CN107449745A - 一种水中过氧化氢浓度的可见分光光度测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水中过氧化氢浓度的可见分光光度测定方法，是以过氧化氢酶催化过氧化氢，以2'‑联氨‑双‑3‑乙基苯并噻唑啉‑6‑磺酸为指示剂，通过浓度梯度的标准样反应后吸光度的测试，拟合得到过氧化氢浓度相对于吸光度的标准曲线及线性回归方程，然后通过测定待测样品相同反应后的吸光度即可得知相应的过氧化氢浓度，是一种操作简便、准确灵敏、绿色环保、经济实用的仅需使用可见分光光度计即可在实验室和现场快速检测样品中过氧化氢含量的方法。本发明方法可广泛用于环保、日化及医疗行业中，对各种经氧化、漂白或消毒的样品、雨水以及特定芬顿体系中过氧化氢残余含量进行快速而准确的检测。

Description

一种水中过氧化氢浓度的可见分光光度测定方法
技术领域
本发明涉及一种水中过氧化氢的快速测定方法，具体涉及一种以过氧化氢酶为催化剂、以2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸为指示剂快速测定水中过氧化氢浓度的可见分光光度法。
背景技术
由于具有较强的氧化能力以及绿色环保的特点，过氧化氢在环保、日化、食品、医疗以及印染行业中，被广泛的用作氧化剂、消毒剂、灭菌剂以及漂白剂。此外，过氧化氢还可以被过渡金属离子、金属氧化物、微波辐射以及紫外线辐射等活化产生具有更强氧化能力的羟基自由基(E0＝1.8-2.7V)，被广泛用于环保领域，尤其水处理领域中去除难降解有机污染物以及灭活致病微生物。在使用过氧化氢过程中，往往会伴随着氧化剂的分解以及残余。据报道，人体中残余的过氧化氢会消耗抗氧化物质使得人体加速衰老；长期接触或误食低浓度的残余过氧化氢会导致人体遗传物质损伤以及基因突变，甚至诱发癌症。因此，在过氧化氢的使用过程中，需要监测过氧化氢残余量的变化。
目前，过氧化氢含量的测定方法主要有滴定法、化学发光法、色谱法、分光光度法、试纸比色法、电流分析法等。滴定法中主要有碘量法和高锰酸钾法，该方法灵敏度高、测定结果准确，但也存在操作复杂、干扰因素多等不足。色谱法具有专一性强、准确度高、抗干扰能力强等优点，如专利ZL 201310745895.7，然而色谱法需要使用昂贵的色谱仪，导致测定成本高昂。化学发光法具有灵敏度高、检出限低、测定结果准确等优点，但同样存在测定时间长、测定成本高等不足之处。紫外可见分光光度法测定结果可靠、测定速度快、操作相对简便，如专利ZL 201310745891.9和ZL 201410034574.0，但也存在反应时间较长、反应试剂有毒易造成环境污染等不足之处，试纸比色法具有操作简便、测定速度快等优点，如专利ZL201310337923.1，但也存在试纸制备成本较高、测定结果准确性较差、灵敏度较低等不足之处。电流分析法测定结果准确可靠、灵敏度高，如专利ZL 200780034519.X，但同样存在着测定成本高昂、测定所需时间长、抗干扰能力差等不足之处。
发明内容
本发明为了解决现有过氧化氢测定方法存在的操作复杂繁琐、测定结果误差大、测定时间长、反应试剂有毒以及测定成本高昂等问题，提出了一种水中过氧化氢浓度的可见分光光度测定方法。
本发明的一种水中过氧化氢浓度的可见分光光度测定方法，它包括以下步骤：
一种水中过氧化氢浓度的可见分光光度测定方法，包括以下步骤：
步骤一：制作标准曲线：将过氧化氢酶溶液和2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶液加入缓冲溶液中得混合溶液A，测定混合溶液A在特定吸收波长处的吸光度值，并校零；分别向若干混合溶液A中加入相同体积不同浓度的过氧化氢标准溶液形成若干混合溶液B，使该些混合溶液B形成过氧化氢的浓度梯度；对各混合溶液B进行氧化显色反应一段时间后，测定显色后各混合溶液B在所述特定吸收波长处的吸光度值，记为b；以b作为横坐标，以混合溶液B中过氧化氢的浓度作为纵坐标，建立标准曲线及其线性回归方程；其中，所述过氧化氢酶溶液活度为12500～500000units L-1，所述2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶液浓度为1～10mmol L-1；所述过氧化氢酶溶液、2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶液、过氧化氢标准溶液的加入量与混合溶液B的体积比为0.002～0.04:0.01～0.1:0.02～0.1:1；
步骤二：测定样品中过氧化氢含量：向所述混合溶液A中加入与所述过氧化氢标准溶液加入量相同的待测过氧化氢样品形成混合溶液C，反应一段时间后，测定显色后混合溶液C在所述特定吸收波长处的吸光度值，记为c；将c值代入到步骤一中所得标准曲线的线性回归方程中，再通过所加入的待测过氧化氢样品与混合溶液C的体积关系计算得出待测样品中过氧化氢的含量。
可选的，所述缓冲溶液是醋酸缓冲溶液、磷酸缓冲溶液或硼酸缓冲溶液，pH值为5～9。
可选的，所述氧化显色反应温度为0～35℃。
可选的，所述氧化显色反应时间为15～45秒。
可选的，所述特定吸收波长为415nm、650nm、732nm或820nm。
可选的，步骤一中，所述过氧化氢的浓度梯度是指使过氧化氢于混合溶液B中的浓度至少包括0、5、10、20、30及40μmol L-1。
本发明包括以下有益效果：
本发明与现有测定方法相比，利用过氧化氢酶催化过氧化氢快速氧化2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸生成绿色自由基来测定水中过氧化氢浓度，即在含有过氧化氢酶、过氧化氢以及2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸的反应液中，过氧化氢酶与过氧化氢首先快速反应生成中间产物，然后2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸与生成的中间产物快速反应生成绿色物质2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸自由基，再依据2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸自由基在特定吸收波长处的吸光度值来测定水中过氧化氢浓度。
本发明方法简单易行，不需要再额外进行紫外辐照、微波辐照、电子束辐照、超声空化、曝气、外加电磁场及加热；与传统碘量法相比，本发明测定时间由30～45分钟缩短至仅需15～45秒；与高锰酸钾滴定法相比，本发明具有操作简便、结果可靠、受其他离子以及有机物影响小的特点；与化学发光法相比，本发明使用的药剂廉价易获取、测定时间短；与色谱法相比，本发明使用仪器相对廉价；与基于偶氮染料褪色的紫外可见分光光度法相比，本发明具有绿色环保的优点，测定过程中投加的过氧化氢酶、2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸及产物均为对环境友好的化学物质；与利用过氧化氢酶—N,N-二乙基对苯二胺试纸比色法相比，本发明具有实验药品廉价、易保存、易配置、易获取、灵敏度高等特点；与电流分析法相比，本发明具有操作简便、测试时间短、测试成本低等特点。
此外，本发明不需要昂贵仪器设备及试剂，仅需一台价格低廉的可见分光光度计即可满足测定要求，降低了测定成本。本发明方法可广泛用于环保、日化及医疗行业中，对各种经氧化、漂白或消毒的样品中过氧化氢含量进行快速、简单、准确的检测。
以下结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但本发明不局限于实施例。
附图说明
图1为实施例1的标准曲线图；
图2为实施例2的标准曲线图。
具体实施方式
实施例1：
本实施例的一种水中过氧化氢浓度的可见分光光度测定方法，它是按以下步骤进行：
步骤一：制作标准曲线：
1、将0.05mL的过氧化氢酶母液和0.1mL的2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸硫酸盐母液加入至2.3mL的磷酸缓冲溶液中，得混合溶液A，测定混合溶液A在415nm处的吸光度值，并校零；
2、分别向混合溶液A中加入0.05mL不同浓度梯度的过氧化氢标准溶液形成混合溶液B，总反应体积为2.5mL；
3、常温反应30秒后，测定反应后混合溶液B在415nm处的吸光度值，记为b；
4、以b作为横坐标，以过氧化氢在混合溶液B中的最终浓度作为纵坐标，建立标准曲线及其线性回归方程；
说明：
其中，磷酸缓冲溶液浓度为50mmol L-1，过氧化氢酶母液的浓度为125000units L-1，2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸硫酸盐母液浓度为2.5mmol L-1；过氧化氢酶溶液、2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸硫酸盐溶液与混合溶液B的体积比为0.02:0.04:1；所述的不同浓度梯度是指过氧化氢在混合溶液B中的浓度分别为0、5、10、20、30及40μmol L-1。
步骤二：测定样品中过氧化氢含量：
1、将0.05mL的过氧化氢酶母液和0.1mL的2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸硫酸盐母液加入到2.3mL的磷酸缓冲溶液中，得混合溶液A，测定混合溶液A在415nm处的吸光度值，并校零；
2、向混合溶液A中加入0.05mL的已知过氧化氢浓度为1000μmol L-1的水样，得到混合溶液C，常温反应15秒后，测定显色后混合溶液C在415nm处的吸光度值，记为c；
3、将c值代入到步骤一中所得标准曲线的线性回归方程中，计算得出水样中过氧化氢的含量。
本实施例所得的标准曲线如图1所示，所得线性回归公式如下：
[过氧化氢]反应＝A415÷0.0623
因此，水样中过氧化氢浓度计算公式如下：
[过氧化氢]样品＝V总÷V样品×[过氧化氢]反应
＝2.5÷0.05×(A415÷0.0623)
本实施例测得的A415为1.259，代入上述公式中计算得出水样中过氧化氢浓度为1010μmol L-1，测定偏差为1.00％，说明本测定方法准确可靠。
实施例2
本实施例的初期雨水中过氧化氢浓度的快速测定方法，它是按以下步骤进行：
步骤一：制作标准曲线：
1、将0.05mL过氧化氢酶母液和0.1mL 2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸硫酸盐母液加入1.65mL的磷酸缓冲溶液中，得混合溶液A，测定混合溶液A在732nm处的吸光度值，并校零；
2、分别向混合溶液A中加入0.05mL的不同浓度梯度的过氧化氢标准溶液形成混合溶液B，总反应体积为3.2mL；
3、常温反应15秒后，测定显色后混合溶液B在732nm处的吸光度值，记为a；
4、以a作为横坐标，以过氧化氢在混合溶液B中的最终浓度作为纵坐标，建立标准曲线及其线性回归方程；
说明：
其中，磷酸缓冲溶液浓度为100mmol L-1，过氧化氢酶母液的活度为125000unitsL-1，2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸硫酸盐母液浓度为2.5mmol L-1；过氧化氢酶溶液、2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸硫酸盐溶液与混合溶液B的体积比为0.02:0.03:1；所述的不同浓度梯度是指过氧化氢在混合溶液B中的浓度分别为0、5、10、20、30及40μmol L-1。
步骤二：测定初期雨水中过氧化氢含量：
1、将0.05mL的过氧化氢酶母液和0.1mL的2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸硫酸盐母液加入到1.65mL的磷酸缓冲溶液中，得混合溶液A，测定混合溶液A在732nm处的吸光度值，并校零；
2、向混合溶液A中加入1.35mL初期雨水水样形成混合溶液C，常温反应15秒后，测定显色后混合溶液C在732nm处的吸光度值，记为c；
3、将c值代入到步骤一中所得标准曲线的线性回归方程中，计算得出水样中过氧化氢浓度。
本实施例所得标准曲线如图2所示，所得线性回归公式如下：
[过氧化氢]反应＝A732÷0.0292
因此，水样中过氧化氢计算公式如下：
[过氧化氢]样品＝V总÷V样品×[过氧化氢]反应
＝3.2÷1.35×(A732÷0.0292)
本实施例测得的A732为0.688，代入上述公式中计算得出水样中过氧化氢含量为55.88μmol L-1。
本领域普通技术人员可知，本发明的具体参数和组分在下述范围内变化时，仍能够得到与上述实施例相同或相近的技术效果：
一种水中过氧化氢浓度的可见分光光度测定方法，包括以下步骤：
步骤一：制作标准曲线：将过氧化氢酶溶液和2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶液加入缓冲溶液中得混合溶液A，测定混合溶液A在特定吸收波长处的吸光度值，并校零；分别向若干混合溶液A中加入相同体积不同浓度的过氧化氢标准溶液形成若干混合溶液B，使该些混合溶液B形成过氧化氢的浓度梯度；对各混合溶液B进行氧化显色反应一段时间后，测定显色后各混合溶液B在所述特定吸收波长处的吸光度值，记为b；以b作为横坐标，以混合溶液B中过氧化氢的浓度作为纵坐标，建立标准曲线及其线性回归方程；其中，所述过氧化氢酶溶液浓度为12500～500000units L-1，所述2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶液浓度为1～10mmol L-1；所述过氧化氢酶溶液、2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶液、过氧化氢标准溶液的加入量与混合溶液B的体积比为0.002～0.04:0.01～0.1:0.02～0.1:1；所述缓冲溶液是醋酸缓冲溶液、磷酸缓冲溶液或硼酸缓冲溶液，pH值为5～9；所述氧化显色反应温度为0～35℃，时间为15～45秒；特定吸收波长为415nm、650nm、732nm或820nm。
步骤二：测定样品中过氧化氢含量：向所述混合溶液A中加入与所述过氧化氢标准溶液加入量相同的待测过氧化氢样品形成混合溶液C，反应与步骤1相同时间后，测定显色后混合溶液C在所述特定吸收波长处的吸光度值，记为c；将c值代入到步骤一中所得标准曲线的线性回归方程中，再通过所加入的待测过氧化氢样品与混合溶液C的体积关系计算得出待测样品中过氧化氢的含量。
此外，通过调整测试混合溶液中过氧化氢酶溶液浓度、2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸的浓度以及过氧化氢样品与混合溶液的体积关系，可以得到一个较宽的检测范围，以适用于较高浓度或较低浓度等不同目标物的检测，检测精度较高。
上述实施例利用过氧化氢酶催化过氧化氢快速氧化2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸硫酸盐生成绿色自由基，方法简单易行，不需要再额外进行紫外辐照、微波辐照、电子束辐照、超声空化、曝气、外加电磁场及加热，测定时间短，测定结果误差小，投加的过氧化氢酶、2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸硫酸盐及它们的反应产物均为对环境友好的化学物质，不需要昂贵仪器设备及试剂，仅需一台价格低廉的可见分光光度计即可满足测定要求，降低了成本。测定方法可广泛用于环保、印染及医疗行业中，对各种经氧化、漂白或消毒的样品中过氧化氢含量进行快速、环保、有效的检测。
上述实施例仅用来进一步说明本发明的一种水中过氧化氢浓度的可见分光光度测定方法，但本发明并不局限于实施例，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均落入本发明技术方案的保护范围内。

Claims (6)

1.一种水中过氧化氢浓度的可见分光光度测定方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一：制作标准曲线：将过氧化氢酶溶液和2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶液加入缓冲溶液中得混合溶液A，测定混合溶液A在特定吸收波长处的吸光度值，并校零；分别向若干混合溶液A中加入相同体积不同浓度的过氧化氢标准溶液形成若干混合溶液B，使该些混合溶液B形成过氧化氢的浓度梯度；对各混合溶液B进行氧化显色反应一段时间后，测定显色后各混合溶液B在所述特定吸收波长处的吸光度值，记为b；以b作为横坐标，以混合溶液B中过氧化氢的浓度作为纵坐标，建立标准曲线及其线性回归方程；其中，所述过氧化氢酶溶液活度为12500～500000units L-1，所述2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶液浓度为1～10mmol L-1；所述过氧化氢酶溶液、2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶液、过氧化氢标准溶液的加入量与混合溶液B的体积比为0.002～0.04:0.01～0.1:0.02～0.1:1；
步骤二：测定样品中过氧化氢含量：向所述混合溶液A中加入与所述过氧化氢标准溶液加入量相同的待测过氧化氢样品形成混合溶液C，反应一段时间后，测定显色后混合溶液C在所述特定吸收波长处的吸光度值，记为c；将c值代入到步骤一中所得标准曲线的线性回归方程中，再通过所加入的待测过氧化氢样品与混合溶液C的体积关系计算得出待测样品中过氧化氢的含量。
2.根据权利要求1所述的水中过氧化氢浓度的可见分光光度测定方法，其特征在于：所述缓冲溶液是醋酸缓冲溶液、磷酸缓冲溶液或硼酸缓冲溶液，pH值为5～9。
3.根据权利要求1所述的水中过氧化氢浓度的可见分光光度测定方法，其特征在于：所述氧化显色反应温度为0～35℃。
4.根据权利要求1所述的水中过氧化氢浓度的可见分光光度测定方法，其特征在于：所述氧化显色反应时间为15～45秒。
5.根据权利要求1所述的水中过氧化氢浓度的可见分光光度测定方法，其特征在于：所述特定吸收波长为415nm、650nm、732nm或820nm。
6.根据权利要求1所述的水中过氧化氢浓度的可见分光光度测定方法，其特征在于：步骤一中，所述过氧化氢的浓度梯度是指使过氧化氢于混合溶液B中的浓度至少包括0、5、10、20、30及40μmol L-1。
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