CN105713914B - 与荠菜抗药性相关的分子标记及其检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明是申请号为201410643602.9，名称为“与荠菜抗药性相关的分子标记及其检测试剂盒”专利申请的分案申请，本发明提供了与荠菜抗药性相关的特异性DNA片段和用于检测抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂荠菜的特异性PCR引物对，包括用于特异性扩增荠菜JC‑ALS基因的引物对。采用该引物的PCR检测方法具有极好的特异性和灵敏性，能够实现对田间疑似抗ALS抑制剂荠菜的快速鉴定和突变位点的确认，从而指导生产实践中抗性杂草的科学治理。

Description

与荠菜抗药性相关的分子标记及其检测试剂盒

技术领域

本发明是申请号为201410643602.9，名称为“与荠菜抗药性相关的分子标记及其检测试剂盒”专利申请的分案申请，本发明涉及抗除草剂杂草检测技术，具体地说，涉及与荠菜抗药性相关的分子标记及其检测试剂盒。

背景技术

乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase,简称ALS)，也称乙酰羟酸合酶(acetohydroxyacid synthase，简称AHAS)，是诱导植物和微生物体内缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成过程中关键性酶，也是一种重要的除草剂靶标。ALS抑制剂类除草剂的开发及使用始于上世纪80年代初，由于此类除草剂有超高活性、对人及动物低毒、环境友好等明显的优势，受到广泛关注，目前已有50多个品种被开发和使用。上世纪80年代开始，我国陆续在冬小麦田推广使用苯磺隆、甲磺隆、氯磺隆、双氟磺草胺、啶磺草胺等，2009年仅苯磺隆在我国的产量就达230多吨(有效成分)，相当于麦田化除面积2亿多亩。苯磺隆作为小麦田最经济、有效的优秀除草剂，对控制荠菜等阔叶杂草起到了非常重要的作用。但由于该类除草剂分子靶标单一，长期使用易引起杂草抗药性，近些年来，以常规剂量喷施苯磺隆无法有效防除荠菜的问题在我国河北、陕西、山东、河南、山西、江苏等地的一些麦田非常突出，并且发现，有些麦田抗苯磺隆的荠菜对双氟磺草胺等ALS抑制剂也产生了交互抗性。麦田杂草对上述几种ALS抑制剂产生交互抗性，使这些农田不能继续使用该类除草剂，而在生产中由于农民对杂草抗药性的认识上的不足，盲目增大用药剂量，不仅增加了成本，使药害风险加大，严重影响农民收入和国家粮食安全。因此，目前迫切需要一个简便，快速的抗药性杂草检测鉴定方法。

我国抗药性杂草的研究起步较晚，传统的抗药性杂草检测通常采用室内生物测定法，既对田间采集的疑似抗性的杂草的种子在室内进行培养，在一定叶龄喷施除草剂后，调查株防效和地上部分生物量来计算抗性指数。这种方法能够客观地评价某种杂草对相应除草剂的抗性情况，但也有其局限性，主要表现在以下两方面：一是不能当季、当时进行检测，二是占地多、时间长、工作量大。

随着分子生物学技术在杂草抗药性机理研究方面的应用，越来越多的杂草的抗药性机理得到明确。目前已有的研究报道显示，对ALS抑制剂产生抗性的植物在其靶标酶ALS保守区共发现了8个SNP位点(http://www.weedscience.org/Mutations/MutationDisplayAll.aspx)，这些位点的任意一个位点氨基酸突变为其他氨基酸都使植物对相应除草剂产生抗性。这8个氨基酸位点目前公认以拟南芥ALS为标准标注位点，包括122、197、205、376、377、574、653、654位氨基酸。其中，荠菜对苯磺隆等ALS抑制剂类除草剂产生抗性的原因也已证实与编码ALS保守区某一位点发生点突变相关。研究报道中只克隆了荠菜的一个ALS基因，但我们在研究中发现，荠菜具有两个ALS基因，分别命名为JC-ALS-1和JC-ALS-2，这两个基因都具有功能，任意一个基因在保守区发生突变，都能够引起抗药性产生。因此，可以通过分子生物学手段检测其靶标酶ALS的保守区突变位点来检测荠菜是否发生抗药性。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂荠菜的检测方法。

为了实现本发明的目的，本发明首先提供与荠菜抗药性相关的分子标记，所述分子标记为：

(1)核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的JC-ALS-1基因；所编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；其中，编码第373位氨基酸的密码子发生GAT-GAA碱基突变，或编码第571位氨基酸的密码子发生TGG-TTG碱基突变，导致荠菜抗药性出现多态性；

或(2)核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的JC-ALS-2基因；所编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；其中，编码第372位氨基酸的密码子发生GAT-GAA碱基突变，或编码第570位氨基酸的密码子发生TGG-TTG碱基突变，导致荠菜抗药性出现多态性；

所述抗药性具体表现为抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂。

需要指出的是，JC-ALS-1基因发生碱基突变，导致翻译的氨基酸发生变化的第373位和第571位氨基酸位点，若以拟南芥ALS氨基酸顺序，则分别为376位和574位。同样，JC-ALS-2基因发生碱基突变，导致翻译的氨基酸发生变化的第372位和第570位氨基酸位点，若以拟南芥ALS氨基酸顺序，则分别为376位和574位。

因此，本发明所述分子标记翻译的氨基酸序列，相对于拟南芥ALS氨基酸顺序来说，由于在编码第376位氨基酸的密码子发生GAT-GAA碱基突变，使得该位置氨基酸由Asp变为Glu；或由于在编码第574位氨基酸的密码子发生TGG-TTG碱基突变，使得该位置氨基酸由Trp变为Leu。

为了叙述简洁，本发明在后文中将利用拟南芥ALS氨基酸顺序，对所述分子标记导致的氨基酸突变位点进行描述。

本发明还提供了用于检测抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂荠菜的特异性PCR引物对，包括用于特异性扩增荠菜JC-ALS-1基因和JC-ALS-2基因的引物对，引物对的核苷酸序列如下：

正向引物JC-ALS-F：5'-TATTCGCTTACCCAGGTG-3'；

反向引物JC-ALS-R：5'-GGTTCTGAGTTTCATCTCTCA-3'。

本发明还进一步提供了用于检测抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂荠菜的试剂盒，所述试剂盒含有前述引物对。

作为优选，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的至少一种。

更为优选，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明还提供一种抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂荠菜的PCR检测方法，利用前述引物对或试剂盒检测抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂的荠菜。

进一步地，所述PCR检测方法具体包括以下步骤：

1)提取样品中的DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用前述引物对或试剂盒进行PCR扩增反应；

3)分析PCR产物。

PCR反应体系以20μl计为：

PCR反应条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性1分钟，55.3℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环；72℃延伸10分钟。

本发明根据荠菜的JC-ALS-1和JC-ALS-2序列信息(SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)设计出特异性引物JC-ALS-F和JC-ALS-R，采用该引物的PCR检测方法具有极好的特异性和灵敏性，经特异性试验证明(图1、2)能够将荠菜的两个ALS基因同时扩增出来。由于PCR方法操作简便快捷，基于对核苷酸的检测，当季就可以取样检测，从取样到出结果仅需2～4天。其灵敏度和特异性能够实现对田间疑似抗ALS抑制剂类除草剂荠菜的快速鉴定和突变位点的确认，从而指导生产实践中抗性杂草的科学治理。

本发明提供的用于检测抗ALS抑制剂类除草剂荠菜的试剂盒，可对田间采集的疑似抗性的荠菜进行快速检测。可以替代一直沿用的生物测定的传统检测方法，并适于在其他抗药性杂草的监测领域中广泛开发应用，实用性强，可满足田间抗药性杂草快速诊断的需要。

附图说明

图1为本发明实施例2中利用特异性检测引物JC-ALS-F/JC-ALS-R对不同荠菜DNA的PCR扩增结果。其中，7为DNA Marker(DL2000)，1-6泳道为引物对JC-ALS-F/JC-ALS-R扩增6个荠菜样品的结果。

图2为为本发明实施例2中利用特异性检测引物JC-ALS-F/JC-ALS-R对荠菜DNA的PCR产物测序结果部分截图。其中A为克隆后测序结果，B为PCR产物直接测序结果。

图3为本发明实施例3中利用JC-ALS-F/JC-ALS-R引物对扩增敏感性荠菜PCR产物测序结果。其中，A为JC-ALS-1和JC-ALS-2的编码第197位氨基酸附近截图，此位点均为CCT；B为JC-ALS-1和JC-ALS-2的编码第376位氨基酸附近截图，此位点均为GAT；C为JC-ALS-1和JC-ALS-2的编码第574位氨基酸附近截图，此位点均为TGG(反向互补序列)。

图4为本发明实施例3中利用JC-ALS-F/JC-ALS-R引物对扩增抗药性荠菜PCR产物测序结果。A中有一条ALS的编码第197位氨基端的碱基由CCT突变为TCT；B中有一条ALS的编码第197位氨基酸的碱基由CCT突变为ACT；C中有一条ALS的编码第197位氨基酸的碱基由CCT突变为CTT。

图5为本发明实施例3中利用JC-ALS-F/JC-ALS-R引物对扩增抗药性荠菜PCR产物测序结果。其中，有一条ALS的编码第376位氨基酸的碱基由GAT突变为GAA。

图6为本发明实施例3中利用JC-ALS-F/JC-ALS-R引物对扩增抗药性荠菜PCR产物测序结果。其中，有一条ALS的编码第574位氨基酸的碱基由TGG突变为TTG(反向互补序列)。

图7为本发明实施例4中敏感和抗药性种群在施用一系列浓度梯度苯磺隆后21天的效果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1用于检测抗ALS抑制剂类除草剂荠菜的PCR引物的合成

在GenBank数据库中查询荠菜ALS基因序列(GenBank登录号：H Q880660.1)，根据查询到的序列信息，利用引物设计生物学软件，设计用于特异性扩增JC-ALS-1和JC-ALS-2的保守区序列的PCR引物，并通过3'RACE和染色体步移的方法获得两端序列，最终分别获得荠菜的两个ALS基因序列。

引物序列如下：

正向引物JC-ALS-F：5'-TATTCGCTTACCCAGGTG-3'；

反向引物JC-ALS-R：5'-GGTTCTGAGTTTCATCTCTCA-3'。

引物合成由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。

实施例2抗ALS抑制剂类除草剂荠菜的PCR检测方法

实验材料：采自不同地区的荠菜(Capsella bursa-pastoris)。

实验方法：

1、荠菜DNA的制备

取荠菜新鲜叶片200mg，采用液氮研磨，常规CTAB法提取各荠菜叶片DNA。

2、用于检测荠菜JC-ALS-1和JC-ALS-2突变位点的特异性引物，引物序列见实施例1。

3、用于检测荠菜ALS突变位点的PCR反应体系

PCR反应体系，其中10×PCR反应缓冲液2μL，15mM MgCl₂0.5μL，2.5mM dNTPs 1μL，10μM引物各0.5μL，Taq DNA聚合酶1U，DNA模板1μL，其余为灭菌双蒸水，终体积为20μL。

4、用于检测荠菜ALS突变位点的PCR扩增程序

94℃预变性3min；94℃变性1min，55.3℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

5、PCR产物的鉴定

取3μL PCR产物，用1％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果。

6、PCR产物测序

引物对JC-ALS-F/JC-ALS-R的PCR扩增产物用引物JC-ALS-F和JC-ALS-R分别正反向测序。测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。对测序结果进行比对分析。

实验结果：

检测特异性引物对JC-ALSF/JC-ALSR对不同荠菜PCR扩增结果(图1)显示这对引物具有很好的特异性(扩增目的片段约1687bp)。测序结果进一步证实这对引物能够同时扩增JC-ALS-1和JC-ALS-2序列，图2中A为克隆测序结果的部分序列比对图，其中黑色部分为100％一致部分，AA为JC-ALS-1序列，GG为JC-ALS-2序列。图2中B为PCR产物直接测序峰图截图，在相同位点找到了AA和GG的套峰，说明这对引物能够同时扩增JC-ALS-1和JC-ALS-2序列，用这对引物扩增的PCR产物直接测序能够检测到荠菜的两条ALS基因序列。

用这对引物扩增出来的敏感和抗药性荠菜的PCR产物分别测序，在相应位点能够找到序列上的差异。

实施例3PCR法检测田间抗ALS抑制剂的荠菜

检测方法如下：

1、样品采集与DNA制备

为验证PCR检测方法的可行性，2013和2014年连续两年在疑似发生抗药性荠菜的农田采集样品，在实验室进行检测。这些田块在小麦返青后施用过一次苯磺隆来防除荠菜，但没有效果，因此怀疑可能对苯磺隆产生抗性。因此，从这些疑似发生抗药性农田采集荠菜植株，进行适当保湿处理后，邮寄至实验室进行检测。取荠菜新鲜叶片200mg，采用液氮研磨，常规CTAB法提取各荠菜叶片DNA。

2、用于检测荠菜JC-ALS-1和JC-ALS-2突变位点的特异性引物，引物序列见实施例1。

3、用于检测荠菜ALS突变位点的PCR反应体系

同实施例2。

4、用于检测荠菜ALS突变位点的PCR扩增程序

同实施例2。

5、PCR产物的鉴定

同实施例2。

6、PCR产物测序

同实施例2。

实验结果：

2013年和2014年从河北、陕西、江苏、山东省的不同农田，共采集31个，按照本发明的检测方法对其进行检测。检测结果显示(表1)(图3～6)。其中，有21个荠菜样品的JC-ALS在编码197位氨基酸的碱基发生突变，有5个荠菜样品的JC-ALS在编码376位氨基酸的碱基发生突变，有4个种群的JC-ALS在编码574位氨基酸的碱基发生突变。

由此可见，该方法能够快速、准确地检测采自田间的疑似抗药性荠菜的抗药性突变的发生位点及取代的氨基酸种类，能够快速准确地给出能否继续使用ALS抑制剂来防除荠菜，是一种检测荠菜抗药性种群的简单、快速的方法。

表1 PCR法检测田间荠菜抗药性突变位点结果

实施例4

实验材料：在上述已发现靶标突变的田间采集抗性荠菜种群(2014-JC-1、2014-JC-33)，以敏感种群作为对照。

实验方法：

1、采自不同田间的抗性荠菜种群的种子和敏感种群种子，经过打破休眠处理后均匀播种于直径为12cm的花盆，花盆内土壤与有机肥比例为3:1(重量比)。播种好的荠菜在培养箱内培养，温度15-25℃。

2、植株长至2叶开始间苗，使每盆荠菜植株均匀分布，每盆留10株。

3、荠菜长至3叶施用一系列浓度梯度的苯磺隆，其有效剂量为0、0.01、0.1、1、10、100、1000g a.i./ha，21天后调查。

4、从施用苯磺隆后存活的抗药性种群2014-JC-1、2014-JC-33中各取5株，从敏感种群2011-JC-S的空白对照取5株。

5、DNA制备方法同实例2。

6、用于检测荠菜ALS基因突变位点的特异性引物，引物序列见实施例1。

7、用于检测荠菜ALS基因突变位点的PCR反应体系同实施例2。

8、用于检测荠菜ALS基因突变位点的PCR扩增程序同实施例2。

9、PCR产物的鉴定同实施例2。

10、PCR产物测序同实施例2。

实验结果：敏感种群在施用1g a.i./ha苯磺隆后21天已全部死亡，两个抗药性种群2014-JC-1和2014-JC-33在100g a.i./ha苯磺隆作用下仍有存活，表现出极强的抗性(图7)。

从每个抗药性和敏感种群存活植株中随机选取5个植株，检测其ALS基因序列。检测结果显示，两个敏感种群的ALS都没有发生突变，抗药性种群2014-JC-1的5个植株在相对于拟南芥的第574位氨基酸的密码子发生TGG-TTG碱基突变，2014-JC-33的5个植株在相对于拟南芥的第376位氨基酸的密码子发生GAT-GAA碱基突变。这个结果与已有的其他植物的报道相符(http://www.weedscience.org/Mutations/MutationDisplayAll.aspx)。因此，可以通过PCR的方法快速检测由于靶标突变引起的杂草的抗性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (3)

1.与荠菜抗药性相关的特异性DNA片段，其特征在于，所述特异性DNA片段为：

(1)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的JC-ALS-1基因；所编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；其中，编码第571位氨基酸的密码子发生TGG-TTG碱基突变；

或(2)核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的JC-ALS-2基因；所编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；其中，编码第570位氨基酸的密码子发生TGG-TTG碱基突变；

所述抗药性表现为抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂。

2.特异性PCR引物对在特异性扩增权利要求1所述特异性DNA片段中的应用，其特征在于，所述特异性PCR引物对的核苷酸序列如下：

正向引物JC-ALS-F：5'-TATTCGCTTACCCAGGTG-3'；

反向引物JC-ALS-R：5'-GGTTCTGAGTTTCATCTCTCA-3'。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取样品中的DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用所述引物对进行PCR扩增反应；

3)分析PCR产物；

其中：

PCR反应体系以20μl计为：

PCR反应条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性1分钟，55.3℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环；72℃延伸10分钟。