CN107422012A

CN107422012A - 电化学生物传感器电极、传感器及其制备方法

Info

Publication number: CN107422012A
Application number: CN201710433421.7A
Authority: CN
Inventors: 冯雪; 鲁思渊; 陈毅豪; 方旭飞; 苏红宏
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2017-06-09
Filing date: 2017-06-09
Publication date: 2017-12-01
Anticipated expiration: 2037-06-09
Also published as: WO2018223760A1; CN107422012B

Abstract

本发明涉及一种电化学生物传感器电极、传感器及其制备方法，所述感器电极包括：基底、基底之上的金薄膜，以及形成于所述金薄膜之上的修饰层，所述金薄膜为使用溅射沉积法形成，其厚度为200‑400nm，所述修饰层中包括普鲁士蓝，且其厚度为35‑110nm，所述普鲁士蓝的至少一部分以球形和/或立方状颗粒形式存在。

Description

电化学生物传感器电极、传感器及其制备方法

技术领域

本发明属于生物材料及电化学生物传感器领域，涉及一种用以检测过氧化氢(H₂O₂)的传感器的制备及检测方法。

背景技术

过氧化氢(H₂O₂)具有较强的氧化作用，是很多生物氧化酶的反应产物，在生物体内常以酶氧化反应的副产物存在。对H₂O₂的定量测量可以作为对生物体内众多激素和代谢产物的有效定量表征手段，如血糖、乳酸、胆固醇、酒精等的测量方法。因此，对于过氧化氢的有效定量检测技术在食品处理，纺织品工业，纸张漂白，制药，临床医学以及消毒剂制造等领域具有广泛的应用。

现阶段，对于H₂O₂的分析方法，主要有荧光光谱法，化学发光法，分光光度法以及电化学检测法等。其中，电化学检测方法具有设备操作简单，检测灵敏度高，检测选择性强和效费比高等优势。电化学方法对于H₂O₂的检测，基于过氧化氢酶与过氧化氢之间进行的氧化还原反应。酶与过氧化氢之间的反应可实现电子的转移，进而产生可检测并与待检测物质浓度相对应的电流信号。辣根过氧化物酶(HRP)与普鲁士蓝(Prussian blue，PB)是现阶段广泛应用的过氧化氢酶。PB因为具有较低的工作电压范围，可以减轻生物体内其它氧化性激素和代谢产物对过氧化氢检测的干扰信号，是一种人工过氧化氢酶。同时，PB也可以通过电化学，丝网印刷等方法进行制备，具有极高的效费比。

基于电化学方法所制备的生物传感器，是一类以电流或电压强度为信号，以电极作为信号转换装置，施加一定电位或电压或电流进行测量的电化学传感器。电化学生物传感器通常以三电极体系实现电能的输入和电信号的输出，包括参比电极，工作电极和对电极(辅助电极)。参比电极一般选用银/氯化银或甘汞电极(SCE)，工作电极为具有导电性的金属电极，对电极则选用铂丝或铂片电极。工作电极与对电极之间有电流通过，工作电极与参比电极之间控制体系的电压输入和输出。电化学方法可以进行PB功能层的电沉积以及过氧化氢的电流响应检测。在进行PB功能层的电沉积过程中，工作电极为具有导电性的电极，如铂，金，银以及玻碳电极等；过氧化氢电流响应过程则以表面具有PB功能层的电极为工作电极。

现阶段用于双氧水电化学传感器的工作电极一般为玻碳电极、炭糊、金片或铂片等，应用过程中必须进行封装并连接导线等过程，造成了电极体积过大，不易进行柔性化制造等问题。随着物理气相沉积技术的发展，磁控溅射已发展成为制作金属薄膜的高效方法。磁控溅制备的金属薄膜，具有100-1000nm可调的厚度，在柔性器件制备领域有广泛的应用。因此，应用金属薄膜进行生物传感器的制备，对于传感器的柔性化设计并进而提高生物传感器的应用舒适度具有重要的应用价值。

引用文献1，公开了一种双氧水电化学传感器的制备方法，其采用玻碳电极片表面镀覆多层修饰薄膜，其第一层为萘酚绿。所述传感器的检测极限为0.9μM，相应的线性范围为8×10^-6-1.8×10^-4M。

引用文献2，其公开了电化学传感器，其在玻碳电极表面电沉积金纳米颗粒以及磁性四氧化三铁，并公开了其检测极限为50nM。

引用文献3，其公开了一种过氧化氢非酶电化学传感器及其制备方法，其采用诸如金等贵金属纳米颗粒对电极进行修饰。其采用离子束流沉积进行贵金属的沉积，控制沉积量在5层以内，其对双氧水的检测的线性范围为4-44M。

引用文献4，其公开了一种金微球-氮化钛纳米管阵列复合材料及其制备方法，还提供了该复合材料在制备无酶过氧化氢电化学传感器中的应用。其在氮化钛基片上排列氮化钛纳米阵列管，并在该阵列管顶端形成金微球。

引用文献5，其利用循环伏安法在两种不同组成的电解液中进行铂电极上普鲁士蓝膜的电化学沉积，在氯化钾溶液中测量了修饰膜的循环伏安行为,比较了两种膜的电化学阻抗谱。修饰普鲁士蓝膜铂电极的电化学阻抗谱测量结果表明，沉积条件及其沉积膜厚度均对电子传递过程产生影响。

因此，可以看出，现有技术中对于得到高检测灵敏度、宽的检测线性范围、低的检测极限、较好的使用耐久性以及较为便利的制备方法的研究依然存在提高的空间。

引用文献1：CN102043002A

引用文献2：CN101986147A

引用文献3：CN103792271A

引用文献4：CN103952763A

引用文献5：“普鲁士蓝膜的电沉积及其电化学阻抗谱”，张芬芬等，《化学研究与应用》，第15卷第2期，2003年4月。

发明内容

发明要解决的问题

针对如上问题，本发明致力于提供一种电化学生物传感器电极，以及基于该电极的电化学生物传感器，特别是将其用于检测过氧化氢浓度时，能够获得检测检测灵敏度、检测线性范围、以及检测极限和使用耐久性均优异的特性。

此外，本发明还提供了一种制备以上电化学生物传感器电极，以及基于该电极的电化学生物传感器的简单、有效的制备方法。

用于解决问题的方案

本发明首先提供了一种电化学生物传感器电极，所述电极包括：基底、基底之上的金薄膜，以及形成于所述金薄膜之上的修饰层，

所述金薄膜为使用溅射沉积法形成，其厚度为200-400nm，

所述修饰层中包括普鲁士蓝，且其厚度为35-110nm，

所述普鲁士蓝的至少一部分以球形和/或立方状颗粒形式存在。

根据以上所述的传感器电极，所述基底选自石墨、碳纳米管、石墨烯、类金刚石碳、硼掺杂金刚石之类的碳基底、玻碳基底或硅基底、ITO(氧化铟锡)、IZO(氧化铟锡)、AZO(掺铝氧化锌)、FTO(掺氟氧化锡)之类的半导体透明导电膜、导电高分子膜，优选为硅基底。

根据以上所述的传感器电极，在基底与金薄膜之间存在金属过渡层，所述金属过渡层包含选自Cr、Ti以及它们的合金中的至少任一者。

根据以上所述的传感器电极，所述金属过渡层采用溅射沉积法形成，其厚度为10-40nm。

根据以上所述的传感器电极，所述修饰层通过电化学沉积法形成。

另一方面，本发明提供了一种电化学生物传感器，其是基于根据以上任一所述的传感器电极而成的。

另一方面，本发明还一种过氧化氢检测用电化学生物传感器，所述传感器为基于以上所述的传感器，所述传感器检测过氧化氢的灵敏度为250-350mA/Mcm²，检测极限为0.77μM以上，线性范围为1-XμM，所述X为大于1500且在4500以下的数值。。

此外，本发明提供了一种电化学生物传感器电极的制备方法，所述方法包括：

形成基底电极的步骤，以及在基底电极上沉积修饰层的步骤，

所述形成基底电极的步骤中包括，通过溅射法在基底上沉积金薄膜的步骤，

所述在基底电极上形成修饰层的步骤为通过电化学沉积方法形成修饰层，所述修饰层中包括普鲁士蓝，

所述金薄膜厚度为200-400nm，所述修饰层厚度为35-110nm，

根据以上所述方法，在所述形成基底电极的步骤中，包括在基底上沉积金薄膜之前，预先沉积金属过渡层的步骤，所述金属过渡层包含选自Cr、Ti以及它们的合金中的至少任一者。

根据以上所述的方法，所述金属过渡层通过溅射方法进行沉积，厚度为10-40nm。

进一步，本发明还提供了一种过氧化氢检测用电化学生物传感器的制备方法，其包括根据以上任一项所述的方法，所述传感器的检测灵敏度为250-350mA/Mcm²，检测极限为0.77μM以上，线性范围为1-XμM，所述X为大于1500且在4500以下的数值。

发明的效果

本发明运用电化学沉积方法在磁控溅射金薄膜基底上沉积包括普鲁士蓝的薄膜，得到了一种基于普鲁士蓝薄膜修饰的宽线性检测范围，高灵敏度，低检测极限，且耐久性优异，以及强选择性的电化学生物传感器，尤其适用于对过氧化氢的检测。

此外，本发明所提供的电化学生物传感器电极以及过氧化氢检测用电化学生物传感器的制备方法，过程简单有效，更加适合工业大规模生产，并减少了制造成本。

附图说明

图1：实施例1制备的厚度为30nm双氧水传感器的表面结构图。其中图(a)为扫描电子显微镜(SEM)图片，图(b)为原子力显微镜测得的PB膜与金膜界面图，图(c)为图(b)中所示线段的高度信息。

图2：实施例2制备的厚度为50nm的双氧水传感器的表面结构图。其中图(a)为扫描电子显微镜(SEM)图片，图(b)为原子力显微镜测得的PB膜与金膜界面图，图(c)为图(b)中所示线段的高度信息。

图3：实施例3制备的厚度为80nm双氧水传感器的表面结构图。其中图(a)为扫描电子显微镜(SEM)图片，图(b)为原子力显微镜测得的PB膜与金膜界面图，图(c)为图(b)中所示线段的高度信息。

图4：实施例4制备的厚度为106nm双氧水传感器的表面结构图。其中图(a)为扫描电子显微镜(SEM)图片，图(b)为原子力显微镜测得的PB膜与金膜界面图，图(c)为图(b)中所示线段的高度信息。

图5：实施例1-4制备的过氧化氢传感器检测过氧化氢新能图。其中a，b，c，d分别是实施例1，2，3，4所述的过氧化氢传感器在-0.1V(相对Ag/AgCl)恒压条件下的过氧化氢计时电流曲线。

图6：实施例1-4制备的过氧化氢传感器的电流密度与过氧化氢浓度之间的关系图。其中a，b，c，d分别为实施例1-4制备的过氧化氢传感器的电流密度与过氧化氢浓度关系，均由图5计算拟合得出。

图7：实施例1-4制备的过氧化氢传感器利用循环伏安法测试耐久性对比图。其中图a-d分别为实施例1-4制备的过氧化氢传感器进行1000次循环伏安测试后，以100次循环为间隔取得的CV曲线图像。

图8：通过图7计算出的实施例1-4制备的过氧化氢传感器的耐久性曲线，曲线中的各点以每100次间隔的循环伏安曲线面积除以第一次循环伏安曲线面积所得百分比，均由图7计算得出。

具体实施方式

以下将对本发明的各具体实施方式作出详细说明，其中，除非特殊说明，本发明所出现或使用的术语均具有本领域通常的物理、化学含义。如，本发明中为了简要起见，使用“M”表示1摩尔/升或1mol/L。

<第一实施方式>

本发明的第一实施方式，提供了一种电化学生物传感器电极，所述电极包括：基底、基底之上的金薄膜，以及形成于所述金薄膜之上的修饰层，所述金薄膜为使用溅射沉积法形成。

基底

本发明的基底没有特别的限定，只要其可以实现本发明的上述效果即可。如可以使用本领域常规的基底，只要其具备所需要的导电性和支撑性。

本发明的基底可以选自碳类、玻碳类基底以及半导体类基底或导电高分子类基体。

对于碳类基体，例如可以列举的为石墨、碳纳米管、石墨烯、类金刚石碳、硼掺杂金刚石之类的碳基底等。对于半导体类例如，可以列举的为或硅、或ITO、IZO、AZO、FTO之类的半导体透明导电膜。此外，对于导电高分子膜，其为采用导电高分子形成的膜材或板材加工而得到。所谓导电高分子是由具有共扼π-键的高分子经化学或电化学“掺杂”使其由绝缘体转变为导体的一类高分子材料。高分子导电材料通常分为复合型和结构型两大类：①复合型高分子导电材料，由通用的高分子材料与各种导电性物质通过填充复合、表面复合或层积复合等方式而制得；②结构型高分子导电材料。是指高分子结构本身或经过掺杂之后具有导电功能的高分子材料。根据电导率的大小又可分为高分子半导体、高分子金属等。

并且，从获得高检测范围，高灵敏度，低检测极限的电极的角度考虑，本发明的基底优选为硅片。

此外，在使用本发明所可选基底前，可以对基底进行必要的清洗和/或活化。具体的清洗、活化方式没有特殊限定，可以使用本领域通用的方式来进行，只要不损害本发明的最终效果即可。

金薄膜以及金属过渡层

本发明中的采用溅射沉积的方法在上述基底上沉积形成一层金薄膜。

具体而言，本发明中使用磁控溅射沉积的方法。溅射沉积是在真空环境下，利用荷能离子轰击材料表面，使被轰击出的粒子沉积在基体表面的技术。磁控溅射沉积方法一般分为平衡磁控溅射法以及非平衡磁控溅射法。对于本发明而言，从基底尺寸以及工艺简便的角度考虑，优选使用平衡磁控溅射法。

平衡磁控溅射通常被称作常规磁控溅射。利用磁场对二次电子实施有效控制，从而变二极溅射的缺点为自身的优点。平衡磁控溅射的工作原理为将二次电子在相互垂直的电磁场中，被束缚在靶表面附近沿着“跑道”环绕磁力线做圆滚性运动，提高了气体的离化率，即使工作气压降低到10^-1-10^-2Pa数量级，仍能增加等离子体密度，从而可提高入射离子密度，有利于降低溅射电压，同时提高沉积速率；而二次电子只有在能量耗尽以后才能脱离靶表面落在阳极上，所以基体避免了二次电子的轰击，基体温升低，无损伤。平衡磁控溅射可有效应用于对温度要求严格的基体材料的表面改性。

本发明中，金薄膜的沉积厚度控制在200-400nm，优选为200-350nm，更优选为250-330nm。金薄膜的厚度沉积过小，则有无法消除表面缺陷的担忧，使得传感器电极的各项检测性能出现噪音或者重复性较差。但厚度过大，则一方面并不能明显提高传感器电极的各项性能，另一发明则增加制造成本。

进一步，在本发明优选的实施方式中，在进行上述溅射沉积金薄膜之前，预先在基底上沉积一层金属过渡层。

取决于溅射沉积控制的条件等因素，在将金薄膜直接沉积于基底之上时，由于金/基底界面存在着晶格不匹配的现象，在某些情况下将导致金薄膜初始形成的孵育时间变长，同时也导致在沉积金薄膜时容易形成表面缺陷和不均。在另外的情况下，也可能导致沉积于基底之上的金薄膜与基底的结合性受到影响，从而在后续的电化学循环中引起不期望的传感器时效。

因此，在金薄膜与基底之间预先形成金属过渡层有利于避免以上问题。即，本发明优选的实施方案中，金属过渡层可以良好的解决基底与金薄膜之间存在的晶格不匹配以及增加金薄膜与基底的结合的作用。

金属过渡层可以采用如上所述的磁控溅射沉积法进行沉积，沉积的厚度为10-40nm，优选20-30nm。对于金属过渡层的厚度，太小则无法起到晶格匹配的作用，太大则经济性变差。

对于金属过渡层的材质，只要能够满足改善基底/金薄膜的界面结合性，就没有特别的限定。例如，可以选自Cr、Ti以及它们的合金中的至少任一者。优选的，本发明中，金属过渡层的材质不同于或不含有金，特别优选的，本发明中，金属过渡层使用Cr而形成。

修饰层

本发明的修饰层为电化学活性物质层，具有特定的选择性。本发明的修饰层中，包括普鲁士蓝(PB)。

在本发明的一些实施方案中，在金薄膜之上，采用电化学方法沉积一层普鲁士蓝层。典型的，进行沉积时，可以以金薄膜为工作电极，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt丝为对电极，以含有Fe³⁺及Fe(CN)₆ ⁴⁺，K⁺以及HCl的混合溶液为电解液进行电化学沉积，在恒定的沉积电压0.4V(相对Ag/AgCl电极)下进行电化学沉积，获得PB修饰电极。

控制沉积的时间，可以控制PB层的沉积厚度。本发明中PB层的厚度为35-110nm。沉积时间可以为15-240s，在一些情况下，沉积时间可以为10-260s，只要能够获得上述所需的沉积厚度，沉积时间随着沉积条件的不同可以进行适当的调整。

在本实施方式中，通过对PB沉积厚度的控制和调整，能够获得高检测线性范围，高灵敏度，低检测极限，较好耐久性以及强选择性的电化学过氧化氢生物传感器电极。

在现有的一些研究中提出了降低PB层的沉积厚度可以提高检测的灵敏度，然而本发明发现，对于PB层的沉积厚度过低，则可能导致检测灵敏度的损失。推测的原因在于，由于PB沉积层厚度过低，则可能导致PB沉积层无法实现均匀的覆盖，也可能导致PB沉积过程中沉积层所出现的一些缺陷点无法得到与有效的修复。因此，按照本发明的观点，PB沉积层的厚度应当在35nm以上，优选在40nm以上，这样的厚度，将有利于消除PB沉积不均的现象，同时能够使得PB层的表面缺陷得到消除。当PB层厚度低于35nm，尤其是当其厚度30nm以下时，则表现出了灵敏度的损失。因此，尽管理论上PB层的厚度越小越有利于PB与薄膜的相互作用，从而有利于提高检测灵敏度，但受到现实物理、化学条件的影响，PB的有效作用厚度存在一定的阈值。

随着PB沉积厚度的增加，检测的线性范围明显变宽，但此时检测的灵敏度呈现出下降的趋势。推测的原因可能在于，随着PB沉浸厚度的增加，使得PB表面的缺陷得到改善，因此，在恒定的电压下，能够呈现出较宽的线性范围，且线性相关系数大于0.99，但此时PB表层与金薄膜的距离变大，使得被检测分子或其与PB相互作用的产物扩散到金薄膜层的距离变长(即，电信号的扩散或接收距离增长)，因此，又导致了检测灵敏度的相对下降。

此外，随着PB层沉积厚度的增加，PB的微观形貌由主要为(无定型的)球状过渡到主要为立方(晶型)颗粒状，而随着PB层的形貌的变化，影响到电极的使用耐久性。在一些情况下，由于在最初形成的PB层中，以无定型的球形颗粒为主，随着PB的厚度的增加，耐久性增加，但是PB厚度增加到一定程度后在一定的PB厚度范围内，耐久性不再继续明显增加。然而，经过进一步的PB层的沉积，PB层中，逐渐形成了立方晶型的PB颗粒，此后又导致了耐久性的增加。当PB层中立方晶型的PB颗粒成长到一定程度时，由于晶界的作用，也可能导致PB层表面出现裂纹。

因此，可以看出，对于在金薄膜上PB层的沉积厚度，不仅要考虑兼顾优良的灵敏度，也要兼顾较宽的检测线性范围、以及使用的耐久性等。因此，从这个角度而言，本发明的PB沉积厚度为35-110nm，优选40-70nm，更优选40-60nm。

通过对以上PB膜厚度的控制，举例而言，可以实现如下优异的检测效果，对双氧水的检测限为0.77μM以上，即检测极限的最低值为0.77μM；检测的线性范围为1-XμM，所述X为大于1500且在4500以下的数值，并且，在一些实施方案中，线性范围优选为1-3000μM，检测灵敏度为250-350mA/Mcm²，优选为280-350mA/Mcm²，更优选为310-350mA/Mcm²。

其他活性物质

在本实施方式中，除了在金薄膜上电化学沉积PB可以作为活性物质层以外，不受限制的，可以根据实际需要，在同一层，或者PB层以外的独立的层中沉积使用其他的活性物质。

所述的活性物质可以为各种酶。可以列举的为：葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、辣根过氧化氢酶、胆固醇氧化酶、黄嘌呤氧化酶、乙酰胆碱脂酶、有机膦水解酶等中的一种或几种。

对于以上活性物质可以通过本领域通常的沉积方法进行沉积。并且，可以根据需要，进行一层或多层的沉积，前提是不损害本发明的技术效果。

<第二实施方式>

本发明的第二实施方式中，提供了一种电化学生物传感器。该传感器基于<第一实施方式>中所描述或定义的传感器电极。

上述传感器可以单独作为直接传感器而直接使用，可以检测对PB敏感的小分子，如过氧化氢。

此外，亦如上所述，可以将包括其他活性物质层的传感器作为间接传感器而使用。可以结合使用上文所提及的酶，对诸如葡萄糖、蛋白质等分子或成分进行检测。

进一步，可以将上述传感器进行必要的封装或者其他的任意修饰，只要不损害本发明的效果即可。通过必要的封装，可以适用于各种场合，并且有利于提高使用的安全性和保证检测的有效性。

此外，在本发明的实施方式中，同时提供了一个电化学生物传感器，其包括<第一实施方式>中的传感器电极，并基于此，制备为工作电极。此外，该传感器还包括参比电极以及对电极。所述参比电极可以为本领域常规的参比电极，例如甘汞电极、银/氯化银电极等。对于对电极，可以使用Pt丝或板等。

典型地，本实施方式的产品为一种可以对过氧化氢浓度进行直接检测的电化学生物传感器。具体而言，在同一电解池中，本实施方式采用三电极体系，一个工作电极，一个参比电极，一个对电极，其中工作电极采用磁控溅射金膜。此后，在电解池中加入一定量的沉积液，通过在工作电极上施加恒定电压，一定时间后金膜表面即沉积一层普鲁士蓝薄膜。将得到的普鲁士蓝修饰电极进行一定化学、物理过程处理后，置入相同电解池中，以普鲁士蓝修饰电极为工作电极进行过氧化氢浓度测定。测定过程中仍然在工作电极施加恒定电压，在电解池中加入一定量磷酸缓冲液(PBS)，施加搅拌条件下滴入不同浓度的过氧化氢溶液，通过电流强度响应进行检测。

<第三实施方式>

在本实施方式中，本发明提供了一种制备电化学生物传感器电极以及制备一种检测过氧化氢用电化学生物传感器的方法。

其中，制备所述传感器电极的方法包括：

所述金薄膜厚度为200-400nm，所述修饰层厚度为35-110nm，

根据以上所述方法，在所述形成基底电极的步骤中，还包括在基底上沉积金薄膜之前，预先沉积金属过渡层的步骤，所述金属过渡层包含选自Cr、Ti以及它们的合金中的至少任一者。

此外，本实施方式的过氧化氢检测用电化学生物传感器的制备方法包括了以上的步骤，任选的，还可以包括形成或制备其他活性物质层的步骤、制备参比电极、对电极以及任意必要的封装的步骤。

在这些步骤中，所使用的仪器或设备，没有特殊的限定，只要满足足以实现本发明的效果即可。

更具体而言，本实施方式中制备电化学生物传感器电极的技术方案如下：

(1)基底电极的形成：将300μm厚度的硅片置于磁控溅射设备中，以超纯铬(铬含量≥99.99wt.％)为靶材，首先沉积一层20nm厚度的铬金属层；之后以金(金含量≥99.99wt.％)为靶材，溅射沉积一层200-400nm厚度的金膜。

(2)将所得金膜通过切割工艺制成尺寸为10mm×10mm的正方形金膜电极，并依次在稀盐酸，稀氢氧化钠溶液，去离子水，丙酮和酒精中进行超声清洗并吹干。

(3)以预处理后的金膜为工作电极，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt丝为对电极，以含有Fe³⁺及Fe(CN)₆ ⁴⁺，K⁺以及HCl的混合溶液为电解液进行电化学沉积，沉积时间为10-240s，沉积电压为0.4V(相对Ag/AgCl电极)获得PB修饰电极。

(4)将所得到的PB修饰电极在含K⁺及HCl的溶液中进行循环伏安活化，电压范围-0.05V～0.35V，电压扫描速率0.05V/s，循环次数为25-40，优选35次。之后在磷酸缓冲液中进行恒电位稳定极化，恒定电位-0.1～0.1V(相对Ag/Cl电极)，优选-0.05V(相对Ag/Cl电极)，稳定极化时间为120-600s，优选600s。之后将PB修饰电极用去离子水进行清洗并在100℃下干燥1h，得到所述电化学生物传感器电极。

进一步，步骤(3)中所述沉积溶液为2.5mM FeCl₃+2.5mM K₃Fe(CN)₆+0.1M KCl+0.12M HCl溶液，由上述无机盐及酸溶液与100mL去离子水制得。

进一步，步骤(3)所述沉积时间为10s，沉积电压为0.4V(相对Ag/AgCl电极)，获得PB薄膜厚度为30nm。

进一步，步骤(3)所述沉积时间为40s，沉积电压为0.4V(相对Ag/AgCl电极)，获得PB薄膜厚度为50nm。

进一步，步骤(3)所述沉积时间为120s，沉积电压为0.4V(相对Ag/AgCl电极)，获得PB薄膜厚度为80nm。

进一步，步骤(3)所述沉积时间为240s，沉积电压为0.4V(相对Ag/AgCl电极)，获得PB薄膜厚度为106nm。

进一步，步骤(4)所述电极稳定溶液为0.12M HCl+0.1M KCl溶液，由上述无机盐和浓盐酸溶液与100mL去离子水制得。

进一步，步骤(4)所述磷酸缓冲液为0.05M KH₂PO₄/K₂HPO₄+0.1M KCl溶液，由上述无机盐粉末与100mL去离子水制得。

本实施方式以上电极可以作为直接传感器用于过氧化氢的检测，在另外的实施方式中，配合其他活性物质酶，如上文所述的，可以实现对于葡萄糖、蛋白质等物质的检测(即，间接传感器)。

本发明所述过氧化氢传感器电极的功能薄膜(PB薄膜)厚度为35-110nm，优选40-70nm，更优选为40-60nm，对双氧水的检测限为0.77μM以上，检测的线性范围为1-XμM，所述X为大于1500且在4500以下的数值，在一些实施方案中线性范围优选为1-3000μM，检测灵敏度为250-350mA/Mcm²，优选为280-350mA/Mcm²，更优选为310-350mA/Mcm²。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明采用电化学沉积方法制备基于PB功能层的过氧化氢传感器，其灵敏度高，线性范围广，检测极限低且耐久性优异。功能层的制备及固定一次性完成。与其他传感器相比，本发明采用磁控溅射金薄膜，具有成本低，操作简单，并且可实现柔性制备应用生物体检测体验舒适等优点。

实施例

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

本发明所述过氧化氢传感器检测过氧化氢的灵敏度和耐久性测试方法为：

(1)灵敏度及检测范围测试：

以本发明过氧化氢传感器(Au/PB电极)为工作电极，Ag/Cl为参比电极，Pt片为对电极。在以步骤(3)所述的100mL磷酸缓冲液(PH＝6.2)中，在轻微搅拌条件下(转子转速为200-250RMP)采用计时电流法，不断滴加定量浓度的过氧化氢溶液进行灵敏度及线性范围测试，实验过程中在工作电极施加恒电位，电压范围-0.15～0.15V(相对Ag/Cl电极)，优选-0.1V。

(2)耐久性测试：

以本发明所述过氧化氢传感器(Au/PB电极)为工作电极，Ag/Cl为参比电极，Pt片为对电极。在以步骤(3)所述的100mL磷酸缓冲液(PH＝6.2)中，利用循环伏安法测试传感器的耐久性能。循环伏安的电压范围为-0.05～0.35V(相对Ag/AgCl电极)，扫描速率50mV/s，循环次数为600-1200次，优选1000次，通过计算各100次的循环伏安曲线面积进行耐久性测试。实施例1(参考例)

(1)磁控溅射金膜处理

将200-400μm厚度的硅片置于磁控溅射设备中，以超纯铬(铬含量≥99.99wt.％)为靶材，首先沉积一层20nm厚度的铬金属层；之后以金(金含量≥99.99wt.％)为靶材，溅射沉积一层200-400nm厚度的金膜。之后，将所得磁控溅射金膜裁剪为10mm×10mm的正方形金膜电极，并依次在稀盐酸，稀氢氧化钠溶液，去离子水，丙酮和酒精中进行超声清洗30min，之后使用氮气喷枪吹干，获得预处理后的金膜，备用。

(2)普鲁士蓝修饰薄膜的制备

采用三电极体系，以步骤(2)预处理后的金膜基底材料为工作电极，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt丝为对电极，以终浓度为2.5mM的FeCl₃，终浓度为2.5mM的K₃Fe(CN)₆，终浓度为0.1M KCl和终浓度为0.12M的HCl溶液为电解液进行电化学沉积，沉积时间为10s，沉积电压为0.4V(相对于Ag/AgCl电极)获得厚度为30nm的PB修饰电极。

(3)将所得到的PB修饰电极在终浓度为0.12M的HCl和终浓度为0.1M的KCl混合溶液中进行循环伏安活化，电压范围-0.05～0.35V，电压扫描速率0.05V/s，循环圈数为25。之后在100mL含有0.05M KH₂PO₄/K₂HPO₄+0.1M KCl的磷酸缓冲液(PH＝6.2)中进行恒电位稳定极化，恒定电位-0.05V(相对Ag/Cl电极)，稳定极化时间为120s。之后将PB修饰电极用去离子水进行清洗，使用氮气枪吹干后在100℃下干燥1h，得到所述双氧水生物传感器。该过氧化氢生物传感器的表面结构及功能层厚度如图1所示。

(4)过氧化氢电流响应测试：

将PB功能层厚度为30nm的过氧化氢生物传感器置于0.05M磷酸缓冲液中(PH＝6.2)中，在轻微搅拌条件下(转子转速为200RMP)采用计时电流法，不断滴加定量浓度的过氧化氢溶液进行灵敏度及线性范围测试，实验过程中在工作电极施加0.1V(相对Ag/Cl电极)恒电位。结果如图5中a曲线及图6中a曲线所示，该传感器对过氧化氢的检测限为0.44μM(信噪比为3)，线性范围为1-1500μM，检测灵敏度为204mA/Mcm²。

(5)过氧化氢生物传感器的耐久性测试

以本发明所述过氧化氢传感器(Au/PB电极)为工作电极，Ag/Cl为参比电极，Pt片为对电极。在磷酸缓冲液(PH＝6.2)中，利用循环伏安法测试传感器的耐久性能。循环伏安的电压范围为-0.05～0.35V(相对Ag/AgCl电极)，扫描速率0.05V/s，循环次数为1000次，每隔100次的循环伏安曲线与首次循环伏安曲线面积进行比例计算，得到图7中a所示的循环伏安曲线及图8中的a曲线。实验数据表明，该电极在进行1000次循环伏安扫描后，电容衰减率约为35％。

实施例2

采用三电极体系，以实施例1步骤(1)预处理后的金膜基底材料为工作电极，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt丝为对电极，加以实施例1中的电解液进行电化学沉积，沉积时间为40s，沉积电压为0.4V(相对于Ag/AgCl电极)获得厚度为50nm的PB修饰电极。

将所得到的PB修饰电极在实施例1中的活化用溶液中进行循环伏安活化，电压范围-0.05V～0.35V，电压扫描速率0.05V/s，循环圈数为35。之后在实施例1中的磷酸缓冲液(PH＝6.2)中进行恒电位稳定极化，恒定电位-0.05V(相对Ag/Cl电极)，稳定极化时间为600s。之后将PB修饰电极用去离子水进行清洗，使用氮气枪吹干后在100℃下干燥1h，得到所述双氧水生物传感器。该过氧化氢生物传感器的表面结构及功能层厚度如图2所示。

该传感器对过氧化氢的检测灵敏度及线性范围(检测方法同实施例1)见图5中b曲线及图6中b曲线所示，其过氧化氢的检测限为0.77μM(信噪比为3)，线性范围为1-3000μM，检测灵敏度为341mA/Mcm²。该电极的耐久性测试(测试方法同实施例1)结果见图7中b及图8中b曲线，其1000次循环伏安扫描后的电容衰减率小于25％。

实施例3

采用三电极体系，以实施例1步骤(1)预处理后的金膜基底材料为工作电极，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt丝为对电极，加以实施例1中的电解液进行电化学沉积，沉积时间为120s，沉积电压为0.4V(相对于Ag/AgCl电极)获得厚度为80nm的PB修饰电极。

将所得到的PB修饰电极在实施例1中的活化用溶液中进行循环伏安活化，电压范围-0.05V～0.35V，电压扫描速率0.05V/s，循环圈数为35。之后在实施例1中的磷酸缓冲液(PH＝6.2)中进行恒电位稳定极化，恒定电位-0.05V(相对Ag/Cl电极)，稳定极化时间为240s。之后将PB修饰电极用去离子水进行清洗，使用氮气枪吹干后在100℃下干燥1h，得到所述双氧水生物传感器。该过氧化氢生物传感器的表面结构及功能层厚度如图3所示。

该传感器对过氧化氢的检测灵敏度及线性范围(检测方法见实施例1)见图5中c曲线及图6中c曲线所示，其过氧化氢的检测限为0.1μM(信噪比为3)，线性范围为1-3500μM，检测灵敏度为318mA/Mcm²。该电极的耐久性测试(测试方法同实施例1)结果见图7中c及图8中c曲线，其1000次循环伏安扫描后的电容衰减率为25％。

实施例4

采用三电极体系，以实施例1步骤(1)预处理后的金膜基底材料为工作电极，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt丝为对电极，加以实施例1中的电解液进行电化学沉积，沉积时间为240s，沉积电压为0.4V(相对于Ag/AgCl电极)获得厚度为106nm的PB修饰电极。

将所得到的PB修饰电极在实施例1中的活化用溶液中进行循环伏安活化，电压范围-0.05V～0.35V，电压扫描速率0.05V/s，循环圈数为30。之后在实施例1中的磷酸缓冲液(PH＝6.2)中进行恒电位稳定极化，恒定电位-0.05V(相对Ag/Cl电极)，稳定极化时间为240s。之后将PB修饰电极用去离子水进行清洗，使用氮气枪吹干后在100℃下干燥1h，得到所述双氧水生物传感器。该过氧化氢生物传感器的表面结构及功能层厚度如图3所示。

该传感器对过氧化氢的检测灵敏度及线性范围(检测方法见实施例1)见图5中d曲线及图6中d曲线所示，其过氧化氢的检测限为2.38μM(信噪比为3)，线性范围为5-4500μM，检测灵敏度为281mA/Mcm²。该电极的耐久性测试(测试方法同实施例1)结果见图7中d及图8中d曲线，其1000次循环伏安扫描后的电容衰减率为少于22.5％。

实施例5(参考例)

重复实施例4的实验条件，除了将沉积PB膜的时间调整为280s，以得到厚度更厚的PB沉积膜。

从以上实施例1-4可以看出，随着沉积时间的的增加，PB膜的沉积厚度逐渐增加。

对于以往文献所指出的活性物质层形成的厚度越小，则灵敏度约高的判断，实施例1显示了在沉积时间为10s的情况下，沉积厚度(30nm)过小，可能在金薄膜表面沉积层出现分布不均匀或者产生过多缺陷，导致其检测灵敏度较低。这也说明了，尽管本领域在某种程度上可能存在着以上的定性共识，但从本发明的定量分析上，PB膜厚度对检测灵敏度的反相关现象具有一定的阈值。即只有当厚度超过了这个阈值之后，PB膜厚度才展现出与检测灵敏度的反相关。

对于实施例2-4，则显示出了随着PB膜的厚度的增加，虽然检测灵敏度依次降低，但检测线性范围逐渐变宽，因此，可以根据实施例2-4的数据，将PB膜的厚度控制在适当的范围，既可以得到较好的检测灵敏度，也可以兼顾较宽的检测范围。

对于检测极限，虽然实施例1示出了较低的检测极限，但考虑到其检测灵敏度较低，且其PB膜可能存在缺陷的问题，因此，其检测灵敏度不在本发明的保护范围以内。

对于实施例5，在实际进行操作时，重复相同的实施例5，发现在一些PB膜表面出现裂纹，导致测试数据出现分散和不稳定，这可能是由于，随着沉积厚度的增加(尤其是PB膜厚度大于110nm后)，PB膜层中立方晶体不断生长，晶界与晶界之间出现分离现象有关。

产业上的可利用性

本发明的生物电化学传感器可以被工业生产，并可以应用于生物体过氧化氢的检测。

Claims

1.一种电化学生物传感器电极，其特征在于，所述电极包括：基底、基底之上的金薄膜，以及形成于所述金薄膜之上的修饰层，

所述金薄膜为使用溅射沉积法形成，其厚度为200-400nm，

所述修饰层中包括普鲁士蓝，且其厚度为35-110nm，

2.根据权利要求1所述的传感器电极，其特征在于，所述基底选自碳基底、玻碳基底、半导体基底或导电高分子膜基底，

所述碳基底选自：石墨、碳纳米管、石墨烯、类金刚石碳或硼掺杂金刚石；

半导体基底选自：硅基底、或ITO、IZO、AZO、FTO半导体透明导电膜；

作为优选的基底，为硅基底。

3.根据权利要求1或2所述的传感器电极，其特征在于，在基底与金薄膜之间存在金属过渡层，所述金属过渡层包含选自Cr、Ti以及它们的合金中的至少任一者。

4.根据权利要求3所述的传感器电极，其特征在于，所述金属过渡层采用溅射沉积法形成，其厚度为10-40nm。

5.根据权利要求1-4任一项所述的传感器电极，其特征在于，所述修饰层通过电化学沉积法形成。

6.一种电化学生物传感器，其特征在于，其是基于根据权利要求1-5任一项所述的传感器电极而得到。

7.一种过氧化氢检测用电化学生物传感器，其特征在于，所述传感器为根据权利要求6所述的传感器，所述传感器检测过氧化氢的灵敏度为250-350mA/Mcm²，检测极限为0.77μM以上，线性范围为1-XμM，所述X为大于1500且在4500以下的数值。

8.一种电化学生物传感器电极的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

所述金薄膜厚度为200-400nm，所述修饰层厚度为35-110nm，

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在所述形成基底电极的步骤中，还包括在基底上沉积金薄膜之前，预先沉积金属过渡层的步骤，所述金属过渡层包含选自Cr、Ti以及它们的合金中的至少任一者。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述金属过渡层通过溅射方法进行沉积，厚度为10-40nm。

11.一种过氧化氢检测用电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，其包括根据权利要求8-10任一项所述的方法，所述传感器的检测灵敏度为250-350mA/Mcm²，检测极限为0.77μM以上，线性范围为1-XμM，所述X为大于1500且在4500以下的数值。