CN107490700A - 一种定量检测人促卵泡激素的双抗夹心酶联免疫分析法 - Google Patents

一种定量检测人促卵泡激素的双抗夹心酶联免疫分析法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于定量检测人促卵泡激素(hFSH)的双抗夹心酶联免疫分析法，主要解决现有技术灵敏度低、系统稳定性差、检测范围受限和可重复性不高，以及操作繁琐等技术问题。本发明采用配对的两种特异性单克隆抗体(即anti‑FSH alpha抗体和anti‑FSH beta抗体)来检测与量化人促卵泡激素或相关促卵泡激素样品。该种方法易于操作、灵敏性高、特异性强和系统稳定可重复，以及检测FSH的范围广，并可根据酶标仪检测的吸光值(OD值)直接反映出FSH标品或样品的浓度或体外生物学活性。

Description

一种定量检测人促卵泡激素的双抗夹心酶联免疫分析法
技术领域
本发明涉及一种定量检测人促卵泡激素的双抗夹心酶联免疫分析法，属于生物医学酶联免疫分析技术领域。
背景技术
促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，FSH)是一种由α亚基和β亚基通过非共价键连接而成的糖蛋白类激素，它是常用于治疗男女不孕药物的主要成分之一。在女性中，促卵泡激素可促进黄体素生成、卵泡成熟和诱导排卵；在男性中，促卵泡激素主要是促进精子的生成和成熟。目前市场上有两类商业化的促卵泡激素药物制剂，一类是从绝经妇女尿液中提取出的尿源性促卵泡激素(urinary-derived FSH，uFSH)，另一类是通过DNA重组技术生产出的重组促卵泡激素(recombinant FSH，rFSH)。
促卵泡激素定量是许多生物药企生产该种药物的一个重要环节。此外，对许多医疗卫生部门检在诊断、监控和治疗人体各种疾病等方面有着重要意义。当前FSH的定量检测有放射免疫分析法、酶联免疫分析法、化学发光免疫分析法和时间分辨荧光免疫分析法。然而每一种分析方法有其优势和不足，因此迫切需要建立一种稳定可靠、高灵敏、检测范围广的定量检测分析方法。
酶联免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)作为一种诊断工具或药物质量分析工具广泛地应用在生物医学研究和生物制药企业，经过多年来的发展和完善已衍生出直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA、竞争ELISA和多重-便捷式ELISA等多种类型。酶联免疫分析法是利用酶标记的抗原或抗体去检测生物分子(蛋白质、肽、激素或抗体)，其中常用的酶标记为碱性磷酸酶、葡糖氧化酶和辣根过氧化物酶，并通过酶底物颜色变化的深浅和酶标仪测量出的吸光值(OD值)来反映标品或样品中某物质的浓度或体外生物学活性。
夹心ELISA是一种基于两种特异性的抗体(一种抗体包被酶标板作捕获抗体，另一种带酶标记的抗体作检测抗体)来检测样品中特定的抗原。与其他类型ELISA相比，这种方法操作简单、稳定性好和可重复性高，以及具有高灵敏性、高特异性和高精度。
发明内容
本发明提供了一种用于定量检测人促卵泡激素(hFSH)的双抗夹心酶联免疫分析法，主要解决现有技术灵敏度低、系统稳定性差、检测范围受限和可重复性不高，以及操作繁琐等技术问题。本发明采用配对的两种特异性单克隆抗体(即anti-FSH alpha抗体和anti-FSH beta抗体)来检测与量化人促卵泡激素或相关促卵泡激素样品。该种方法易于操作、灵敏性高、特异性强和系统稳定可重复，以及检测FSH的范围广，并可根据酶标仪检测的吸光值(OD值)直接反映出FSH标品或样品的浓度或体外生物学活性。
为了实现本发明的技术目的，本发明采用以下技术方案实施定量检测hFSH双抗夹心酶联免疫分析法：
(1)一抗包被：96孔酶标板(Corning公司；商品型号2592)中包被100ul anti-FSHalpha抗体(Anogen公司；商品目录MO-M40050B；将anti-FSH alpha抗体用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释成4ug/ml的工作液)，4℃过夜；次日，酶标板使用包含0.05％Tween-20的PBS缓冲液清洗，即PBST清洗3次，并后续每一步操作前均需要用PBST清洗3～5次，每次清洗时间为60～90s。
(2)封闭：酶标板中每孔添加320ul封闭缓冲液进行封闭，即5％脱脂奶粉(美国BD公司；商品目录号232100；将1g脱脂奶粉溶于20ml去离子水并充分搅拌混匀后成封闭缓冲液)封闭清洗干净的酶标板，放置37℃孵育2.5～3.0h。
(3)添加FSH标品或样品：将100ul FSH标品或样品添加到封闭好的酶标板，放置37℃孵育2h或4℃无振动孵48h。这里是将含有alpha链和beta链的尿源促卵泡激素作为标品(丽申宝，75IU，中国丽珠集团；国药准字H20052130)。用时，丽申宝粉末制剂用250ul无菌去离子水配制成0.300IU/ml储备液并保存-20℃备用，且设置整个标品的稀释范围在0.125IU/—8.000IU/ml。
(4)孵育二抗：添加100ul偶联辣根过氧化物酶(HRP)的anti-FSH beta抗体工作液(Anogen公司；商品目录MO-M40050T；将anti-FSH beta抗体按1:2000用PBS缓冲液稀释成工作度)。随后放置37℃孵孵育1h。
(5)颜色反应：添加100ul酶底物TMB显色液(索莱宝公司；商品目录号PR1210)，放置37℃避光孵育15min。
(6)终止反应与酶标检测：50ul 2M硫酸终止反应，随后5min内使用酶标仪在450nm读取吸光值，即OD450值。
(7)数据处理：将原始数据导入Excel中初步处理后，进一步使用GraphPad Prism5绘图软件分析处理并绘制出标准曲线或剂量反应曲线和拟合矫正回归直线等。
本发明有益效果在于：
(1)本发明定量检测的促卵泡激素是含有alpha链和beta链的重组促卵泡激素和尿源性促卵泡激素中任意一种。
(2)本发明采用的是两种单克隆抗体，对促卵激素定量检测具有高特异性。
(3)本发明易于操作、灵敏度高和系统稳定可重复，能与商业化的促卵泡激素检测试剂盒相媲美。
(4)本发明检测的曲线范围宽广，并可根据检测的OD值直接量化和放映促卵泡激素的浓度或体外生物学活性。
(5)本发明FSH标品或样品在37℃孵育2h和4℃无振动孵育48h两种孵育体系均能有效的对其进行定量检测。
附图说明
图1为促卵泡激素双抗夹心酶联免疫分析法原理。
图2为促卵泡激素双抗夹心酶联免疫分析法工作流程。
图3为促卵泡激素双抗夹心酶联免疫分析法检测系统本身产生的背景效应。
图4为尿源性促卵泡激素(丽申宝)采用37℃孵育2h定量检测体系所得的(A)标准曲线或剂量反应曲线和(B)拟合矫正回归直线。
图5为尿源性促卵泡激素(丽申宝)采用4℃无振动孵育48h定量检测体系所得的(A)标准曲线或剂量反应曲线和(B)拟合矫正回归直线。
图6为本实验室提供的一种含有alpha链和beta链的重组促卵泡激素培养上清检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施案例，进一步阐述本发明，实施案例仅用于解释而不用于限制本发明的范围。实施案例中所用各种试剂材料均可从市场购买获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟悉的常规方法和常规条件，或根据制造商所建议的条件进行操作。
在实施案例前，需要完成以下准备工作：
人尿源性促卵泡激素(丽申宝，75IU)采用250ul无菌去离子水稀释为300IU/ml(或0.300IU/ul)抗原储备品于-20℃保存备用。
含重组促卵泡激素培养上清(本实验室提供的一种待测样品，该种重组激素为含有alpha链和beta链二聚体蛋白)，4℃保存备用。
Anti-FSH alpha抗体(0.5mg)采用500ul无菌去离子水稀释为1mg/ml抗体储备品于-20℃保存备用。
实施例1：人尿源性促卵泡激素(丽申宝——37℃孵育2h定量检测体系)定量检测
(1)一抗包被：96孔酶标板中包被100ul anti-FSH alpha抗体(4ug/ml，即anti-FSH alpha抗体储备品(1mg/ml)用PBS缓冲液稀释成4ug/ml的工作液)，4℃过夜；次日，酶标板使用包含0.05％Tween-20的PBS缓冲液清洗，即PBST清洗4次，并后续每一步操作前均需要用PBST清洗3～5次，每次清洗时间为60～90s。同时事先在酶标板中设置3组对照来判断整个体系自己产生的背景效应，即对照组1：采用相同体积的PBS缓冲溶液代替标品；对照组2：只接收FSH beta工作液；对照组3：只需封闭即可。
(2)封闭：酶标板中每孔添加320ul 5％脱脂奶粉封闭缓冲液(电子天平将1g脱脂奶粉溶于20ml去离子水并充分搅拌混匀后成封闭缓冲液)封闭清洗干净的酶标板，放置37℃孵育2.5h。
(3)添加尿源促卵泡激素-丽申宝标品/样品：取每个梯度尿源促卵泡激素稀释液100ul添加到封闭好的酶标板中(移液枪取24ul的尿源促卵泡激素标品/样品-丽申宝(300IU/ml)在小离心管(1.5ml)用900ul PBS溶液稀释为8.000IU/ml,然后依次在小离心管中按倍比稀释成梯度稀释液，即促卵泡激素丽申宝稀释范围设置在0.125IU/—8.000IU/ml)，每个梯度重复3孔，并选取酶标板中的5孔用相同体积PBS缓冲液代替促卵激素样品作对照。随后放置37℃孵育2h。
(4)孵育二抗：添加100ul偶联辣根过氧化物酶(HRP)的anti-FSH beta抗体工作液(即移液枪取3ul anti-FSH beta抗体按1:2000用3000ul PBS缓冲液稀释成工作液)，放置37℃孵育1h。
(5)颜色反应：添加100ul酶底物TMB显色液，放置37℃避光孵育15min。(6)终止反应与酶标检测：50ul 2M硫酸终止反应，随后5min内使用酶标仪在450nm读取吸光值，即OD450值。
(7)数据处理：将原始数据导入Excel中初步处理后，进一步使用GraphPad Prism5绘图软件分析处理并绘制出标准曲线或剂量反应曲线和拟合矫正回归直线等。
实施例2：人尿源性促卵泡激素(丽申宝——4℃无振荡孵育48h定量检测体系)定量检测
(1)一抗包被：96孔酶标板中包被100ul anti-FSH alpha抗体(4ug/ml，即anti-FSH alpha抗体储备品(1mg/ml)用PBS缓冲液稀释成4ug/ml的工作液)，4℃过夜；次日，酶标板使用包含0.05％Tween-20的PBS缓冲液清洗，即PBST清洗4次，并后续每一步操作前均需要用PBST清洗3～5次，每次清洗时间为60～90s。同时事先在酶标板中设置3组对照来判断整个体系自己产生的背景效应，即对照组1：采用相同体积的PBS缓冲溶液代替标品；对照组2：只接收FSH beta工作液；对照组3：只需封闭即可。
(2)封闭：酶标板中每孔添加320ul 5％脱脂奶粉封闭缓冲液(电子天平将1g脱脂奶粉溶于20ml去离子水并充分搅拌混匀后成封闭缓冲液)封闭清洗干净的酶标板，放置37℃孵育2h。
(3)添加尿源促卵泡激素-丽申宝标品/样品：取每个梯度尿源促卵泡激素稀释液100ul添加到封闭好的酶标板中(移液枪取24ul的尿源促卵泡激素标品/样品-丽申宝(300IU/ml)在小离心管(1.5ml)用900ul PBS溶液稀释为8.000IU/ml,然后依次在小离心管中按倍比稀释成梯度稀释液，即促卵泡激素丽申宝稀释范围设置在0.125IU/—8.000IU/ml)，每个梯度重复3孔，并选取酶标板中的5孔用相同体积PBS缓冲液代替促卵激素样品作对照。随后放置4℃无振动孵育48h。
(4)孵育二抗：添加100ul偶联辣根过氧化物酶(HRP)的anti-FSH beta抗体工作液(即移液枪取3ul anti-FSH beta抗体按1:2000用3000ul PBS缓冲液稀释成工作液)，放置37℃孵育1h。
(5)颜色反应：添加100ul酶底物TMB显色液，放置37℃避光孵育15min。
(6)终止反应与酶标检测：50ul 2M硫酸终止反应，随后5min内使用酶标仪在450nm读取吸光值，即OD450值。
(7)数据处理：将原始数据导入Excel中初步处理后，进一步使用GraphPad Prism5绘图软件分析处理并绘制出标准曲线或剂量反应曲线和拟合矫正回归直线等。
实施例验证：
(1)曲线与范围
(2)有效性与准确性
促卵泡激素双抗夹心酶联免疫分析法有效性与准确性评估，采用尿源性促卵泡激素(丽申宝)样品/标品三个不同浓度，即高浓度(4.000IU/ml)、中浓度(1.000IU/ml)、低浓度(0.125IU/ml)。在同一块酶标板中对每个浓度重复测试6个孔并计算其吸光值(OD450)的平均值，标准偏差和变异系数[CV(％)]，其结果如表1所示。
此外，我们也进行了促卵泡激素双抗夹心ELISA对含有alpha链和beta链的重组促卵泡激素定量检测。采用哺乳动物细胞(HEK-293细胞)系统表达的重组促卵泡激素(rFSH)上清做供试样品(由本实验室提供，采用瞬时转染方式，48h后收集培养上清进行检测)，尿源性丽申宝(2.000IU/ml)做阳性对照品,HEK-293培养上清、培养基(DMEM)和PBS代替标品/样品做对照，其检测结果如图6所示。
表1促卵泡激素双抗夹心酶联免疫分析法有效性与准确性评估

Claims (1)

1.一种定量检测人促卵泡激素的双抗夹心酶联免疫分析法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)一抗包被：96孔酶标板(Corning公司；商品型号2592)中包被100ul anti-FSHalpha抗体(Anogen公司；商品目录MO-M40050B；将anti-FSH alpha抗体用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释成4ug/ml的工作液)，4℃过夜；次日，酶标板使用包含0.05％Tween-20的PBS缓冲液清洗，即PBST清洗4次，并后续每一步操作前均需要用PBST清洗3～5次，每次清洗时间为60～90s；
(2)封闭：酶标板中每孔添加320ul封闭缓冲液进行封闭，即5％脱脂奶粉(美国BD公司；商品目录号232100；将1g脱脂奶粉溶于20ml去离子水并充分搅拌混匀后成封闭缓冲液)封闭清洗干净的酶标板，放置37℃孵育2.5～3.0h；
(3)添加FSH标品或样品：将100ul FSH标品或样品添加到封闭好的酶标板，放置37℃孵育2h或4℃无振动孵48h；这里是将含有alpha链和beta链的尿源促卵泡激素作为标品(丽申宝，75IU，中国丽珠集团；国药准字H20052130)；用时，丽申宝粉末制剂用250ul无菌去离子水配制成0.300IU/ml储备液并保存-20℃备用，且设置整个标品的稀释范围在0.125IU/—8.000IU/ml；
(4)孵育二抗：添加100ul偶联辣根过氧化物酶(HRP)的anti-FSH beta抗体工作液(Anogen公司；商品目录MO-M40050T；将anti-FSH beta抗体按1:2000用PBS缓冲液稀释成工作度)。随后放置37℃孵孵育1h；
(5)颜色反应：添加100ul酶底物TMB显色液(索莱宝公司；商品目录号PR1210)，放置37℃避光孵育15min；
(6)终止反应与酶标检测：50ul 2M硫酸终止反应，随后5min内使用酶标仪在450nm读取吸光值，即OD450值；
(7)数据处理：将原始数据导入Excel中初步处理后，进一步使用GraphPad Prism 5绘图软件分析处理并绘制出标准曲线或剂量反应曲线和拟合矫正回归直线等。
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