CN107460219A - 一种差异核酸酶切方法及其在LC‑MS法检测mRNA内部修饰中的应用 - Google Patents

一种差异核酸酶切方法及其在LC‑MS法检测mRNA内部修饰中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种差异核酸酶切方法及其在LC‑MS法检测mRNA内部修饰中的应用。本发明利用S1核酸酶和磷酸二酯酶I对mRNA的5’端帽子结构的酶切具有差异性的特点，使用S1核酸酶和磷酸二酯酶I分别将mRNA酶解为核苷后进行LC‑MS检测分析，结合这两种酶酶解的检测结果可以区分出mRNA帽子和mRNA内部的N 7‑甲基鸟嘌呤核苷 (m7G)，从而实现对mRNA内部的m7G进行定性和定量分析。该方法灵敏度高、选择性高，可以定量检测真核生物mRNA内部的m7G含量，可以应用在分析mRNA内部m7G相关功能的研究。

Description

一种差异核酸酶切方法及其在LC-MS法检测mRNA内部修饰中 的应用
技术领域
本发明涉及一种差异核酸酶切结合LC-MS的方法及其在mRNA上修饰核苷分析中的应用。
背景技术
RNA修饰指的是在RNA碱基A\T\C\G\U以及核糖上的修饰。目前已发现 RNA存在超过上百种的核苷修饰以及数以千计的修饰位点，它们大多存在于 rRNA和tRNA中并影响着RNA的形成，结构以及功能。近来研究发现mRNA 上也存在有核苷修饰，并且这些修饰是动态变化的，它们影响着基因的表达，是在DNA修饰之外生物体调控基因表达的另一条新途径。N7-甲基鸟嘌呤核苷 (m7G)是真核生物mRNA上一种特殊的修饰，因为它构成了真核生物mRNA5’端特殊的帽子结构。该m7G的帽子结构对真核细胞的生长来说是必需的，因为它在维持mRNA的稳定，促进mRNA的成熟与降解，推动mRNA的出核以及促进翻译方面都具有至关重要的作用。然而，m7G是否存在于除5’端以外的 mRNA内部还未有报道。
G的7位N上被甲基化形成m7G并且携带一个正电荷，早前研究发现m7G 携带正电会影响tRNA的碱基配对从而改变tRNA的高级结构。此外，m7G还具有招募特异性结合蛋白的功能，从而影响多种RNA功能。根据m7G的特殊化学性质和越来越多的修饰被发现存在于mRNA中，我们有理由相信m7G存在于除 5’端以外的mRNA内部(图1)。然而，由于缺乏适当的分析方法，这一猜测目前仍没有被证实。传统的酶解方法将RNA酶解为核苷后可用各种手段进行分析修饰核苷，例如薄层色谱、毛细管电泳和质谱等。然而这些方法都没法将mRNA5’端的m7G和内部的m7G区分开，因此若要探究mRNA内部是否存在m7G需要发展一种新的、能够区分5’端和内部m7G的高选择性、高灵敏度、准确的检测方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种能用于检测mRNA内部m7G修饰核苷的结合差异核酸酶切策略的具有高灵敏度和高选择性的LC-MS分析方法(图2)。所述的差异核酸酶切方法中S1核酸酶和磷酸二酯酶I对mRNA5’端帽子结构的酶切效率具有巨大差异性，磷酸二酯酶I对5’端的帽子结构的平均酶切效率为99.3％，S1核酸酶对5’端的帽子结构的平均酶切效率仅为1.9％。(图3)
本发明提供的技术方案具体如下：
第一方面，提供一种差异核酸酶切的方法，包括以下步骤：
(1)首先提取生物样品的总RNA，再从总RNA中分离纯化出mRNA；
(2)分别使用S1核酸酶和磷酸二酯酶I将同一个样品的mRNA酶解为核苷酸；
(3)通过碱性磷酸酶将核苷酸酶解为核苷，再通过两次氯仿抽提蛋白后，收集的上清，冷冻旋干，纯化得到核苷。
优选地，步骤(1)利用mRNA Isolation System试剂盒从总RNA 中分离纯化出mRNA。
优选地，步骤(2)的S1核酸酶的酶解条件为：取1μg的mRNA溶于8.5μL 水中，加入1μL的10×S1核酸酶缓冲液，充分涡旋混匀后放置到95℃水浴中加热5min，然后迅速置于0℃冰水浴中2min；加入90U(0.5μL)的S1核酸酶，反应总体积为10μL，轻弹混匀后置于37℃水浴中温浴1h；
步骤(2)的磷酸二酯酶I的酶解条件为：取1μg的mRNA溶于7μL水中，加入1μL的10×碱性磷酸酶缓冲液，充分涡旋混匀后置于95℃水浴中加热5 min，迅速置于0℃冰水浴中2min；加入0.002U(2μL)的磷酸二酯酶I，反应总体积为10μL，轻弹混匀后置于37℃水浴中温浴1h。
优选地，步骤(3)得到核苷的步骤具体为：向上述S1核酸酶酶解体系中加入4μL的10×碱性磷酸酶缓冲液，向上述磷酸二酯酶I的酶解体系中加3μL 的10×碱性磷酸酶缓冲液，再分别加入9U(0.3μL)的碱性磷酸酶，加水将反应体系总体积补齐到40μL，轻弹混匀后在37℃水浴中温浴30min；反应结束后，加入160μL水，再加入200μL三氯甲烷，充分涡旋混合3min，12000rpm 离心8min，取上层清液，再加入200μL三氯甲烷，重复涡旋、离心和取上清液过程以除去样品中的蛋白质，收集的上清液使用冷冻旋干仪干燥。
第二方面，所述的差异核酸酶切策略结合LC-MS的分析方法在修饰核苷分析领域中的应用：干燥后的样品复溶于水中后直接进行反相液相色谱-电喷雾质谱分析，采用正离子模式。
优选地，所述的差异核酸酶切策略结合LC-MS的分析方法在修饰核苷分析领域中的应用：修饰核苷分析是指mRNA内部m7G的含量计算：
Pm7G＝Capm7G+Internalm7G (1)
Sm7G＝1.9％*Capm7G+Internalm7G (2)
公式中Pm7G表示磷酸二酯酶I酶解得到的测量值，S m7G表示S1核酸酶酶解得到的测量值，由公式(1)和公式(2)推出mRNA内部的m7G含量Internalm7G＝ (Sm7G-1.9％*Pm7G)/98.1％；还可以推出mRNA5’端帽子结构的m7G含量Capm7G＝ Pm7G-Internalm7G。
本发明的有益效果如下：
1.本发明中，方法操作简便，mRNA酶解后直接进行LC-MS分析。
2.本发明利用S1核酸酶和磷酸二酯酶I对mRNA5’端帽子结构酶切效率的巨大差异，可以将5’端帽子结构的m7G和内部的m7G进行区分，实现对mRNA 内部m7G的检测分析。
3.本发明涉及到的酶类均可通过商品化购买获得。
4.本发明的酶解方法适用于分析各种真核生物的mRNA内部的m7G。
5.本发明为进一步对mRNA内部m7G的精确定位研究打下基础。
附图说明
图1为本发明研究细胞mRNA内部m7G修饰核苷。
图2为本发明中S1核酸酶和磷酸二酯酶I差异酶解mRNA的示意图。
图3为本发明中S1核酸酶和磷酸二酯酶I对mRNA的5’端帽子结构的酶切效率。
图4为本发明中S1核酸酶酶解、磷酸二酯酶I酶解与其它酶解方法的酶解效率对比图。
图5为本发明中S1核酸酶酶解、磷酸二酯酶I酶解水稻mRNA得到的m7G与标品对比的提取离子色谱图。
图6为本发明中S1核酸酶酶解、磷酸二酯酶I酶解水稻mRNA得到的m7G与标品对比的高分辨质谱图。
图7为本发明中所建立的差异核酸酶解的方法用于实际样品HeLa细胞、MCF-7 细胞、293T细胞、大鼠肝脏组织和水稻样品mRNA中m7G的准确定量分析。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段包括核酸的提取为本领域技术人员所熟知的常规手段。LC-MS法中所用质谱仪为Applied Biosystems公司的AB 3200QTRAP massspectrometer(Foster City,美国)，使用电喷雾离子源(Turbo Ionspray)。液相色谱为Shimadzu LC-20AD HPLC(Tokyo,日本)，装配有LC-20AD 二元高压梯度泵、SIL-20A自动进样器、CTO-20AC恒温柱温箱和DGU-20A3脱气机。使用C18反相色谱柱(Inersil ODS-3column,2.1×250mm i.d.,5μm,GL Sciences,Inc.Japan)进行化合物分离，柱温控制在35℃。流动相溶剂A为2mM 碳酸氢铵的水溶液，用乙酸调节pH至6.8，使用前需经过0.45μm的水系微孔滤膜(天津腾津,Tianjin,China)过滤。流动相溶剂B为甲醇。流动相的流速为0.2mL/min。流动相洗脱梯度如下：0-5min，5％B；5-25min，5％B-80％B；25-28min， 80％B；28-30min，80％-5％B；30-40min，5％B。质谱检测在正离子模式下进行，采用MRM模式监测。
实施例1：S1核酸酶酶解、磷酸二酯酶I酶解对mRNA的5’端帽子结构的酶切效率
使用mMESSAGET7Kit试剂盒以具有T7启动子的双链DNA 为模板进行带5’端m7G帽状结构的RNA的体外转录，该RNA的5’端与真核生物mRNA相同，且转录出的每条RNA只在5’端含有一个m7G。分别使用S1核酸酶、磷酸二酯酶I将该RNA酶解为核苷酸，再使用碱性磷酸酶将核苷酸酶解为核苷，除蛋白后冷冻旋转干燥，复溶于65μL水中，进样50μL，用LC-MS 分析。可计算出S1核酸酶酶解、磷酸二酯酶I酶解对mRNA的5’端帽子结构的酶切效率，结果见图3，S1核酸酶和磷酸二酯酶I对mRNA5’端帽子结构的酶切效率具有巨大差异性，磷酸二酯酶I对5’端的帽子结构的平均酶切效率为99.3％， S1核酸酶对5’端的帽子结构的平均酶切效率仅为1.9％。
实施例2：S1核酸酶酶解、磷酸二酯酶I酶解与其它酶解方法的酶解效率对比
分别使用S1核酸酶、磷酸二酯酶I、常规酶解(S1核酸酶与磷酸二酯酶I 共用)、核酸外切酶T、核酸外切酶I和T4DNA聚合酶将同样含量的mRNA酶解为核苷酸，再使用碱性磷酸酶将核苷酸酶解为核苷，除蛋白后冷冻旋转干燥，复溶于65μL水中，进样50μL，用LC-MS分析。对比不同酶解方法所得正常核苷(A、G、C、U)的峰面积，结果见图4。
实施例3：m7G标准品与水稻样品中mRNA内部m7G的色谱保留时间对比
使用TRIzol试剂提取水稻样品的总RNA，再利用mRNA IsolationSystem试剂盒从水稻总RNA中分离纯化出mRNA。分别用S1核酸酶和磷酸二酯酶I将mRNA酶解为核苷酸后，使用碱性磷酸酶将核苷酸酶解为核苷，除蛋白后冷冻旋转干燥，复溶于65μL水中。利用LC-MS分析m7G标准品、 S1核酸酶酶解产物和磷酸二酯酶I酶解产物。对比m7G标准品、S1核酸酶酶解产物和磷酸二酯酶I酶解产物的提取离子色谱图，结果见图5。
实施例4：m7G标准品与水稻样品中mRNA内部m7G的高分辨质谱图对比
使用TRIzol试剂提取水稻样品的总RNA，再利用mRNA IsolationSystem试剂盒从水稻总RNA中分离纯化出mRNA。分别用S1核酸酶和磷酸二酯酶I将mRNA酶解为核苷酸后，使用碱性磷酸酶将核苷酸酶解为核苷，除蛋白后冷冻旋转干燥，复溶于65μL水中。利用LC-HRMS分析m7G标准品、S1核酸酶酶解产物和磷酸二酯酶I酶解产物。LC-HRMS方法所用系统由 LTQ-Orbitrap Elite(Thermo-Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)质谱仪和 UltiMate 3000UHPLC(Thermo-Dionex)液相色谱仪组成，实验采用MS/MS分析，正离子模式，分辨率为60,000，CID能量设置为12％。离子源和质量传输管的参数设置如下：加热器温度，300℃；毛细管温度，350℃；鞘气流量，35arb；辅助气流量，15arb；喷雾电压，3.5kV；毛细管电压，35V；S-lens射频水平， 50％。液相方法与LC-MS法相同。结果见图6。
实施例5：哺乳动物细胞中mRNA内部m7G含量的分析
使用试剂盒E.Z.N.A.HP Total RNA Kit提取293T、HeLa以及MCF-7细胞的总RNA，再利用mRNA Isolation System试剂盒从以上哺乳动物细胞的总RNA中分离纯化出各自的mRNA。分别用S1核酸酶和磷酸二酯酶I 将mRNA酶解为核苷酸后，使用碱性磷酸酶将核苷酸酶解为核苷，除蛋白后冷冻旋转干燥，复溶于65μL水中，进样50μL，用LC-MS分析。结果见图7。
实施例6：大鼠肝脏组织中mRNA内部m7G含量的分析
使用试剂盒E.Z.N.A.Tissue RNA Kit提取大鼠肝脏组织的总RNA，再利用mRNA Isolation System试剂盒从大鼠肝脏组织总RNA中分离纯化出mRNA。分别用S1核酸酶和磷酸二酯酶I将mRNA酶解为核苷酸后，使用碱性磷酸酶将核苷酸酶解为核苷，除蛋白后冷冻旋转干燥，复溶于65μL水中，进样50μL，用LC-MS分析。结果见图7。
实施例7：植物水稻样品中mRNA内部m7G含量的分析
使用TRIzol试剂提取水稻样品的总RNA，再利用mRNA IsolationSystem试剂盒从水稻总RNA中分离纯化出mRNA。分别用S1核酸酶和磷酸二酯酶I将mRNA酶解为核苷酸后，使用碱性磷酸酶将核苷酸酶解为核苷，除蛋白后冷冻旋转干燥，复溶于65μL水中，进样50μL，用LC-MS分析。结果见图7。

Claims (7)

1.一种差异核酸酶切的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)首先提取生物样品的总RNA，再从总RNA中分离纯化出mRNA；
(2)分别使用S1核酸酶和磷酸二酯酶I将同一个样品的mRNA酶解为核苷酸；
(3)通过碱性磷酸酶将核苷酸酶解为核苷，再通过两次氯仿抽提蛋白后，收集的上清冷冻旋干，纯化得到核苷。
2.根据权利要求1所述的差异核酸酶切的方法，其特征在于，步骤(1)利用mRNA Isolation System试剂盒从总RNA中分离纯化出mRNA。
3.根据权利要求1所述的差异核酸酶切的方法，其特征在于，步骤(2)的S1核酸酶的酶解条件为：取1μg的mRNA溶于8.5μL水中，加入1μL的10×S1核酸酶缓冲液，充分涡旋混匀后放置到95℃水浴中加热5min，然后迅速置于0℃冰水浴中2min；加入0.5μL 90U的S1核酸酶，反应总体积为10μL，轻弹混匀后置于37℃水浴中温浴1h；
步骤(2)的磷酸二酯酶I的酶解条件为：取1μg的mRNA溶于7μL水中，加入1μL的10×碱性磷酸酶缓冲液，充分涡旋混匀后置于95℃水浴中加热5min，迅速置于0℃冰水浴中2min；加入2μL 0.002U的磷酸二酯酶I，反应总体积为10μL，轻弹混匀后置于37℃水浴中温浴1h。
4.根据权利要求1所述的差异核酸酶切的方法，其特征在于，步骤(3)得到核苷的步骤具体为：向上述S1核酸酶酶解体系中加入4μL的10×碱性磷酸酶缓冲液，向上述磷酸二酯酶I的酶解体系中加3μL的10×碱性磷酸酶缓冲液，再分别加入0.3μL 9U的碱性磷酸酶，加水将反应体系总体积补齐到40μL，轻弹混匀后在37℃水浴中温浴30min；反应结束后，加入160μL水，再加入200μL三氯甲烷，充分涡旋混合3min，12000rpm离心8min，取上层清液，再加入200μL三氯甲烷，重复涡旋、离心和取上清液过程以除去样品中的蛋白质，收集的上清液使用冷冻旋干仪干燥。
5.权利要求1所述的差异核酸酶切的方法，其特征在于，干燥后的样品复溶于水中后，直接进行反相液相色谱-电喷雾质谱分析，采用正离子模式。
6.权利要求1-5任一项所述的差异核酸酶切的方法在修饰核苷分析领域中的应用。
7.权利要求6所述的差异核酸酶切的方法在修饰核苷分析领域中的应用，其特征在于，修饰核苷分析是指mRNA内部m7G的含量计算：
Pm7G＝Capm7G+Internalm7G (1)
Sm7G＝1.9％*Capm7G+Internalm7G (2)
公式中Pm7G表示磷酸二酯酶I酶解得到的测量值，S m7G表示S1核酸酶酶解得到的测量值；由公式(1)和公式(2)推出mRNA内部的m7G含量Internalm7G＝(Sm7G-1.9％*Pm7G)/98.1％；还可以推出mRNA5’端帽子结构的m7G含量Capm7G＝Pm7G-Internalm7G。
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CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20200410

Termination date: 20210724

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