CN107446935B - 与鳢肠抗药性相关的基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与鳢肠抗药性相关的分子标记及其应用，该分子标记是核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的LC‑ALS基因编码的SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第176位氨基酸的密码子发生CCC‑TCC碱基突变。本发明还提供了用于检测该分子标记的特异性引物和方法，所述特异性引物对的序列如SEQ ID NO.3‑4和SEQ ID NO.5‑6所示，采用前述引物对能够实现对田间疑似抗ALS抑制剂鳢肠的快速鉴定和突变位点的确认，从而指导生产实践中抗性鳢肠的科学治理，具有良好的特异性和敏感性，方法准确可靠，操作简便。

Description

与鳢肠抗药性相关的基因及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及与鳢肠抗药性相关的基因LC-ALS，与鳢肠抗药性相关的SNP分子标记、以及检测LC-ALS基因的方法。
背景技术
乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase,简称ALS)，也称乙酰羟酸合酶(acetohydroxyacid synthase，简称AHAS)，是诱导植物和微生物体内缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成过程中关键性酶，也是一种重要的除草剂靶标。ALS抑制剂类除草剂的开发及使用始于上世纪80年代初，由于此类除草剂有超高活性、对人及动物低毒、环境友好等明显的优势，受到广泛关注，目前已有50多个品种被开发和使用。上世纪80年代开始，我国陆续在水稻田推广使用甲磺隆、吡嘧磺隆、苄嘧磺隆等。吡嘧磺隆、苄嘧磺隆作为水稻田最经济、有效的优秀除草剂，对控制鳢肠(Capsella bursa-pastoris)等阔叶杂草起到了非常重要的作用。但由于该类除草剂分子靶标单一，长期连续使用易引起杂草抗药性，近些年来，以常规剂量喷施吡嘧磺隆和苄嘧磺隆无法有效防除鳢肠的问题在我国江苏等地的一些水稻田非常突出。而在生产中由于农民对杂草抗药性的认识上的不足，盲目增大用药剂量，不仅增加了成本，使药害风险加大，严重影响农民收入和国家粮食安全。因此，目前迫切需要一个简便，快速的抗药性杂草检测鉴定方法。
我国抗药性杂草的研究起步较晚，传统的抗药性杂草检测通常采用室内生物测定法，既对田间采集的疑似抗性的杂草的种子在室内进行培养，在一定叶龄喷施除草剂后，调查株防效和地上部分生物量来计算抗性指数。这种方法能够客观地评价某种杂草对相应除草剂的抗性情况，但也有其局限性，主要表现在以下两方面：一是不能当季、当时进行检测，二是占地多、时间长、工作量大。
随着分子生物学技术在杂草抗药性机理研究方面的应用，越来越多的杂草的抗药性机理得到明确。目前已有的研究报道显示，对ALS抑制剂产生抗性的植物在其靶标酶ALS保守区共发现了8个SNP位点(http://www.weedscience.org/Mutations/MutationDisplayAll.aspx)，这些位点的任意一个位点氨基酸突变为其他氨基酸都使植物对相应除草剂产生抗性。这8个氨基酸位点目前公认以拟南芥ALS为标准标注位点，包括122、197、205、376、377、574、653、654位氨基酸。目前还没有关于鳢肠ALS抑制剂类除草剂产生抗性与ALS的保守区突变位点相关的报道。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种鳢肠抗药性相关的基因LC-ALS及其应用。
本发明的另一个目的是提供LC-ALS基因上与抗药性相关的SNP分子标记及其应用。
本发明提供的鳢肠抗药性相关的基因LC-ALS其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明提供了基因LC-ALS在检测抗药性鳢肠中的应用。
所述的抗药是指抗乙酰乳酸合酶抑制剂类药物。通常这类药物作为除草剂使用。
本发明提供了与鳢肠抗药性相关的SNP分子标记，该分子标记是核苷酸序列如SEQID No.1所示的LC-ALS基因编码的SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第176位氨基酸的密码子发生CCC-TCC碱基突变；所述抗药是指抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂。
需要指出的是，LC-ALS基因发生碱基突变，导致翻译的氨基酸的第176位发生变化，若以拟南芥ALS氨基酸顺序，则为第197位。
因此，本发明所述分子标记翻译的氨基酸序列，相对于拟南芥ALS氨基酸顺序来说，由于在编码第197位氨基酸的密码子发生CCC到TCC碱基突变，使得该位置氨基酸由Pro(脯氨酸)变为Ser(丝氨酸)。
本发明提供了上述SNP分子标记在治理田间杂草中的应用。
优选地，所述的杂草为鳢肠。
本发明提供了上述SNP分子标记在检测抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂植物中的应用。
优选地，所述的植物为鳢肠。
本发明提供了用于检测鳢肠LC-ALS基因的特异性引物对，包括：
引物对I：
正向LC-ALS-IF(69)：5'-CCCACCCTGCTTCATCCT-3'
反向LC-ALS-IR(1484)：5'-CCGAAACCCATCGCTCCT-3'；或引物对II：
正向LC-ALS-IIF(1142)：5'-GGAAGAATAAACAGCCCCAT-3'
反向LC-ALS-IIR(1988)：5'-AGCCTGCTTACAGAACACAC-3'。
引物对I的阳性扩增结果为1416bp大小的片段，引物对II的阳性扩增结果为847bp大小的片段。
另一方面，本发明提供了用于检测抗药性鳢肠的特异性引物对，包括：
引物对I：
正向引物LC-ALS-IF(69)：5'-CCCACCCTGCTTCATCCT-3'
反向引物LC-ALS-IR(1484)：5'-CCGAAACCCATCGCTCCT-3'；和引物对II：
正向LC-ALS-IIF(1142)：5'-GGAAGAATAAACAGCCCCAT-3'
反向LC-ALS-IIR(1988)：5'-AGCCTGCTTACAGAACACAC-3'。
本发明还提供了一种检测抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂鳢肠的方法，包括以下步骤：
(1)提取样品基因组DNA，以其为模板，利用2对特异性引物分别进行2次PCR扩增反应，获得大小分别为1416bp和847bp的扩增产物片段；
所述2对特异性引物为：
引物对I：
正向引物LC-ALS-IF(69)：5'-CCCACCCTGCTTCATCCT-3'
反向引物LC-ALS-IR(1484)：5'-CCGAAACCCATCGCTCCT-3'；
引物对II：
正向LC-ALS-IIF(1142)：5'-GGAAGAATAAACAGCCCCAT-3'
反向LC-ALS-IIR(1988)：5'-AGCCTGCTTACAGAACACAC-3'；
(2)对扩增产物片段测序，与野生型敏感鳢肠的基因序列进行对比，若1416bp片段编码的第78、153、161、332、333位氨基酸任一个位点发生突变，或847bp片段编码的第172、251、252位氨基酸任一个位点发生突变，则待测样品为抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂鳢肠。上述1416bp片段编码的第153位氨基酸即对应SEQ ID NO.2所示序列的第176位氨基酸。
进一步地，步骤(1)中PCR扩增反应使用的扩增体系以15μl计为：鳢肠基因组DNA0.5μl，10×PCR Buffer 1.5μl，2.5mM dNTP Mixture 1μl，10μM正、反向引物各0.3μl，TaqDNA聚合酶0.3μl，余量为水。
进一步地，步骤(1)中PCR扩增反应的条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，57.8℃(引物对I)或53.3℃(引物对II)退火30秒，72℃延伸60秒，共30个循环；72℃延伸10分钟。
在本发明的实施例中，采用上述2对引物对进行检测时，将获得的2个片段进行测序，发现阳性抗药性鳢肠的扩增产物1416bp大小的片段的第458位点编码的第153氨基酸密码子由CCC突变为TCC。因此本发明提供了一个更优选的检测抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂鳢肠的方法，包括以下步骤：
(1)提取样品基因组DNA，以其为模板，利用引物对I进行PCR扩增反应，获得大小为1416bp的扩增产物片段；
(2)对扩增产物片段测序，与野生型敏感鳢肠的基因序列进行对比，若1416bp片段第458bp位点发生突变，则待测样品为抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂鳢肠。
含有本发明2对特异性引物对的试剂盒属于本发明的保护范围。
本发明提供了上述特异性引物对或含有该引物对的试剂盒在治理田间杂草用药指导中的应用。
优选地，所述的杂草为鳢肠。
本发明提供了上述特异性引物对或含有该引物对的试剂盒在检测抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂植物中的应用。
优选地，所述的植物为鳢肠。
本发明根据鳢肠的LC-ALS序列信息(SEQ ID No.1)设计出特异性引物对I：LC-ALS-ⅠF(69)、LC-ALS-ⅠR(1484)和引物对II：LC-ALS-ⅡF(1142)和LC-ALS-ⅡR(1988)，采用该引物的PCR检测方法具有极好的特异性和灵敏性，经特异性试验证明(图9、10)能够将鳢肠的ALS基因检测出来。由于PCR方法操作简便快捷，基于对核苷酸的检测，当季就可以取样检测，从取样到出结果仅需2～4天。其灵敏度和特异性能够实现对田间疑似抗ALS抑制剂类除草剂鳢肠的快速鉴定和突变位点的确认，从而指导生产实践中抗性杂草的科学治理。
本发明提供的用于检测抗ALS抑制剂类除草剂鳢肠的试剂盒，可对田间采集的疑似抗性的鳢肠进行快速检测。可以替代一直沿用的生物测定的传统检测方法，并适于在其他抗药性杂草的监测领域中广泛开发应用，实用性强，可满足田间抗药性杂草快速诊断的需要。
附图说明
图1为实施例1中第一组的三对引物温度梯度PCR扩增结果电泳图，其中泳道1：Marker DL2000；泳道2-4:143-1012温度梯度(56-58℃)扩增条带；泳道5-7:143-1594温度梯度(56-58℃)扩增条带；泳道8-10:143-1950温度梯度(56-58℃)扩增条带。
图2为实施例1中第二组的一对引物温度梯度PCR扩增结果电泳图，其中泳道1：Marker DL2000；泳道2-8:1048-1803温度梯度(49-57℃)扩增条带。
图3为实施例1中第三组的三对引物温度梯度PCR扩增结果电泳图，其中泳道1-2:136-1551温度梯度(52-54℃)扩增条带；3-5：220-1803温度梯度(54-57℃)扩增条带；6：Marker DL2000；7-11:310-2010温度梯度(55-62℃)扩增条带。
图4为实施例1中第四组的一对引物温度梯度PCR扩增结果电泳图，其中泳道1：Marker DL2000；泳道2-6:11-1950温度梯度(55-59℃)扩增条带。
图5为实施例1中第五组的10对引物温度梯度PCR扩增结果电泳图，其中泳道1:Marker DL2000；泳道2、3：220-1370温度梯度(53-54℃)扩增条带；泳道4、5：220-1551温度梯度(53-54℃)扩增条带；泳道6、7:220-1559温度梯度(53-54℃)扩增条带；泳道8、9；220-1608温度梯度(53-54℃)扩增条带；泳道10、11:11-1008温度梯度(55-56℃)扩增条带；泳道12、13:11-1594温度梯度(55-56℃)扩增条带；泳道14、15:11-1732温度梯度(55-56℃)扩增条带；泳道16、17：11-1803温度梯度(55-56℃)温度梯度；泳道18、19:11-2010温度梯度(55-56℃)扩增条带；泳道20、21:11-1608温度梯度(54-56℃)扩增条带。
图6为实施例1中第六组的一对引物温度梯度PCR扩增结果电泳图，其中泳道1：Marker DL2000；泳道2-4:340-2010温度梯度(54-56℃)扩增条带。
图7为3'端染色体步移扩增电泳图，其中，泳道4、8、12、16：Marker DL2000；泳道1-3：AP1为上游引物的1st、2nd和3rd反应扩增条带；泳道5-7：AP2为上游引物的1st、2nd和3rd反应扩增条带；泳道9-11：AP3为上游引物的1st、2nd和3rd反应扩增条带；泳道13-15：AP4为上游引物的1st、2nd和3rd反应扩增条带。
图8为5'端染色体步移扩增电泳图，其中，泳道4、8、12、16：Marker DL2000；泳道1-3：AP1为上游引物的1st、2nd和3rd反应扩增条带；泳道5-7：AP2为上游引物的1st、2nd和3rd反应扩增条带；泳道9-11：AP3为上游引物的1st、2nd和3rd反应扩增条带；泳道13-15：AP4为上游引物的1st、2nd和3rd反应扩增条带。
图9为实施例2中引物对I温度梯度扩增结果电泳图，其中泳道1：Marker DL2000；泳道2-4：引物对I的温度梯度(温度分别为57.858.5 58.9℃)扩增条带。
图10为实施例2中引物对II温度梯度扩增结果电泳图，其中泳道5：MarkerDL2000；泳道1-4：引物对I的温度梯度(温度分别为53.5，53.9，54.6，55.3℃)扩增条带。
图11为实施例3中检测敏感和抗性鳢肠ALS编码197位(相对于拟南芥)氨基酸测序峰图(箭头所指为突变碱基)，其中a图为敏感鳢肠样品测序峰图；b图为抗性鳢肠样品测序峰图。
图12为实施例4中敏感和抗药性鳢肠种群在吡嘧磺隆用药后14天药效反应。
图13为实施例4中敏感和抗药性鳢肠种群对吡嘧磺隆的剂量-反应曲线。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。若未特殊说明，本发明实施例中抗药性相关SNP位点是针对拟南芥ALS氨基酸顺序，对所述分子标记导致的氨基酸突变位点进行描述。
实施例1鳢肠ALS基因的克隆
在NCBI网站检索与鳢肠亲缘关系较近的菊科植物向日葵(Helianthus annuus，登录号AY541454.1)、苍耳(Xanthium sibiricum，登录号U16280.1)、小蓬草(ConyzaCanadensis，登录号HM067014.1)及臭春黄菊(Anthemis cotula，登录号JF327754.1)的ALS作为参考序列，结合拟南芥(Arabidopsis thaliana，登录号AY042819.1)的ALS基因进行序列对比。根据引物设计原则，利用DNA MAN6.0软件，设计第一组引物，见表1。
表1扩增鳢肠ALS基因引物(第一组)
方向 编号 序列5'-3'
F 143 CACCACCAAACCACCCTC
R 1012 AGCTCCACAAACCGCCTC
F 143 CACCACCAAACCACCCTC
R 1594 AACCCAAAACCCATCGCC
F 143 CACCACCAAACCACCCTC
R 1950 CGTTCTGCCATCACCCTC
PCR扩增体系(15μl)如下：鳢肠基因组DNA 0.5μl，10×PCR Buffer1.5μl，2.5mMdNTP Mixture 1μl，10μM正向引物0.3μl，10μM反向引物0.3μl，Taq DNA聚合酶0.3μl，ddH2O11.1μl。
温度梯度PCR反应条件如下：94℃10min；94℃30s，x℃30s，72℃1min，共30个循环；72℃10min。
取PCR反应液3μl用1％的Agarose凝胶电泳，第一组引物温度梯度扩增结果如图1所示，以上引物均未扩增出单一目的条带。根据引物设计原则，利用DNA MAN6.0软件，设计第二组引物，见表2。
表2扩增鳢肠ALS基因的引物(第二组)
Figure BDA0001007068050000091
PCR扩增体系(15μl)及反应条件同第一组的PCR。取PCR反应液3μl用1％的Agarose凝胶电泳，第二组引物温度梯度扩增结果如图2所示，扩增出目的条带。
将PCR产物连接到载体并转化大肠杆菌后进行测序，将测序结果在NCBI上BLAST，得到与ALS基因的相似度最高，可以确定扩增序列为鳢肠的ALS基因，涵盖W574位点。以已得到的鳢肠ALS基因序列和相似度最高的向日葵和苍耳ALS序列为模板，设计引物，继续向两端扩增。根据引物设计原则，利用DNA MAN6.0软件，设计第三组引物，见表3。
表3扩增鳢肠ALS基因的引物(第三组)
Figure BDA0001007068050000092
PCR扩增体系(15μl)及反应条件同第一组的PCR。取PCR反应液3μl用1％的Agarose凝胶电泳，第三组引物对温度梯度扩增结果如图3所示，均未扩增出目的条带。
根据引物设计原则，利用DNA MAN6.0软件，设计第四组引物，见表4。
表4扩增鳢肠ALS基因的引物(第四组)
Figure BDA0001007068050000101
PCR扩增体系(15μl)及反应条件第一组的PCR。取PCR反应液3μl用1％的Agarose凝胶电泳，第四组引物对温度梯度扩增结果如图4所示，均未扩增出单一目的条带。
用DNA MAN6.0软件设计引物，并利用现有的引物来组合进行PCR，正向引物取220F和11F，反向引物取1008R、1370R、1551R、1559R、1608R、1594R、1732R、1803R和2010R，组合见表5。
表5扩增鳢肠ALS基因的引物(第五组)
Figure BDA0001007068050000102
Figure BDA0001007068050000111
PCR扩增体系(15μl)及反应条件同第一组的PCR。取PCR反应液3μl用1％的Agarose凝胶电泳，第五组引物对温度梯度扩增结果如图5所示，均未扩增出单一目的条带。
根据引物设计原则，利用DNA MAN6.0软件，设计第六组引物，见表6。
表6扩增鳢肠ALS基因的引物(第六组)
Figure BDA0001007068050000112
PCR扩增体系(15μl)以及反应条件同第一组的PCR。取PCR反应液3μl用1％的Agarose凝胶电泳，第六组引物对温度梯度扩增结果如图6所示，可扩增出单一目的条带。
将PCR产物连接载体并转化大肠杆菌后进行测序，将测序结果在NCBI上BLAST，得到与ALS基因的相似度最高，可以确定扩增序列为鳢肠的ALS基因，涵盖要检测的P197，A205，D376，R377和W574位点。
以上述已扩增序列为基础，利用染色体步移技术(PCR反应试剂和染色体步移试剂盒由宝生物工程(大连)有限公司生产)，向两端扩增出鳢肠ALS基因的5'和3'末端序列。根据染色体步移引物设计原则，利用DNA MAN6.0软件，设计3个引物，扩增鳢肠ALS 3'末端，见表7。
表7鳢肠3'端染色体步移引物
方向 编号 序列5'-3'
F 3'-SP1 CACAATTCGCGTTGAAAATCTGCCT
F 3'-SP2 GCATTTGGGTATGGTGGTTCAGTGG
F 3'-SP3 GGAAATCCGTCGAACGAGACTGAAA
以试剂盒中的兼并引物AP Primer(AP1、AP2、AP3和AP4)分别为上游引物，以3'-SP1为下游引物，进行1st反应。染色体步移1st PCR反应体系如下：鳢肠基因组DNA 2μl，10×LA Buffer(Mg2+plus)5μl，2.5mM dNTP Mixture 8μl，AP Primer1μl，3'-SP1Primer1μl，LA-Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.5μl，ddH2O 32.5μl。
染色体步移第一步反应条件如下：94℃ 1min；
Figure BDA0001007068050000121
72℃2min；94℃30s；25℃3min；72℃2min；
Figure BDA0001007068050000122
72℃10min
取1μl 1st PCR反应液作为2nd PCR反应的模板，以AP1、AP2、AP3和AP4分别为上游引物，3'-SP2Primer为下游引物，进行2nd反应。染色体步移第二步反应体系如下：模板(1stPCR反应液)1μl，10×LA Buffer(Mg2+plus)5μl，2.5mM dNTP Mixture 8μl，AP Primer1μl，3'-SP2Primer 1μl，LA-Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.5μl，ddH2O33.5μl。
染色体步移第二步反应条件如下：
Figure BDA0001007068050000131
72℃10min
取2nd PCR反应液1μl作为3rd PCR反应的模板，以AP1、AP2、AP3和AP4分别为上游引物，3'-SP3Primer为下游引物，进行第三步反应。染色体步移第三步反应体系如下：模板(第二步PCR反应液)1μl，10×LA Buffer(Mg2+plus)5μl，2.5mM dNTP Mixture 8μl，APPrimer1μl，3'-SP3Primer 1μl，LA-Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.5μl，ddH2O33.5μl。
染色体步移第三步反应条件如下：
Figure BDA0001007068050000132
72℃ 10min
取上述各步骤PCR反应液5μl进行1％的Agarose凝胶电泳，扩增结果如图7。
结果显示，第7、11和15泳道扩增条带大小与目的条带接近，将PCR产物连接载体并转化大肠杆菌后进行测序。将测序结果在NCBI上BLAST，得到结果与ALS基因的相似度最高，可以确定扩增序列为鳢肠ALS基因的3'端序列，得到的序列包括终止密码子和S653，G654位点。
用相同的方法扩增鳢肠ALS基因的5'端。根据染色体步移引物设计原则，利用DNAMAN6.0软件，设计3个引物，扩增鳢肠ALS基因5'端，见表8。
表8鳢肠ALS基因5'端染色体步移引物
方向 编号 序列5'-3'
R 5'-SP1 ACAATTTGCTCTAACTGCCCATCAT
R 5'-SP2 ACCAATTGCTGCTGTATATCCTTCG
R 5'-SP3 GACCCGACGACGCAAGATAAAAAGC
鳢肠5'端染色体步移第一、二、三步反应体系以及反应条件同3'端染色体步移第一、二、三步反应体系以及反应条件。
分别取上述各步骤PCR反应液5μl用1％的Agarose凝胶电泳检测扩增产物，扩增结果如图8。
由上图可知，7、11和15泳道均得到单一目的条带，将其PCR产物连接转化大肠杆菌后进行测序。而后将测序结果在NCBI上BLAST，得到与ALS基因的相似度最高，可以确定扩增序列为鳢肠ALS基因的5'端，得到的序列包括起始密码子和A122位点。拼接鳢肠ALS基因的全长，总长共1950个碱基，649个氨基酸，命名为LC-ALS，核苷酸序列和氨基酸序列序列分别见SEQ ID NO.1-2。
实施例2用于检测抗ALS抑制剂类除草剂鳢肠的PCR引物设计
根据鳢肠ALS基因全长序列及引物设计原则，利用DNA MAN6.0软件，设计2对引物，扩增鳢肠ALS基因全长，见表9。
表9扩增鳢肠ALS基因的引物
Figure BDA0001007068050000141
Figure BDA0001007068050000151
PCR扩增体系(15μl)以及反应条件同第一组的PCR。取PCR反应液3μl用1％的Agarose凝胶电泳，引物对温度梯度扩增结果如图9、10所示，扩增效果良好，测序结果显示为鳢肠ALS基因序列，片段涵盖与抗药性相关的A122，P197，A205，D376，R377，W574，S653和G654八个SNP位点。
实施例3 抗ALS抑制剂类除草剂鳢肠的PCR检测方法
实验材料：采自不同地区的鳢肠。
实验方法：①鳢肠DNA的制备取鳢肠新鲜叶片200mg，采用液氮研磨，常规CTAB法提取各鳢肠叶片DNA。
②用于检测鳢肠LC-ALS突变位点的特异性引物，引物序列见实施例2中表9。
③用于检测鳢肠ALS突变位点的PCR反应体系见实施例1中的第一组的PCR。
④用于检测鳢肠ALS突变位点的PCR扩增程序见实施例1中的第一组的PCR，引物对I，引物对II。
⑤PCR产物的鉴定 取3μL PCR产物，用1％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果。
⑥PCR产物测序 引物对I的PCR扩增产物用引物LC-ALS-ⅠF(69)测序和LC-ALS-ⅠR(1484)正反向测序，保证其准确性；引物对Ⅱ的PCR扩增产物用引物LC-ALS-ⅡR(1988)测序。测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。对测序结果进行比对分析。
实验结果：检测特异性引物对Ⅰ和Ⅱ对敏感和抗性鳢肠PCR扩增结果(图9、10)显示这对引物具有很好的特异性(扩增目的片段分别为1416bp、847bp)，测序结果进一步证实这对引物能够检测LC-ALS序列。
将敏感和抗药性鳢肠的ALS基因进行比对后发现，在相对于拟南芥的197位(相对于SEQ ID NO.2为第176位)发生单核苷酸突变，由CCC突变为TCC(图11)。
由此可见，该方法能够快速、准确地检测采自田间的疑似抗药性鳢肠的抗药性突变的发生位点及取代的氨基酸种类，能够快速准确地给出能否继续使用ALS抑制剂来防除鳢肠，是一种检测鳢肠抗药性种群的简单、快速的方法。
实施例4 ALS197突变鳢肠对吡嘧磺隆的抗性水平
实验材料：发现靶标突变的抗性鳢肠种群LC12-25，以敏感种群LC12-24作为对照。
实验方法：
①鳢肠LC12-25对吡嘧磺隆抗性水平测定
将未施用除草剂的农田表层土壤过筛，并按照3:1(表层土:营养土)的比例加入营养土(有机质含量≥15.00％，氮磷钾总含量≥0.88％，pH为7～7.5)，定量装入10.5cm×9cm盆钵中备用。不同种群的鳢肠种子用清水于4°浸种15天，打破休眠，播种并均匀覆土，保持昼夜温度25～35℃。子叶展开至2叶期逐渐间苗，使每盆保留长势均匀一致的植株10株，以植株间互不遮挡为宜确保植株间互不遮挡。
鳢肠长至2叶期，使用ASS-4型行走式喷雾塔，在喷雾压力0.275Mpa，喷液量367.5L/hm2条件下进行茎叶喷雾。
吡嘧磺隆处理剂量为0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320ga.i./hm2，每个处理3次重复。
施药后观察要害症状的变化，在施药后14天，测定各处理地上部分鲜重，并计算出不同药剂剂量下的鲜重抑制率。得到的数据采用SigmaPlot 12.0软件的双逻辑非线性回归模型进行处理，计算鲜重抑制中量GR50，计算公式如下：
y＝C+{(D-C)/[1+(X/GR50)b]}
式中，y为吡嘧磺隆浓度处理下所测杂草地上部鲜重的相对生长量；C为剂量反应下限；D为剂量反应上限；x为吡嘧磺隆用量；GR50为生长抑制中量；b为斜率。
根据所得GR50值计算抗药性指数(Resistance Index,RI)：
RI＝抗药性种群GR50/敏感种群GR50
②鳢肠LC12-25ALS基因突变位点检测
从抗药性鳢肠LC12-25中随机选取10个植株，检测其ALS基因序列，用LC12-24的ALS基因序列做对照。检测方法详见实施例3。
结果与分析：
①鳢肠LC12-25对吡嘧磺隆抗性水平
施药14天观察不同鳢肠种群生长情况，敏感性鳢肠种群LC12-24在吡嘧磺隆处理剂量为0.3125-1.25g a.i./hm2时，鳢肠叶片呈现畸形，叶缘开始枯黄；处理剂量为2.5-20ga.i./hm2时，叶片部分枯萎；当处理剂量为40-320g a.i./hm2时，叶片全部枯萎。而抗药性鳢肠种群LC12-25在吡嘧磺隆处理剂量为0.3125和0.625g a.i./hm2时与空白对照无明显差异；处理剂量为1.25-20g a.i./hm2时，相比对照生长缓慢；处理剂量为40-320g a.i./hm2时，鳢肠叶片呈现畸形，叶缘枯黄(见图12)。
采用整株测定法所得不同鳢肠种群对吡嘧磺隆的剂量反应曲线见图13。在供试剂量范围内，随着吡嘧磺隆处理浓度的升高，鳢肠种群鲜重显著降低。吡嘧磺隆处理浓度为0.3125g a.i./hm2时，敏感种群鲜重抑制率为52.36％，而抗药性种群鲜重抑制率为2.11％；当吡嘧磺隆处理浓度为20g a.i./hm2时，敏感种群鲜重抑制率为94.79％，而抗药性种群鲜重抑制率为46.57％；施用吡嘧磺隆最高剂量320g a.i./hm2时，敏感种群鲜重抑制率为98.38％，而抗药性种群鲜重抑制率为88.71％。
根据双逻辑非线性回归模型计算出，鳢肠敏感种群LC12-24和鳢肠抗药性种群LC12-25对吡嘧磺隆的GR50值分别为0.25和16.66g a.i./hm2，LC12-25的抗药性指数(RI)为66.64(见表10)，这表明鳢肠种群LC12-25已对吡嘧磺隆产生较高水平抗性。
表10吡嘧磺隆对敏感和抗性鳢肠种群的GR50
Figure BDA0001007068050000181
②鳢肠LC12-25ALS基因突变位点
检测结果显示，敏感种群的ALS都没有发生突变，抗药性种群LC12-25的10个植株在相对于拟南芥的第197位(相对于本发明SEQ ID NO.2第176位)氨基酸的密码子发生CCC-TCC碱基突变。这个结果与已有的其他植物的报道相符(http://www.weedscience.org/Mutations/MutationDisplayAll.aspx)。因此，可以确定，LC12-25对吡嘧磺隆产生抗性主要原因是靶标酶ALS的突变，并且通过PCR产物测序的方法能够快速检测由于靶标突变引起的抗性鳢肠，除了ALS197位突变之外，如果抗药性鳢肠在ALS其他7个抗药性相关位点发生突变，同样可以用这两对引物检测到。
上文虽然已对本发明以及其实施方式做了详尽的描述，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以对相应的条件等做一些改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
Figure IDA0001007068130000011
Figure IDA0001007068130000021
Figure IDA0001007068130000031
Figure IDA0001007068130000041
Figure IDA0001007068130000051
Figure IDA0001007068130000061
Figure IDA0001007068130000071
Figure IDA0001007068130000081
Figure IDA0001007068130000091

Claims (1)

1.一种检测抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂鳢肠的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取样品基因组DNA，以其为模板，利用2对特异性引物进行PCR扩增反应，获得大小分别为1416bp和847bp的扩增产物片段；
所述2对特异性引物为：
引物对I：
正向引物LC-ALS-IF(69)：5'-CCCACCCTGCTTCATCCT-3'
反向引物LC-ALS-IR(1484)：5'-CCGAAACCCATCGCTCCT-3'；
引物对II：
正向引物LC-ALS-IIF(1142)：5'-GGAAGAATAAACAGCCCCAT-3'
反向引物LC-ALS-IIR(1988)：5'-AGCCTGCTTACAGAACACAC-3'；
(2)对扩增产物片段测序，若1416bp片段编码的第78、153、161、332、333位氨基酸任一个位点发生突变，或847bp片段编码的第172、251、252位氨基酸任一个位点发生突变，则待测样品为抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂鳢肠。
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