CN107474149A - 一种新的天然产物鸡冠菌多糖lsm‑x及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新的天然产物鸡冠菌多糖LSM‑X及其应用，鸡冠菌多糖LSM‑X是由三种单糖组成的杂多糖，即β‑D‑葡萄糖，α‑D–半乳糖和D‑来苏糖以4:2:1的比例组成，平均分子量约为14695Da，主链是1,6‑连接的β‑D‑葡萄糖，4‑O上有一侧链，具有两个1,6‑连接的α‑D‑半乳糖残基和一个1‑连接的D‑来苏糖。本发明一定剂量的鸡冠菌多糖LSM‑X鸡冠菌多糖具有显著的免疫调节活性，LSM‑X在10μg/mL浓度时，B和T细胞增殖抑制率最高；可通过影响细胞周期的三个阶段促进B细胞增殖。当LSM‑X浓度为5μg/mL时，处于G0/G1期的B细胞百分比最低。
Description
技术领域
本发明属于真菌多糖应用技术领域，具体地说，涉及一种新的天然产物鸡冠菌多糖LSM-X及其应用。
背景技术
多多糖(polysaccharides)是生物体普遍存在的一类生物大分子。近代生物化学研究发现，多糖能参与细胞骨架和一些生物活性分子；如维持细胞结构的纤维素、几丁质；提供能量来源的淀粉、糖元等物质。多糖的发展较晚，结构又复杂多样，因此对研究其结构、活性等都较困难。
近20年来，关于多糖生物活性的研究报道主要集中在免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化和降血糖等方面，其作用是多途径、多环节、多靶点的。
鸡冠菌，拉丁学名Lactikporus supharells(Fr.)Murr.，又称硫色多孔菌、硫黄菌、鲑鱼菌。菌盖肉质，呈半圆形，多数重叠生长呈覆瓦状，子实体较大，菌盖厚，表面鲜或带黄的朱红色。菌肉幼时有弹性，干后变白且酥脆。管孔长，管口圆形至不正形。多生长于落栎等阔叶树干基部，引起树干基部块状褐色腐朽。
目前，对鸡冠菌多糖LSM-X的精细结构与免疫调节活性研究及其应用尚未见任何报道。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种新的天然产物鸡冠菌多糖LSM-X及其应用。
其具体技术方案为：
一种新的天然产物鸡冠菌多糖LSM-X，由三种单糖组成的杂多糖，即β-D-葡萄糖，α-D–半乳糖和D-来苏糖以4:2:1的比例组成，平均分子量约为14695Da，主链是1,6-连接的β-D-葡萄糖，4-O上有一侧链，具有两个1,6-连接的α-D-半乳糖残基和一个1-连接的D-来苏糖。鸡冠菌多糖的结构式为：
本发明所述新的天然产物鸡冠菌多糖LSM-X在免疫调节药物制备过程中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明一定剂量的鸡冠菌多糖LSM-X鸡冠菌多糖具有显著的免疫调节活性，LSM-X在10μg/mL浓度时，B和T细胞增殖抑制率最高；可通过影响细胞周期的三个阶段促进B细胞增殖。当LSM-X浓度为5μg/mL时，处于G0/G1期的B细胞百分比最低。
附图说明
图1鸡冠菌多糖LSM-X重均分子量；
图2鸡冠菌多糖LSM-X的红外谱；
图3鸡冠菌多糖LSM-X的HLPC图谱；
图4鸡冠菌多糖LSM-X的1H NMR图谱；
图5鸡冠菌多糖LSM-X的13C NMR图谱；
图6鸡冠菌多糖LSM-X的HH-COSY图谱；
图7鸡冠菌多糖LSM-X的HMQC图谱；
图8鸡冠菌多糖LSM-X的结构；
图9鸡冠菌多糖LSM-X对B细胞增殖的影响；
图10鸡冠菌多糖LSM-X对B细胞周期的影响；
图11鸡冠菌多糖LSM-X对T细胞增殖的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1鸡冠菌多糖LSM-X的分离提取
1.1鸡冠菌多糖LSM-X的分离提取
1.1.1通过热水提取法提取鸡冠菌粗多糖
粉碎后的鸡冠菌子实体粉末和蒸馏水以1：3的体积比在100℃的水浴中煮沸3小时，煮沸3次，收集上清液浓缩至200ml。加入三倍体积的无水乙醇形成絮状沉淀物，收集沉淀并干燥。此过程是用Sevage法除去提取液中的蛋白质而获得鸡冠菌粗多糖。
1.1.2DEAE-纤维素柱层析法分离纯化鸡冠菌粗多糖
称取DEAE-纤维素50.00g，用蒸馏水搅拌均匀后，浸泡24h，以除去悬浮颗粒。然后经过0.5mol/L NaOH溶液浸泡4h，蒸馏水洗至中性→再用0.5mol/L HC1溶液浸泡4h，蒸馏水洗至中性→再次用0.5mol/L NaOH溶液浸泡4h，蒸馏水洗至中性。此时的纤维素就具有活性，可与多糖进行交换吸附而被分离纯化。
将活化的纤维素装柱后，经蒸馏水压柱平衡24h后即可进行粗多糖的分离纯化。将粗多糖稀释后的上清液(3ml)加入DEAE纤维素柱中，加入不同浓度的NaCl(0mol/L，0.1mol/L，0.2mol/L，0.3mol/L，0.4mol/L，0.5mol/L)洗脱。多糖用硫酸-苯酚法测定。将洗脱液浓缩至5ml，将样品在纤维素柱上纯化。用透析袋(Mw≥7kDa)透析，持续3天，除去小分子化合物，冻干，得到鸡冠菌多糖，命名为LSM-X。
1.2.鸡冠菌多糖LSM-X的结构鉴定
运用水解、甲基化分析、气相色谱和质谱联用技术、红外谱技术、核磁共振技术、高效液相色谱，对鸡冠菌多糖LSM-X进行结构解析。
1.2.1分子量的测定
将5mg鸡冠菌多糖LSM-X样品用1ml ddH2O溶解，超声5min，进行HPGPC分析。
1.2.2鸡冠菌多糖LSM-X的红外谱分析
LSM-X样品2mg与KBr混合压片，红外分光光度计扫描4000cm-1-400cm-1范围。
1.2.3鸡冠菌多糖LSM-X的高效液相色谱分析
六种标准品和经TFA酸水解后的多糖样品用流动相(75％乙腈)溶解后进行HLPC分析。
1.2.4鸡冠菌多糖LSM-X的核磁共振分析
取LSM-X样品10mg溶于0.5mL重水(D2O)中，装入核磁管中，在核磁共振仪上检测。
1.2.5鸡冠菌多糖LSM-X的甲基化与硅烷化衍生后进行GC-MS分析
称取多糖样品40mg，加入5mL饱和的氢氧化钠溶液使其充分溶解，然后逐渐加入硫酸二甲酯使其反应，反应后加水终止反应。用氯仿萃取产物，干燥后得甲基化多糖。甲基化多糖经TFA完全酸水解后，水洗三次，得甲基化完全酸水解产物。
将上述样品1mg依次加入无水吡啶(0.2ml)，六甲基二硅氮烷(0.2ml)和三甲基氯硅烷(0.1ml)，50℃条件下反应20min，离心(10000rpm，20min)，取上层溶液用于GC-MS分析。
1.3结果
1.3.1鸡冠菌多糖LSM-X的基本性质结果
鸡冠菌纯多糖重均分子量为14695Da(见图1)。
1.3.2鸡冠菌多糖LSM-X的FTIR谱分析
如图2所示，通过傅里叶变换红外光谱进行LSM-X的红外分析，表征LSM-X的结构。3442.37cm-1是O-H的伸缩吸收峰，2927.37cm-1是饱和C-H的伸缩振动峰。多糖的特征吸收峰中，1643.54cm-1为C＝O,C＝C振动峰，1401.43cm-1为C-H的弯曲振动峰，在1000-1200cm-1范围内的C-O-C和C-O-H伸缩振动峰中，1127.06cm-1，1080.73cm-1，1035.10cm-1为三个延伸峰。吡喃糖环特征峰中，812.10cm-1显示含有α-吡喃糖，618.66cm-1为C-H的摇摆振动峰。
1.3.3鸡冠菌多糖LSM-X的高效液相分析
通过HPLC分析LSM-X的酸性水解产物，得到LSM-X的单糖组成分析(图3所示)。结果表明，LSM-X多糖主要由β-D-葡萄糖，α-D-半乳糖和D-来苏糖组成，组成比为4：2：1。
1.3.4鸡冠菌多糖LSM-X的NMR谱分析
LSM-X具有三个异头氢信号(δ5.00，δ4.95和δ4.89)，表明LSM-X多糖由三种单糖构成。δ5.00，δ4.95处的质子信号属于α-吡喃糖，δ4.89处的质子信号为β-吡喃糖。δ4.70是水的质子信号。δ3.39-δ4.09之间的强信号被鉴定为糖基CH2O和CHO，可归因于H2-H5的质子信号分布(图4)。图5为LSM-X的13CNMR光谱，δ102.83，δ102.38和δ99.38的信号为异质子信号峰，表明LSM-X中单体存在α和β同种型。结果与IR和1HNMR的结果一致。101-104ppm区域的共振归因于D-吡喃半乳糖(-D-Galp)的杂原子碳原子。96-101ppm区域是D-吡喃葡萄糖(D-Glcp)和D-来苏糖的碳原子。所有的碳的化学位移都总结在表1中。HH-COSY谱(图6)，表明H2的化学位移为3.78,3.80,3.88ppm。通过HMQC光谱(图7)可以鉴定碳和氢之间的重叠信号。
表1鸡冠菌多糖LSM-X的13C NMR图中的化学位移
1.3.5鸡冠菌多糖LSM-X的GC-MS谱分析结果
LSM-X的甲基化结果表明(表2)，LSM-X重复单元具有(1→6)连接的β-D-吡喃葡萄糖和(1→6,4)-β-D-吡喃葡萄糖，分支应由(4→1)-α-D-吡喃半乳糖残基和(6→1)-D-莱索糖。综上可初步推断鸡冠菌多糖的结构(见图8)。
表2鸡冠菌多糖的GC-MS结果
| Methylated sugar | Linkage | m/z |
| 2,3,4-Me-1,6-Glu | 1,6- | 29 45 59 73 88 101 117 133 145 159 174 205 229 245 265 287 319 351 |
| 2,3-Me-1,6-Glu | 1,4,6- | 29 45 59 73 88 117 133 147 159 205 232 259 287 303 319 345 377 409 |
| 3,4-Me-1,2,6-Gal | 1,2,6- | 45 59 73 89 103 133 146 159 173 189 205 232 259 277 317 345 377 |
| 2,4-Me-1,3,6-Gal | 1,3,6- | 45 59 73 89 131 146 159 191 207 231 259 275 303 319 345 377 |
| 2,3,4-Me-1-Lyx | 1- | 15 29 45 58 73 88 101 115 133 146 159 174 185 205 217 |
2.鸡冠菌多糖LSM-X的免疫调节活性研究
在体外运用两种CCK-8法和细胞周期试剂盒测定鸡冠菌多糖LSM-X的免疫调节活性，包括B和T细胞的增殖影响、B细胞的细胞周期影响。
2.1试剂
CCK-8试剂盒，细胞周期试剂盒，RPIM1640，FBS，DMSO，双抗等。
2.2仪器
酶标仪；流式细胞仪
2.3方法
2.3.1LSM-X对免疫细胞(B细胞，T细胞)的增殖影响
通过CCK-8法测定B和T细胞上LSM-X增殖影响。将LSM-X多糖溶解于培养基中，用0.22μm过滤器灭菌。取对数生长期的T，B细胞，用新鲜培养基稀释至1×105个细胞/mL。将PBS缓冲液加入到围绕无菌水环境的96孔板中，并将剩余的孔加入100μL细胞稀释液。在37℃，5％CO2培养箱中孵育24小时后，加入100μL细胞培养，LPS和不同浓度的LSM-X多糖溶液(最终质量浓度5,10,20μg/mL)。培养箱中培养24小时后，向每个孔中加入5μL CCK-8溶液并孵育3小时。测量450nm处的吸光度并记录结果。用横坐标绘制曲线，吸光度为纵坐标，拍摄图像。
2.3.2LSM-X对B细胞的细胞周期影响
用细胞周期和凋亡检测试剂盒测试B细胞周期。实验组(LSM-X：5,10,20μg/mL)和阳性对照组(LPS：5μg/mL)加油刺激细胞。将各组的细胞收集后用预冷的70％乙醇固定4小时。然后加入制备的0.5mL碘化丙啶染色溶液，37℃孵育30分钟。流式细胞术用于检测488nm的激发波长。
2.4结果
2.4.1.LSM-X对B细胞的增殖影响
B细胞效应如图9所示，5μg/mL LPS作为对照组。当LSM-X浓度为5μg/mL时，B细胞增值效应显著(P<0.05)，浓度为10μg/mL时达到最大值。值得注意的是，LSM-X浓度增加20μg/mL，B细胞增殖仍然非常显着。
2.4.2.LSM-X对B细胞的细胞周期影响
结果表明，与对照组相比，LPS对照组中处于G0/G1期的B细胞百分比低于空白对照组(图10)，LSM-X为5μg/mL时，G0/G1期细胞百分比最低。G2/M期细胞百分比在LSM-X浓度为5μg/mL时最大，表明LSM-X刺激的LS细胞的细胞周期减少，G0时间和G1期的制备时间减少。细胞分裂(M期)细胞百分比增加B细胞分化能力。简而言之，LSM-X可促进B细胞有丝分裂，并将B细胞从G0/G1期转化为G2/M期，使B细胞增殖增加。
2.4.1.LSM-X对T细胞的增殖影响
在图11中显示了LSM-X对T细胞的刺激效果。与对照组比较，低浓度LSM-X显著促进T细胞增殖(5-10μg/mL，p<0.01)，T细胞增殖呈正相关。当LSM-X浓度为10μg/mL时，T细胞增殖最大。值得注意的是，LSM-X在20μg/mL时细胞增殖活性较低(p<0.05)，5μg/mL LPS诱导的细胞增殖活性显着。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (2)
1.一种新的天然产物鸡冠菌多糖LSM-X，其特征在于，由三种单糖组成的杂多糖，即β-D-葡萄糖，α-D–半乳糖和D-来苏糖以4:2:1的比例组成，平均分子量约为14695Da，主链是1,6-连接的β-D-葡萄糖，4-O上有一侧链，具有两个1,6-连接的α-D-半乳糖残基和一个1-连接的D-来苏糖，鸡冠菌多糖的结构式为：
2.权利要求1所述新的天然产物鸡冠菌多糖LSM-X在免疫调节药物制备过程中的应用。
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