CN107400700B - 一种检测外周血中卵巢癌细胞标志物的试剂盒 - Google Patents

一种检测外周血中卵巢癌细胞标志物的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种检测外周血中卵巢癌细胞标志物的试剂盒，包括结合有卵巢癌抗体的磁珠及相应缓冲试剂，该试剂盒采用磁珠分选，RT‑PCR等分子生物学的方法检测卵巢癌患者血液循环中的肿瘤细胞的生物学活性，确定药物治疗靶点的基因，通过检测EpCAM‑2、Muc1、Her2，Wt‑1、Pax8和P16的表达水平，确定卵巢癌的发展及转归，对卵巢癌的个性化治疗提供理论依据和实验证据。本发明提供的试剂盒检测样本量小，对患者伤害小，检测灵敏度高，检出率可达100％。

Description

一种检测外周血中卵巢癌细胞标志物的试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种卵巢癌检测试剂盒，具体涉及一种准确性高的检测外周血中卵巢癌细胞标志物的试剂盒。
背景技术
1.1卵巢癌概述
卵巢癌(ovarian cancer)是女性生殖系统三个恶性肿瘤之一，是当今致死率最高的妇科肿瘤，每年约2万人被诊断为该疾病，造成全球每年约114,000女性死于该疾病，而每位女性一生中约1/73的概率发生该疾病。上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer)占所有卵巢肿瘤的90％，按其病理组织学形态的不同，可分为浆液性(serous)、粘液性(mucinous)、子宫内膜样(endometrioid)、透明细胞癌(clear cell carcinoma)与移行细胞癌(transitional cells carcinoma)5种类型，其中浆液性卵巢癌最多，占全部上皮性卵巢癌的50％以上。卵巢癌危险因素有持续排卵、遗传因素、内分泌因素、年龄、环境因素等，关于上皮性卵巢癌的起源目前还不明确，较广泛接受的学说有卵巢表面生发上皮学说、第二缪勒系统学说、输卵管起源学说和干细胞学说等。以往人们认为卵巢癌转移的主要途径是局部浸润、腹腔种植、淋巴转移、血行转移等，其中以腹腔种植为多，但是近年来研究，血行转移除了造成远端转移外，也是造成腹腔网膜转移灶形成原因之一，因此血行转移也是不容忽视的转移途径。
上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)占所有卵巢肿瘤的90％，由于卵巢癌起病隐匿，早期症状不明显，因此大部分患者就诊时已到晚期，复发和转移是其死亡的主要原因，因此早期诊断、及早发现微转移在减少卵巢癌复发转移、提高生存率等方面具有重要的意义。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)为原发肿瘤组织和转移灶脱落入血形成的，其除介导远端转移外有研究表明也介导卵巢癌的种植性转移，因此CTC可以提示肿瘤进展及判断预后，由于外周血样本易获得且创伤小等特点显示出了CTC的临床优势。
1.2影响卵巢癌预后的相关因素
造成卵巢癌预后如此之差的相关因素中影响最大的是卵巢癌晚期转移，临床上大部分卵巢癌患者死于卵巢癌转移导致的肠梗阻、电解质紊乱、恶液质、肾脏等多器官功能衰竭。由于卵巢癌起病隐匿，早期症状不明显，70％患者就诊时已到晚期(Ⅲ，Ⅳ期)，患者表现为向周围组织浸润转移累计盆腹腔多个脏器造成腹痛、腰痛、下肢疼痛、下肢浮肿、腹水等临床表现，此时五年生存率小于30％，但是若早期(Ⅰ，Ⅱ期)诊断和治疗局部病灶，则五年生存期将高达90％，由此可知，高敏感性或高特异性的甄选以及监测肿瘤的进展方法对于卵巢癌的诊治具有十分重要的意义。目前FIGO将卵巢癌的分期大致分为4期，Ⅰ期为局限于卵巢部位，Ⅱ期为肿瘤累及一侧或双侧卵巢，伴有盆腔转移或腹膜癌，Ⅲ期为除了肿瘤累及一侧或双侧卵巢或输卵管，或原发性腹膜癌外，伴有细胞学或组织学确认的盆腔外腹膜播散，和(或)转移至腹膜后淋巴结，Ⅳ期为存在腹腔之外的转移。表1详细的列出了为2014年FIGO卵巢癌分期标准。
表1：2014年FIGO有关卵巢癌分期系统
Figure BDA0000993290160000021
Figure BDA0000993290160000031
注1：包括肿瘤蔓延至肝脏和脾脏包膜，但不包括脏器实质的受累。
注2：脏器实质转移属于IVB期。
1.3临床常用卵巢癌检测技术
目前临床上针对卵巢癌的常规检测有血清学检测和免疫组化检测，血清学检测包括癌抗原125(CA125)，癌胚抗原(CEA)，甲胎蛋白(CEA)，CA19-9等，CA125是目前应用最广泛的肿瘤标记物，其在正常的卵巢组织中不存在，最常见于EOC患者的血清中，粘液性卵巢癌中不表达。当作为单独的标记物，CA125只在47％的早期卵巢癌患者中高表达，在晚期卵巢癌患者中80-90％会提高，故不用于卵巢癌的早期诊断，另外CA125在其他肿瘤如乳腺癌，前列腺癌，胃癌等也会有提高，而且CA125在月经期、怀孕等良性妇科状态及盆腔炎症时也会提高，所以CA125作为卵巢癌标记物缺乏足够的敏感性和特异性。免疫组织检测的指标包括增殖细胞核相关抗原KI67，抑癌基因p53等，其中ki67的免疫组化结果成为反应肿瘤增殖潜能的指标，是卵巢癌恶性度的指标，可鉴别卵巢良性、交界性、恶性肿瘤的指标，另外其在卵巢癌中高表达与预后差相关，但其以病理组织为样本，创伤性较大，无法作为检测肿瘤进展的指标，因此临床需要一种创伤小，有助于早期诊断且能实时检测肿瘤进展的有效的检测方法。
1.4卵巢癌转移的机制
长久以来，人们一直被“是什么决定了哪个器官发生转移”这个问题所困扰，1889年，Stephen Paget观察到乳腺癌患者更偏向发生肝转移，Pagett认为这是不寻常的因为其他的器官如脾脏也会同样的收到相同的影响，因为脾脏和肝脏有相同的血流量，这个发现促使Pagett提出了“种子-土壤”学说，他假设某些肿瘤细胞，也就是种子，选择性克隆至远端器官，也就是土壤，其提供了一个适合肿瘤细胞生长的环境“当植物开始播种，它的种子可以播撒向任何方向但是其只会落在合适的土壤中生长”因此某些器官必须提供合适的适合器官特异性转移的环境从而导致器官的选择性。卵巢癌转移部位的不同也验证了此假说，以往认为被动和重复的腹腔暴露于脱落的肿瘤细胞是导致腹膜疾病的主导原因，但是临床上有一部患者在初诊的时候有腹膜后或远端转移如肝转移和肺转移另外，即使在腹腔中，间皮疾病的存在也提示其他转移途径的存在。SunilaPradee等人建立了表明卵巢癌血行转移偏向于大网膜转移的异体共存小鼠模型，其研究揭示了NRG1轴是血行转移至大网膜的主要通路，卵巢癌细胞高表达ErbB3和大网膜表达NRG1是肿瘤细胞定居和生长的原因，低表达ErbB3减少了大网膜转移，其研究强调了卵巢癌血行转移在卵巢癌转移中的重要地位。
1.5循环肿瘤细胞
循环肿瘤细胞是指原发肿瘤或转移灶脱落入血的肿瘤细胞，第一次被提出是在1869年，部分入血的CTC可能具备了在组织支持的微环境中克隆生长形成转移灶的能力，因此CTC数目和分子特征可以作为一种实时无创的实时“液体活检”手段提供关于预后、治疗选择及有效性等临床信息。现今CTC研究已成为相当活跃的领域，大量研究表明了CTC在恶性肿瘤中的存在及其临床意义，这些研究提示CTC是预后不良的独立预测因素，CTC检测阳性患者的无进展生存期和总生存期明显短于CTC检测阴性的患者，而有效的细胞减灭术或放化疗后CTC数目下降，提示CTC可以辅助检测治疗效果从而对进一步的治疗做出指导；另外，CTC中还会携带原发组织的遗传信息，通过分子水平的变化可以为个体化治疗提供依据。
在卵巢癌特别是浆液性癌中，EpCAM、HER2、MUC1、PAX8、WT-1和P16的高表达，预示着卵巢癌的转归，其中EpCAM、HER2、MUC1和P16的高表达与卵巢癌的预后有关，而PAX8、WT-1的共同表达是区分卵巢癌和乳腺癌的关键因子。
综上所述，检测卵巢癌患者血液中循环肿瘤细胞的数量对于卵巢癌诊断及评估预后具有重大的理论和实际意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以准确检测卵巢癌标志物的试剂盒，主要是指一种通过采集卵巢癌患者外周血液中的卵巢癌细胞的检测试剂盒及复合的检测技术，具体地说是一种准确性高的检测卵巢癌细胞(恶性肿瘤细胞)的检测技术和试剂盒，特别是能够检测经过放、化疗治疗后残存在血液中的游离卵巢癌细胞的检测试剂盒，该检测结果对卵巢癌治疗方案的选择和预后具有重要指导意义。
本发明的发明思路为：采用磁珠分离，RT-PCR等分子生物学的方法检测卵巢癌患者血液循环中的肿瘤细胞的生物学活性，通过检测EpCAM、Muc1，Her-2，Wt-1，Pax8和P16的表达水平，确定药物治疗靶点上的基因，确定卵巢癌的发展及转归，对卵巢癌的个性化治疗提供理论依据和实验证据。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
本发明提供一种检测外周血中卵巢癌细胞标志物的试剂盒，所述试剂盒由如下组分组成：
结合有卵巢癌抗体的磁珠：
结合有寡核苷酸Oligo(dT)的磁珠；
缓冲液A 100-200mL；
缓冲液B 100-200mL；
裂解/结合缓冲液150-250mL；
10×缓冲液4.0-5.0mL；
dNTPs，5mM each 4.0-5.0mL；
逆转录酶，10000U/μL 2.0-3.0mL；
RNA酶抑制剂，40U/μL 0.4-0.6mL；
2×热启动PCR混合液2-3mL；
RNase-free水1-2mL；
卵巢癌肿瘤标志物引物10μmol/L 3.0-5.0mL；
其中所述卵巢癌肿瘤标志物为EpCAM、Her2、Muc1、Pax8、wt-1、P16中的一种或多种；
所述EpCAM引物序列为：
上游引物如SEQ ID NO：1所示：5’-TGAGCGAGTGAGAACCTA-3’；
下游引物如SEQ ID NO：2所示：5’-CACAACAATTCCAGCAAC-3’；
所述Her2引物序列为：
上游引物如SEQ ID NO：3所示：5’-AGGAGTGCGTGGAGGAAT-3’；
下游引物如SEQ ID NO：4所示：5’-AGTGGGTGCAGTTGATGG-3’；
所述Muc 1引物序列为：
上游引物如SEQ ID NO：5所示：5’-GCACCGACTACTACCAAGAG-3’；
下游引物如SEQ ID NO：6所示：5’-AAGGAAATGGCACATCACT-3’；
所述Pax8引物序列为：
上游引物如SEQ ID NO：7所示：5’-GCAATAGCCGAGGAA-3’；
下游引物如SEQ ID NO：8所示：5’-GAAAGAGCCAAGCAAA-3’；
所述Wt1引物序列为:
上游引物如SEQ ID NO：9所示：5’-AGTCCGCCATCACAACAT-3’；
下游引物如SEQ ID NO：10所示：5’-TGGTACAATAATTCCATCCC-3’；
所述P16引物序列为：
上游引物如SEQ ID NO：11所示：5’-TCTGAGAAACCTCGGGAAAC-3’
下游引物如SEQ ID NO：12所示：5’-CTCGCAAGAAATGCCCAC-3’
所述卵巢癌抗体为抗EpCAM单克隆抗体、抗Muc 1单克隆抗体和抗Her2单克隆抗体。
其中，所述2×热启动PCR混合液中包含HotStarTaq DNA Polymerase5U/μL。
其中，所述缓冲液A的配方为：10mM Tris-HCl,pH7.5；0.15M LiCl；1mM EDTA；0.1％LiDS。
其中，所述缓冲液B的配方为：10mM Tris-HCl,pH7.5；0.15M LiCl；1mM EDTA。
其中，所述裂解/结合缓冲液配方：100mM Tris-HCl,pH7.5；500mM LiCl；10mMEDTA,pH8；1％LiDS；5mM dithiothreitol(DTT)。
在本发明中用于富集循环血中卵巢癌细胞的肿瘤标志物为EpCAM、Her2、Muc1；而鉴定卵巢癌的标志物为EpCAM、Her2、Muc1、Wt-1、Pax8和P16。
引物配制：
引物为每个先稀释至10μM(即10μmol/L)，然后将引物混合加水至每个引物浓度为2μM，多重PCR反应体系中每个引物终浓度为0.2μM。
使用时每1mL血液使用25μL抗体标记后的磁珠。
反应结果分析：
采用Agilent 2100生物分析仪对PCR产物物进行分析：
本发明的有益效果在于：
本发明提供一种检测外周血中卵巢癌标志物的试剂盒，该试剂盒要求的检测样本量小，对患者伤害小，检测灵敏度高，对癌细胞的检出量可低至2细胞水平，即样品中含有2个游离癌细胞即可检出，并且可根据卵巢癌肿瘤标志物的含量确定检出为卵巢癌细胞还是卵巢癌干细胞，检出率可达100％，对卵巢癌患者治疗后是否复发及复发的个性化治疗提供理论依据和实验证据。
附图说明
图1为本发明提供的试剂盒中EpCAM、Her2和Muc1的量效关系图。
图2为本发明提供的试剂盒中Pax 8、Wt-1和P16的量效关系图。
图3为本发明提供的试剂盒中EpCAM、Her2和Muc1在卵巢癌患者中的表达结果。
图4为本发明提供的试剂盒Pax 8、Wt-1和P16在卵巢癌患者中的表达结果。
具体实施方式
本发明中所用试剂与仪器：
1.抗EpCAM单克隆抗体、抗Muc 1单克隆抗体和抗Her-2单克隆抗体购自Abcom公司。
2.用于结合抗体的磁珠选用美国invitrogen公司
Figure BDA0000993290160000071
M-450Tosylactivated，单克隆抗体标记量为每100μg抗体标记500μL磁珠，标记方法按照其说明书进行操作。
3.结合有寡核苷酸Oligo(dT)的磁珠选用美国invitrogen公司
Figure BDA0000993290160000072
Oligo(dT)25磁珠。
4.10×缓冲液：为美国QIAGEN公司的Sensiscript Reverse Transcriptase反应缓冲液(10x Buffer RT)。
5.2×热启动PCR混合液：为美国QIAGEN公司Multiplex PCR Master Mix，其中含有HotStarTaq DNA Polymerase规格为浓度：5U/μL。
6.Agilent 2100生物分析仪购自安捷伦科技(中国)有限公司。
未标明的试剂与仪器均为实验室常规试剂与仪器。
实施例1：结合卵巢癌抗体的磁珠的制备：
使用的抗体为抗EpCAM单克隆抗体、抗Muc1单克隆抗体和抗Her-2单克隆抗体。本试剂盒采用分别标记上述3种抗体，然后将它们混合使用。
标记方法：磁珠使用美国invitrogen公司生产的
Figure BDA0000993290160000073
M-450Tosylactivated。标记的方法严格按照产品说明书进行。
标记比例为：每100μg抗体标记500μL磁珠，标记后等量混合。
实施例2：卵巢癌细胞的分离：
2.1样品处理：
取卵巢癌患者外周血5mL，EDTA抗凝，4度保存，48小时之内使用。
2.2磁珠处理：
将结合有卵巢癌抗体的磁珠(抗体标记磁珠，为标记三种抗体的混合磁珠，且按1mL样本加25μL磁珠的比例准备抗体标记磁珠)用PBS反复清洗三次，分离出磁珠，冰上备用；
具体操作为：吸取125μL标记好的磁珠加入1.5mL的离心管中，用移液器轻轻的吹吸混匀(注意不能使用混旋仪)后放在磁珠富集器上静置1min，使磁珠贴附到离心管壁上，弃去上清；然后加入1mL PBS，放在磁珠富集器上1min，使磁珠贴附到离心管壁上，弃去上清；采用相同方法使用PBS共清洗3次，以清除防腐剂；移去上清后加入200μL PBS，冰上备用。
后续步骤磁珠分离也均使用磁珠富集器进行分离。
2.3卵巢癌细胞的分选：
将样本和抗体标记磁珠均加入15mL锥形离心管中，将反应管放在4℃的试管旋转混合器上，以10rpm的速度孵育30min，分离磁珠，弃去上清；加1mL PBS洗涤磁珠，移去上清液以去除不要的细胞，加入1mL PBS混匀磁珠后，转移到新的1.5mL离心管中，备用。
2.4卵巢癌细胞裂解：
去除PBS，在结合了抗体标记磁珠的细胞中加入裂解/结合缓冲液200μL混匀，55℃水浴(或金属浴)反应5min使磁珠上结合的细胞裂解，mRNA释放到上清液中，将离心管放到磁铁上静置5min，将上清液转移到新的1.5mL离心管中，将抗体标记磁珠弃去。
卵巢癌细胞选择步骤结束，样品mRNA用于进一步实验或-20℃储存最长1周，长期储存采用-70℃储存。
实施例3：卵巢癌细胞标记物的检测：
3.1mRNA纯化
将40μL带有寡核苷酸Oligo(dT)的磁珠混匀加入到1.5mL离心管中，加入500μL裂解/结合缓冲液冲洗2次，分离磁珠，加入上清液，混匀，室温孵育10min，使mRNA与磁珠结合；然后分离磁珠，使用500μL缓冲液A清洗2次磁珠，分离磁珠，再用500μL缓冲液B清洗2次磁珠，分离磁珠，再用100μL RNase-free水清洗一次，分离磁珠，用29.5μL RNase-free水重悬磁珠，55℃水浴(或金属浴)中孵育5min，冰上放置2min，获得mRNA/磁珠混合物。
mRNA/磁珠混合物不能储存，需立即进行逆转录。
3.2逆转录：
逆转录步骤如下：
Figure BDA0000993290160000081
Figure BDA0000993290160000091
逆转录程序：
37℃60min，93℃5min，4℃保存。
逆转录结束后继续进行PCR或储存在-20℃(最长可以保存2周)。
反应同时以RNase-free水替代样品作为阴性对照。
3.3PCR
引物序列：
Figure BDA0000993290160000092
阳性对照为：将将卵巢癌细胞系SKOV3稀释至1，2，5，10，50，100个/5mL兔外周血中，按上述方法进行磁珠富集、磁珠富集mRNA，逆转录翻译获得阳性对照的cDNA；
阴性对照为：高纯水。
反应体系
Figure BDA0000993290160000093
Figure BDA0000993290160000101
PCR:程序
95℃15min；94℃30s，58℃90s，72℃60s，35个循环；60℃30min；4℃∞
PCR产物置于冰上或-20℃保存。
3.5结果分析
实验结构均采用Agilent生物分析仪分析对PCR产物进行分析。
1)所有患者的样品必须有Actin基因的条带(内标)；
2)RT的阴性对照不能有大于80个核苷酸的条带；
3)如果产物大于1kb，说明被基因组DNA污染(内含子)；
4)在本实验中PCR产物中每组的3个阳性条带中任何一个条带为阳性均可以判定结果为阳性；
5)在PCR结果中，除Actin外的6个PCR产物均存在于肿瘤细胞，而EpCAM的PCR产物与肿瘤细胞的来源是上皮细胞有关；
6)在PCR结果中，除Actin外为每次必须出现的条带外，其他的6个条带可以随机出现。但是采用本方法检测，最低的PCR检出应该为2个细胞，即在被测样品中只要存在2个及2个以上的肿瘤细胞或肿瘤干细胞，均可以检测到6个PCR产物中的任何一个。
首先通过阳性对照分析试剂盒的灵敏度，其中，为了防止PCR产物之间差距过小无法区分，因此将6种卵巢癌标记物分成两组进行PCR，如图1和图2所示。图1中为EpCAM、Her2、Muc1三种标记物的PCR结果，图2中为Pax 8、Wt-1和P16三种标记物的PCR结果。如图1和图2所示可以看出，当癌细胞数量在2个及2个以上时，即可使用本发明提供的试剂盒检出卵巢癌细胞，并且随着癌细胞数量的增多，PCR产物的量也增多，并且具有明显的量效关系，这对于卵巢癌患者预后评估具有重大的应用价值。图3和图4为本发明试剂盒检测卵巢癌患者预后的结果，图3和图4使用100个以上的卵巢癌细胞系细胞作为阳性对照，而阴性对照为没有加入任何卵巢癌细胞的阴性对照。从图3和图4的中可以看出本发明提供的试剂盒在八位患者样本中均不同程度的检出了游离的卵巢癌细胞，而且不同患者的细胞因子的表达情况有一定的差异。在临床样品中由于卵巢癌患者的肿瘤类型及疾病进程的不同，可能在循环血中表达的因子有一定的差异。
从上述实施例可以看出，本发明检测外周血中卵巢癌细胞的试剂盒检测方法简便，且检测样本量小，对患者伤害小，检测灵敏度高，外周血液样本中含有2个卵巢癌细胞即可检出，检测准确率可以达到100％，检测结果可信。
本发明提供的试剂盒主要针对卵巢癌患者治疗后的监测，为医生对卵巢癌患者治疗后是否复发及治疗效果评价提供可靠的实验数据。
Figure IDA0000993290240000011
Figure IDA0000993290240000021
Figure IDA0000993290240000031
Figure IDA0000993290240000041

Claims (5)

1.一种检测外周血中卵巢癌细胞标志物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由如下组分组成：
结合有卵巢癌抗体的磁珠：
结合有寡核苷酸Oligo(dT)的磁珠；
缓冲液A 100-200mL；
缓冲液B 100-200mL；
裂解/结合缓冲液 150-250mL；
10×缓冲液 4.0-5.0mL；
dNTPs，5mM each 4.0-5.0mL；
逆转录酶，10000U/μL 2.0-3.0mL；
RNA酶抑制剂，40U/μL 0.4-0.6mL；
2×热启动PCR混合液 2-3mL；
RNase-free水 1-2mL；
卵巢癌肿瘤标志物引物10μmol/L 3.0-5.0mL；
其中所述卵巢癌肿瘤标志物为EpCAM、Her2、Muc1、Pax8、wt-1和P16；
所述EpCAM引物序列为：
上游引物如SEQ ID NO：1所示；
下游引物如SEQ ID NO：2所示；
所述Her2引物序列为：
上游引物如SEQ ID NO：3所示；
下游引物如SEQ ID NO：4所示；
所述Muc 1引物序列为：
上游引物如SEQ ID NO：5所示；
下游引物如SEQ ID NO：6所示；
所述Pax8引物序列为：
上游引物如SEQ ID NO：7所示；
下游引物如SEQ ID NO：8所示；
所述Wt-1引物序列为：
上游引物如SEQ ID NO：9所示；
下游引物如SEQ ID NO：10所示；
所述P16引物序列为：
上游引物如SEQ ID NO：11所示；
下游引物如SEQ ID NO：12所示；
所述卵巢癌抗体为抗EpCAM单克隆抗体、抗MUC1单克隆抗体和抗HER-2单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述2×热启动PCR混合液中包含HotStarTaq DNA Polymerase 5U/μL。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液A的配方为：10mM Tris-HCl,pH7.5；0.15M LiCl；1mM EDTA；0.1％LiDS。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液B的配方为：10mM Tris-HCl,pH7.5；0.15M LiCl；1mM EDTA。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解/结合缓冲液配方：100mM Tris-HCl,pH7.5；500mM LiCl；10mM EDTA,pH8；1％LiDS；5mM dithiothreitol。
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