连接，氮气供气装置1、氧气供气装置2分别通过铜管与稳压室5连通，稳压室5上设置排气阀门6，其两根连接铜管上分别设置氮气气体流量计3、氧气气体流量计4，稳压室5连接稳压室流量计7并与混合室13通过单向阀8连接，混合室13设置混合室排气阀门14；混合室13与测量室16配合连接，其连接管路上设置测量室单向进水阀门15，测量室16出口与废液收集罐20连接，其连接管路上设置单向出水阀门18；

使用时，将样本17置于载玻片上放入测量室内16，开启稳压室排气阀门6，调节氮气气体流量计3、氧气气体流量计4向稳压室5内通入一定N₂与O₂，通过控制N₂与O₂比例获得氧分压从低至高的混合气体，待稳压室5内气压稳定后，关闭排气阀门6，缓慢打开混合室排气阀门14及稳压室流量计7，将混合气体注入混合室13，气速45-50 ml／s，通气4-6 min使混合室13内水样溶解氧含量达到稳定后，关闭混合室排气阀门14；缓慢开启测量室单向进水阀门15和单向出水阀门18，混合池中的水样被导入测量池，废液由废液收集罐20收集；然后关闭测量室单向进水阀门15和单向出水阀门18，用共聚焦激光扫描显微镜19测定荧光信号并记录在计算机系统12中；通过测定不同溶解氧条件下荧光信号，结合溶解氧纳米探针标准曲线，可获得不同溶解氧条件下生物膜内溶解氧分布及变化。

以下通过相应的试验数据进一步说明本发明的有益效果。

试验：好氧颗粒污泥内溶解氧分布测定

好氧颗粒污泥是一种自固定化生物膜形式，其形成是在特定环境下，通过微生物自凝聚作用将活性污泥转化为颗粒状活性污泥。好氧颗粒污泥与传统生物膜工艺同样具有致密的物理结构和由外向内的好氧-缺氧分区。与传统生物膜不同的是，好氧颗粒污泥不具有固着的载体供其附着生长，其单个颗粒粒径仅为500-3000 μm左右，因此颗粒内部溶解氧测定难度高于传统生物膜。

在实验室10 L反应器中培养好氧颗粒污泥进行溶解氧分布测定。接种污泥采用污水处理厂二沉池回流污泥，接种污泥浓度为4000 mg /L，SVI₃₀ 120ml/g。实验采用人工模拟配水，进水COD为1014±27 mg/L，有机负荷率3.0 kg COD /m³ /d。运行14d后，反应器中SVI降至40 mL/g，污泥浓度最终稳定在8000 mg/L左右。反应器具有良好的COD和NH₄ ⁺-N去除效果。对反应器中好氧颗粒污泥粒径分布研究发现，运行14d后，反应器中平均粒径达到500 μm以上，出现了明显的颗粒化（图3）。对反应器中颗粒进行筛分，取粒径为2000-2500μm的好氧颗粒污泥进行内溶解氧分布测定。

实验采用联吡啶钌（[Ru(bpy)₂]²⁺Cl₂·6H₂O）为荧光剂，附着在平均粒径为127±12nm 的TiO₂-SiO₂纳米载体上制成溶解氧纳米探针。通过控制N₂与O₂比例调节氧分压为0、0.05、0.1、0.2、0.3*10⁵ pa，制作联吡啶钌纳米探针标准曲线。

将颗粒污泥用去离子水清洗3次后，加入浓度为2 mg/L联吡啶钌纳米探针，用涡旋振荡器低速混合20 min后，用去离子水清洗3次去除未附着的联吡啶钌溶解氧纳米探针。

采用共聚焦激光扫描显微镜读取颗粒污泥内荧光强度，结合溶解氧纳米探针标准曲线，测定水中不同溶解氧条件下颗粒污泥内溶解氧变化。其中高亮区域为纳米探针激发产生的荧光信号，表明该区域溶解氧浓度为零，未发生荧光淬灭。实验结果表明，当水中溶解氧为1.0 mg/L时，O₂能穿透328±59 μm，颗粒内部处于缺氧状态（图4）；而高曝气条件下，当水中溶解氧含量为5.0 mg/L时，溶解氧最深渗透至颗粒内部812 ±98 μm（图5）。研究认为传质阻力是造成颗粒内部溶解氧限制的主要原因。尽管颗粒具有通透性通道结构，但其中大多数通道只能渗透至颗粒内部300～500 μm，此后由于多糖层的阻碍，溶解氧难以抵达颗粒深处。

Claims

1.一种基于荧光淬灭的好氧生物膜内部溶解氧检测方法，其特征在于，包括TiO₂-SiO₂纳米级载体制备、荧光剂在载体上的附着、溶解氧纳米探针的标定、溶解氧纳米探针在生物膜上附着、生物膜内溶解氧测定5个步骤；

1）TiO₂-SiO₂纳米级载体制备：取Q1体积钛酸丁酯，3×Q1体积的正硅酸乙酯，10×Q1体积的异丙醇完全混合20-40 min后，逐滴加水至混合液形成凝胶态，750-850℃灼烧1.5-2.5h，灼烧后形成TiO₂-SiO₂纳米级载体，其表观为乳白色轻质固体，具有均匀多孔网络结构，粒径为80-200 nm；

2）荧光剂在载体上的附着：将一定体积的荧光剂加入制备好的TiO₂-SiO₂纳米级载体中，采用涡旋振荡器低速混合9-11h后，去除上清液，用100%乙醇溶液清洗3次去除剩余荧光剂，在75-85℃烘干，获得溶解氧纳米探针；所述荧光剂为联吡啶钌；

3）溶解氧纳米探针的标定：在标定装置中，向标定装置的测量室中的水样加入2 mL浓度为1-3 mg/L 的溶解氧纳米探针，通过向水中通入不同氧分压的混合气体，调节水中溶解氧含量，采用荧光光度计测定不同溶解氧条件下荧光强度，对溶解氧纳米探针进行标定，获得溶解氧纳米探针标准曲线；

4）溶解氧纳米探针在生物膜上附着：将生物膜样品用去离子水清洗3次后，加入浓度为1-3 mg/L的溶解氧纳米探针，用涡旋振荡器低速混合10-30 min后，用去离子水清洗3次去除未附着的溶解氧纳米探针；

5）生物膜内溶解氧测定：在测定装置中，采用共聚焦激光扫描显微镜读取生物膜内溶解氧纳米探针的荧光发射强度值，结合溶解氧纳米探针标准曲线，测定水中不同溶解氧条件下生物膜内溶解氧含量分布及变化。

2.如权利要求1所述的一种基于荧光淬灭的好氧生物膜内部溶解氧检测方法，其特征在于步骤1）中：混合时间为25-30 min，灼烧温度780-800℃，灼烧时间1.8-2h，粒径为100-150 nm。

3.如权利要求1所述的一种基于荧光淬灭的好氧生物膜内部溶解氧检测方法，其特征在于步骤2）中：采用涡旋振荡器低速混合10h，烘干温度为78-80℃。

4.如权利要求1所述的一种基于荧光淬灭的好氧生物膜内部溶解氧检测方法，其特征在于步骤4）中：采用浓度为2 mg/L的溶解氧纳米探针，用涡旋振荡器低速混合15-20min。

5.如权利要求1所述的一种基于荧光淬灭的好氧生物膜内部溶解氧检测方法，其特征在于步骤3）中溶解氧纳米探针的标定装置，包括计算机系统、荧光光度计、氮气供气装置、氧气供气装置，氮气供气装置、氧气供气装置分别通过铜管与稳压室连通，稳压室上设置排气阀门，两根连接铜管上分别设置氮气气体流量计、氧气气体流量计，稳压室连接稳压室流量计并与测量室的一端通过单向阀连接；测量室为自制的比色皿，其另一端采用单向阀排空；采用荧光光度计测定不同溶解氧条件下荧光信号，并记录在计算机系统中；

使用时，在测量室中加入2 mL浓度为1-3 mg/L 的溶解氧纳米探针，根据荧光剂条件设定荧光光度计激发波长和发射波长；开启稳压室排气阀门，调节氮气气体流量计、氧气气体流量计，向稳压室内通入一定N₂与O₂，通过控制N₂与O₂比例获得氧分压从低至高的混合气体；待稳压室内气压稳定后，关闭排气阀门，缓慢打开稳压室流量计，将混合气体注入测量室，气速45-50 ml／s，通气4-6min，使测量室内水样溶解氧含量达到稳定后，关闭稳压室与测量室之间的单向阀，采用荧光光度计测定不同溶解氧条件下荧光信号，并记录在计算机系统中，通过测定不同溶解氧条件下荧光信号，获得溶解氧纳米探针标准曲线。

6.如权利要求1所述的一种基于荧光淬灭的好氧生物膜内部溶解氧检测方法，其特征在于步骤5）中该生物膜内溶解氧的测定装置，包括计算机系统、共聚焦激光扫描显微镜、测量室、氮气供气装置、氧气供气装置，共聚焦激光扫描显微镜与计算机系统配合连接，氮气供气装置、氧气供气装置分别通过铜管与稳压室连通，稳压室上设置排气阀门，两根连接铜管上分别设置氮气气体流量计、氧气气体流量计，稳压室连接稳压室流量计并与混合室通过单向阀连接，混合室设置混合室排气阀门；混合室与测量室配合连接，其连接管路上设置测量室单向进水阀门，测量室出口与废液收集罐连接，其连接管路上设置单向出水阀门；

使用时，将生物膜样本置于载玻片上放入测量室内，开启稳压室排气阀门，调节氮气气体流量计、氧气气体流量计向稳压室内通入一定N₂与O₂，通过控制N₂与O₂比例获得氧分压从低至高的混合气体，待稳压室内气压稳定后，关闭稳压室排气阀门，缓慢打开混合室排气阀门及稳压室流量计，将混合气体注入混合室，气速45-50 ml／s，通气4-6 min，使混合室内水样溶解氧含量达到稳定后，关闭混合室排气阀门；缓慢开启测量室单向进水阀门和单向出水阀门，混合池中的水样被导入测量池，废液由废液收集罐收集；然后关闭测量室单向进水阀门和单向出水阀门，用共聚焦激光扫描显微镜测定荧光信号并记录在计算机系统中；通过测定不同溶解氧条件下荧光信号，结合溶解氧纳米探针标准曲线，获得不同溶解氧条件下生物膜内溶解氧含量分布及变化。