CN107475348B

CN107475348B - 一种评估胆盐、去氧胆酸钠抑菌能力的方法

Info

Publication number: CN107475348B
Application number: CN201610395973.9A
Authority: CN
Inventors: 陈颖; 赵贵明; 姬庆龙; 赵勇胜
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2016-06-07
Filing date: 2016-06-07
Publication date: 2020-09-15
Anticipated expiration: 2036-06-07
Also published as: CN107475348A

Abstract

本发明公开了一种评估胆盐、去氧胆酸钠抑菌能力的方法。以藤黄微球菌和表皮葡萄球菌为敏感性测试菌株，以Oxoid的3号胆盐为对照品(Bile Salts No.3)，通过对比测试菌株的生长状态，评估不同批次、不同来源胆盐、去氧胆酸钠的抑菌能力，进而指导胆盐、去氧胆酸钠在培养基中的精确用量，保证需添加胆盐或去氧胆酸钠培养基性能的稳定性。

Description

一种评估胆盐、去氧胆酸钠抑菌能力的方法

技术领域

本发明涉及一种细菌培养基中天然抑菌剂的抑菌效果测定方法，尤其涉及一种胆盐、去氧胆酸钠的抑菌效果测定方法。

背景技术

培养基是研究细菌各项生理特征、分离与鉴别目标菌的基础试剂，培养基中除含有营养成分如蛋白胨、酵母粉、肉浸粉、糖类物质及载体(指固体培养基）外，还经常需要添加抑制剂如抗生素、无机盐以及胆盐类物质，通过抑制杂菌来提高目标菌的分离效率。

在这些抑菌剂中，有一种天然抑菌剂--胆盐较为特别，不仅可抑制革兰氏阳性菌，还对不同革兰氏阴性菌表现出强弱不同的抑菌效果，具有抗生素、单成分化学物质无法替代的优势，因此，一直沿用至今，目前约50多种常规培养基使用胆盐，如分离肠杆菌科细菌的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）、分离弧菌的硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂（TCBS），其次，胆盐在成分组成方面有别于抗生素、化学抑制剂，胆盐从动物胆汁中提取，含有胆汁酸、结合胆酸类和胆汁醇类，为多组分物质，多种成分含量不仅随动物的种属不同而变化，而且制造工艺的差异，也导致抑菌效果差别较大，此外，为了增强抑菌效果，有时还会将几种胆盐混合使用，如3号胆盐，这就使其成分更加复杂。然而，包括标准方法在内的现有配方中通常给出的胆盐用量为固定添加量（如：GB4789.4-2010食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验附录A.5、A.6），这就导致配制成的培养基性能出现偏差，尽管也有针对培养基性能的质控方法（如：GB4789.28-2010食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求），即通过观察质控菌株在培养基上的生长和受到的抑制情况进行判断，但是存在明显问题，由于培养基中不只是胆盐一种抑制成分，因此，观察到的抑菌效果不能准确反映胆盐的抑菌能力，如SS琼脂。也有通过测定胆酸含量评价胆盐抑菌能力的方法，但总胆酸由几种不同类型胆酸组成，组成的比例不同，即使总胆酸含量相同，表现出的抑菌效果也不相同，且测定方法繁琐费时费力，因此，现有方法均不能精确评估胆盐、去氧胆酸钠的抑菌能力，也就不能正确指导不同种类、不同批次胆盐、去氧胆酸钠产品在培养基中的最适用量。

通过设置对照品和固定测试菌株，比较对照品胆盐与供试品胆盐中测试菌株的生长状态，得以精确测定胆盐的效价，本发明参照该原理，筛选出藤黄微球菌和表皮葡萄球菌作为敏感性测试菌株，以Oxoid的3号胆盐为对照品胆盐(Bile Salts No.3)，通过比较对照品胆盐与测试品胆盐对于敏感性测试菌株的最小抑菌浓度(Minimum InhibitoryConcentration, MIC）和最小杀菌浓度(Minimum Bactericidal Concentration，MBC），应用统计学方法，精确获得测试样品的抑菌能力，指导胆盐、去氧胆酸钠在培养基中的准确用量，保证培养基性能的稳定性，提高培养基的实用性。

发明内容

本发明的内容在于提供一种评估胆盐、去氧胆酸钠抑菌能力的方法，具体内容如下：

（1）测试用菌株及试剂

藤黄微球菌(Micrococcus Luteus)菌种号(ATCC49732)或表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)菌种号(ATCC12228)、3号胆盐(oxoid)、磷酸盐缓冲溶液、生理盐水、待测胆盐、去氧胆酸钠，哥伦比亚血琼脂平板(oxoid)、TSB液体培养基(oxoid)。

（2）仪器设备

恒温培养箱、高压灭菌锅、微量移液器(20μl～200μl、100～1000μl)、麦氏比浊管、比浊仪、Bioscreen全自动生长曲线分析仪。

（3）菌悬液的制备

将敏感性测试菌株活化后接种于哥伦比亚血琼脂平板，经(36±1)℃培养18h~24h，直至出现明显菌落。挑取3-5个菌落，分散于TSB液体培养基中制成菌悬液。将菌悬液的浊度调整至0.5麦氏比浊标准，此时菌悬液的浓度为1.5×10⁸ CFU/mL。

（4）不同浓度胆盐培养基的制备

向TSB液体培养基中加入作为标准的oxoid 3号胆盐，配置成胆盐浓度分别为0.05%，0.1%，0.15%，0.2%，0.25%和0.3%的TSB液体培养基。其他待测胆盐按照相应比例配成相应的TSB液体培养基，待测胆盐浓度最大设置为0.5%。

（5）MIC和MBC的测定

取30μl菌悬液接种于270μl相应的含胆盐的TSB培养基中，置于Bioscreen全自动生长曲线分析仪中，37℃培养48h，每15min测一次浊度值。每个实验测试3个平行样，取平均值绘制菌种生长曲线，最小抑菌浓度MIC是胆盐能够完全抑制细菌生长的最低药物浓度，记录不同胆盐对敏感性测试菌株的MIC值。

48h之后，在全自动生长曲线分析仪中每一个样品管中取200μl菌液均匀的涂在哥伦比亚血琼脂平板上，(36±1)℃培养48h，观察平板上的菌落数。最小杀菌浓度MBC是胆盐能够杀死99.9%的细菌(降低3个数量级)所需的最低药物浓度，记录不同胆盐对敏感性测试菌株的MBC值。

通过比较对照品胆盐与测试品胆盐对于敏感性测试菌株的MIC和MBC，进而评估测试样品的抑菌能力，指导胆盐、去氧胆酸钠在培养基中的准确用量，提高培养基的适用性。

具体实施方式

实施例1：不同品牌3号胆盐效果差异测定

1.测试用菌株的复活与制备

将藤黄微球菌(ATCC49732)活化后接种于哥伦比亚血琼脂平板，经(36±1)℃培养18h~24h，直至出现明显菌落。挑取3-5个菌落，分散于TSB液体培养基中制成菌悬液。将菌悬液的浊度调整至0.5麦氏比浊标准，此时菌悬液的浓度约为1.5×10⁸ CFU/mL，备用。

2.不同浓度3号胆盐培养基的制备

向TSB液体培养基中加入作为标准的3号胆盐(oxoid)，配置成胆盐浓度分别为0.05%，0.1%，0.15%，0.2%，0.25%和0.3%的TSB液体培养基。待测的3号胆盐按照相应比例配成相应的TSB液体培养基，其他待测胆盐浓度最大设置为0.5%。

3.MIC和MBC的测定

取30μl菌悬液接种于270μl相应的含胆盐的TSB培养基中，置于Bioscreen全自动生长曲线分析仪中，37℃培养48h，每15min测一次浊度值。每个实验测试3个平行样，取平均值绘制菌种生长曲线，记录不同胆盐对藤黄微球菌的MIC值。

48h之后，在全自动生长曲线分析仪中每一个样品管中取200μl菌液均匀的涂在哥伦比亚血琼脂平板上，(36±1)℃培养48小时，观察平板上的菌落数，记录不同胆盐样品对藤黄微球菌的MBC值。

4.结果分析

其中0为作为标准的oxoid 3号胆盐，1，2，3分别为不同公司产的3号胆盐；

Figure DEST_PATH_288510DEST_PATH_IMAGE001

结果说明，虽然不同的3号胆盐样品对于藤黄微球菌(ATCC49732)的最小抑菌浓度都为0.1%，但是只有1号样品的最小杀菌浓度同对照品一致。说明三号胆盐的品质上，1号样品>3号样品>2号样品。

实施例2： 3号胆盐对不同菌株的抑菌效果测定

1. 测试用菌株的复活与制备

将藤黄微球菌(ATCC49732)，金黄色葡萄球菌(ATCC25923)，表皮葡萄球菌(ATCC12228)，乙型溶血性链球菌(CMCC32210)，单核细胞增生李斯特氏菌(ATCC19115)，阪崎肠杆菌(ATCC29544)，鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)，大肠埃希氏菌(ATCC25922)，大肠埃希氏菌O157:H7(IQCC10102)，福氏志贺菌(ATCC12022)分别活化后接种于哥伦比亚血琼脂平板，经(36±1)℃培养18h~24h，直至出现明显菌落。分别挑取3-5个菌落，分散于TSB液体培养基中制成菌悬液。将菌悬液的浊度调整至0.5麦氏比浊标准，此时菌悬液的浓度为1.5×10⁸CFU/mL，使用。

2. 3号胆盐液体培养基的制备

向TSB液体培养基中加入作为标准的3号胆盐(oxoid)。对于阪崎肠杆菌等革兰氏阴性菌配置成胆盐浓度分别为0.05%，0.1%，0.15%，0.2%，0.25%和0.3%的TSB液体培养基。对于藤黄微球菌等革兰氏阳性菌配置成胆盐浓度分别为0.025%，0.05%，0.075%，0.1%和0.15%的TSB液体培养基。

3.接种

将藤黄微球菌(ATCC49732)，金黄色葡萄球菌(ATCC25923)，表皮葡萄球菌(ATCC12228)，乙型溶血性链球菌(CMCC32210)，单核细胞增生李斯特氏菌(ATCC19115)，阪崎肠杆菌(ATCC29544)，鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)，大肠埃希氏菌(ATCC25922)，大肠埃希氏菌O157:H7(IQCC10102)，福氏志贺菌(ATCC12022)分别取30μl菌悬液接种于270μl相应的含胆盐的TSB培养基中，置于Bioscreen全自动生长曲线分析仪中，37℃培养48h，每15min测一次浊度值。每个实验测试3个平行样，取平均值绘制菌种生长曲线，记录胆盐对不同菌种的MIC值。

4.结果分析

根据生长曲线（见附图：其中图1是阪崎肠杆菌(ATCC29544)在不同浓度的3号胆盐下的生长曲线图；图2是鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)在不同浓度的3号胆盐下的生长曲线图；图3是大肠埃希氏菌(ATCC25922)在不同浓度的3号胆盐下的生长曲线图；图4是大肠埃希氏菌O157:H7(IQCC10102)在不同浓度的3号胆盐下的生长曲线图；图5是福氏志贺菌(ATCC12022)在不同浓度的3号胆盐下的生长曲线图；图6是藤黄微球菌(ATCC49732))在不同浓度的3号胆盐下的生长曲线图；图7是金黄色葡萄球菌(ATCC25923)在不同浓度的3号胆盐下的生长曲线图；图8是表皮葡萄球菌(ATCC12228)在不同浓度的3号胆盐下的生长曲线图；图9是乙型溶血性链球菌(CMCC32210)在不同浓度的3号胆盐下的生长曲线图；图10是单增李斯特氏菌(ATCC19115)在不同浓度的3号胆盐下的生长曲线图），3号胆盐(oxoid)对于阪崎肠杆菌等革兰氏阴性菌并无明显的抑制作用，而对于藤黄微球菌等革兰氏阳性菌起到了明显的抑制作用，革兰氏阳性菌株的MIC值见下表。

Figure DEST_PATH_641868DEST_PATH_IMAGE002

结果说明3号胆盐对于革兰氏阳性菌有很强的抑制能力，对于筛选革兰氏阴性菌的选择培养基来说，加入适量3号胆盐可以有效的排除革兰氏阳性菌的干扰，Bioscreen法可以有效衡量3号胆盐的抑菌效果。

实施例3：胆盐敏感性测试菌株的选取

1.测试用菌株的复活与制备

从实施例2中得知，乙型溶血性链球菌对胆盐非常敏感，但是作为敏感性测试菌株，除了对胆盐非常敏感外，还应考虑安全性，因此选取藤黄微球菌(ATCC49732)和表皮葡萄球菌(ATCC12228)作为敏感性测试菌株，分别活化后接种于哥伦比亚血琼脂平板，经(36±1)℃培养18h~24h，直至出现明显菌落。挑取3-5个菌落，分散于TSB液体培养基中制成菌悬液。将菌悬液的浊度调整至0.5麦氏比浊标准，此时菌悬液的浓度为1.5×10⁸ CFU/mL，备用。

2. 不同胆盐液体培养基的制备

将选取的某品牌牛胆盐、3号胆盐、猪胆盐和脱氧胆酸钠分别加入液体培养基TSB中，分别配置成胆盐浓度分别为0.05%，0.1%，0.15%，0.2%，0.25%，0.3%，0.4%和0.5%的胆盐培养基。

3. MIC和MBC的测定

取30μl菌悬液接种于270μl相应的含胆盐的TSB培养基中，置于Bioscreen全自动生长曲线分析仪中，37℃培养48h，每15min测一次浊度值。每个实验测试3个平行样，取平均值绘制菌种生长曲线，记录不同胆盐对测试菌株的MIC值。

48小时之后，在全自动生长曲线分析仪中每一个样品管中取200μl菌液均匀的涂在哥伦比亚血琼脂平板上，(36±1)℃培养48小时，观察平板上的菌落数，记录不同胆盐样品对测试菌株的MBC值。

4.结果分析

Figure DEST_PATH_296972DEST_PATH_IMAGE003

结果说明，藤黄微球菌和表皮葡萄球菌都可以被选做为胆盐的敏感菌株，因此在判定胆盐品质好坏的时候，可以选择更敏感一些的藤黄微球菌，也可以选择两种敏感性菌株更全面的比较胆盐品质的优劣。

实施例4：不同类型胆盐的抑菌效果测定

1. 测试用菌株的复活与制备

将选取藤黄微球菌(ATCC49732)活化后接种于哥伦比亚血琼脂平板，经(36±1)℃培养18h~24h，直至出现明显菌落。挑取3-5个菌落，分散于TSB液体培养基中制成菌悬液。将菌悬液的浊度调整至0.5麦氏比浊标准，此时菌悬液的浓度为1.5×10⁸ CFU/mL，备用。

2. 不同胆盐液体培养基的制备

将某品牌的牛胆盐、3号胆盐和猪胆盐分别加入液体培养基TSB中，分别配置成胆盐浓度分别为0.05%，0.1%，0.15%，0.2%，0.25%，0.3%，0.4%和0.5%的胆盐培养基。

3. MIC和MBC的测定

48h之后，在全自动生长曲线分析仪中每一个样品管中取200μl菌液均匀的涂在哥伦比亚血琼脂平板上，(36±1)℃培养48h，观察平板上的菌落数，记录不同胆盐样品对藤黄微球菌的MBC值。

4. 结果分析

Figure DEST_PATH_629864DEST_PATH_IMAGE004

结果说明，对于藤黄微球菌来说，某品牌的猪胆盐有更好的抑菌效果，其次是牛胆盐，3号胆盐的抑菌效果不如猪胆盐和牛胆盐。

实施例5：测定不同批次不同品牌的脱氧胆酸钠的抑菌效果

1.测试用菌株的复活与制备

选取藤黄微球菌(ATCC49732)，表皮葡萄球菌(ATCC12228)，分别活化后接种于哥伦比亚血琼脂平板，经(36±1)℃培养18h~24h，直至出现明显菌落。挑取3-5个菌落，分散于TSB液体培养基中制成菌悬液。将菌悬液的浊度调整至0.5麦氏比浊标准，此时菌悬液的浓度为1.5×10⁸ CFU/mL，备用。

2. 脱氧胆酸钠液体培养基的制备

将不同品牌和批次的脱氧胆酸钠分别加入液体培养基TSB中，分别配置成胆盐浓度分别为0.05%，0.1%，0.15%，0.2%，0.25%，0.3%，0.4%和0.5%的胆盐培养基。

3. MIC和MBC的测定

取30μl菌悬液接种于270μl相应的含胆盐的TSB培养基中，置于Bioscreen全自动生长曲线分析仪中，37℃培养48h，每15min测一次浊度值。每个实验测试3个平行样，取平均值绘制菌种生长曲线，记录脱氧胆酸钠对待测菌的MIC值。

48h之后，在全自动生长曲线分析仪中每一个样品管中取200μl菌液均匀的涂在哥伦比亚血琼脂平板上，(36±1)℃培养48h，观察平板上的菌落数，记录脱氧胆酸钠样品对待测菌的MBC值。

4. 结果分析

其中1号和2号样品为某品牌的脱氧胆酸钠，批号分别为20180815和20180816，3号样品为另一品牌的脱氧胆酸钠。

Figure DEST_PATH_818138DEST_PATH_IMAGE005

结果说明某品牌不同批次的脱氧胆酸钠的抑菌效果没有明显区别；另一品牌的脱氧胆酸钠比某品牌的脱氧胆酸钠的相对的抑菌效果好。相比于表皮葡萄球菌，藤黄微球菌对于脱氧胆酸钠的敏感性更强。

实施例6：替换胆盐对选择培养基的影响实验

在一些选择培养基中，常常加入某些抑制剂来消除杂菌对目的菌的影响，如小肠耶尔森氏菌的选择培养基中，通常加入0.2%的3号胆盐(oxoid)来抑制革兰氏阳性菌的生长。根据国标GB4789.28—2013中针对非目标菌（选择性）半定量测试方法，验证配制的小肠耶尔森氏菌选择培养基对革兰氏阳性菌的抑制作用，选取表皮葡萄球菌(ATCC12228)作为测试工作菌株，培养过夜后用1μL接种环取菌悬液1环，在待测培养基表面划六条平行直线，同时接种两个平板，36±1℃培养18h~24h后观察。生长指数G的计算方法如下：每条有比较稠密菌落生长的划线则G为1，如果仅一半的线有稠密菌落生长，则G为0.5，如果划线上没有菌落生长、生长量少于划线的一半或者菌落生长微弱，则G为0，记录每个平板的得分总和便得到G。按照0.2%的比例分别加入0号、1号、2号和3号四种胆盐，测量四种培养基的G值。

Figure DEST_PATH_578283DEST_PATH_IMAGE006

国标中要求对于非目标菌（选择性）半定量培养基的指控评定标准是G≤1，由表可知，相同比例的不同胆盐对于表皮葡萄球菌的抑制效果不一样，0号、1号和2号符合国标标准，3号则与标准不符，因此需要对使用的胆盐的抑菌效果进行相应评估，重新计算胆盐的含量比例。

1.测试用菌株的复活与制备

由于此实例是要抑制绝大多数革兰氏阳性菌，因此选取对胆盐相对不敏感的表皮葡萄球菌作为测试菌株，将表皮葡萄球菌(ATCC12228)活化后接种于哥伦比亚血琼脂平板，经(36±1)℃培养18h~24h，直至出现明显菌落。挑取3-5个菌落，分散于TSB液体培养基中制成菌悬液。将菌悬液的浊度调整至0.5麦氏比浊标准，此时菌悬液的浓度为1.5×10⁸ CFU/mL，备用。

2.不同浓度3号胆盐培养基的制备

向TSB液体培养基中加入作为标准的3号胆盐(oxoid)，配置成不同胆盐浓度分别为0.05%，0.1%，0.15%，0.2%，0.25%和0.3%的TSB液体培养基。待测的3号胆盐按照相应比例配成相应的TSB液体培养基。

3.MIC和MBC的测定

取30μl菌悬液接种于270μl相应的含胆盐的TSB培养基中，置于Bioscreen全自动生长曲线分析仪中，37℃培养48h，每15min测一次浊度值。每个实验测试3个平行样，取平均值绘制菌种生长曲线，记录不同胆盐对表皮葡萄球菌的MIC值。

48h之后，在全自动生长曲线分析仪中每一个样品管中取200μl菌液均匀的涂在哥伦比亚血琼脂平板上，(36±1)℃培养48小时，观察平板上的菌落数，记录不同胆盐样品对表皮葡萄球菌的MBC值。

4.结果分析

其中0为作为标准的oxoid 三号胆盐，1为某公司产的三号胆盐，2为某公司生产的三号胆盐，3为另一公司生产的胆盐三号；

编号	MIC	MBC
			0	0.05%	0.1%
1	0.1%	0.15%
			2	0.2%	＞0.5%
3	0.25%	＞0.5%

根据测得的MIC值，将编号为3的三号胆盐的浓度提至0.3%后，3号培养基的G值降为0.5，符合国标中G≤1的要求。

虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。

Claims

1.一种定量测试胆盐、去氧胆酸钠抑菌能力的方法，其特征在于以藤黄微球菌和/或表皮葡萄球菌为敏感性测试菌株，接种于含有测试样品的液体培养基中，培养一定时间后绘制生长曲线，测定胆盐类物质的抑菌能力。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于如下步骤；

1）菌悬液的制备：将藤黄微球菌和/或表皮葡萄球菌活化接种到平板，培养后挑取菌落，分散于TSB液体培养基中制成菌悬液；

2）不同浓度胆盐培养基的制备：配置胆盐浓度为0.05%—0.5%的TSB液体培养基；

3）MIC的测定：将菌悬液接种于相应的含胆盐的TSB培养基中，置于Bioscreen全自动生长曲线分析仪中，绘制生长曲线，并根据不同胆盐浓度的生长曲线确定其 MIC值；

4）MBC的测定：生长曲线绘制之后，在每一个样品管中取适量菌液均匀的涂在平板上，培养48h后，观察平板上的菌落数，记录不同胆盐对藤黄微球菌和/或表皮葡萄球菌的MBC值；

5）结果分析：通过比较对照品胆盐与测试品胆盐对于藤黄微球菌和/或表皮葡萄球菌的MIC和MBC值，进而评估测试样品的抑菌能力。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤2）所述不同浓度的胆盐培养基配制是以0.05%为梯度设置胆盐浓度，系列浓度分别为0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、0.5%。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤3）所述的MIC值为待测胆盐能够完全抑制细菌生长的最低浓度。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤4）所述的MBC值为待测胆盐能够杀死99.9%的细菌(降低3个数量级)所需的最低浓度。