CN107501284A

CN107501284A - 一种探针及应用该探针同时检测微量Cu2+和/或Hg2+的方法

Info

Publication number: CN107501284A
Application number: CN201710676404.6A
Authority: CN
Inventors: 曾晞; 方浚安; 廖贤; 牟兰
Original assignee: Guizhou University
Current assignee: Guizhou University
Priority date: 2017-08-09
Filing date: 2017-08-09
Publication date: 2017-12-22
Anticipated expiration: 2037-08-09
Also published as: CN107501284B

Abstract

本发明公开一种探针及应用该探针同时检测微量Cu²⁺和/或Hg^2+‑的方法，所述的探针是以三(2‑氨乙基)胺、罗丹明B和4‑氯‑7‑硝基苯呋咱为原料合成的。所述的探针同时检测Cu²⁺和/或Hg²⁺的方法，包括以探针为试剂用荧光光谱法对Cu²⁺和Hg²⁺的检测、以探针为试剂用紫外‑可见吸收光谱法对Cu²⁺和Hg²⁺的检测、或以探针为试剂用目视比色法对Hg²⁺离子的检测。本发明所述探针能同时用来检测Cu²⁺和Hg²⁺，检测成本低，效率高，有利于对复杂微观系统的分析。

Description

一种探针及应用该探针同时检测微量Cu2+和/或Hg2+的方法

技术领域

本发明涉及一种探针及应用该探针检测微量离子方法，特别是一种探针及应用该探针同时检测微量Cu²⁺和/或Hg^2+-的方法。

背景技术

在人体必需的微量元素中，铜是仅次于铁和锌的含量位列第三位的微量元素，铜在生物体中扮演着重要的功能。虽然对人类而言，铜是一种相对能够忍耐较大浓度的元素，但缺乏和过量，对人体都可导致并发症。当铜离子的水平超过细胞所需就会对生物体系产生毒害。在各种过渡金属离子中，铜离子不仅会引起严重的环境污染，而且充当多种酶促反应的刺激因子。因而，不论是暴露在环境中的高水平的铜，还是生物体中的微量铜的分布，精确和精准的定量测定的方法是非常重要的。

在各种重金属中，汞污染由于其毒性大，在水体和陆地的分布广而引起世界范围的环境关注。汞离子污染主要来源于自然界和生产活动，如海洋、火山爆发、黄金生产、化石燃料、采矿、电池和电子产品等。即使在低浓度下，因其可累积性而对人类健康和环境有严重影响。汞离子很容易通过皮肤、呼吸道和胃肠道组织进入人体，被认为是最危险的金属离子，即使很低浓度也能导致各种疾病，如胎儿脑损伤、严重的认知障碍和水俣病。存在于土壤或废水中的汞元素和汞离子被微生物吸收和转化为甲基汞，为一种通过食物链生物积累的神经毒素，有机汞化合物很容易渗透细胞膜和血脑屏障从而损害肾脏和神经功能。汞的暴露甚至在很低浓度下也会导致人类严重的代谢、运动和认知障碍等长期的疾病。因此，灵敏和选择性的检测汞离子而不是总汞是当前最重要的任务。

通常定量检测铜、汞的传统分析技术有原子吸收法、原子荧光法、ICP原子发射光谱法、ICP质谱法、离子色谱、毛细管电泳等。虽然这些方法具有很好的灵敏度，但存在明显的局限性。如破坏样品、耗时、样品前处理繁琐、设备复杂等限制了不能快速、在线地检测，特别不适用于一些特殊的生物样品检测。

作为化学传感器的荧光探针技术对特殊环境中的离子检测是一种非常重要的方法。探针能够以高灵敏、高选择、实时在线的方式，直观地检测环境和生物样品中微量离子的浓度及其变化。同时，荧光探针能够以颜色和荧光视觉变化的光学形式反馈结合离子的信息，既可作为比色染色剂方便和灵巧的检测，又可作为吸收离子后受影响的生物细胞等的荧光成像试剂，能够可视化地描绘出离子的分布，提供定位动态信息及分子水平的定量检测。但是目前，大多数的荧光探针只能用于Cu²⁺和Hg²⁺，不能同时用来检测Cu²⁺和Hg²⁺，检测成本高，效率低，且不利于对复杂微观系统的分析。

因此，现有探针，不能同时用来检测Cu²⁺和Hg²⁺的问题。检测成本高，效率低，且不利于对复杂微观系统的分析。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种探针及应用该探针同时检测微量Cu²⁺和/或Hg²⁺的方法，本发明所述探针能同时用来检测Cu²⁺和Hg²⁺，检测成本低，效率高，有利于对复杂微观系统的分析。

本发明的技术方案：一种探针，所述探针的化学名称为三[2,2’-二(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑)-4-氨基乙基-2”-罗丹明甲酰氨基乙基]胺；所述探针的结构式为：

前述的探针中，所述的探针；是以三(2-氨乙基)胺、罗丹明B和4-氯-7-硝基苯呋咱为主要原料合成；具体的合成路线为：

前述的探针中，所述的以三(2-氨乙基)胺、罗丹明B和4-氯-7-硝基苯呋咱为主要原料合成；是按下述方法进行合成：

1)中间体的合成：

N₂保护下，取25-30mmol的三(2-氨乙基)胺于100ml三口瓶中，量取20mL无水乙醇搅拌回流，再取2-5mmol的罗丹明B溶于40mL的无水乙醇中，用恒压漏斗缓慢滴加入三口烧瓶，滴完后回流30-40h，减压蒸去乙醇，分别用100mL二氯甲烷萃取3次，有机相用无水硫酸钠干燥过夜，蒸去溶剂，得红色粘稠状物，硅胶柱层析分离，洗脱液为体积比9/1/1的甲醇/三氯甲烷/三乙胺，中间体；

2)探针的合成：

在冰盐浴下100mL的三口瓶中，取0.5-1mmol中间体溶于40mL二氯甲烷中，再取1-2mmol 4-氯-7-硝基苯呋咱，用20mL二氯甲烷溶解后以每秒1滴的速度缓慢滴入三口烧瓶中，滴完后加入3mL三乙胺，氮气保护下反应1.5-2.5h，撤去冰浴，减压蒸去溶剂得黑色固体，硅胶柱层析分离，洗脱液为体积比为100/1的三氯甲烷/甲醇，得探针。

一种应用前述的探针同时检测Cu²⁺和/或Hg²⁺的方法，包括以探针为试剂用荧光光谱法对Cu²⁺和Hg²⁺的检测、以探针为试剂用紫外-可见吸收光谱法对Cu²⁺和Hg²⁺的检测、或以探针为试剂用目视比色法对Hg²⁺离子的检测。

前述的探针同时检测Cu²⁺和/或Hg²⁺的方法中，所述的以探针为试剂用荧光光谱法对Cu²⁺和Hg²⁺的检测；是检测Cu²⁺时，在体积比为99/1的乙腈/水溶液中，控制探针的浓度在5～20μM，以460nm为激发波长，探针在525nm处的荧光强度与Cu²⁺浓度呈线性关系，其他共存金属离子不干扰检测，用校正曲线法检测Cu²⁺；其他共存金属离子包括Hg²⁺、Li⁺、Na⁺、K⁺、Mg² ⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Sr²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Fe³⁺、Cr³⁺或Ag²⁺，其他共存金属离子浓度与Cu²⁺浓度相同时，对Cu²⁺的测定无干扰；

检测Hg²⁺时，是在体积比为99/1的乙腈/水溶液中，控制探针的浓度在40～80μM，以460nm为激发波长，探针在575nm与540nm处的比率荧光强度与Hg²⁺浓度呈线性关系，其他共存金属离子不干扰检测，用校正曲线法检测Hg²⁺；其他共存金属离子包括Cu²⁺、Li⁺、Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Sr²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Fe³⁺、Cr³⁺或Ag²⁺，其他共存金属离子浓度与Hg²⁺浓度相同时，对Hg²⁺的测定无干扰。

前述的探针同时检测Cu²⁺和/或Hg²⁺的方法中，所述的以探针为试剂用紫外-可见吸收光谱法对Cu²⁺和Hg²⁺的检测；是检测Cu²⁺时，在体积比为99/1的乙腈/水溶液中，控制探针的浓度在5～20μM，探针在375nm与456nm处的比率吸光度与Cu²⁺浓度呈线性关系，其他共存金属离子不干扰检测，用校正曲线法检测Cu²⁺；其他共存金属离子包括Hg²⁺、Li⁺、Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Sr²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Fe³⁺、Cr³⁺或Ag²⁺，其他共存金属离子浓度与Cu²⁺浓度相同时，对Cu²⁺的测定无干扰；

检测Hg²⁺时，在体积比为99/1的乙腈/水溶液中，控制探针的浓度在40～80μM，探针在560nm处的吸光度与Hg²⁺离子浓度呈线性关系，其他共存金属离子不干扰检测，用校正曲线法检测Hg²⁺；其他共存金属离子包括Cu²⁺、Li⁺、Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Sr²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Fe³⁺、Cr³⁺或Ag²⁺，其他共存金属离子浓度与Hg²⁺浓度相同时，对Hg²⁺的测定无干扰。

前述的探针同时检测Cu²⁺和/或Hg²⁺的方法中，所述的以探针为试剂用目视比色法对Hg²⁺离子的检测；是日光下，在体积比为99/1的乙腈/水溶液中，控制探针浓度为40～80μM，Hg²⁺的加入使探针溶液颜色明显变化，Hg²⁺浓度在5～1000μM范围，由黄色到橙黄色、橙色、橙红色，随Hg²⁺浓度增大红色逐渐加深。

前述的探针同时检测Cu²⁺和/或Hg²⁺的方法中，所述的以探针为试剂用目视比色法对Hg²⁺离子的检测；是365nm紫外灯下，在体积比为99/1的乙腈/水溶液中，控制探针浓度为40～80μM，Hg²⁺的加入使探针溶液颜色荧光明显变化，Hg²⁺浓度在5～1000μM范围，由黄绿色到黄色、橙黄色、橙红色，随Hg²⁺浓度增大，红色逐渐加深。

前述的探针同时检测Cu²⁺和/或Hg²⁺的方法中，所述的以探针为试剂用目视比色法对Hg²⁺离子的检测；是日光下，硅胶板为喷有探针浓度为40～80μM的乙腈溶液，观察硅胶板的颜色明显变化，硅胶板的颜色从浅黄色到浅橙色、浅橙红色、浅红色，随Hg²⁺浓度增大，红色逐渐加深。

前述的探针同时检测Cu²⁺和/或Hg²⁺的方法中，所述的以探针为试剂用目视比色法对Hg²⁺离子的检测；365nm紫外灯下，硅胶板为喷有探针浓度为40～80μM的乙腈溶液，观察喷过的硅胶板的颜色明显变化，硅胶板的荧光颜色从浅绿色到黄绿色、黄色、橙黄色，随Hg²⁺浓度增大，红色逐渐加深。

发明人进行了大量的试验研究，部分试验如下：

1、实施例1进行制备的探针，溶于体积比为99/1的乙腈/水溶液中，配制成探针浓度为10μM的溶液，分别不加金属离子或加入200μM金属离子Hg²⁺，Cu²⁺，Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Sr²⁺，Zn²⁺，Al³⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Cd²⁺，Pb²⁺，Fe³⁺，Cr³⁺，Ag⁺后的荧光光谱。Cu²⁺的加入使探针在525nm处的荧光强度增强，Hg²⁺的加入使探针的光谱略有位移而强度并未增加。其他上述实验金属离子的加入均不改变探针的荧光光谱和强度，表明在此条件下，探针能选择性检测Cu²⁺。测试的激发波长为460nm。见图1。

2、实施例1进行制备的探针，溶于体积比为99/1的乙腈/水溶液中，配制成探针浓度为10μM的溶液，分别加入不同浓度Cu²⁺到探针溶液中，随着Cu²⁺的加入，分别测得的荧光光谱曲线。随Cu²⁺浓度增大，在525nm处的荧光强度线性增强。测试的激发波长为460nm。见图2。

3、实施例1进行制备的探针，溶于体积比为99/1的乙腈/水溶液中，配制成探针浓度为10μM的溶液，分别加入不同浓度Cu²⁺，测定525nm处荧光强度。纵坐标为荧光强度，横坐标为Cu²⁺的浓度。激发波长为460nm。见图3。

4、实施例1进行制备的探针，溶于体积比为99/1的乙腈/水溶液中，配制成探针浓度为10μM的溶液，分别加入200μM的金属离子Cu²⁺，Li⁺，Na⁺，K⁺，Ag⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Sr²⁺，Zn² ⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Pb²⁺，Cd²⁺，Fe³⁺，Al³⁺，Cr³⁺，Hg²⁺后，测定525nm处的荧光强度，仅有Cu²⁺的加入能使探针产生强烈荧光。再分别向探针-Cu²⁺混合溶液中加入上述其他金属离子后，再测定525nm处的荧光强度值的变化。见图4，黑色条表示在探针溶液中分别加入金属离子后在525nm处的荧光强度值；白色条表示在探针-Cu²⁺混合溶液再分别加入上述其他共存金属离子后在525nm处的荧光强度值的变化。表明探针检测Cu²⁺的荧光强度不受上述离子共存的影响。测试的激发波长为460nm，荧光发射波长为525nm。

5、实施例1进行制备的探针，溶于体积比为99/1的乙腈/水溶液中，配置成探针浓度为50μM的溶液，分别不加金属离子或加入200μM金属离子Hg²⁺，Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Sr²⁺，Zn²⁺，Al³⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Cd²⁺，Pb²⁺，Fe³⁺，Cr³⁺，Ag⁺后的荧光光谱。Hg²⁺的加入使探针在540nm处的荧光降低，575nm处的荧光增强，557nm处有等吸收点，在575nm与540nm形成比率荧光。而其他上述实验金属离子的加入均不改变探针的荧光光谱和强度，表明在此条件下，探针能选择性检测Hg²⁺。测试的激发波长为460nm。见图5。

6、实施例1进行制备的探针，溶于体积比为99/1的乙腈/水溶液中，配制成探针浓度为50μM的溶液，分别加入不同浓度Hg²⁺到探针溶液中，随着Cu²⁺的加入，分别测得的荧光光谱曲线。随Hg²⁺浓度增大，在575nm处的荧光强度线性增强，在540nm处荧光强度线性降低，形成比率荧光，在557nm处出现等吸收点。测试的激发波长为460nm。见图6。

7、实施例1进行制备的探针，溶于体积比为99/1的乙腈/水溶液中，配制成探针浓度为50μM的溶液，分别加入200μM的金属离子Hg²⁺、Cu²⁺、Li⁺、Na^+、，K⁺、Ag⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Sr² ⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Pb²⁺、Cd²⁺、Fe³⁺、Al³⁺或Cr³⁺后，测定575nm与540mn处的比率荧光强度值，仅有Hg²⁺的加入能使探针产生强烈荧光。再分别向探针-Hg²⁺混合溶液中加入上述其他金属离子后，再测定575nm与540mn处的比率荧光强度值的变化。见图7，黑色条表示在探针溶液中分别加入金属离子后在575nm与540mn处的比率荧光强度值；白色条表示在探针-Hg²⁺混合溶液再分别加入上述其他共存金属离子后在575nm与540mn处的比率荧光强度值的变化。表明探针检测Hg²⁺的比率荧光强度值不受上述离子共存的影响。横坐标为波长在575nm与540mn处的荧光强度比值。测试的激发波长为460nm。

8、实施例1进行制备的探针，溶于体积比为99/1的乙腈/水溶液中，配制成探针浓度为50μM的溶液，分别加入不同浓度Hg²⁺，测定575nm与540nm处荧光强度比值。纵坐标为比率荧光强度，横坐标为Hg²⁺的浓度。激发波长为460nm。见图8。

9、实施例1进行制备的探针，溶于体积比为99/1的乙腈/水溶液中，配制成探针浓度为10μM的溶液，分别不加金属离子或加入200μM金属离子Hg²⁺，Cu²⁺，Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Sr²⁺，Zn²⁺，Al³⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Cd²⁺，Pb²⁺，Fe³⁺，Cr³⁺，Ag⁺后的紫外-可见吸收光谱。Cu²⁺的加入使探针在456nm处的吸光度下降，375nm处的吸光度增强；Hg²⁺的加入使探针在360nm和527nm处出现新的吸收峰，456nm处的波长红移到480nm。而其他上述实验金属离子的加入对探针均无明显的响应信号，表明在此条件下，探针能选择性检测Cu²⁺、Hg²⁺。具体见图9。

10、实施例1进行制备的探针，溶于体积比为99/1的乙腈/水溶液中，配制成探针浓度为10μM的溶液，分别加入不同浓度Cu²⁺到探针溶液中，随着Cu²⁺的加入，分别测得的紫外-可见吸收光谱曲线。随Cu²⁺浓度增大，在456nm处的吸光度线性降低，375nm处的吸光度线性增加，形成比率吸收，418nm处出现等吸收点。见图10。

11、实施例1进行制备的探针，溶于体积比为99/1的乙腈/水溶液中，配制成探针浓度为10μM的溶液，分别加入不同浓度Cu²⁺，测定375nm与456nm处比率吸光度值。纵坐标为比率吸光度值，横坐标为Cu²⁺的浓度。见图11。

12、实施例1进行制备的探针，溶于体积比为99/1的乙腈/水溶液中，配制成探针浓度为10μM的溶液，分别加入200μM的金属离子Cu²⁺，Li⁺，Na⁺，K⁺，Ag⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Sr²⁺，Zn² ⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Pb²⁺，Cd²⁺，Fe³⁺，Al³⁺，Cr³⁺，Hg²⁺后，测定375nm与456nm处的比率吸光度值，再分别向探针-Cu²⁺混合溶液中加入上述其他金属离子后，再测定375nm与456nm处的比率吸光度值的变化。见图12，黑色条表示在探针溶液中分别加入金属离子后在375nm与456nm处的比率吸光度值；白色条表示在探针-Cu²⁺混合溶液再分别加入上述其他共存金属离子后在375nm与456nm处的比率吸光度值的变化。表明探针检测Cu²⁺的比率吸光度略受Hg²⁺共存影响，不受上述离子共存的影响。

13、实施例1进行制备的探针，溶于体积比为99/1的乙腈/水溶液中，配制成探针浓度为50μM的溶液，分别加入不同浓度Hg²⁺到探针溶液中，随着Hg²⁺的加入，分别测得的紫外-可见吸收滴定光谱曲线。随Hg²⁺浓度增大，在560nm处的吸光度值线性增强。见图13。

14、实施例1进行制备的探针，溶于体积比为99/1的乙腈/水溶液中，配制成探针浓度为50μM的溶液，分别加入不同浓度Hg²⁺，测定吸光度。纵坐标为波长560nm处吸光度，横坐标为Hg²⁺的浓度。见图14。

15、实施例1进行制备的探针，溶于体积比为99/1的乙腈/水溶液中，配制成探针浓度为50μM的溶液，分别加入200μM的金属离子Hg²⁺，Cu²⁺，Li⁺，Na⁺，K⁺，Ag⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Sr² ⁺，Zn²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Pb²⁺，Cd²⁺，Fe³⁺，Al³⁺，Cr³⁺后，测定560nm处的吸光度，再分别向探针-Hg²⁺混合溶液中加入上述其他金属离子后，再测定560nm处的吸光度的变化。见图15，黑色条表示在探针溶液中分别加入金属离子后在560nm处的吸光度；白色条表示在探针-Hg²⁺混合溶液再分别加入上述其他共存金属离子后在560nm处的吸光度的变化。表明探针检测Hg²⁺的吸光度不受上述离子共存的影响。横坐标为波长在560nm处的吸光度。

16、在日光下，探针浓度为50μM的探针乙腈溶液中，随Hg²⁺浓度增加，探针溶液颜色从黄色到橙黄色、橙色、橙红色。见图16。

17、在365nm紫外灯下，探针浓度为50μM的探针乙腈溶液中，随Hg²⁺浓度增加，探针溶液荧光从绿色到黄绿色、黄色、橙黄色、橙红色。见图17。

18、在日光下，喷有探针浓度为50μM的探针乙腈溶液的硅胶板，检测浓度在5～1000μM范围内的Hg²⁺颜色变化，随Hg²⁺浓度增加，硅胶板的颜色变化明显，颜色从浅黄色到浅橙色、浅橙红色、浅红色。见图18。

19、在365nm紫外灯下，喷有探针浓度为50μM的探针乙腈溶液的硅胶板，检测浓度在5～1000μM范围内的Hg²⁺颜色变化，随Hg²⁺浓度增加，硅胶板的颜色变化明显，荧光颜色从浅绿色到黄绿色、黄色、橙黄色。见图19。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)单探针多目标检测，能对单一离子Cu²⁺或Hg²⁺检测的探针已有报道，本发明可同时分辨检测微量Cu²⁺、Hg²⁺离子。

(2)控制探针浓度，利用探针对不同离子的灵敏度差异提高选择性。探针在低浓度时对Cu²⁺有较高的灵敏度，而Hg²⁺不干扰检测；控制探针在高浓度时检测Hg²⁺，由于荧光检测波长不同，Cu²⁺不干扰检测。

(3)利用波长分辨提高选择性。探针检测Hg²⁺用比率荧光方式，检测Cu²⁺用单波长荧光方式；检测Cu²⁺用比率吸收方式，检测Hg²⁺用单波长吸收方式，实现波长分辨高灵敏、高选择的检测两种金属离子。

(4)多功能检测，利用探针可用于荧光光谱、紫外-可见吸收光谱定量检测Cu²⁺和Hg²⁺，还可用目视比色在溶液中或用硅胶板上，快速、定性、半定量检测微量Hg²⁺离子。

本发明可实现单探针能同时检测微量Cu²⁺和/或Hg²⁺，控制探针浓度，在低浓度时检测Cu²⁺，在高浓度时检测Hg²⁺，利用波长分辨，同时实现Cu²⁺、Hg²⁺检测，此外，本发明探针可以作为试剂用于荧光光谱法中检测微量离子，也可以作为试剂用于紫外-可见吸收光谱法中检测微量离子，还可以作为试剂用于目视比色法中检测微量离子，适用范围广，成本低。因此，本发明所述探针能同时用来检测Cu²⁺和Hg²⁺，检测成本低，效率高，有利于对复杂微观系统的分析。

附图说明：

图1是探针检测Cu²⁺的荧光光谱图；

图2是不同浓度的Cu²⁺与探针的荧光光谱滴定图；

图3是探针检测Cu²⁺的荧光强度校正曲线图；

图4是共存金属离子对探针检测Cu²⁺的荧光强度影响图；

图5是探针检测Hg²⁺的荧光光谱图；

图6是不同浓度的Hg²⁺与探针的荧光光谱滴定图；

图7是共存金属离子对探针检测Hg²⁺的荧光强度影响图；

图8是探针检测Hg²⁺的荧光强度校正曲线图；

图9是探针检测Cu²⁺、Hg²⁺的紫外-可见吸收光谱图；

图10是不同浓度的Cu²⁺与探针的紫外-可见吸收光谱滴定图；

图11是探针检测Cu²⁺的吸光度校正曲线图；

图12是共存金属离子对探针检测Cu²⁺的吸光度影响图；

图13是不同浓度的Hg²⁺与探针的紫外-可见光谱滴定图；

图14是探针检测Hg²⁺的吸光度校正曲线图；

图15是共存金属离子对探针检测Hg²⁺的吸光度影响图；

图16是探针检测Hg²⁺溶液的颜色比色照片；

图17是探针检测Hg²⁺溶液的荧光比色照片；

图18探针在硅胶板上检测Hg²⁺的比色照片；

图19探针在硅胶板上检测Hg²⁺的荧光比色照片。

具体实施方式

实施例1：

1、探针的制备：

以三(2-氨乙基)胺、罗丹明B和4-氯-7-硝基苯呋咱为原料合成探针，合成路线如下：

1)中间体的合成：

在N₂保护下称取三(2-氨乙基)胺(4.00g，27.36mmol)于100ml的三口瓶中，称取罗丹明B(1.64g，3.42mmol)溶于40mL的无水乙醇中，滴加入三口烧瓶，滴加完成后回流36h，减压蒸去乙醇，用二氯甲烷(3×100mL)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥过夜，蒸去溶剂，得红色粘稠状物，硅胶柱层析分离，洗脱液为体积比9/1/1的甲醇/三氯甲烷/三乙胺，N₂保护下，取27.36mmol的三(2-氨乙基)胺于100ml三口瓶中，量取20mL无水乙醇搅拌回流，再取2-5mmol的罗丹明B溶于40mL的无水乙醇中，用恒压漏斗缓慢滴加入三口烧瓶，滴完后回流37h，减压蒸去乙醇，分别用100mL二氯甲烷萃取3次，有机相用无水硫酸钠干燥过夜，蒸去溶剂，得红色粘稠状物，硅胶柱层析分离，洗脱液为体积比9/1/1的甲醇/三氯甲烷/三乙胺，中间体；得1.63g无色粘稠状中间体，产率83.1％。结构表征数据如下：¹H NMR(500MHz,CDCl₃,ppm)δ:7.887(s,1H,ArH)，7.452(s,2H,ArH),7.097(bs,1H,ArH)，6.396(d,J＝12.5Hz,4H,ArH)，6.282(d,J＝9.0Hz,2H,ArH)，3.365～3.337(m,8H,-CH₂CH₃)，3.154(t,J＝7.8Hz,2H,O＝CNCH₂-)，2.557(t,J＝6.0Hz,4H,-CH₂NH₂)，2.357(t,J＝6.0Hz,4H,NCH₂CH₂)，2.237(t,J＝7.5Hz,2H,NCH₂CH₂),1.251(m,6H,-CH₂CH₃)，1.169(t,J＝7.0Hz,12H,-CH₃)。

2)探针的合成：

在冰盐浴下100mL的三口瓶中，称取中间体0.8mmol溶于40mL二氯甲烷中，再称取4-氯-7-硝基苯呋咱(0.36g，1.84mmol)用20mL二氯甲烷溶解后以每秒1滴的速度缓慢滴入三口烧瓶中，滴加完成后加入3mL三乙胺，在氮气保护下反应2h，撤去冰浴，减压蒸去溶剂得黑色固体，硅胶柱层析分离，洗脱液为体积比为100/1的三氯甲烷/甲醇，得橙红色固体探针414mg，即探针，产率52.7％。结构表征数据如下：IR(KBr,ν(cm^-1):3427(N-H),2974(-CH₂-),1674(O＝C-N),1563(C＝C),1546(C＝C),1399(N-CH₃),1356(NO₂),788(Ar-H).¹H NMR(500MHz,CDCl₃,ppm)δ:8.357(d,J＝8.5Hz,1H,ArH),7.988(s,1H,ArH),7.503(s,2H,ArH),7.438(d,J＝7.0Hz,2H,ArH),7.038(bs,1H,ArH),6.36(3m,J＝9.0Hz,4H,ArH),6.131(d,J＝7.0Hz,2H,ArH),3.328～3.286(m,8H,-CH₂CH₃),1.595(br,4H,CH₂NH₂),1.126(t,J＝6.5Hz,12H,-CH₃).MS(MALDI-TOF)计算值[C₄₆H₅₀N₁₂O₈]:m/z 898.391,测定值:m/z 896.906[M-2H]⁺。

2、试剂的配制：

(1)探针溶液：称取9.0mg的探针(按上述方法进行制备)，用乙腈溶解，配制成100mL溶液，浓度为100μM；

(2)Hg²⁺溶液：称取798.9mg高氯酸汞，用水溶解，配制成100mL溶液，浓度为20mM；根据需要用水逐级稀释到适宜的浓度；

(3)Cu²⁺溶液：称取高氯酸铜370.5mg，用水溶解，配制成浓度为20mM的溶液50mL；根据需要用水逐级稀释到适宜的浓度；

(4)其它共存金属离子溶液：取各种金属相应的高氯酸盐，配制方法同上。

本发明所用荧光分光光度计型号为Cary Eclipse荧光分光光度计，美国VARIAN公司生产；紫外-可见分光光度计型号为UV-1800，日本岛津公司公司生产；实验用水为超纯水。

3、荧光光谱法探针对Hg²⁺、Cu²⁺的检测

在10.0mL容量瓶中加入探针溶液(100μM，1mL)，金属离子Hg²⁺(2mM，1mL)，用体积比为99/1的乙腈/水溶液稀释至刻度，摇匀，设置荧光激发波长为460nm，移入1cm的石英比色皿进行荧光光谱测定。

在比色皿中加入3ml探针浓度为10μM探针-乙腈溶液，在体积比为99/1的乙腈/水溶液中进行荧光光谱测试。探针在535nm波长处有微弱荧光发射。分别不加金属离子或加入200μM金属离子Hg²⁺，Cu²⁺，Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Sr²⁺，Zn²⁺，Al³⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Cd²⁺，Pb²⁺，Fe³⁺，Cr³⁺，Ag⁺后的荧光光谱。Cu²⁺的加入使探针在525nm处的荧光强度增强，Hg²⁺的加入使探针的光谱略有位移而强度并未增加。其他上述实验金属离子的加入均不改变探针的荧光光谱和强度，表明在此条件下，探针能选择性检测Cu²⁺(见图1)。

取上述方法制备的探针，用体积比为99/1的乙腈/水溶液溶解，配制成探针浓度为10μM的溶液，分别加入不同浓度Cu²⁺测得的荧光光谱曲线。随Cu²⁺浓度增大，在525nm处的荧光强度线性增强(见图2)。测定Cu²⁺浓度变化时探针在525nm处的荧光强度，获得荧光校正曲线(见图3)。由校正曲线的斜率和测定11次空白值的标准偏差，测定并计算得到探针荧光法检测Cu²⁺的浓度线性范围和检出限列于表1。

与上述相同测试条件下，探针检测Cu²⁺在525nm波长处的荧光强度值在上述其他金属离子分别作为共存离子存在于探针-Cu²⁺混合溶液中，当共存金属离子浓度与Cu²⁺离子相当时，探针检测Cu²⁺的荧光强度不受其它金属离子共存影响(见图4)。

取上述方法制备的探针，用体积比为99/1的乙腈/水溶液溶解，配制成探针浓度为50μM的溶液，设置荧光激发波长为460nm，在比色皿中加入3ml探针浓度为50μM的溶液，在体积比为99/1的乙腈/水溶液中进行荧光光谱测试，探针在535nm波长处有微弱荧光发射。当加入200μM的Hg²⁺后，使探针在540nm处的荧光降低，575nm处的荧光增强，557nm处有等吸收点，在575nm与540nm形成比率荧光。而其他上述实验金属离子的加入均不改变探针的荧光光谱和强度。相同条件下，在探针溶液中分别加入Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Sr²⁺，Zn²⁺，Co² ⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Ag⁺，Pb²⁺，Cd²⁺，Al³⁺，Cr³⁺，Fe³⁺金属离子后，几乎不会改变探针的荧光光谱及强度。探针对Hg²⁺有选择性荧光检测响应性能(见图5)。

取上述方法制备的探针，用体积比为99/1的乙腈/水溶液溶解，配制成探针浓度为50μM的溶液，分别加入不同浓度Hg²⁺测得的荧光光谱曲线。随Hg²⁺浓度增大，在575nm与540nm处的荧光强度比值线性增强(见图6)。测定Hg²⁺浓度变化时探针在575nm与540nm处的比率荧光强度值，获得荧光校正曲线(见图7)。由校正曲线的斜率和测定9次空白值的标准偏差，测定并计算得到探针荧光法检测Hg²⁺的浓度线性范围和检出限列于表1。

与上述相同测试条件下，探针检测Hg²⁺在575nm与540mn处的比率荧光强度值在上述其他金属离子分别作为共存离子存在于探针-Hg²⁺混合溶液中，当共存金属离子浓度与测试的Hg²⁺离子相当时，探针检测Hg²⁺的比率荧光强度不受其它金属离子共存影响(见图8)。

表1探针荧光法检测Cu²⁺、Hg²⁺的分析参数

4、紫外-可见吸收光谱法探针对Hg²⁺、Cu²⁺检测

在10.0mL容量瓶中加入探针溶液(100μM，1mL)，金属离子Hg²⁺(2mM，1mL)，用体积比为99/1的乙腈/水溶液稀释至刻度，摇匀，移入1cm的石英比色皿进行紫外-可见吸收光谱测定。

在比色皿中加入3ml探针浓度为10μM的探针-乙腈溶液，在体积比为99/1的乙腈/水溶液中进行紫外-可见吸收光谱测试。加入200μM的Cu²⁺后，使探针在456nm处的吸光度下降，375nm处的吸光度增强；加入200μM的Hg²⁺后，使探针在360nm和527nm处出现新的吸收峰，456nm处的波长红移到480nm；相同条件下，在探针溶液中分别加入200μM的Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Sr²⁺，Zn²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Ag⁺，Pb²⁺，Cd²⁺，Al³⁺，Cr³⁺，Fe³⁺金属离子后，不改变探针的紫外-可见吸收光谱及吸光度(见图9)。

取上述方法制备的探针，用体积比为99/1的乙腈/水溶液溶解，配制成探针浓度为10μM的溶液，分别加入不同浓度Cu²⁺到探针溶液中，测得的紫外光谱滴定曲线，随Cu²⁺浓度增大，在456nm处的吸光度线性降低，375nm处的吸光度线性增加，形成比率吸收，418nm处出现等吸收点(见图10)。测定Cu²⁺浓度变化时探针在375nm与456nm处的比率吸光度值，获得吸光度校正曲线(见图11)。由校正曲线的斜率和测定11次空白值的标准偏差，测定并计算得到探针荧光法检测Cu²⁺的浓度线性范围和检出限列于表2。

与上述相同测试条件下，探针检测Cu²⁺在375nm与456nm处的比率吸光度值在上述其他金属离子分别作为共存离子存在于探针-Cu²⁺混合溶液中，当共存金属离子浓度与Cu²⁺离子相当时，除Hg²⁺略有影响外，探针检测Cu²⁺的吸光度不受其它金属离子共存影响(见图12)。

取上述方法制备的探针，用体积比为99/1的乙腈/水溶液溶解，配制成探针浓度为50μM的溶液，分别加入不同浓度Hg²⁺测得的紫外-可见吸收光谱曲线，随Hg²⁺浓度增大，在560nm处的吸光度线性增强(见图13)。测定Hg²⁺浓度变化时探针在525nm处的吸光度，获得荧光校正曲线(见图14)。由校正曲线的斜率和测定11次空白值的标准偏差，测定并计算得到探针紫外-可见吸收光度法检测Hg²⁺的浓度线性范围和检出限列于表2。

与上述相同测试条件下，探针检测Hg²⁺在560mn处的吸光度在上述其他金属离子分别作为共存离子存在于探针-Hg²⁺混合溶液中，当共存金属离子浓度与测试的Hg²⁺离子相当时，探针检测Hg²⁺的吸光度不受其它金属离子共存影响(见图15)。

表2探针紫外-可见吸收光谱法检测Cu²⁺、Hg²⁺的分析参数

5目视比色法对Hg²⁺离子的检测

1.溶液中检测Hg²⁺

在探针浓度为50μM探针-乙腈溶液中，分别加入浓度为0，5，25，50，100，500，1000μM的Hg²⁺离子溶液：日光灯下，探针检测Hg²⁺溶液荧光颜色从黄色到橙黄色，再到橙色，橙红色，红色(见图16)；365nm紫外灯下，探针检测Hg²⁺溶液荧光颜色从绿色到黄绿色，再到黄色，橙黄色，橙红色(见图17)。

2.硅胶板检测Hg²⁺

在一系列2cm×5cm干燥的硅胶板上，喷探针浓度为50μM的探针-乙腈溶液，待溶剂挥发后，再分别依次喷浓度为0，5，25，50，100，500，1000μM的Hg²⁺离子溶液，待溶剂挥发后：日光下，观察并拍照硅胶板颜色变化。随Hg²⁺浓度增加，硅胶板的颜色依次从从浅黄色到浅橙色，再到浅橙红色，浅红色(见图18)；在365nm紫外灯下，观察并拍照硅胶板颜色变化。随Hg²⁺浓度增加，硅胶板的荧光颜色依次从浅绿色到黄绿色、黄色、橙黄色(见图19)。

Claims

1.一种探针，其特征在于：所述探针的化学名称为三[2,2’-二(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑)-4-氨基乙基-2”-罗丹明甲酰氨基乙基]胺；所述探针的结构式为：

2.如权利要求1所述的探针，其特征在于：所述的探针；是以三(2-氨乙基)胺、罗丹明B和4-氯-7-硝基苯呋咱为主要原料合成；具体的合成路线为：

3.如权利要求2所述的探针，其特征在于：所述的以三(2-氨乙基)胺、罗丹明B和4-氯-7-硝基苯呋咱为主要原料合成；是按下述方法进行合成：

1)中间体的合成：

2)探针的合成：

在冰盐浴下100mL的三口瓶中，取0.5-1mmol中间体溶于40mL二氯甲烷中，再取1-2mmol4-氯-7-硝基苯呋咱，用20mL二氯甲烷溶解后以每秒1滴的速度缓慢滴入三口烧瓶中，滴完后加入3mL三乙胺，氮气保护下反应1.5-2.5h，撤去冰浴，减压蒸去溶剂得黑色固体，硅胶柱层析分离，洗脱液为体积比为100/1的三氯甲烷/甲醇，得探针。

4.一种应用如权利要求1-3中任一项所述的探针同时检测Cu²⁺和/或Hg²⁺的方法，其特征在于：包括以探针为试剂用荧光光谱法对Cu²⁺和Hg²⁺的检测、以探针为试剂用紫外-可见吸收光谱法对Cu²⁺和Hg²⁺的检测、或以探针为试剂用目视比色法对Hg²⁺离子的检测。

5.如权利要求4所述的探针同时检测Cu²⁺和/或Hg²⁺的方法，其特征在于：所述的以探针为试剂用荧光光谱法对Cu²⁺和Hg²⁺的检测；是检测Cu²⁺时，在体积比为99/1的乙腈/水溶液中，控制探针的浓度在5～20μM，以460nm为激发波长，探针在525nm处的荧光强度与Cu²⁺浓度呈线性关系，用校正曲线法检测Cu²⁺；

检测Hg²⁺时，是在体积比为99/1的乙腈/水溶液中，控制探针的浓度在40～80μM，以460nm为激发波长，探针在575nm与540nm处的比率荧光强度与Hg²⁺浓度呈线性关系，用校正曲线法检测Hg²⁺。

6.如权利要求4所述的探针同时检测Cu²⁺和/或Hg²⁺的方法，其特征在于：所述的以探针为试剂用紫外-可见吸收光谱法对Cu²⁺和Hg²⁺的检测；是检测Cu²⁺时，在体积比为99/1的乙腈/水溶液中，控制探针的浓度在5～20μM，探针在375nm与456nm处的比率吸光度与Cu²⁺浓度呈线性关系，用校正曲线法检测Cu²⁺；

检测Hg²⁺时，在体积比为99/1的乙腈/水溶液中，控制探针的浓度在40～80μM，探针在560nm处的吸光度与Hg²⁺离子浓度呈线性关系，用校正曲线法检测Hg²⁺。

7.如权利要求4所述的探针同时检测Cu²⁺和/或Hg²⁺的方法，其特征在于：所述的以探针为试剂用目视比色法对Hg²⁺离子的检测；是日光下，在体积比为99/1的乙腈/水溶液中，控制探针浓度为40～80μM，Hg²⁺的加入使探针溶液颜色明显变化，Hg²⁺浓度在5～1000μM范围，由黄色到橙黄色、橙色、橙红色，随Hg²⁺浓度增大红色逐渐加深。

8.如权利要求4所述的探针同时检测Cu²⁺和/或Hg²⁺的方法，其特征在于：所述的以探针为试剂用目视比色法对Hg²⁺离子的检测；是365nm紫外灯下，在体积比为99/1的乙腈/水溶液中，控制探针浓度为40～80μM，Hg²⁺的加入使探针溶液颜色荧光明显变化，Hg²⁺浓度在5～1000μM范围，由黄绿色到黄色、橙黄色、橙红色，随Hg²⁺浓度增大，红色逐渐加深。

9.如权利要求4所述的探针同时检测Cu²⁺和/或Hg²⁺的方法，其特征在于：所述的以探针为试剂用目视比色法对Hg²⁺离子的检测；是日光下，硅胶板为喷有探针浓度为40～80μM的乙腈溶液，观察硅胶板的颜色明显变化，硅胶板的颜色从浅黄色到浅橙色、浅橙红色、浅红色，随Hg²⁺浓度增大，红色逐渐加深。

10.如权利要求4所述的探针同时检测Cu²⁺和/或Hg²⁺的方法，其特征在于：所述的以探针为试剂用目视比色法对Hg²⁺离子的检测；365nm紫外灯下，硅胶板为喷有探针浓度为40～80μM的乙腈溶液，观察喷过的硅胶板的颜色明显变化，硅胶板的荧光颜色从浅绿色到黄绿色、黄色、橙黄色，随Hg²⁺浓度增大，红色逐渐加深。