CN107406870A - 乳酸和/或乙酸细菌或真菌的选择性检测 - Google Patents

乳酸和/或乙酸细菌或真菌的选择性检测 Download PDF

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Abstract

一种用于在食品加工基质中检测乳酸和/或乙酸细菌的方法，所述食品加工基质包含微生物菌群(微生物菌群包含乳酸和/或乙酸细菌菌群)和真菌菌群，细菌菌群包含细菌来源的三磷酸腺苷，真菌菌群包含真菌来源的三磷酸腺苷，所述方法包括以下步骤：‑向基质施加抗真菌剂，该抗真菌剂具有抗真菌作用，其在第一时间限制对于真菌菌群是致命的；以及抗生素作用，其在第一时间限制之后的第二时间限制对于细菌菌群是非致命的，‑在第一时间限制和第二时间限制之间检测微生物菌群，其中对于第一时间限制，致命抗真菌作用将真菌来源的三磷酸腺苷释放到基质中，并且其中在第一时间限制和第二时间限制之间通过以下步骤来检测微生物菌群：‑从基质除去游离三磷酸腺苷，然后‑向基质施加裂解剂，以从基质释放细菌来源的三磷酸腺苷，然后‑测量释放的三磷酸腺苷。

Description

乳酸和/或乙酸细菌或真菌的选择性检测
本申请涉及在这些细菌和这些真菌的混合物中细菌的选择性检测或真菌的选择性检测。
本申请因此涉及在包含这些乳酸细菌(乳酸菌，lactic acid bacteria)或这些乙酸细菌(乙酸菌，acetic acid bacteria)并且包含真菌，特别是酵母或霉菌的混合物中乳酸或乙酸细菌的存在的检测、测量或评估。在饮料如啤酒、葡萄酒中，在糖业中在甜菜或甘蔗汁的挤压期间，以及在碳酸甜饮料如柠檬汁中，或在果汁(在它们的处理过程中)中发现这样的混合物。
本申请还涉及在包含乳酸细菌或乙酸细菌并且包含所述真菌，特别是酵母或霉菌的混合物中真菌的存在的检测、测量或评估。
本申请甚至更具体地涉及在含有真菌的介质中乳酸或乙酸细菌的存在的评估，其中通过测量这些细菌的三磷酸腺苷或ATP，或ATP测量法，尤其是通过利用荧光素、荧光素酶和生物发光测量。
本申请还涉及所述评估，其中通过添加发光试剂，如鲁米诺或生存力标记，以使得活微生物能够在有或没有激发的情况下发射可测量或可检测的冷光(通过任何光学方式)。
乙酸细菌以下是指需氧革兰氏阴性菌，其能够将乙醇转化成乙酸。乙酸细菌存在于葡萄酒和苹果酒中并且很少在用二氧化碳饱和的啤酒中。在酒精和或苹果乳酸发酵之后，在葡萄酒中，在啤酒中，以及在碳酸和甜饮料中，乙酸细菌的发展是不期望的。
乳酸细菌以下是指革兰氏阳性菌(兼性厌氧的或微需氧的)，其特别采取球菌或杆菌或四联球菌的形状并且能够将糖发酵成乳酸。乳酸细菌存在于葡萄酒、苹果酒、甜菜和甘蔗汁中，并且可以在碳酸饮料中，尤其是在苏打水和甜汁饮料中发现。在葡萄酒发酵和亚硫酸盐化(sulfiting)之后，以及在没有苹果乳酸发酵的苹果酒中，乳酸细菌的发展是不期望的，因为它们可以改变葡萄酒和苹果酒的感官品质。除了一些类型的比利时黑啤或柏林淡啤酒，其中在发酵期期间添加乳酸细菌，在啤酒中，乳酸细菌是不期望的。在糖业中，某些乳酸细菌如“肠膜明串珠菌”的发展会消耗在甜菜汁中的蔗糖，产生过滤问题和经济损失。
在整个申请中，术语“乳酸细菌或乙酸细菌”应理解为是指乳酸细菌、乙酸细菌或乳酸细菌和乙酸细菌。
除非另有规定，在本申请中，术语“细菌”或“细菌菌群(bacterial flora)”将被理解为“乳酸或乙酸细菌”的同义词。
在本申请中，术语“真菌”或“真菌菌群”将被理解为“霉菌或酵母菌”的同义词。
在本申请中，术语“基质(matrix)”将被理解为物质的组合物(composition ofmatter)(“物质的组合物”，在英语中)，其包含细菌和真菌。这样的混合物可以是固体，尤其是当它是干的，作为滤液或在离心之后，或湿的如果它被分散成液体时，或气体，例如空气采样。
术语“食品加工基质(food-processing matrix)”将被理解为固体或液体或气体介质，其含有(在容积中或在其表面处)在农业食品行业(包括农业)中，或在食物或饮料的手工生产期间遇到的微生物菌群(微生物菌丛，microbial flora)。
在本申请中，术语“产物A对产物B的液相应用”是指操作，其导致液体，该液体含有在溶液或分散体中的A和B。在水相中的应用是指液相应用，用于液体，其是水或与在通过本申请获得的溶液中的细菌生存相容的液体。
在本申请中，术语ATP或三磷酸腺苷是指这样的分子，在所有已知的活生物体的生物化学中，通过水解，其提供代谢的化学反应所需要的能量。
术语“游离ATP”是指在任何细胞之外的ATP，不管此ATP是否可用于生物发光反应。
术语发光是指任何发光，其不是在分析的样品中自然发生的，而是通过添加对这种发光反应必不可少的一种或多种试剂所诱导的，所述发光是在样品的活微生物细胞中可检测的，尤其是通过任何光学系统(在有或没有这种发光的激发的情况下)。
术语“杀菌剂”是指处理，基于在处理之后样品的琼脂平板计数，其具有减少细菌群体至少三个十进制对数的菌落形成单位/ml的效应。
麦角甾醇是指真菌的膜或细胞壁的成分。
“麦角甾醇的甾醇前体”是指这样的分子，该分子具有甾醇的化学结构，即，脂质，其具有在C-3位置处携带羟基的甾烷核，其是在真菌细胞中的麦角甾醇生物合成期间所产生。
术语“β-葡聚糖”是指由与β连接结合的D-葡萄糖组成的多糖，其中上述β连接可以是β(1,3)连接、β(1,4)或β(1,6)连接，数字表示有关的D-葡萄糖的原子。
术语“非竞争性抑制”是指酶的抑制，通过以对于这种酶的尽可能大的亲和力来结合自身以降低这种酶的活性，而不管这种酶是或不是结合至它的底物。
术语MRS是指De Man、Rogosa和Sharpe液体培养基或琼脂。
术语鲁米诺是指这样的分子，当与某些氧化剂混合时，其化学式C8H7N3O2产生具有独特的蓝色辉光的化学发光。还可以通过添加催化剂如甲萘醌来催化这种借助于鲁米诺的发光反应。一定数量的研究显示出在鲁米诺的发光信号和样品中细菌细胞的数目之间的相关性。
术语生存力标记是指使用的任何标记，其用来评估死细胞、受损细胞或具有细胞壁完整性的细胞的细胞壁状态，如碘化丙啶或溴化乙锭，以检测细胞内酶活性如例如活微生物细胞的酯酶活性，其经常是通过引入非发光分子来测量，其中在活细胞中的酶转化之后上述非发光分子成为发光的，或以同时评估细胞壁完整性和活细胞的细胞内酶活性。标记对于特定种类的微生物是非特异性的并且既不包括核酸探针也不包括DNA或RNA引物。通过发光，这种生存力标记是可检测的。它可以连同标记阻滞剂一起用来通过标记细胞的发光以改善检测。
现有技术熟悉ATP测量法的技术，其允许测量在溶液中的游离ATP以评估在溶液中存在的生物质。此技术首先假设制备通过释放进入溶液可得到的生物质ATP，例如通过裂解剂(lysis agent)，其引起活生物体的死亡并释放它们的ATP进入溶液，然后假设进行发光测量，其与在溶液中游离ATP的量成比例。为此目的，使用了利用荧光素-荧光素酶底物-酶复合物的已知的生物发光反应。通过借助于三磷酸腺苷水解的荧光素的事先激活来发生生物发光反应。可以使产生的光强度与在混合物中游离ATP的量成比例，因而可以通过发光计来光学上获得在样品中ATP量的评估。
裂解剂将被理解为：一种产物，其能够破开细菌或真菌膜。然而，大多数裂解剂只允许进入存在于溶液中的总生物质的细胞内ATP的总量。
对于细菌和真菌的混合物，因此不可能分别获得细菌菌群的细胞内ATP值的测量结果或真菌菌群的细胞内ATP值的测量结果。
于是，当它们具有比细菌更大的尺寸时，机械过滤用来保留真菌。然而，对于乳酸和乙酸细菌的混合物，过滤不是有效的。确实，在酵母菌和真菌的尺寸和乳酸和乙酸细菌簇的尺寸之间存在重叠，其中某些乳酸细菌形成非常可变长度的自然链、四联球菌、或簇，以及对于乙酸细菌比对于乳酸菌也是如此。在暴露于亚硫酸盐的葡萄酒和苹果酒中的Brettanomyces bruxellensis酵母菌具有例如减小的尺寸，其接近那些单细胞乙酸和乳酸细菌的尺寸。一些乳酸细菌还结合至酵母菌，这使得它们的机械分离不可能。
因此，在实践中，对于现有技术，通过ATP测量法，对在细菌菌群和真菌菌群的混合物中的乳酸或乙酸菌生物质的选择性测量是困难的问题。这同样适用于在这样的混合物中获得真菌生物质的选择性测量，除非忽略细菌生物质。
在这种情况下，本发明涉及用于在包含微生物菌群的食品加工基质中检测乳酸细菌和/或乙酸细菌的方法，微生物菌群包含乳酸和/或乙酸细菌菌群并包含真菌菌群，细菌菌群含有细菌来源(bacterial origin)的三磷酸腺苷，真菌菌群含有真菌来源的三磷酸腺苷，上述方法包括以下步骤：
-向基质施加抗真菌剂(antifungal)，该抗真菌剂具有抗真菌作用，其在第一时间限制(a first time limit)下对于真菌菌群是致命的，以及抗生素作用(antibioticaction)，其在第一时间限制之后的第二时间限制下对于细菌菌群是非致命的，
-在第一时间限制和第二时间限制之间检测微生物菌群；
其中，对于第一时间限制，致命抗真菌作用将真菌来源的三磷酸腺苷释放进入基质，以及在第一时间限制和第二时间限制之间通过以下步骤来检测微生物菌群：
-从基质除去游离三磷酸腺苷，然后
-向基质施加裂解剂以从基质释放细菌来源的三磷酸腺苷，然后
-测量释放的三磷酸腺苷。
在方法的变体中：
-抗真菌剂是麦角甾醇的抑制剂。
-抗真菌剂是麦角甾醇的甾醇前体的抑制剂。
-抗真菌剂具有戊二酰亚胺官能团并且是真核生物(真核细胞，eukaryote)的蛋白质合成的延长期的易位步骤的抑制剂。
-麦角甾醇的抑制剂是多烯家族的分子。
-麦角甾醇的甾醇前体的抑制剂是吗啉家族的分子。
-麦角甾醇的甾醇前体的抑制剂是唑类(吡咯，azoles)家族的分子。
-抗真菌剂是β-葡聚糖的合成的抑制剂。
本发明还涉及一种装置，该装置包含抗真菌剂，在应用之后，其具有抗真菌活性，该抗真菌活性在第一时间限制对于真菌菌群是致命的，以及在第一时间限制之后的第二时间限制下对于乳酸和/或乙酸细菌菌群为非致命抗生素活性，以及其包含用于检测微生物菌群的装置，所述微生物菌群包含真菌菌群以及乳酸和/或乙酸细菌菌群。
在装置的变型中：
-用于检测微生物菌群的装置包含裂解剂。
本发明还涉及上述方法单独评估(分开评估，separate assessment)在包含乳酸和/或乙酸细菌菌群和真菌菌群的食品加工基质中真菌来源的三磷酸腺苷和细菌来源的三磷酸腺苷的应用，包括以下步骤：
-获取基质的第一等分部分(aliquot)；
-获取基质的第二等分部分；
-将所述方法应用至第一等分部分以获得第一测量结果，其表示在基质中细菌来源的三磷酸腺苷的量；
-将裂解剂施加至第二样品，然后测量在第二等分部分中的游离三磷酸腺苷，以获得第二测量结果，其表示在基质中细菌和真菌来源的三磷酸腺苷的量；
-在第二测量结果和第一测量结果之间形成差以获得第三测量结果，其表示在基质中真菌来源的三磷酸腺苷的量。
本发明还涉及用于在包含微生物菌群的食品加工基质中检测真菌的方法，微生物菌群包含乳酸和/或乙酸细菌菌群并包含真菌菌群，细菌菌群含有细菌来源的三磷酸腺苷，真菌菌群含有真菌来源的三磷酸腺苷，上述方法包括以下步骤：
-向基质施加抗真菌剂，该抗真菌剂具有抗真菌作用，其在第一时间限制对于真菌菌群是致命的，以及抗生素作用，其在第一时间限制之后的第二时间限制下对于细菌菌群是非致命的，
-在第一时间限制和第二时间限制之间测量在基质中释放的三磷酸腺苷。
鉴于下面描述的实施方式，本发明将更加清楚。
在第一实施方式中，选择多烯家族的抗真菌剂，抗真菌剂是：
分子A1＝两性霉素B
此多烯家族靶向真菌膜的麦角甾醇。多烯家族特别包含两性霉素B、制霉菌素、纳他霉素。
对酵母菌和对细菌的毒性结果示于下表，其显示真菌菌群暴露于分子A1的持续时间以及相关的荧光测量结果：通过微观检验和亚甲蓝染色，证实了在暴露于抗真菌剂之后的酵母菌裂解。
术语“接触时间”以下是指微生物暴露于杀真菌剂，这里为分子A1，的时间。
在下文中：“Sacch.”是“酵母属(Saccharomyces)”的缩写。
在下文中：“没有菌落”是“基于琼脂平板计数，没有菌落形成单元”的缩写。
分子A1
剂量：400mg/L(毫克/升)接触时间4小时
可以看出，对于使用的多烯家族的分子A1，发现了一种抗真菌剂，以400mg/升的剂量给予时，其仍然是非杀菌的。
分子A1：剂量：200mg/L接触时间4小时
可以看出，对于使用的多烯家族的分子A1，发现了一种抗真菌剂，当以200mg/升的剂量给予时，其对于乳酸菌和乙酸菌仍然是非杀菌的。
据估计，对于分子A1，浓度阈值在50mg/L之内或50mg/l至100mg/l，其允许获得对于乳酸和乙酸细菌为非杀菌的本发明的效果，同时对于酵母菌群体为抗真菌的。
为了确定特定分子是否适用于本发明，本领域技术人员可以构成抗真菌剂的第一清单和对于细菌为非杀菌剂的第二清单，然后选择出现在第一和第二清单中的产品，对于其来说，在杀菌活性以前，发生杀真菌活性干预。然而，杀真菌活性的实验验证将是必要的以确定最小抗真菌浓度/mg/L(或微克/毫升)，其取决于针对的真菌菌群。
为了利用分子A1对于上文提到的细菌和真菌的选择性性能，然后如下所述进行处理。
首先制备乳酸和/或乙酸细菌和真菌菌群的初始混合物，其表示在亚硫酸盐化之后在葡萄酒老化期期间的葡萄酒菌群，其被接种进入乳酸细菌和真菌菌群的人造葡萄酒或混合物，然后其被接种进入在瓶中的巴氏消毒啤酒，并构成人造水溶液。
或者，样品采样自过滤或未过滤的啤酒，其具有浊度和/或苦味，通常由乳酸细菌所引起，或取自在葡萄酒老化期期间的葡萄酒，在亚硫酸盐化以后，或在装瓶和过滤但已经历其感官品质的改变以后，如在口腔中的苦味或油性特点、或带有轻微醋味的酒香，其通常由乳酸或乙酸细菌所引起。然后在后亚硫酸盐化葡萄酒老化期期间，进行上述方法的应用，以在各种震动操作之后，或在啤酒厂中在啤酒麦汁的酒精发酵期期间，在啤酒过滤之后和之前，监测其数目逐渐减少的乳酸和乙酸细菌的异常生长，用于监测不受欢迎的乳酸细菌生长(用于质量控制目的)。
在第一步骤中，将初始混合物暴露于抗真菌剂，在这种情况下为A1，以例如100mg/l的浓度，其中通过施加进入水相，例如8小时。
为了进行这种施加进入水相：如果抗真菌剂和初始混合物各自在水相中，将混合它们；如果仅两种之一具有粉末形式，那么将它混合进入其它一种的水相，以及如果两者均具有粉末形式，则可以使它们与含水缓冲液混合。
在初始混合物暴露于抗真菌剂之后，真菌细胞已将它们的ATP释放进入水相并且可以通过各种已知方式(过滤，ATP酶，...)从水相消除这种真菌ATP。
细菌是在这个阶段剩下的仅有的活微生物并且它们具有比ATP分子更大的尺寸，其允许例如过滤。
因而，在消除真菌ATP之后，本发明的方法可以使用剩下细菌的任何计数方法，条件是在水相中死真菌细胞的膜碎片的存在不影响上述方法。
因而，活细菌的任何计数方法(例如通过固相的培养和枚举或通过流式细胞术、阻抗测量术、弯曲流式细胞术，在英语中为“喷射流式细胞术”，以及生存力标记、鲁米诺、发光试剂，…)可以以等同的方式用于对现在描述的死细菌的测量。
为了计数细菌，以下将使用它们的细菌ATP的测量。
因此，可以通过孔径为约0.2微米或0.45微米等级的过滤器来过滤水相，也就是说，比ATP分子更大的尺寸但比细菌的尺寸更小的尺寸，以获得在过滤器上的滤渣，其含有缺乏ATP的死真菌细胞膜和含有ATP的活细菌。
还可以通过酶如ATP酶，其除去游离ATP，来消除ATP，在这个阶段用于除去在水相中的游离ATP的任何方式是用于本发明的等效方式。
作为选择的方法，为了计数细菌，结合总溶解和ATP测量法的方法于是将用于本发明。为此目的，通过暴露于液相，通常为水相中的裂解剂，将杀死细胞，但首先能够从细胞释放ATP，在这个阶段，它们的生存是不再有用的。因而可以设想不同于水的其它液体用于裂解剂的这种应用，只要这些液体基本上不抑制ATP生物发光的酶反应。
例如对于细菌为非特异性的裂解剂的液相应用，它将引起在水相中存在的所有微生物细胞，因而演绎地主要存在于乳酸和乙酸菌细胞的初始混合物中的微生物细胞的裂解，其中通过将它们的细菌ATP释放进入液相。如果存在其它细菌，它们将构成系统误差，因此，本发明特别适用于在发酵期中的饮料(尤其是啤酒、葡萄酒、苹果酒)，其中可以微弱设想不同于乳酸和乙酸菌的其它细菌的存在，这是由于这些饮料pH或在啤酒中二氧化碳的存在。
在这个阶段，其中细菌的ATP主要构成在本发明的方法的水相中的游离ATP，于是可以以等同的方式使用在溶液中游离ATP的任何量化方法，以及尤其是ATP测量法。
为此目的，将方便地使用耦合的荧光素/荧光素酶以及与这种耦合的ATP的生物发光反应，以光学上确定细菌ATP以及得出在初始混合物中细菌来源的生物质的估计。
对于分子A1，针对4小时或8小时的接触时间以及对于不同菌株，已进行了真菌菌群破坏和对于乳酸或乙酸细菌菌群的抗真菌处理无害性的ATP测量法检查。
测试的菌株：酒酒球菌DSM、氧化葡糖杆菌、布鲁塞尔芽孢杆菌、酿酒酵母(制备在MRS液体培养基中)。
取1ml的样品并与在水溶液中制备的9ml的杀真菌处理剂混合，然后分析其中的500μL。
材料：借助于Biothema抗体生物发光试剂，即试剂“ATP消除缓冲剂”、“提取剂B/S”、“ATP试剂HS”以及来自新视野诊断(New Horizons Diagnostics)的0.45μm孔隙率FiltravetteTM比色杯过滤器，来测试Lum-1ATP仪表(型号类似于来自新视野诊断的Profile-1生物发光计)。
初始协议的描述：
在10mL塑料注射器内添加500μL的未经杀真菌处理或经杀真菌处理的悬浮液，上述塑料注射器包括在其末端处的合并有FiltravetteTM的细胞浓缩器。
通过FiltravetteTM的过滤
借助于下面的吸垫，将FiltravetteTM安置在FiltravetteTM夹持器上
在Filtravette内添加50μL的“ATP消除缓冲剂”
在室温下温育10分钟
借助于正压，通过吸垫，来冲洗“ATP消除缓冲剂”试剂
添加30μL的“提取剂B/S”均化和1分钟温育。
添加240μL的“ATP试剂HS”均化。
将Filtravette插入Lum-1抽屉(drawer)并关闭抽屉。
在关闭Lum-1抽屉之后125秒，记录显示值(以URL，相对光单位为单位)
对于分子A1，还测试了以下菌株：布鲁塞尔芽孢杆菌，糖化酵母(S.diastaticus)(制备在乳酸林格氏溶液中)。
简化协议：
取1ml的样品并与9ml的制备在水溶液中的杀真菌处理剂混合，然后分析其中的100μL
使用300毫升透明的葛来娜第一生化(Greiner Bio One)无菌平底一次性比色杯以及Biothema抗体生物发光试剂
1.将100μL的待测试的悬浮液加入已经在设备的读数室中就位的比色杯。
2.如有需要，添加30μL的“提取剂B/S”，然后均化。
3.添加150μL的“ATP试剂HS”均化。
4.在生物发光计抽屉滑动关闭之后65秒，进行发光读数(以URL，相对光单位为单位)。
在处理之前和之后的生物发光值说明处理效率
在处理之前和之后的生物发光值说明处理效率
上述方法适用于本发明的所有实施方式，即，具有对于乳酸或乙酸细菌为选择性的任何抗真菌剂。
同样，在本发明的所有实施方式中，将可以对两个等分部分，也就是说具有相同量的假想是均匀的初始混合物的两个样品，使用以下方法以选择性地确定在初始混合物中的真菌生物质：
-上述方法用于第一等分部分以获得细菌生物质的值的第一测量结果
-裂解第二等分部分以释放真菌和细菌ATP
-通过ATP测量法来测量真菌ATP，以获得真菌和细菌生物质的值的第二测量结果
-从第二测量结果减去第一测量结果以获得单独真菌生物质的值的第三测量结果。
因此，分子A1适应于本发明。
在第二实施方式中，选择吗啉家族的抗真菌剂，抗真菌剂是：
分子A2＝阿莫罗芬
此吗啉家族靶向真菌膜的麦角甾醇的甾醇前体。
对酵母菌和对细菌的毒性结果示于下表，其显示真菌菌群暴露于分子A2的持续时间以及通过在MRS琼脂培养基上的计数来获得。
分子A2
剂量：400mg/L，4小时接触时间
可以看出，对于使用的吗啉家族的分子A2，发现一种抗真菌剂，当以400mg/升的剂量给予时，其对于乳酸菌群和乙酸菌群均不是杀菌的。
分子A2：剂量：200mg/L，接触时间4小时
还可以看出，对于使用的吗啉家族的分子A2，发现一种抗真菌剂，当以200mg/升的剂量给予时，其对于乳酸菌群和乙酸菌群均不是杀菌的，因此适应于本发明。
据估计，对于分子A2，浓度阈值包括在100mg/l至200mg/l内(comprised within100mg/l and 200mg/l)，上述浓度阈值允许获得本发明的效果：对于乳酸和乙酸细菌是非杀菌的，同时对于酵母菌群体是早期抗真菌的。
与在第一实施方式中同样的方法适用于确定细菌或真菌生物质。
在第三实施方式中，选择唑类家族的抗真菌剂，抗真菌剂是：
分子A3＝伏立康唑
这种唑类家族靶向真菌膜的麦角甾醇的甾醇前体。
对于酵母菌和对于细菌的毒性结果示于下表，其显示真菌菌群暴露于分子A3的持续时间。
分子A3
剂量：400mg/L，接触时间18小时
可以看出，对于使用的唑类家族的分子A3，发现了一种抗真菌剂，当以400mg/升的剂量给予时，其对于乳酸菌群和对于乙酸菌群均不是杀菌的。
因此，在400mg/L的浓度下，分子A3适应于本发明。
分子A3：剂量：200mg/L，接触时间18小时
可以看出，对于使用的唑类家族的分子A3，发现了一种抗真菌剂，当以200mg/升的剂量给予时，其对于乳酸菌群和对于乙酸菌群均不是杀菌的。
据估计，对于分子A3，允许获得本发明的效果的浓度阈值是包括在200mg/l至300mg/l内。
与在第一实施方式中同样的方法适用于确定细菌或真菌生物质。
因此，在200mg/L的浓度下，分子A3适应于本发明。
在第四实施方式中，选择一种抗真菌剂，其具有戊二酰亚胺官能团并且是真核生物的蛋白质合成的延长期的易位步骤的抑制剂，抗真菌剂是：
分子A4＝放线菌酮
此家族还特别包括以下化合物：lactimidomycin。
对酵母菌和对细菌的毒性结果示于下表，其显示真菌菌群暴露于分子A4的持续时间。
分子A4
测试编号2：400mg/L
可以看出，对于使用的上述功能上定义家族的分子A4，发现了一种抗真菌剂，当以400mg/升或更大的剂量给予时，其还是保留了细菌细胞的完整性。
据估计，对于分子A4，允许获得本发明的效果的浓度阈值是大于300mg/l。
与在第一实施方式中同样的方法适用于确定细菌或真菌生物质。
分子A4适应于本发明。
分子A4特别适合于在亚硫酸盐化之后在葡萄酒老化期期间的葡萄酒，其靶向在酒糟中和在酒糟的附近存在的野生酵母菌。
在第五实施方式中，棘球白素家族的抗真菌剂，真菌细胞的β-葡聚糖的合成的抑制剂，抗真菌剂是：
分子A5＝卡泊芬净
通过1,3-β-葡聚糖合成酶的非竞争性抑制，这种化合物家族抑制真菌细胞的β-葡聚糖的合成并且包含至少以下化合物：白菌素、棘球白素B、睫状真菌素、卡泊芬净(或用法语“卡泊芬净”或“卡泊芬净”)、米卡芬净(或用法语“米卡芬净”或“米卡芬净”)、阿尼芬净(或用法语“阿尼芬净”或“阿尼芬净”)。
对酵母菌和对细菌的毒性结果示于下表，其显示真菌菌群暴露于分子A5的持续时间：
分子A5
剂量：400mg/L，接触时间4小时
可以看出，对于使用的棘球白素家族的分子A5，发现了一种抗真菌剂，当以400mg/升的剂量给予时，其对于乙酸细菌和对于乳酸细菌酒酒球菌仍然是非杀菌的。
分子A5
剂量：200mg/L，接触时间4小时
可以看出，对于使用的棘球白素家族的分子A5，发现了一种抗真菌剂，当以200mg/升的剂量给予时，其对于乙酸细菌和对于乳酸细菌酒酒球菌仍然是非杀菌的。
据估计，对于分子A5，浓度阈值是在100mg/l和200mg/l之间，其允许获得本发明的效果：对于乙酸细菌是非杀菌的，同时对于酵母菌群体是抗真菌的。
因此，本发明允许，通过将某些抗真菌剂施加于含有乳酸和/或乙酸菌群以及含有真菌的饮料或汁，可靠地和独立于真菌生物质来测量细菌生物质。本发明还允许通过从总生物质减去细菌生物质来确定真菌生物质。
因此本发明允许，以简单的方式，以进行的细菌ATP的测量的精度，或以用于替代施加于剩下的细菌的ATP测量法的细菌的任何计数方法的精度，在施加非杀菌的抗真菌剂之后，检测或估计在真菌菌群以及乳酸和/或乙酸细菌菌群的混合物中的细菌生物质的值。
为此，本领域技术人员可以研究真菌膜成分，如甘露聚糖或几丁质，以及在所述成分的生物合成路径中的这种成分或其前体之一的抗真菌抑制剂，具体如下：
选择一般可以涉及对于真菌王国具有特异性的生物合成反应的抑制剂，也就是说，涉及上述成分的生物合成路径的分支。在用于酿酒酵母生物合成路径的麦角甾醇成分的情况下，因而对开始自羊毛甾醇的特定分支进行选择。烯丙基胺家族的成员，例如，不是麦角甾醇生物合成的甾醇前体的抑制剂的一部分。因而测试此家族的分子，其中在不到二十四小时接触时间内均没有观测到杀酵母菌和杀菌效果。
选择可以涉及任何其它发光试剂，如使用鲁米诺、或任何细胞生存力标记，从而使得可以通过任何光学方式加以检测。
一般来说，对于其教导以及“具有在致命抗真菌作用之后的杀菌作用的抗真菌剂”的定义，本发明还涉及真菌膜的成分的生物合成反应的抑制剂，也就是说，这种抑制剂抑制在成分的生物合成路径中发生的反应。
本发明特别容许工业应用：制作葡萄酒、啤酒、苹果酒、苏打水和碳酸饮料，以及从甜菜汁或甘蔗汁来生产糖。
还可以看出，在其所有实施方式中，本发明可以以方法的形式用于在食品加工基质中选择性地检测真菌，上述食品加工基质包含微生物菌群，微生物菌群包含乳酸和/或乙酸细菌菌群并且包含真菌菌群，细菌菌群含有细菌来源的三磷酸腺苷，真菌菌群含有真菌来源的三磷酸腺苷，其中通过重复以下步骤：向基质施加抗真菌剂，其在第一时间限制对真菌菌群具有致命抗真菌作用，以及在第一时间限制之后的第二时间限制对细菌菌群具有非致命抗生素作用，所述致命作用释放真菌来源的三磷酸腺苷，时间为第一时间限制；在第一时间限制和第二时间限制之间测量释放进入基质的真菌来源的三磷酸腺苷。尤其是通过ATP测量法。
确实，在根据本发明的抗真菌剂被确定并具有对真菌菌群的第一致命作用以及在第一作用之后的对细菌菌群的第二作用之后，它可以尽快用于在这两种菌群的混合物中的细菌的选择性测量，其中通过测量，尤其是通过ATP测量法，在其间真菌是死的以及细菌是活的时间窗口，在致命作用之后剩余细菌的ATP或真菌ATP。

Claims (10)

1.一种用于在食品加工基质中检测乳酸细菌和/或乙酸细菌的方法，所述食品加工基质包含微生物菌群，所述微生物菌群包含乳酸和/或乙酸细菌菌群并且包含真菌菌群，所述细菌菌群包含细菌来源的三磷酸腺苷，所述真菌菌群包含真菌来源的三磷酸腺苷，所述方法包括以下步骤：
-向所述基质施加抗真菌剂，所述抗真菌剂具有在第一时间限制下对所述真菌菌群是致命的抗真菌作用以及在所述第一时间限制之后的第二时间限制下对所述细菌菌群是非致命的抗生素作用，
-在所述第一时间限制和所述第二时间限制之间检测所述微生物菌群；
其中，对于所述第一时间限制，所述致命的抗真菌作用将真菌来源的三磷酸腺苷释放到所述基质中，并且其中在所述第一时间限制和所述第二时间限制之间通过以下步骤来检测所述微生物菌群：
-从所述基质除去游离的三磷酸腺苷，然后
-向所述基质施加裂解剂，以从所述基质释放所述细菌来源的三磷酸腺苷，然后
-测量释放的所述三磷酸腺苷。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述抗真菌剂是麦角甾醇的抑制剂。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述抗真菌剂是麦角甾醇的甾醇前体的抑制剂。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述抗真菌剂具有戊二酰亚胺官能团并且是真核生物蛋白质合成延长期的易位步骤的抑制剂。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述抗真菌剂是β-葡聚糖的合成的抑制剂。
6.根据权利要求2所述的方法，其中，所述麦角甾醇的抑制剂是多烯家族的分子。
7.根据权利要求3所述的方法，其中，所述麦角甾醇的甾醇前体的抑制剂是吗啉家族的分子。
8.根据权利要求3所述的方法，其中，所述麦角甾醇的甾醇前体的抑制剂是唑类家族的分子。
9.根据权利要求1所述的方法单独评估在包含乳酸和/或乙酸细菌菌群和真菌菌群的食品加工基质中的真菌来源的三磷酸腺苷和细菌来源的三磷酸腺苷的应用，包括以下步骤：
-获取所述基质的第一等分部分；
-获取所述基质的第二等分部分；
-将根据权利要求1所述的方法应用至所述第一等分部分以获得代表在所述基质中的所述细菌来源的三磷酸腺苷的量的第一测量结果；
-将裂解剂施加至第二样品，然后测量在所述第二等分部分中的游离三磷酸腺苷，以获得代表在所述基质中的细菌和真菌来源的三磷酸腺苷的量的第二测量结果；
-形成在所述第二测量结果和所述第一测量结果之间的差，以获得代表在所述基质中的所述真菌来源的三磷酸腺苷的量的第三测量结果。
10.一种用于在包含微生物菌群的食品加工基质中检测真菌的方法，所述微生物菌群包含乳酸和/或乙酸细菌菌群并且包含真菌菌群，所述细菌菌群包含细菌来源的三磷酸腺苷，所述真菌菌群包含真菌来源的三磷酸腺苷，所述方法包括以下步骤：
-向所述基质施加抗真菌剂，所述抗真菌剂具有在第一时间限制下对于所述真菌菌群是致命的抗真菌作用以及在所述第一时间限制之后的第二时间限制下对于所述细菌菌群是非致命的抗生素作用，所述致命作用在所述第一时间限制下释放真菌来源的三磷酸腺苷，
-在所述第一时间限制和所述第二时间限制之间测量在所述基质中释放的所述真菌来源的三磷酸腺苷。
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