CN107505305A - 一种快速分析壮阳保健品中非法添加西地那非类似物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药分析技术领域，具体是一种快速分析壮阳保健品中非法添加西地那非类似物的方法，和筛选西地那非衍生物快速检测条件的方法，涉及采用分子对接的方法，从整体上考虑配体(小分子)与受体(生物大分子)相互作用的好坏，从而发现具有潜在药理活性、易被作为非法添加的化合物；进一步结合密度泛函理论计算得到理论拉曼峰位，深入挖掘数据整理后得到的理论共有峰，可作为现场检测快速判断壮阳保健品中非法添加那非类化合物的依据。本发明的方法不需要人工合成对照品，应用范围广泛，实验成本低，操作简便、快速，适合现场快速检测，为保健食品中非法添加的衍生物的鉴定提供了更加坚固的保证。

Description

一种快速分析壮阳保健品中非法添加西地那非类似物的方法
技术领域
本发明涉及医药分析技术领域，具体地说，是一种快速分析壮阳保健品中非法添加西地那非类似物的方法，和一种筛选西地那非衍生物快速检测条件的方法，涉及采用分子对接的方法，从整体上考虑配体(小分子)与受体(生物大分子)相互作用的好坏，并找到其之间最佳的结合模式，从而发现具有潜在药理活性的化合物；进一步结合密度泛函理论计算其理论拉曼峰位，通过计算得到的理论共有峰来快速判断壮阳保健品中非法添加那非类化合物的方法。
背景技术
磷酸二酯酶5型(PDE-5)抑制剂临床用于不同病因引起的男性勃起功能障碍(ED)。目前，只有三种PDE-5抑制剂经美国食品和药物管理局批准，分别是：枸橼酸西地那非、伐地那非以及他达那非，此类药物必须在医生指导下使用。由于对PDE-5抑制剂的需求广泛，一些号称“安全、纯天然”的性功能保健产品在市场上所占比例也与日俱增。这些所谓的“纯天然”中药保健品真正起到药效的并非本身的中药材，而是不法商人在其中非法添加了PDE-5抑制剂。然而随着执法力度和检测手段的日益提高，在保健食品中非法添加的除了西地那非外，还出现添加多种新型衍生物的趋势，一些厂商通过对这些衍生物进行结构修饰(比如：改变部分官能团、取代基等)后，掺杂到保健食品中以达到逃避检测的目的。虽然这些衍生物具备原有的疗效，但分子结构改变后化合物的药效和毒性也会随之改变。在未经国家食品药品监督管理局批准，未经过药理及毒性试验而非法添加到保健食品中的化药衍生物，会给不知情的消费者带来极为严重的危害。
但是，化药衍生物合成难(合成得到的标准品不一定是非法添加的物质)、检测难(由于缺乏标准品及相应的检测手段，容易发生漏检现象)、鉴定难(对于未知化合物，需要联合多种大型仪器设备进行结构鉴定)是目前急需攻克的问题。为了人民群众的健康，有必要建立一种新的检测策略来杜绝在保健食品中、甚至饮料中非法添加的恶劣行为。
分子对接技术是根据分子对接和打分函数评价，证明所设计的衍生物具有抑制PDE-5的活性，并将其列入衍生物库中，无需全部将其进行化学合成。在此基础上，需要另一种手段来预测虚拟对接后打分函数高的衍生物的特征性的鉴别谱图(比如拉曼光谱)。密度泛函数理论(Density Functional Theory,DFT)，是一种研究多电子体系电子结构的量子力学方法。在DFT方法的不断开发过程中，B3LYP方法的提出，更好的描述了电子相关能和电子密度之间函数关系，使得DFT得以广泛应用。无论是CADD还是DFT技术，都是一种理论预测手段，仍然需要一定的实验数据来验证其预测的准确性。
有关壮阳类保健食品中非法添加PDE-5抑制剂的实验检测方法已有很多报道，液相色谱-质谱(High pressure liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)是最重要、最常应用的检测方法之一。但此方法往往只针对已知目标物的分析，并且在没有对照品、需要在短时间内优化方法的情况下，难以实现现场快速检测，此外，品前处理复杂、不易携带等缺点使得这其也不符合现场药品快检的实际需求。
薄层色谱法(Thin layer chromatography,TLC)技术简单且容易掌握、对环境污染小等优点也是药品快检的优选方法之一。但经TLC分离后的物质只能根据物质的斑点、比移值来判断是否存在掺杂现象。当检出样品为疑似阳性时，筛查结果要在现场进行进一步确证的话，需要另一种便携式的、能提供特征性鉴别谱图的仪器(比如拉曼光谱仪)对其进行定性分析。表面增强拉曼光谱法(Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)可克服TLC分离后样品浓度降低等因素。
因此，本研究策略为今后保健食品检测在无法得到系列衍生物对照品的情况下，为现场检测提供可靠的理论依据，大大节省了检测时间，甚至无需依赖昂贵且不易获得的对照品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速分析非法添加西地那非类似物的方法。本发明的另一目的在于提供一种筛选西地那非衍生物快速检测条件的方法。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
采用计算机辅助设计技术，设计的目标化合物与PDE-5复合物晶体结构中活性腔对接研究，对计算机对接打分函数评分高的化合物进行密度泛函数理论计算，获得理论拉曼光谱峰位，并归纳系列衍生物的共有理论拉曼峰位。
本发明的第一方面，提供一种快速分析非法添加西地那非类似物的方法，包括以下步骤：
步骤A，薄层分离：吸取1μL样品溶液，采用二氯甲烷:丙酮:氨水体积比为20:1.5:0.2的展开体系展开；待展开完全后，取出，晾干，薄层斑点在紫外灯254nm下检视；
步骤B，检测脂溶性类似物时，在薄层斑点处滴加表面增强剂有机银溶胶4μL，采用便携式拉曼光谱仪对滴加表面增强剂的斑点位置进行信号采集，积分时间20s，激光功率80mW，采集次数为3次；
检测水溶性类似物时，在薄层斑点处滴加表面增强剂银溶胶3μL，采用便携式拉曼光谱仪对滴加表面增强剂的斑点位置进行信号采集，积分时间5s，激光功率90mW，采集次数为3次；
步骤C，非空白谱图进行处理：采用标准谱图处理软件对非空白谱图进行处理，选取400-1700cm-1波段作为特征波段，对所述特征波段采用OPUS 5.0软件对谱图进行平滑及基线校正，再对校正后的光谱数据进行矢量归一化处理，得到预处理表面增强拉曼光谱图；
步骤D，对预处理表面增强拉曼光谱图进行判别：
有机银溶胶测得的西地那非类似物的共有吸收峰为417±10cm-1，813±10cm-1，905±10cm-1，927±10cm-1，1002±10cm-1，1159±10cm-1，1233±10cm-1，1529±10cm-1，1560±10cm-1，当预处理表面增强拉曼光谱图中至少含有上述五个吸收峰，判定待检样品中掺杂西地那非类似物，作为“阳性样品”待实验室验证；当预处理表面增强拉曼光谱图中含有少于五个上述吸收峰，则判定没有掺杂西地那非类似物；
银溶胶测得的西地那非类似物的共有吸收峰为813±10cm-1，905±10cm-1，927±10cm-1，1002±10cm-1，1159±10cm-1，1233±10cm-1，1529±10cm-1，1560±10cm-1，当预处理表面增强拉曼光谱图中至少含有上述五个吸收峰，判定待检样品中掺杂西地那非类似物，作为“阳性样品”待实验室验证；当预处理表面增强拉曼光谱图中含有少于五个上述吸收峰，则判定没有掺杂西地那非类似物。
优选的，所述的步骤A中的样品溶液为浓度为1mg/mL的待检样品甲醇溶液。
优选的，所述的步骤A中于距离薄层板底部1～2cm处点样，展开25min，待展开距离薄层板顶部7cm处，取出，晾干。
优选的，对于薄层分离后在薄层板上不显色物质，检测时，所述的步骤B改为采用逐点扫描的方式获得拉曼光谱图。具体可参见中国专利文献CN104949954A公开的“一种用表面增强拉曼光谱鉴定薄层板上不显色物质的方法”。
本发明的第二方面，提供一种筛选西地那非衍生物快速检测条件的方法，包括以下步骤：
步骤一：以西地那非的中间体3-(6,7-二氢-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1H-吡唑[4,3-d]嘧啶-5-yl)-4-乙氧基-苯磺酰为关键中间体，基于构效关系设计西地那非衍生物目标分子(本发明中设计了50余种)，目标分子待下一步进行对接；
步骤二：配体与磷酸二酯酶5型(PDE-5)复合物晶体结构进行虚拟对接
采用药物设计对接平台Discovery Studio 3.0进行步骤一目标分子与PDE-5复合物晶体结构活性腔对接，选择Libdock分子对接技术，(该对接方法首先针对受体活性位点计算得到热区图，包括分子极性和非极性部分；其次，不同构想的配体分子分别刚性地叠合至热区图以形成比较合适的相互作用；最后，进行能量优化，保留打分较高的对接构象)根据对接后打分函数，优选出打分函数高的西地那非衍生物；在本发明的实施例中，打分函数高的化合物共11个，分别为乙基哌嗪S-102、丙基哌嗪S-109、丁基哌嗪S-104、葵基哌嗪S-110、哌啶取代物S-301、芳环取代物S-400,甲基芳环取代物S-401、乙基芳环取代物S-402、丙基芳环取代物S-403、丁基芳环取代物S-404、4-甲基咪唑取代物S-501。(见表1)。
步骤三：密度泛函方法预测西地那非衍生物的理论拉曼图谱
采用GAUSS VIEW 5.0对分子构型进行优化后，选择B3LYP水平的DFT方法，对体系中氢原子加p极化函数和重原子加d的极化函数的6-31G*(d,p)基组，对步骤二优选的西地那非衍生物进行构型优化后，在Linux系统中，由GAUSSIAN 09软件计算；
步骤四：西地那非衍生物理论共有峰
根据DFT计算结果，采用GAUSSVIEW 5.0软件对计算得到的西地那非衍生物理论拉曼谱图进行理论共有峰归纳；
在本发明的实施例中，根据理论峰位吸收强度，总结出西地那非衍生物的吸收峰的DFT理论拉曼值共有峰共有15个，分别是417,485,515,593,805,890,916,941,1010,1041,1150,1253,1263,1523,1550cm-1。
优选的，上述的筛选西地那非衍生物快速检测条件的方法，还包括以下步骤：(即对上述预测方法的验证)
步骤五：西地那非衍生物的合成及结构验证
合成步骤二优选的西地那非衍生物，经质谱、核磁验证结构；
在本发明的实施例中，所述的西地那非衍生物的制备方法为：取3-(6,7-二氢-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1H-吡唑[4,3-d]嘧啶-5-yl)-4-乙氧基-苯磺酰5mmol，溶于氯仿30ml中，冰浴、搅拌溶解，加入三乙胺10mmol。分别加入N-乙基哌嗪(5mmol)、N-丁基哌嗪(5mmol)、N-异丙基哌嗪(5mmol)、N-癸基哌嗪(5mmol)、4-甲基哌啶(5mmol)、苯胺(5mmol)、4-甲基苯胺(5mmol)、4-乙基苯胺(5mmol)、4-丙基苯胺(5mmol)、4-丁基苯胺(5mmol)、4-甲基咪唑(5mmol)进行搅拌反应。后处理得到纯品，经核磁、质谱验证结构。
步骤六：西地那非衍生物结合动力学测定验证
采用Biacore T200分子相互作用分析系统。依次进样不同浓度的化合物，实验数据采用Biacore T200 evaluation软件分析，采用动力学结合模型拟合计算实验结果，获得衍生物结合活性，验证分子对接计算的结果。
步骤七：建立西地那非衍生物的TLC-SERS检测条件
称取步骤五制得的西地那非衍生物进行薄层分离，展开体系为二氯甲烷:丙酮:氨水体积比为20:1.5:0.2；
滴加表面增强剂，表面增强剂为金溶胶、有机银溶胶、银溶胶或金银合胶，采用便携式拉曼光谱仪进行扫描；本方法优选有机银溶胶，采用便携式拉曼光谱仪进行扫描；
步骤八：非空白谱图进行处理
采用标准谱图处理软件对非空白谱图进行处理，选取400-1700cm-1波段作为特征波段，对所述特征波段采用OPUS 5.0软件对谱图进行平滑及基线校正，再对校正后的光谱数据进行矢量归一化处理，得到预处理表面增强拉曼光谱图；
步骤九：对预处理表面增强拉曼光谱图进行判别
步骤七TLC-SERS检测得到共有峰与步骤四DFT理论计算得到的共有峰进行整合和归纳，确定西地那非衍生物的共有吸收峰和判定待测样品中含有西地那非衍生物的标准；
在本发明的实施例中，TLC-SERS检测得到共有峰有9个分别是417，813，905，927，1002，1159，1233，1529，1560，cm-1。与DFT理论计算得到的共有峰进行整合和归纳，即417±10cm-1，813±10cm-1，905±10cm-1，927±10cm-1，1002±10cm-1，1159±10cm-1，1233±10cm-1，1529±10cm-1，1560±10cm-1，当预处理表面增强拉曼光谱图中至少含有五个西地那非衍生物的吸收峰，现场检测人员可初步判定待检样品中掺杂西地那非类似物，作为“阳性样品”待实验室验证(步骤十)。当预处理表面增强拉曼光谱图中含有少于五个上述吸收峰，则现场检测人员可初步判定没有掺杂西地那非类似物。
更优选的，上述的筛选西地那非衍生物快速检测条件的方法，还包括以下实验室验证步骤：
步骤十：UPLC-QTOF/MS实验室验证
为现场检测的结果进行进一步确证，避免“假阳性”情况的发生。建立UPLC-TOF/MS检测方法。对新型未知西地那非衍生物的结构进行确证。并分析西地那非衍生物碎片的裂解规律，总结那非类衍生物共有碎片离子，为今后实验室验证时，无标准品情况下，可根据那非类衍生物共有碎片离子进行判定。
采用快速分离超高效液相色谱-飞行时间质谱联用仪对西地那非衍生物进行定性分析，获得总离子流图和西地那非衍生物的共有碎片离子。以QTOF/MS得到的准分子离子峰确定被测物质的准确分子量，并通过安捷伦“Formula Database Generator”软件建立西地那非衍生物已知化学成分数据库。建立了快速、准确分析中药中非法添加西地那非衍生物的中化学成分的分析方法。
与现有技术相比，本发明的技术方案的优点和积极效果在于：
1.不需要合成对照品，应用范围广泛
本发明的技术方案与现有技术相比，不需要合成一系列的那非类衍生物，也无需衍生物对照品即可实现现场快速判别检测。并且，在本发明的技术方案中，当预处理表面增强拉曼光谱图中含有至少五个西地那非类似物的吸收峰，现场检测人员即可判定待检壮阳中药或保健品中掺杂西地那非类似物，并作为“阳性样品”待实验室进一步验证。
2.实验成本低
计算机辅助药物设计可将所设计的化合物与数据库中的靶酶进行模拟对接，来评价化合物与靶点结合的优劣，对化合物活性作出相应的评价；DFT理论计算结果能直观的反映分子振动的信息，随着DFT理论的发展，大量的理论计算与实验结果进行对比，显示了其计算结果的可信性。本发明将二种理论计算方法结合起来应用，在不需要(或尚未得到)PDE-5抑制剂系列衍生物对照品的情况下，对计算结果评分较好的衍生物首先进行DFT计算，预测其理论拉曼光谱峰。如此，在今后的实验室或现场检测中，无论不法厂商非法添加何种PDE-5抑制剂衍生物或类似物，现场检测人员均可根据本研究提供的共有峰来判断样品中是否掺杂。
3.操作简便、快速，适合现场快速检测
TLC分离后的物质只能根据物质的斑点、比移值来判断是否存在掺杂现象。当检出样品为疑似阳性时，筛查结果要在现场进行进一步确证的话，需要一种便携式的、能提供特征性鉴别谱图的仪器(比如拉曼光谱仪)对其进行定性分析，即表面增强拉曼光谱。现场检测时，通过TLC-SERS检测后的拉曼峰位，结合预测得到的那非类共有峰来判定壮阳类保健品中是否掺杂了西地那非类似物。
4.为保健食品中非法添加的衍生物的鉴定提供了更加坚固的保证
通过“调研-预测-检测-归纳-确证”五步，建立保健品中非法添加未知PDE-5抑制剂的现场-实验室快检验证策略。可以不需要对系列衍生物进行大量的合成，也能了解其生物活性、获得其特征性的鉴别谱图，对实验室或现场检测来说，具有十分重大的意义。
附图说明
图1为本发明的技术方案流程图；
图2为本发明实施例1中的步骤一Discovery Studio 3.0软件对PDE-5与那非衍生物对接结果；
图3为本发明实施例1中的步骤二GAUSS VIEW 5.0软件对虚拟筛选评分优的11种西地那非衍生物优化后的分子构型；
图4为本发明实施例1中的步骤二中对西地那非衍生物进行构型优化后，由GAUSSIAN 09软件(Linux系统)计算，并与实际测得的拉曼光谱进行比较；
图5为本发明实施例1中的步骤三中西地那非衍生物的合成路线通式及衍生物结构式；
图6为本发明实施例1中的步骤三中西地那非S-102号衍生物600HMZ核磁氢谱图；
图7为本发明实施例1中的步骤三中西地那非S-104号衍生物600HMZ核磁氢谱图；
图8为本发明实施例1中的步骤三中西地那非S-109号衍生物600HMZ核磁氢谱图；
图9为本发明实施例1中的步骤三中西地那非S-110号衍生物600HMZ核磁氢谱图；
图10为本发明实施例1中的步骤三中西地那非S-400号衍生物600HMZ核磁氢谱图；
图11为本发明实施例1中的步骤三中西地那非S-401号衍生物600HMZ核磁氢谱图；
图12为本发明实施例1中的步骤三中西地那非S-402号衍生物600HMZ核磁氢谱图；
图13为本发明实施例1中的步骤三中西地那非S-403号衍生物600HMZ核磁氢谱图；
图14为本发明实施例1中的步骤三中西地那非S-404号衍生物600HMZ核磁氢谱图；
图15为本发明实施例1中的步骤三中西地那非S-301号衍生物600HMZ核磁氢谱图；
图16为本发明实施例1中的步骤三中西地那非S-501号衍生物600HMZ核磁氢谱图；
图17为本发明实施例1中的步骤五中西地那非类似物、衍生物标准品TLC分离结果：I-1.S-109；I-2.伐地那非；I-3.他达那非；I-4.S-403；I-5.S-404；I-6.S-401；I-7.S-501；II-1.S-102；II-2.S-104；II-3.S-110；II-4.S-301；II-5.S-400；II-6.S-1402；II-7.西地那非；
图18为本发明实施例1中的步骤五SERS检测条件优化后的检测结果；
图19为本发明实施例1中的步骤五西地那非类似物、衍生物标准品SERS检测结果；
图20为本发明实施例1中的步骤七中模拟样品TLC分离结果；
图21为本发明实施例1中的步骤七中模拟样品SERS采集图谱；
图22为本发明实施例1中的步骤八中UPLC-QTOF/MS液相总离子流图。
图23为本发明实施例2中的步骤C中西地那非类似物标准品TLC分离结果：1.西地那非；2.枸橼酸羟基豪莫西地那非；3.伐地那非；4.伪伐地那非；5.豪莫西地那非；6.红地那非；7.他达那非；8.混合；
图24为本发明实施例2中的步骤C中SERS检测条件优化后的检测结果。
具体实施方式
以下结合附图，对本发明的技术方案(图1)的具体实施形态做进一步说明。
实施例1
在本实施例中，采用的软件包括：药物设计平台Discovery Studio 3.0；GAUSSIAN09程序包。
在本实施例中，采用的设备包括：便携式拉曼光谱仪(BWS415,B&W Tek Inc.,美国)，激发波长785nm，分辨率5cm-1，光谱覆盖范围175-3200cm-1；WFH-203B三用紫外分析仪(上海精科实业有限公司)；超声仪(KUDOS-SK5200HP,中国)；离心机(HERAEUS,FRESCO 17Centrifuge；Thermo Scientific,美国)；分析天平(METTLER AE240,中国)；标准谱图处理软件OPUS 5.0。
在本实施例中，采用的材料包括：薄层色谱分离板F254(10×20cm)(Merck，Darmstadt,Germany)；硝酸银、柠檬酸三钠(AR，国药集团化学试剂有限公司)；其它所用试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；色谱纯甲酸购买自Tedia(美国)；质谱纯甲醇购买自Fisher Scientific(美国)；超纯水由Milli-Q Academic超纯水系统(Millipore，美国)生产。色谱柱为ACQUITY UPLCTM BEH C18 column(2.1mm×100mm,1.7μm,Waters,Milford,MA)色谱柱。
步骤一：
在西地那非结构中的甲基哌嗪位置设计哌嗪类、芳环类、脂肪链等取代基约50种，将所有设计的目标化合物基于计算机辅助设计方法，采用药物设计软件Discovery Studio3.0将设计的50种目标分子与磷酸二酯酶5型(PDE-5)西地那非复合物晶体结构活性腔对接，选择Libdock分子对接技术，选出Libdock打分函数高的化合物11个，分别是乙基哌嗪S-102、丙基哌嗪S-109、丁基哌嗪S-104、葵基哌嗪S-104、哌啶取代物S-301、芳环取代物S-400,甲基芳环取代物S-401、乙基芳环取代物S-402、丙基芳环取代物S-403、丁基芳环取代物S-404、4-甲基咪唑取代物S-501(表1)，11种衍生物的对接结果见图2。
表1.LibDock对接打分结果
步骤二：
采用GAUSS VIEW 5.0对分子构型进行优化(图3)。计算过程中，选择B3LYP水平的DFT方法，该方法由Lee-yang-Parr的相关函数和Becke的杂化交换函数构成。对体系中氢原子加p极化函数和重原子加d的极化函数的6-31G(d,p)基组，对11种西地那非衍生物进行构型优化后，在Linux系统性，由GAUSSIAN 09软件计算。将计算得到的理论拉曼光谱与实际测得的拉曼光谱进行比较。
将11种西地那非衍生物的DFT计算结果、拉曼实测值的共有峰(图4)及TLC-SERS实测值的数据整合并进行比对分析。发现，DFT理论拉曼值共有峰共有41个，分别是在本发明的实施例中，根据理论峰位吸收强度，总结出西地那非衍生物的吸收峰的DFT理论拉曼值共有峰共有15个，分别是417,485,515,593,805,890,916,941,1010,1041,1150,1253,1263,1523,1550cm-1。
TLC-SERS检测得到共有峰有9个分别是417，813，905，927，1002，1159，1233，1529，1560，cm-1。与DFT理论计算得到的共有峰进行整合和归纳，即417±10cm-1，813±10cm-1，905±10cm-1，927±10cm-1，1002±10cm-1，1159±10cm-1，1233±10cm-1，1529±10cm-1，1560±10cm-1，从结果来看，实测值与理论值基本相似(可允许误差在±10cm-1)。
当预处理表面增强拉曼光谱图中至少含有五个上述吸收峰，判定待检壮阳中药中掺杂西地那非衍生物，作为“阳性样品”待实验室验证；当预处理表面增强拉曼光谱图中含有少于五个上述吸收峰，则判定没有掺杂西地那非衍生物。
步骤三：
对优选出的11种西地那非衍生物进行化合物的合成与分离研究，来验证Libdock及DFT计算的预测能力。合成路线通式如图5。
(1)S-102的制备
取3-(6,7-二氢-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1H-吡唑[4,3-d]嘧啶-5-yl)-4-乙氧基-苯磺酰5mmol，溶于氯仿30ml中，冰浴，搅拌溶解，加入三乙胺10mmol，N-乙基哌嗪5mmol溶于氯仿25ml中，澄清后倾入反应瓶中，搅拌反应，完全反应(TLC监控反应进程)。反应物倾入分液漏斗中，饱和碳酸氢钠溶液洗涤，氯化钠溶液洗涤，水洗涤，分岀有机层无水硫酸镁干燥，有机层中加入适量正己烷，慢慢析出结晶，过滤，干燥，得无色固体0.9g。产率36.8％。
1H NMR(600MHz,CDCL3)，δ10.83(s,1H)，δ8.79(d,J＝2.40Hz,1H)，δ7.80(dd,J＝2.40,8.70Hz,1H)，δ7.13(d,J＝8.76Hz,1H)，δ4.36(q,J＝6.98Hz,2H)，δ4.26(s,3H)，δ3.09(s,4H)，δ2.91(t,J＝15.12Hz,3H)，δ2.52(s,4H)，δ2.4(q,J＝7.11Hz,2H)，δ1.85(q,J＝7.56Hz,2H)，δ1.87-1.82(m,2H)，δ1.63(t,J＝6.99Hz,3H)，δ1.03-0.99(m,6H)(如图6)。HRMS[M+H]489.61。
(2)S-104的制备
取3-(6,7-二氢-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1H-吡唑[4,3-d]嘧啶-5-yl)-4-乙氧基-苯磺酰2.1g(5mmol)，溶于氯仿30ml中，室温，搅拌溶解，加入三乙胺1.01g(10mmol)，N-丁基哌嗪0.71g(5mmol)，搅拌反应，回流2h完全反应(TLC监控反应进程)。后处理：反应液移入分液漏斗，饱和碳酸氢钠溶液洗涤20ml，饱和氯化钠溶液洗涤20ml，水洗，有机层无水硫酸镁干燥，活性碳脱色，蒸去氯仿，得粗品。粗品加入二氯甲烷20ml，溶解后加入正己烷10ml，澄清，析晶，过滤，干燥，得无色固体1.15g。产率44.5％。
1H NMR(600MHz,CDCL3)，δ10.82(s,1H)，δ8.83(d,J＝2.4Hz,1H)，δ7.84(dd,J＝2.43,8.73Hz,1H)，δ7.15(d,J＝8.12Hz,1H)，δ4.38(q,J＝6.96Hz,2H)，δ4.28(s,3H)，δ3.12(brs,4H)，δ2.93(t,J＝15.06Hz,2H)，δ2.54(brs,4H)，δ2.34(brs,2H)，δ1.89-1.84(m,2H)，δ1.66(t,J＝6.96Hz,3H)，δ1.41(brs,2H)，δ1.30-1.27(m,2H)，δ1.03(t,J＝7.38Hz,3H)，δ0.88(t,J＝7.35Hz,3H)(如图7)。HRMS[M+H]517.51。
(3)S-109的制备
取3-(6,7-二氢-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1H-吡唑[4,3-d]嘧啶-5-yl)-4-乙氧基-苯磺酰5mmol，溶于氯仿30ml中，室温，搅拌溶解，加入三乙胺10mmol，N-异丙基哌嗪5mmol，搅拌反应，回流2h完全反应(TLC监控反应进程)。后处理：反应液移入分液漏斗，饱和碳酸氢钠溶液洗涤20ml，饱和氯化钠溶液洗涤20ml，水洗，有机层无水硫酸镁干燥，活性碳脱色，蒸去氯仿，得粗品。粗品加入二氯甲烷20ml，溶解后加入正己烷10ml，澄清，析晶，过滤，干燥，得无色固体0.7g。产率27.9％。
1H NMR(600MHz,CDCl3)，δ10.81(s,1H)，δ8.83(d,J＝2.46Hz,1H)，δ7.83(dd,J＝2.46,8.71Hz,1H)，δ7.15(d,J＝8.76Hz,1H)，δ4.38(q,J＝7.00Hz,2H)，δ4.28(s,3H)，δ3.10(brs,4H)，δ2.93(t,J＝15.12Hz,2H)，δ2.69-2.67(m,1H)，δ2.62(brs,4H)，δ1.89-1.85(m,2H)，δ1.65(t,J＝6.99Hz,3H)，δ1.03(t,J＝7.38Hz,3H)，δ1.00(d,J＝6.3Hz,6H)(如图8)。HRMS[M+H]503.68。
(4)S-110的制备
取3-(6,7-二氢-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1H-吡唑[4,3-d]嘧啶-5-yl)-4-乙氧基-苯磺酰5mmol，溶于氯仿30ml中，室温，搅拌溶解，加入三乙胺10mmol，N-癸基哌嗪5mmol，搅拌反应，回流2h完全反应(TLC监控反应进程)。后处理：反应液移入分液漏斗，饱和碳酸氢钠溶液洗涤20ml，饱和氯化钠溶液洗涤20ml，水洗，有机层无水硫酸镁干燥，活性碳脱色，蒸去氯仿，得粗品。粗品加入二氯甲烷20ml，溶解后加入正己烷10ml，澄清，析晶，过滤，干燥，得无色固体0.9g。产率30.0％。
1H NMR(600MHz,CDCL3)，δ10.81(s,1H)，δ8.83(d,J＝2.22Hz,1H)，δ7.83(dd,J＝2.36,8.76Hz,1H)，δ7.14(d,J＝8.76Hz,1H)，δ4.37(q,J＝7.00Hz,2H)，δ4.28(s,3H)，δ3.10(brs,4H)，δ2.93(t,J＝15.12Hz,2H)，δ2.53(brs,4H)，δ2.31(t,J＝14.82Hz,2H)，δ1.89-1.83(m,2H)，δ1.65(t,J＝6.96Hz,3H)，δ1.40(brs,2H)，δ1.26(q,J＝7.02Hz,2H)，δ1.22(s,12H)，δ1.02(t,J＝7.38Hz,3H)，δ0.86(t,J＝7.08Hz,3H)(如图9)。HRMS[M+H]601.35。
(5)S-400的制备
取3-(6,7-二氢-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1H-吡唑[4,3-d]嘧啶-5-yl)-4-乙氧基-苯磺酰5mmol，溶于氯仿30ml中，室温，搅拌溶解，加入三乙胺10mmol，苯胺5mmol，搅拌反应，回流2h完全反应(TLC监控反应进程)。后处理：反应液移入分液漏斗，饱和碳酸氢钠溶液洗涤20ml，饱和氯化钠溶液洗涤20ml，水洗，有机层无水硫酸镁干燥，活性碳脱色，蒸去氯仿，得粗品。粗品加入二氯甲烷20ml，溶解后加入正己烷10ml，澄清，析晶，过滤，干燥，得无色固体0.7g。产率29.9％。
1H NMR(600MHz,CDCL3)，δ10.79(s,1H)，δ8.86(d,J＝2.40Hz,1H)，δ7.79(dd,J＝6.30,11.22Hz,1H)，δ7.26-7.24(m,2H)，δ7.15-7.10(m,3H)，δ7.01(t,J＝7.74Hz,2H)，δ4.30(q,J＝6.98Hz,2H)，δ4.26(s,3H)，δ2.78(t,J＝15.18Hz,2H)，δ1.87-1.81(m,2H)，δ1.59(t,J＝6.96Hz,3H)，δ1.03(t,J＝7.38Hz,3H)(如图10)。HRMS[M+H]468.17。
(6)S-401的制备
取3-(6,7-二氢-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1H-吡唑[4,3-d]嘧啶-5-yl)-4-乙氧基-苯磺酰5mmol，溶于氯仿30ml中，室温，搅拌溶解，加入三乙胺10mmol，4-甲基苯胺5mmol，搅拌反应，回流2h完全反应(TLC监控反应进程)。后处理：反应液移入分液漏斗，饱和碳酸氢钠溶液洗涤20ml，饱和氯化钠溶液洗涤20ml，水洗，有机层无水硫酸镁干燥，活性碳脱色，蒸去氯仿，得粗品。粗品加入二氯甲烷20ml，溶解后加入正己烷10ml，澄清，析晶，过滤，干燥，得无色固体0.8g。产率33.2％。
1H NMR(600MHz,DMSO)，δ12.12(s,1H)，δ10.14(s,1H)，δ7.77(d,J＝2.46Hz,1H)，δ7.80(dd,J＝2.52,8.64Hz,1H)，δ7.27(d,J＝8.88Hz,1H)，δ7.05-7.01(m,4H)，δ4.15(s,3H)，δ4.14(q,J＝7.02Hz,2H)，δ2.79(t,J＝7.38Hz,2H)，δ2.19(s,3H)，δ1.79-1.73(m,2H)，δ1.31(t,J＝6.96Hz,3H)，δ0.96(t,J＝7.38Hz,3H)。(如图11)。HRMS[M+H]482.19。
(7)S-402的制备
取3-(6,7-二氢-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1H-吡唑[4,3-d]嘧啶-5-yl)-4-乙氧基-苯磺酰5mmol，溶于氯仿30ml中，室温，搅拌溶解，加入三乙胺10mmol，4-乙基苯胺5mmol，搅拌反应，回流2h完全反应(TLC监控反应进程)。后处理：反应液移入分液漏斗，饱和碳酸氢钠溶液洗涤20ml，饱和氯化钠溶液洗涤20ml，水洗，有机层无水硫酸镁干燥，活性碳脱色，蒸去氯仿，得粗品。粗品加入二氯甲烷20ml，溶解后加入正己烷10ml，澄清，析晶，过滤，干燥，得无色固体0.8g。产率33.3％。
1H NMR(600MHz,DMSO)，δ12.13(s,1H)，δ10.17(s,1H)，δ7.97(d,J＝2.46Hz,1H)，δ7.83(dd,J＝2.28,8.82Hz,1H)，δ7.27(,J＝8.94Hz,1H)，δ7.08-7.04(m,4H)，δ4.16(s,3H)，δ4.15(q,J＝7.02Hz,2H)，δ2.79(t,J＝Hz,7.56H,2H)，δ2.48(q,J＝Hz,7.56H,2H)，δ1.79-1.72(m,2H)，δ1.31(t,J＝6.96Hz,3H)，δ1.09(t,J＝7.56Hz,3H)，δ0.95(t,J＝7.38Hz,3H)(如图12)。HRMS[M+H]496.20。
(8)S-403的制备
取3-(6,7-二氢-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1H-吡唑[4,3-d]嘧啶-5-yl)-4-乙氧基-苯磺酰5mmol，溶于氯仿30ml中，室温，搅拌溶解，加入三乙胺10mmol，4-丙基苯胺5mmol，搅拌反应，回流2h完全反应(TLC监控反应进程)。后处理：反应液移入分液漏斗，饱和碳酸氢钠溶液洗涤20ml，饱和氯化钠溶液洗涤20ml，水洗，有机层无水硫酸镁干燥，活性碳脱色，蒸去氯仿，得粗品。粗品加入二氯甲烷20ml，溶解后加入正己烷10ml，澄清，析晶，过滤，干燥，得无色固体1.1g。产率43.1％。
1H NMR(600MHz,DMSO)，δ12.12(s,1H)，δ10.1478(s,1H)，δ7.93(d,J＝2.46Hz,1H)，δ7.82(dd,J＝2.46,8.88Hz,1H)，δ7.27(d,J＝8.94Hz,1H)，δ7.06-7.02(m,4H)，δ4.16(s,3H)，δ4.15(q,J＝7.02Hz,2H)，δ2.78(t,J＝7.38Hz,2H)，δ2.43(t,J＝7.44Hz,2H)，δ1.77-1.73(m,2H)，δ1.50-1.46(m,2H)，δ1.31(t,J＝6.96Hz,3H)，δ0.95(t,J＝7.38Hz,3H)，δ0.81(t,J＝7.32Hz,3H)(如图13)。HRMS[M+H]510.22
(9)S-404的制备
取3-(6,7-二氢-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1H-吡唑[4,3-d]嘧啶-5-yl)-4-乙氧基-苯磺酰5mmol，溶于氯仿30ml中，室温，搅拌溶解，加入三乙胺10mmol，4-丁基苯胺5mmol，搅拌反应，回流2h完全反应(TLC监控反应进程)。后处理：反应液移入分液漏斗，饱和碳酸氢钠溶液洗涤20ml，饱和氯化钠溶液洗涤20ml，水洗，有机层无水硫酸镁干燥，活性碳脱色，蒸去氯仿，得粗品。粗品加入二氯甲烷20ml，溶解后加入正己烷10ml，澄清，析晶，过滤，干燥，得无色固体0.7g。产率26.7％。
1H NMR(600MHz,DMSO)，δ12.12(s,1H)，δ10.15(s,1H)，δ7.95(d,J＝2.46Hz,1H)，δ7.83(dd,J＝2.52,8.82Hz,1H)，δ7.27(d,J＝8.94Hz,1H)，δ7.05-7.02(m,4H)，δ4.16(s,3H)，δ4.15(q,J＝6.96Hz,2H)，δ2.78(t,J＝15.00Hz,2H)，δ2.44(t,J＝15.42Hz,2H)，δ1.77-1.73(m,2H)，δ1.46-1.41(m,2H)，δ1.31(t,J＝6.96Hz,3H)，δ1.24-1.20(m,2H)，δ0.95(t,J＝7.35Hz,3H)，δ0.83(t,J＝7.35Hz,3H)(如图14)。HRMS[M+H]524.23。
(10)S-301的制备
取3-(6,7-二氢-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1H-吡唑[4,3-d]嘧啶-5-yl)-4-乙氧基-苯磺酰5mmol，溶于氯仿30ml中，室温，搅拌溶解，加入三乙胺10mmol，4-甲基哌啶5mmol，搅拌反应，回流2h完全反应(TLC监控反应进程)。后处理：反应液移入分液漏斗，饱和碳酸氢钠溶液洗涤20ml，饱和氯化钠溶液洗涤20ml，水洗，有机层无水硫酸镁干燥，活性碳脱色，蒸去氯仿，得粗品。粗品加入二氯甲烷20ml，溶解后加入正己烷10ml，澄清，析晶，过滤，干燥，得无色固体1.2g。产率50.6％。
1H NMR(600MHz,CDCL3)，δ10.85(s,1H)，δ8.79(d,J＝2.4Hz,1H)，δ7.82(dd,J＝2.46,8.70Hz,1H)，δ7.13(d,J＝8.82Hz,1H)，δ4.36(q,J＝6.98Hz,2H)，δ4.25(s,3H)，δ3.78(d,J＝11.4Hz,2H)，δ2.92(t,J＝11.4Hz,2H)，δ2.33(t,J＝11.4Hz,2H)，δ1.87-1.83(m,2H)，δ1.67(d,J＝9.78Hz,2H)，δ1.63(t,J＝6.96Hz,3H)，δ1.33-1.29(m,3H)，δ1.01(t,J＝7.35Hz,3H)，δ0.91(d,J＝5.40Hz,3H)(如图15)。HRMS[M+H]474.22。
(11)S-501的制备
取3-(6,7-二氢-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1H-吡唑[4,3-d]嘧啶-5-yl)-4-乙氧基-苯磺酰5mmol，溶于氯仿30ml中，室温，搅拌溶解，加入三乙胺10mmol，4-甲基咪唑5mmol，搅拌反应，回流2h完全反应(TLC监控反应进程)。后处理：反应液移入分液漏斗，饱和碳酸氢钠溶液洗涤20ml，饱和氯化钠溶液洗涤20ml，水洗，有机层无水硫酸镁干燥，活性碳脱色，蒸去氯仿，得粗品。粗品加入二氯甲烷20ml，溶解后加入正己烷10ml，澄清，析晶，过滤，干燥，得无色固体0.75g。产率33.0％。
1H NMR(600MHz,DMSO)，δ12.26(s,1H)，δ8.26(s,1H)，δ8.16(s,1H)，δ8.14-8.12(m,1H)，δ7.44(s,1H)，δ7.41-7.39(m,1H)，δ4.20(q,J＝6.98Hz,2H)，δ4.15(s,3H)，δ2.76(t,J＝7.5Hz,2H)，δ2.06(s,3H)，δ1.73-1.72(m,2H)，δ1.29(t,J＝6.96Hz,3H)，δ0.94(t,J＝7.35Hz,3H)(如图16)。HRMS[M+H]457.17。
步骤四：西地那非衍生物结合动力学测定验证
采用Biacore T200分子相互作用分析系统。依次进样不同浓度的化合物，实验数据采用Biacore T200evaluation软件分析，采用动力学结合模型拟合计算实验结果，获得衍生物结合活性，验证分子对接计算的结果(表2)。
表2 西地那非衍生物结合动力学测定结果
“-”表示在实验浓度下无法准确计算化合物亲和力
步骤五：建立TLC-SERS检测条件
对照品溶液的制备：精密称取衍生物及标准品适量，加入1mL甲醇溶解，分别制成浓度为1mg/mL的对照品溶液，于4℃冰箱保存，待检。
模拟阳性样品的制备：随机选取10种中药阴性基质并随机添加4种西地那非衍生物，得到4种对照品掺杂量均为1％的实验室自制模拟假药样品，于4℃冰箱保存，待检。
将对照品进行TLC分离(如图17)，对照品混合溶液分别吸取1μL，点于同一薄层色谱分离板F254(10×20cm)，分为2组：组(1)为伐地那非、他达那非、S-109,S-403,S-404,S-401,S-501；组(2)为枸橼酸西地那非、S-102,S-104,S-110,S-301,S-400,S-402各取1μl，采用优化后的TLC展开条件，于距离薄层板底部1～2cm处点样，采用二氯甲烷:丙酮:氨水＝20:1.5:0.2(v/v)展开25min。待展开距离薄层板顶部7cm处，取出，晾干，薄层斑点在紫外灯365nm下检视。
TLC分离结果：组(1)S-109,伐地那非,他达那非,S-403,S-404,S-401,S-501 Rf值分别为0.13,0.02,0.24,0.43,0.45,0.40,0.22；组(2)S-102,S-104,S-110,S-301,S-400,S-402，枸橼酸西地那非Rf值分别为0.24,0.51,0.69,0.75,0.35,0.41,0.10。
定位色谱条带中与对照品Rf值相同的位置，滴有机银溶胶4μL，用采用便携式拉曼光谱仪对滴加银胶的斑点位置进行信号采集，经实验条件优化后(图18)，确定最后采用积分时间20s，激光功率80mW进行SERS图谱(图19)。采集次数为3次。
步骤六：数据分析方法
采用Matlab 13.0软件对所得光谱进行数据预处理，选取谱段(400～1700cm-1)、平滑(Sgolay法)、基线校正(airPLS法)及归一化(Min-Max Normalization法)。采用Origin8.0版作图。
步骤七：TLC-SERS检测模拟阳性样品
将模拟阳性样品进行TLC分离(如图20)，对照品混合溶液分别吸取1μL，点于同一薄层色谱分离板GF254(10×20cm)，采用优化后的TLC展开条件，于距离薄层板底部1～2cm处点样，采用二氯甲烷:丙酮:氨水＝20:1.5:0.2(v/v)展开25min。待展开距离薄层板顶部7cm处，取出，晾干，薄层斑点在紫外灯254nm下检视。
19号样品中，与S-109的Rf相同位置的SERS谱在419，484，553，630，658，712，904，926，1098，1259，1293，1312，1560，1583cm-1处有峰，与S-301的Rf相同位置SERS谱在483，556，725，819，1237，1339，1528cm-1处有峰，与S-400的Rf相同位置SERS谱在525，570，733，753，910，948，1040，1096，1236，1266，1530，1562cm-1处有峰，与S-501的Rf相同位置SERS谱在418，484，535，819，926，990，1009，1185，1236，1332，1529cm-1处有峰，与本研究总结得到的共有峰基本一致，说明19号样品中含有西地那非类衍生物(如图21)。
步骤八：建立UPLC-QTOF/MS对西地那非衍生物结构检测方法(如图22)
液相条件：色谱柱为ACQUITY UPLCTM BEH C18column(2.1mm×100mm,1.7m,Waters,Milford,MA)色谱柱。流动相A为0.1％的甲酸水溶液，流动相B为0.1％的甲酸乙腈，采用梯度洗脱，程序为：0～2min，5～5％B；2～28min，5～95％B；28～30min，95％B。分析时间30min。柱温40℃，流速为0.35ml/min，进样量2μl。
质谱条件：离子源为ESI源，正离子模式，质谱扫描范围为100～1100m/z；检测参数：电离电压4000V，干燥气流速11l/min，干燥气温度为350℃；雾化器压力为45psig，裂解器电压为120V，skimmer 60V，八级杆射频电压750V。选取m/z 12 1.0509和m/z 922.0098的内标离子作实时质量数校正。每次测定样品之前，采用混标调谐液(Turning mixture)校准质量轴。实验数据的采集和分析采用MassHunter software version B.03.00(AgilentTechnologies，USA)软件。进一步进行MS/MS分析，根据离子情况在10-30V之间调整碰撞能量。
步骤九：对衍生物结构的质谱裂解规律进行分析
通过设定碎片电压，对西地那非的准分子离子进行二级质谱分析(如表3)，衍生物裂解规律与西地那非相似。11种西地那非衍生物共有碎片离子为m/z377，329，311，299，283，269，166。S-102，109，104，110主要为哌嗪类物质取代，其共有碎片离子m/z为461，99，84，72，58；S-400～404主要为芳烃类物质取代，其共有碎片离子m/z为360，347。
表3.西地那非衍生物主要碎片离子
综上所述，本发明以西地那非衍生物为研究对象，以CADD为筛选衍生物结构的依据，以DFT理论计算为特征性鉴别谱图谱峰为重点，采用TLC-SERS实验验证，进行保健食品掺杂PDE-5抑制剂的虚拟筛选与预测研究。建立“预测-检测-确证”的全面、快速、准确的分析策略，具有非常大的理论指导意义和应用价值。
实施例2
步骤A，待测样品的预处理：称取待检中药药品1mg，溶于10ml甲醇中，定容3分钟，涡旋5分钟后放置于超声仪器，提取30分钟，离心10分钟(5000rpm，4℃)，于4℃冰箱保存，待检；
步骤B，吸取1μL，点于薄层色谱分离板F254(10×20cm)(Merck，Darmstadt,Germany)，将标准品枸橼酸西地那非、枸橼酸羟基豪莫西地那非、伐地那非、伪伐地那非、豪莫西地那非、红地那非、他达那非各取1μl，采用优化后的TLC展开条件，于距离薄层板底部1～2cm处点样，采用二氯甲烷:丙酮:氨水＝20:1.5:0.2(v/v)展开25min，。待展开距离薄层板顶部7cm处，取出，晾干，薄层斑点在紫外灯254nm下检视。
步骤C，待展开完全后，取出，晾干，薄层斑点在紫外灯254nm下检视(图23)。在类似物的Rf值处：0.108，0.036，0.072，0.373，0.169，0.024，0.253处滴加表面增强剂，表面增强剂为3μL水胶，采用便携式拉曼光谱仪对滴加表面增强剂的斑点位置进行信号采集。(积分时间5s，激光功率90mW。采集次数为3次(图24)。
步骤D，非空白谱图进行处理
采用标准谱图处理软件对非空白谱图进行处理，选取400-1700cm-1波段作为特征波段，选取400-1700cm-1波段作为特征波段，对所述特征波段采用OPUS5.0软件对谱图进行平滑及基线校正，再对校正后的光谱数据进行矢量归一化处理，得到预处理表面增强拉曼光谱图；
步骤E，对预处理表面增强拉曼光谱图进行判别
西地那非及类似物的共有峰为813±10cm-1，905±10cm-1，927±10cm-1，1002±10cm-1，1159±10cm-1，1233±10cm-1，1529±10cm-1，1560±10cm-1，当预处理表面增强拉曼光谱图中至少含有五个西地那非衍生物的吸收峰，判定待检壮阳中药中掺杂西地那非类添加物，作为“阳性样品”待为实验室验证；当预处理表面增强拉曼光谱图中含有少于五个西地那非类添加物的吸收峰，则判定没有掺杂西地那非类添加物。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (7)

1.一种快速分析非法添加西地那非类似物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤A，薄层分离：吸取1μL样品溶液，采用二氯甲烷:丙酮:氨水体积比为20:1.5:0.2的展开体系展开；待展开完全后，取出，晾干，薄层斑点在紫外灯254nm下检视；
步骤B，检测脂溶性类似物时，在薄层斑点处滴加表面增强剂有机银溶胶4μL，采用便携式拉曼光谱仪对滴加表面增强剂的斑点位置进行信号采集，积分时间20s，激光功率80mW，采集次数为3次；
检测水溶性类似物时，在薄层斑点处滴加表面增强剂银溶胶3μL，采用便携式拉曼光谱仪对滴加表面增强剂的斑点位置进行信号采集，积分时间5s，激光功率90mW，采集次数为3次；
步骤C，非空白谱图进行处理：采用标准谱图处理软件对非空白谱图进行处理，选取400-1700cm-1波段作为特征波段，对所述特征波段采用OPUS 5.0软件对谱图进行平滑及基线校正，再对校正后的光谱数据进行矢量归一化处理，得到预处理表面增强拉曼光谱图；
步骤D，对预处理表面增强拉曼光谱图进行判别：
有机银溶胶测得的西地那非类似物的共有吸收峰为417±10cm-1，813±10cm-1，905±10cm-1，927±10cm-1，1002±10cm-1，1159±10cm-1，1233±10cm-1，1529±10cm-1，1560±10cm-1，当预处理表面增强拉曼光谱图中至少含有上述五个吸收峰，判定待检样品中掺杂西地那非类似物，作为“阳性样品”待实验室验证；当预处理表面增强拉曼光谱图中含有少于五个上述吸收峰，则判定没有掺杂西地那非类似物；
银溶胶测得的西地那非类似物的共有吸收峰为813±10cm-1，905±10cm-1，927±10cm-1，1002±10cm-1，1159±10cm-1，1233±10cm-1，1529±10cm-1，1560±10cm-1，当预处理表面增强拉曼光谱图中至少含有上述五个吸收峰，判定待检样品中掺杂西地那非类似物，作为“阳性样品”待实验室验证；当预处理表面增强拉曼光谱图中含有少于五个上述吸收峰，则判定没有掺杂西地那非类似物。
2.根据权利要求1所述的快速分析非法添加西地那非类似物的方法，其特征在于，所述的步骤A中的样品溶液为浓度为1mg/mL的待检样品甲醇溶液。
3.根据权利要求1所述的快速分析非法添加西地那非类似物的方法，其特征在于，所述的步骤A中于距离薄层板底部1～2cm处点样，展开25min，待展开距离薄层板顶部7cm处，取出，晾干。
4.根据权利要求1所述的快速分析非法添加西地那非类似物的方法，其特征在于，检测薄层分离后薄层板上不显色物质时，所述的步骤B改为采用逐点扫描的方式获得拉曼光谱图。
5.一种筛选西地那非衍生物快速检测条件的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：以西地那非的中间体3-(6,7-二氢-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1H-吡唑[4,3-d]嘧啶-5-yl)-4-乙氧基-苯磺酰为关键中间体，基于构效关系设计西地那非衍生物目标分子；
步骤二：配体与PDE-5复合物晶体结构进行虚拟对接
采用药物设计对接平台Discovery Studio 3.0进行步骤一目标分子与PDE-5复合物晶体结构活性腔对接，选择Libdock分子对接技术，根据对接后打分函数，优选评分高的西地那非衍生物；
步骤三：密度泛函方法预测西地那非衍生物的理论拉曼图谱
采用GAUSS VIEW 5.0对分子构型进行优化后，选择B3LYP水平的DFT方法，对体系中氢原子加p极化函数和重原子加d的极化函数的6-31G*(d,p)基组，对步骤二优选的西地那非衍生物进行构型优化后，在Linux系统中，由GAUSSIAN 09软件计算；
步骤四：西地那非衍生物理论共有峰
根据DFT计算结果，采用GAUSSVIEW 5.0软件对计算得到的西地那非衍生物理论拉曼谱图进行理论共有峰归纳。
6.根据权利要求5所述的筛选西地那非衍生物快速检测条件的方法，其特征在于，还包括以下步骤：
步骤五：西地那非衍生物的合成及结构验证
合成步骤二优选的西地那非衍生物，经核磁、质谱验证结构；
步骤六：西地那非衍生物结合动力学测定
采用Biacore T200分子相互作用分析系统，依次进样不同浓度的化合物，实验数据采用Biacore T200 evaluation软件分析，采用动力学结合模型拟合计算实验结果；
步骤七：建立西地那非衍生物的TLC-SERS检测条件
称取步骤五制得的西地那非衍生物进行薄层分离，展开体系为二氯甲烷:丙酮:氨水体积比为20:1.5:0.2；
滴加表面增强剂，表面增强剂为金溶胶、有机银溶胶、银溶胶或金银合胶，采用便携式拉曼光谱仪进行扫描；
步骤八：非空白谱图进行处理
采用标准谱图处理软件对非空白谱图进行处理，选取400-1700cm-1波段作为特征波段，对所述特征波段采用OPUS 5.0软件对谱图进行平滑及基线校正，再对校正后的光谱数据进行矢量归一化处理，得到预处理表面增强拉曼光谱图；
步骤九：对预处理表面增强拉曼光谱图进行判别
TLC-SERS检测得到共有峰与步骤四DFT理论计算得到的共有峰进行整合和归纳，确定西地那非衍生物的共有吸收峰和判定待测样品中含有西地那非衍生物的标准。
7.根据权利要求6所述的筛选西地那非衍生物快速检测条件的方法，其特征在于，还包括以下步骤：
步骤十：UPLC-QTOF/MS验证
采用快速分离超高效液相色谱-飞行时间质谱联用仪对西地那非衍生物进行定性分析，获得总离子流图和西地那非衍生物的共有碎片离子。
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