CN107466973A - 一种桔小实蝇卵的显微注射方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种桔小实蝇卵的显微注射方法，该方法包括以下步骤：用将放有桔小实蝇卵的黑色纱布固定在离心管的管口，倒扣离心管将桔小实蝇卵在体积浓度1.5‑2％的次氯酸钠溶液中浸泡，使桔小实蝇卵充分接触次氯酸钠溶液；将处理过的去壳卵用纯水洗涤，将次氯酸钠溶液尽量洗涤干净；将处理好的去壳卵挑取到覆盖湿润滤纸的培养皿中；在解剖镜下将桔小实蝇去壳卵依次横向排序；转移桔小实蝇去壳卵到玻片上，用镊子的背部轻轻滑过玻片，固定，并将去壳卵干燥；随后用水饱和油覆盖去壳卵表面；进行显微注射。本发明解决了桔小实蝇卵在显微注射中难以干燥和内压过大的问题，提高注射后卵孵化率达10％‑30％，感染率达15％‑50％。
Description
技术领域
本发明属于病虫防害领域，具体地是涉及一种桔小实蝇卵的显微注射方法
背景技术
桔小实蝇(Bactroceradorsalis)是危害水果和蔬菜的危险性有害生物，我国于1911年首次在台湾省台北市的柑桔园发现，在大陆于1937年报道有该虫发生。鉴于该虫寄主范围广，繁殖快及对水果贸易造成的严重危害，许多国家将其列为检疫对象。利用环境友好型防治方法防治害虫是当今害虫防治的趋势。实现桔小实蝇的规模化饲养，有利于开发环保型防控技术，如不育昆虫技术(sterile insect technique,SIT)和利用天敌昆虫(如寄生蜂)防治害虫。
桔小实蝇的规模化饲养中，现有用显微注射桔小实蝇卵的方法如下：
用新鲜橙子扎洞诱导桔小实蝇产卵1h，剥开橙子挑取已产桔小实蝇卵。
在解剖镜下用毛笔将桔小实蝇卵排序，转移桔小实蝇卵到贴在有双面胶的玻片上，轻轻按压；将桔小实蝇卵在干燥剂中干燥30min左右。随后用水饱和油覆盖去壳卵表面，防止进一步干燥。
显微注射完毕，将注射过的桔小实蝇卵挑到预先保温的幼虫食物中；培养7d后，将幼虫挑取到湿润沙子中，让其自然成蛹；蛹培养7d后，将蛹从沙中轻轻筛出，置于饲养笼中，等待蛹羽化成蝇。
上述这种显微注射方法，存在以下缺陷：
由于桔小实蝇卵有外壳包裹，很难干燥，同时卵的内压很大，显微注射过程中容易喷出胞浆，爆裂。
此外，由于新鲜橙子存在季节性，这为采卵增加了很大的局限；桔小实蝇卵呈乳白色，剥开橙子挑卵很容易和果肉混淆。
发明内容
本发明的目的之一提供一种新的桔小实蝇卵的显微注射方法，该方法解决了桔小实蝇卵在显微注射中难以干燥和内压过大的问题。
实现上述目的的技术方案如下。
一种桔小实蝇卵的显微注射方法，包括以下步骤：
(B1)用将放有桔小实蝇卵的黑色纱布固定在离心管的管口，倒扣离心管将桔小实蝇卵在体积浓度1.5-2％的次氯酸钠溶液中浸泡，轻轻晃动离心管使桔小实蝇卵充分接触次氯酸钠溶液；
(B2)将处理过的去壳卵用纯水洗涤，期间轻轻晃动，将次氯酸钠溶液尽量洗涤干净；将处理好的去壳卵挑取到覆盖湿润滤纸的培养皿中；
(B3)先准备好粘着有双面胶的玻片；在解剖镜下将桔小实蝇去壳卵依序横向排序在厚滤纸上，翻转粘着双面胶的玻片，将排列好的桔小实蝇去壳卵转移到双面胶上，用镊子的背部轻轻滑过玻片，从而转移桔小实蝇去壳卵到玻片上，并将去壳卵在干燥剂中干燥8-12min，随后用水饱和油覆盖去壳卵表面，防止进一步干燥；
(B4)进行显微注射，完毕，保留注射过的桔小实蝇去壳卵，既得显微注射的桔小实蝇卵。
优选地，还包括保持覆盖卵的水饱和油充足，将玻片放置在有湿润滤纸的培养皿中，置于桔小实蝇孵化环境中。
优选地，步骤(B1)中，将桔小实蝇卵在体积浓度1.5-2％的次氯酸钠溶液中浸泡1-2min，轻轻晃动离心管使桔小实蝇卵充分接触次氯酸钠溶液。更优选地，所述次氯酸钠的浓度为1.8％
优选地，步骤(B2)中，用纯水洗涤去壳卵5-7次，转移桔小实蝇去壳卵到贴有双面胶的玻片上，将去壳卵在干燥剂中干燥8-12min。
优选地，所述放有桔小实蝇卵的黑色纱布中的桔小实蝇卵，是通过以下方法采集得到的，所述方法包括以下步骤：
在管壁打孔(打孔距离2公分左右)的离心管中加入10ml橙汁(美汁源的果粒橙，过滤掉果粒)，不断摇晃使橙汁充分接触离心管内壁然后将其放入能产卵的桔小实蝇饲养笼中，放置15-35min，桔小实蝇在离心管产卵，得到产卵管；
取出产卵管，用清水冲洗将离心管内壁的卵收集到黑色纱布上。
优选地，所述离心管为25-100ml，更优选为，离心管为50ml。
优选地，放置时间为20-30min。
本发明用次氯酸钠溶液将桔小实蝇外壳去掉，解决了桔小实蝇卵在显微注射中难以干燥和内压过大的问题。在用桔小实蝇未去壳的卵注射，卵孵化率仅有1％-5％，感染率1％-9％；本发明通过一系列的改进，提高注射后卵孵化率达10％-30％，感染率达15％-50％。
其次，本发明采用离心管和橙汁收集桔小实蝇卵，避免了新鲜橙子的季节性以及富集的困难性，并且缩短了产卵时间，保证了蚊卵的新鲜度和同步性。采用该方法，容易采集到桔小实蝇卵，且为后续的显微操作提供了方便。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1：
本实施例所述桔小实蝇卵的采集方法，包括以下步骤：
在管壁打孔的离心管，离心管根据采卵量的大小，容积25-100ml皆可，本实施例采用50ml的离心管，加入10ml橙汁(美汁源的果粒橙，过滤掉果粒)，不断摇晃使橙汁充分接触离心管内壁然后将其放入能产卵的桔小实蝇饲养笼中，放置时间为20-30min，桔小实蝇在离心管产卵，得到产卵管；
取出产卵管，用清水冲洗将离心管内壁的卵收集到黑色纱布上，即采集到桔小实蝇卵；然后按照以下方法进行桔小实蝇卵的显微注射方法：
用橡皮筋将上述放有桔小实蝇卵的黑色纱布固定在15ml离心管的管口，倒扣离心管将桔小实蝇卵在体积浓度1.8％的次氯酸钠溶液中浸泡1.5min，轻轻晃动离心管使卵充分接触次氯酸钠溶液，得到去壳卵；
将处理过的去壳卵用纯水洗涤6次，期间轻轻晃动，将次氯酸钠溶液尽量洗涤干净；将处理好的卵挑取到覆盖湿润滤纸的培养皿中；
先准备好粘着有双面胶的玻片；在解剖镜下将桔小实蝇去壳卵依序排序在厚滤纸上，因去壳之后很难分辨卵的头部和尾部，所以将卵横向排列；翻转粘着双面胶的玻片，将排列好的桔小实蝇去壳卵转移到双面胶上，用镊子的背部轻轻滑过玻片，从而转移桔小实蝇去壳卵到玻片上，并将去壳卵在干燥剂中干燥10min，随后用水饱和油覆盖去壳卵表面，
进行显微注射，完毕，保留注射过的桔小实蝇去壳卵，保持覆盖卵的水饱和油充足，将玻片放置在有湿润滤纸的培养皿中，置于26℃温度、70％相对湿度的环境下；
2d后，在解剖镜下观察培养皿中的玻片和其底部的滤纸，用毛笔轻轻地将已孵化的幼虫转移到幼虫食物上。桔小实蝇卵一般在注射2-3天内孵化，需定时观察是否有幼虫孵化并及时转移到幼虫食物中。
采用三重感染wolbachia的蚊株HC作为注射供体，对比桔小实蝇卵去壳前后的孵化率和感染率。采用如背景技术中所述的现有技术共注射5753个桔小实蝇卵，孵化得到192个幼虫，孵化率为3.34％；羽化得到179个桔小实蝇，经检测只有14个阳性感染桔小实蝇，感染率7.82％。采用本发明改进后的桔小实蝇卵的显微注射方法进行注射，共注射1963个桔小实蝇去壳卵，孵化得到398个幼虫，孵化率为20.3％；羽化得到381个桔小实蝇，经检测有135个阳性感染桔小实蝇，感染率35.4％。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (8)
1.一种桔小实蝇卵的显微注射方法，其特征在于，包括以下步骤：
(B1)用将放有桔小实蝇卵的黑色纱布固定在离心管的管口，倒扣离心管将桔小实蝇卵在体积浓度1.5-2％的次氯酸钠溶液中浸泡，轻轻晃动离心管使桔小实蝇卵充分接触次氯酸钠溶液；
(B2)将处理过的去壳卵用纯水洗涤，期间轻轻晃动，将次氯酸钠溶液尽量洗涤干净；将处理好的去壳卵挑取到覆盖湿润滤纸的培养皿中；
(B3)先准备好粘着有双面胶的玻片；在解剖镜下将桔小实蝇去壳卵依序横向排序在厚滤纸上，翻转粘着双面胶的玻片，将排列好的桔小实蝇去壳卵转移到双面胶上，用镊子的背部轻轻滑过玻片，从而转移桔小实蝇去壳卵到玻片上，并将去壳卵在干燥剂中干燥8-12min，随后用水饱和油覆盖去壳卵表面，防止进一步干燥；
(B4)进行显微注射，完毕，保留注射过的桔小实蝇去壳卵。
2.根据权利要求1所述的桔小实蝇卵的显微注射方法，其特征在于，还包括(B5)保持覆盖卵的水饱和油充足，将玻片放置在有湿润滤纸的培养皿中，置于桔小实蝇孵化环境中。
3.根据权利要求1所述的桔小实蝇卵的显微注射方法，其特征在于，步骤(B1)中，将桔小实蝇卵在体积浓度1.5-2％的次氯酸钠溶液中浸泡1-2min，轻轻晃动离心管使桔小实蝇卵充分接触次氯酸钠溶液。
4.根据权利要求3所述的桔小实蝇卵的显微注射方法，其特征在于，所述次氯酸钠溶液的体积浓度为1.8％。
5.根据权利要求1所述的桔小实蝇卵的显微注射方法，其特征在于，步骤(B2)中，用纯水洗涤去壳卵5-7次，转移桔小实蝇去壳卵到贴有双面胶的玻片上，将去壳卵在干燥剂中干燥10min。
6.根据权利要求1-5任一项所述的桔小实蝇卵的显微注射方法，其特征在于，所述放有桔小实蝇卵的黑色纱布中的桔小实蝇卵，是通过以下方法采集得到的，所述方法包括以下步骤：
在管壁打孔的离心管中加入橙汁，不断摇晃使橙汁充分接触离心管内壁然后将其放入能产卵的桔小实蝇饲养笼中，放置15-35min，桔小实蝇在离心管产卵，得到产卵管；
取出产卵管，用清水冲洗将离心管内壁的卵收集到黑色纱布上。
7.根据权利要求6所述的桔小实蝇卵的显微注射方法，其特征在于，所述离心管为50ml，加入过滤果肉的橙汁10±1ml。
8.根据权利要求6或7所述的桔小实蝇卵的显微注射方法，其特征在于，放置时间为20-30min。
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