CN107400675B - 一种抗瓜类枯萎病活性产物基因的克隆与序列分析方法 - Google Patents

一种抗瓜类枯萎病活性产物基因的克隆与序列分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于瓜类枯萎病防治技术领域，公开了一种抗瓜类枯萎病活性产物基因的克隆与序列分析方法，包括：异位裂解法提取土壤微生物基因组DNA；宏基因组Fosmid文库构建及其质量检测；筛选宏基因组Fosmid表达文库，获得Fosmid活性克隆；活性物质的提纯和鉴定，确定活性物质结构，验证化合物抗瓜类枯萎病的活性；筛选和改造植物内生菌株，将基因转化到改造后的内生菌株，通过选择不同的启动子、不同的培养基和发酵条件，建立抗瓜类枯萎病药物基因的高效表达体系。本发明将分离、筛选和改造植株内生菌作为表达株系，建立从文库中筛选出来的有生物学活性的目的基因异源高效表达体系。为实现抗枯萎病药物的商品化奠定坚实的基础。

Description

一种抗瓜类枯萎病活性产物基因的克隆与序列分析方法
技术领域
本发明属于瓜类枯萎病防治技术领域，尤其涉及一种抗瓜类枯萎病活性产物基因的克隆与序列分析方法。
背景技术
瓜类枯萎病又称蔓割病、萎凋病，是瓜类生产中主要的土传病害之一，尤以西瓜、黄瓜和甜瓜上的危害最为严重。该病遍及中国、美国、意大利、以色列、日本和印度等几十个国家和地区，我国南北方西瓜种植区都有不同程度发生。尤其是南方热带和亚热带地区，雨量充沛、气候温和，病原菌无越冬现象，造成病菌孢子在土壤中的大量累积，病害发生率极高，重茬地一般发病率在30％以上，严重地块达80％，甚至造成绝产。近些年来瓜类枯萎病害频频发生，并有蔓延趋势，严重影响了瓜类产量和品质，使农民遭受巨大的经济损失。瓜类枯萎病的防治方法主要有农业防治(嫁接和培育抗病品种等)、物理防治、化学防治、生物防治等，目前多以化学药剂防治为主。但由于土传病害中的病原菌掩蔽性较强，化学杀菌剂难以与其直接接触，不能从根本上杀灭病原菌，施用成本高。同时化学药剂广泛使用所带来的环境污染等一系列副作用已日趋凸显，生产使用正逐步受到限制。因此，符合现代农业可持续发展战略理念的生物防治方法已显得十分重要和迫切。在瓜类枯萎病的生物防治研究中，生防资源虽然丰富，人们也通过室内生物测定的方法，筛选出对枯萎病有拮抗作用的真菌(木霉属真菌)、细菌(假单胞菌等)和放线菌，但是，其温室和大田防治效果不明显，甚至无效果，不能开发成商品化的生物防治药剂应用于大田实际生产中。究其因，生防菌株不能在根围，甚至维管束部定植，而瓜类枯萎病是一类维管束寄生菌，在适宜的温、湿度下萌发出芽管，从根部、根尖或伤口侵入，进入维管束后阻塞导管，病菌产生大量菌丝和菌核，影响导管对水分和养分的运输，病菌分泌果胶酶和纤维素酶分解破坏细胞，使有毒物质堵塞导管，从而造成维管束变褐，植株萎焉。一旦枯萎病菌能够跨越传播、吸附、侵入的屏障，它将在维管束内大量繁殖，堵塞导管。因此，根据病菌的侵染特点，以植株内生菌作为表达株系，筛选和改造内生菌株，建立抗枯萎病天然活性产物的异源高效表达体系，是实现瓜类枯萎病生物防治的关键，其研究成果对于枯萎病的有效防控将做出重要的贡献。另外，筛选出对枯萎病有拮抗作用的真菌、细菌和放线菌，均是基于实验室可纯培养的微生物。然而，环境中只有不到1％的微生物是可用实验室传统纯培养的方法获得，99％以上的微生物是不可纯培养的。1克土壤可能包含多于4000种微生物(估计微生物细胞数高达100亿以上)。土壤微生物种类极其繁多，代谢形式也呈现多样化，其代谢物的化学复杂性和多样性，是筛选抗生素与药物先导化合物的极具潜力的资源库，许多具有独特结构和良好生物活性的微生物代谢产物被相继发现和开发利用，如用于癌症化疗的药物阿霉素(doxorubicin)、博来霉素(bleomycin)、道诺霉素(daunorubicin)和丝裂霉素(mitomycin)等。近10年来，尽管科学家们努力改进筛选方法和测试病原微生物种类，但是基于微生物纯培养技术发现新抗生素药物的成功几率越来越小(如从40，000微生物中仅筛选到3个可用的新抗生素)，且往往会出现重复筛选的现象。如何挖掘这个巨大的天然宝藏并服务于人类，已成为科学家们的共同目标。首次提出“宏基因组(Metagenome)”的概念，并定义为“the genomes of the totalmicrobiota found in nature”，即某一生境中全部微小生物遗传物质的总和，目前主要指环境样品中的原核生物(细菌、古菌)和真菌的基因组总和。宏基因组文库技术避开了微生物分离培养的问题，既能得到可培养微生物基因，也能得到未培养微生物的基因，为微生物资源利用开辟了一个新的途径。这种寻找新的功能基因或者功能基因簇的策略，对研发新药物、生物农药和工业用酶等诸多生物活性物质开发提供了广阔的前景。随着分子生物学技术在环境微生物生态学中广泛应用，近年来宏基因组研究已成国际上新的研究热点和前沿领域，在欧美等发达国家得到了广泛的重视和快速发展。采用宏基因组克隆技术从以链霉菌为宿主的宏基因组文库中筛选到抗菌活性的五种新的小分子物质TerragineA、B、C、D、E。德国哥廷根大学的Daniel Rolf实验室从土壤样品直接提取DNA，利用表达载体pSK+转化到大肠杆菌中成功构建了宏基因组文库，用42羟基丁酸作唯一的碳源和能源筛选到了5个能够稳定利用42羟基丁酸的克隆，随后的研究中先后获得了新的生物素合成操纵子、琼脂糖酶、乙醇脱氢酶、甘油脱水酶等。由于细菌合成某些活性物质的基因经常以基因簇的形式出现，利用细菌人工染色体载体pBeloBACⅡ构建了两个土壤样品的宏基因组BAC文库，筛选出了1个有抗菌活性、2个分泌酯酶、8个分泌淀粉酶、29个有溶血活性的克隆，随后对1个棕色重组克隆进行了亚克隆研究，获得了2个具有广谱抗菌作用的新抗生素TurbomycinA和B及其合成酶基因簇。通过构建fosmid文库筛选到了一批脂肪酶新型基因，DNA数据揭示他们获得的酶基因和数据库中已知的脂肪酶基因氨基酸序列有45％左右的同源性。但是仅仅限于DNA数据分析，他们没有做酶的表达。构建了土壤eDNA的穿梭粘粒载体文库，从中发现了11个抗肿瘤活性物质新的聚酮合成酶I(PKS I)的基因簇。同时，用不同宿主做了比较实验，发现采用多种不同的宿主可以提高外源基因表达生产不同活性物质的几率。此外，采用人唾液、采用海水构建宏基因组文库分别筛选到了新的几丁质酶和四环素抗性基因等。宏基因组学研究作为一项刚刚起步不久的新技术，其摆脱了传统微生物分离培养的方法，直接获取微生物功能基因，为最大限度的开发利用丰富的未培养微生物资源提供了一个广阔的平台。目前，宏基因组学的研究在美国、德国、法国和韩国等发达国家发展迅速，国内鲜见类似报道。迄今为止，国内外已报道的瓜类枯萎病菌尖孢镰刀菌有7个专化型，即西瓜、甜瓜、丝瓜、葫芦、黄瓜、苦瓜和冬瓜专化型，而以西瓜、黄瓜的危害最为严重。因此，以西瓜枯萎病为研究对象，依托海南岛热带雨林土壤蕴藏的丰富微生物基因资源，利用宏基因组技术从土壤未培养微生物群落中挖掘新的抗瓜类枯萎病基因资源及其异源活性产物的高效表达，并探索开发新的抗瓜类枯萎病药物，为瓜类枯萎病的生物防治研究提供新的技术手段，具有十分重要的科学价值和现实意义。
综上所述，现有技术存在的问题是：目前多以化学药剂防治为主，由于枯萎病属于土传病害，其病原菌掩蔽性较强，化学杀菌剂难以与其直接接触，不能从根本上杀灭病原菌，施用成本高；同时，化学药剂广泛使用所带来的污染环境、破坏生态平衡等一系列副作用已日趋凸显，生产使用正逐步受到限制；此外，长期使用化学药物，病原菌易产生抗药性，久而久之化学药物失去了原有的作用。在生物防治进程中，前人筛选出对枯萎病有拮抗作用的真菌、细菌和放线菌，均是基于实验室可纯培养的微生物。其发现新抗生素药物的成功几率越来越小，且往往会出现重复筛选的现象。而利用宏基因组技术从土壤未培养微生物群落中挖掘新的抗瓜类枯萎病基因资源及其异源活性产物的高效表达，并探索开发新的抗瓜类枯萎病药物，建立抗瓜类枯萎病活性产物基因克隆与序列分析方法，为瓜类枯萎病的生物防治研究提供新的技术手段。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种抗瓜类枯萎病活性产物基因的克隆与序列分析方法。
本发明是这样实现的，一种抗瓜类枯萎病活性产物基因的克隆与序列分析方法，所述抗瓜类枯萎病活性产物基因的克隆与序列分析方法包括：
(1)异位裂解法提取土壤微生物基因组DNA；采集海南岛热带雨林土壤样品30份(五指山和尖峰岭土壤样品各15份)，50目筛孔过筛，去除树枝残根和大颗粒的石块后，-80℃保存备用。每样品称取土样300g，小型搅拌器捣成匀浆，用50mL灭菌离心管分装，1000rpm，离心5min，收集上清。多次重复之后，上清分装于新的50mL灭菌离心管中，差速离心法，11000rpm，离心15min，去上清，沉淀用无菌水混匀后往底部加入Nycodenz密度梯度介质(与水1:1配置)，密度梯度法离心，取中间菌层。约5mL菌悬液，加入5mL DNA提取液。加入溶菌酶100μL，37℃水浴30min。加入蛋白酶K 140μL，加入终浓度为1％SDS，55℃，水浴2h。接下来用氯仿抽提，异丙醇沉淀，70％乙醇洗涤和TE溶解DNA。
(2)宏基因组Fosmid文库构建及其质量检测；文库构建：采用PVPP洗涤，去除腐植酸等杂质后，溶菌酶—蛋白酶K—SDS—CTAB裂解法，提取和纯化大片段的土壤微生物基因组DNA。每次共提取7个样品，混合后形成海南岛热带雨林特色环境土壤微生物基因组总DNA。经1％的琼脂糖凝胶低电压电泳和脉冲电泳检测，发现提取的DNA片段大于23kb，最大达到150kb左右，均适合构建大的插入片段的宏基因组Fosmid文库。末端修复宏基因组DNA后，采用溶胶酶法，不通过过柱，回收DNA片段，很好地保证了片段的完整性，胶回收23kb以上的片段。然后，使用Fosmid文库构建试剂盒中自带的Fast-LinkTM DNA连接酶将回收产物连接到Fosmid载体pCC1FOS上。连接反应在2h内完成。连接产物经λ包装提取物包装，EPI300-T1R菌株转染，涂于含12.5μg/mL的氯霉素的LB平板上，37℃，过夜培养。最终，产生了100板，约40,000个Fosmid克隆，挑取其中30,624个克隆，摇菌，保存。
质量检测：一、克隆阳性率检测：随机挑取18个Fosmid克隆，经初摇和诱导多拷贝之后，按照Fosmid DNA提取和纯化试剂盒(FosmidMAXTM DNA Purification Kit)上的使用说明提质粒。16个克隆质粒都有清晰的条带，且片段大小大于23kb，说明插入片段正常，文库的阳性率较高，达89％；
二、插入片段大小检测：随机挑取14个Fosmid克隆，提质粒，用Not Ⅰ酶切进行酶切。所有克隆在6.5-9.4kb之间有一条8.2kb的载体条带，而插入片段则被消化成大小不一的多个片段，这可能是由于土壤微生物基因组DNA的G+C含量较高，各种酶切位点较多所致。通过叠加各泳道中除了载体带以外的条带，发现各插入片段至少在30kb以上；
三、克隆稳定性检测：随机挑取了7个Fosmid克隆，取1mL继代培养1d和培养5d后，分别提质粒，然后用EcoR Ⅰ37℃酶切4h，结果发现培养1d和培养5d的质粒酶切条带基本一致。因此，可以断定外源插入片段没有出现丢失或重排的现象，如E号克隆的第100代和第0代在1.5kb-5kb之间均有相同的酶切条带。说明所构建的Fosmid文库是稳定的。
四、文库包含的微生物物种多样性检测：158个末端随机测序结果中，有7个分别比对上厌氧粘细菌、拜叶林克氏菌、慢生根瘤菌、假单胞菌、沼泽红假单胞菌、大豆根瘤菌和尚未确定分类地位的细菌，占4.07％。其中，2个比对上假单胞菌属。无同源序列的克隆共151个，占到87.79％。这表明该宏基因组文库覆盖的微生物多样性极其丰富。其次，7个比对上同源序列的都是细菌序列，这可能是有两方面的原因，其一，细菌是该环境样品的优势菌群，其物种丰度远远高于古菌、真菌以及其他微生物；其二，间接提取DNA的方法得到细菌比例更大一些。此外由测序结果分析出该文库的空载率低为1.7％，随机性为98.1％。
(3)筛选宏基因组Fosmid表达文库，获得Fosmid活性克隆；构建用于文库筛选的12合1、8合1文库和96合1文库，即二级池和超级池，大大地缩短了工作量，避免了单个克隆筛选的麻烦。如将文库克隆全部平行转接一套筛选文库，再将筛选文库中每个96孔板中的8排、12列各混在一起，成为复筛库；再将板中每排、列各克隆混合，作为一个初筛库进行初筛。若96孔合一的初筛库有目标克隆则在复筛库中各排、列分别进行筛选，可直接获得目标菌位点。
通过功能驱动筛选(双琼脂层法)初步筛选出对西瓜枯萎病XGW-1菌丝生长有抑制作用的Fosmid克隆4个，编号分别为：129C、142E、142G和153G，并采用牛津杯法和对峙培养法反复验证Fosmid活性克隆129C、142E、142G和153G对西瓜枯萎病菌丝生长的抑制作用。研究发现：129C和142E对西瓜枯萎病菌丝生长的抑制作用最强、最稳定，在牛津杯法室内生物测定中，平均抑菌圈直径能达5.9mm和5.1mm。
(4)活性物质的提纯和鉴定，确定活性物质结构，验证化合物抗瓜类枯萎病的活性；一、亚克隆文库构建、筛选和序列分析：提取Fosmid克隆142G、142E和153G的DNA，经EcoRⅠ和SPh Ⅰ双酶切后，胶回收1.5—5kb大小的片段，连接到用相应的酶双酶切后的pUC19载体上，转化(用E.coli DH5α)后，涂板于LB固体培养基(含50μg/mL氨苄青霉素)上，37℃，12h后，挑取尽量多的亚克隆，37℃，摇菌培养12h，加终浓度为15％的甘油，-20℃冰箱中保存备用。构建了亚克隆表达文库es142E、es142G和es153G，各库库容均包含576个克隆。以西瓜枯萎病菌为靶标菌，采用双琼脂层法，根据是否产生透明圈的表型，从亚克隆文库es142E中，筛选出活性亚克隆unpks-5，其抑菌圈直径为4.5mm。此外，随着测序技术的发展，测序成本、价格等方面降低，我们直接测通了温室盆栽防效最好的活性Fosmid克隆129C。提取克隆隆unpks-5质粒，送北京华大基因研究中心测序。序列分析在生物学软件DNAman和DNAstar中进行。亚克隆中包含的基因数和核酸序列运用在线分析页面(http://linux1.softberry.com/berry.p h t m l？t o p i c＝f g e n e s b&g r o u p＝help&subgroup＝gfindb)中进行。同时，在CBS SignalP 4.1server界面(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)中分析其信号肽劈开位点，通过BDGP Neuralnetwork promoter prediction界面http://www.fruitXy org/seq_tools/
Promoter.html.预测其是否含有独立的启动子。
二、129C序列分析和活性产物鉴定：提取和纯化Fosmid克隆129C的DNA序列，送华大基因测序和序列分析。得到39.145kb的完整序列，包含38个ORF。其中，8个ORF在同一转录单元，可能参与抗枯萎病活性产物基因的表达。经注释，其氨基酸序列包含乙酰辅酶A水解酶、酰基辅酶A脱氢酶、聚酮合成酶(polyketide synthetases,pks)、聚酮化合物环化酶(polyketide cyclase)、辅酶A转移酶等。其中，pks基因核酸序列全长1641bp，编码547个蛋白质氨基酸；蛋白质分子量59,782Da，等电点5.93，G+C含量57.83％，包含起始密码子ATG和终止密码子TAG。在其5′非编码区无S-D序列(Shine-Dalgarno)，3′非编码区无反向串联重复序列(Tandem inverted repeat sequences)，无独立的启动子序列。在氨基酸序列中，34和35个氨基酸序列之间是其信号肽劈开位点。
三、活性产物提纯与鉴定：对活性Fosmid克隆129C发酵液110L采用乙酸乙酯萃取后，获得38.5g浅黄色粗提物，取少量(约5mg)用甲醇配成浓度为10mg/mL的粗提物，采用含毒培养基法对西瓜枯萎病菌进行室内生物测定，同时，设定只加甲醇溶液的PDA对照，每处理重复4次。28℃，培养7d后，采用十字交叉法测定处理和对照的菌丝生长直径。甲醇对照的菌丝生长直径为60mm左右，而初提物处理的菌丝生长直径均不超过35mm。经三次柱层析分离，分离得到1012个流分。取不同流分段(浓度为1mg/mL)采用抑菌圈法对西瓜枯萎病菌分别进行室内生物测定，仅S331～432流分有活性，合并活性流分共5.8g。其中，S331流分抑菌圈直径达到11.2mm，S432流分抑菌圈直径达到12.4mm，抑菌圈边缘菌丝生长受到明显抑制。
四、GC-MS及纯化物的生物活性测定：经与NIST 08.L标准质谱图库进行比对检索，并结合有关文献和人工解析，将该化合物鉴定为2,4,-二乙酰基间苯三酚(2,4-Diacetylphloroglucinol)，分子式为C10H10O5，分子量为210.181。采用菌丝生长速率法，测定了2,4,-二乙酰基间苯三酚对西瓜枯萎病菌XGW-1的生物活性。2,4,-二乙酰基间苯三酚对西瓜枯萎病菌的毒力回归方程Y＝1.188X+3.3208，其EC50和EC95分别为25.91μg/mL和622.16μg/mL，与对照生物防治药剂农抗120抗菌素的效果(EC50和EC95分别为25.22μg/mL和682.02μg/mL)相当；比对照化学药剂50％多菌灵可湿性粉剂的防治效果(EC50和EC95分别为13.44μg/mL和330.22μg/mL)要差。然而，该化合物分离于环境微生物样品，与环境的兼容性较好，因而具有较好的生防潜力。
(5)筛选和改造植物内生菌株，将基因转化到改造后的内生菌株，通过选择不同的启动子、不同的培养基和发酵条件，建立抗瓜类枯萎病药物基因的高效表达体系。从健康的西瓜植株分离出1株内生菌株YA-1，并对其进行了形态鉴定。在LB固体培养基表面菌落为椭圆形或柱形，表面粗糙不透明，污白色到浅黄色，30℃温箱中培养1d后，用牙签挑起，能看到粘稠状菌脓；培养3d后，菌落表面能看到大量褶皱。据其在LB培养基上的生长表型，以及其他形态、生理生化特性和分子生物学手段，将其鉴定为枯草芽孢杆菌。利用分离到的内生菌株YA-1，分别表达从Fosmid文库中筛选到的pepks基因和亚克隆文库筛选到的3-oxoacyl-ACP synthase基因：unpks，实现抗病菌株介导抗病基因表达外源基因联合高效抗病体系。采用质粒的形式在枯草芽孢杆菌中表达外源基因，选择在大肠杆菌和芽孢杆菌中穿梭质粒载体载体pWB980作为表达载体，该载体在枯草芽孢杆菌细胞内拷贝数高，同时该载体采用枯草芽胞杆菌胞苷脱氢酶(Cdd)基因的启动子P43作为外援基因表达的启动子，该启动子属于重叠启动子，能被两种σ因子识别，是一种组成型启动子，具有高效表达的特点。Fosmid文库筛选到的pepks基因序列经带有HindⅢ和kpnⅠ酶切位点的引物扩增后，经HindⅢ和kpnⅠ酶切后连接到pWB980载体的HindⅢ和kpnⅠ酶切位点处，经大肠杆菌扩增后，通过电转化方法转化枯草芽孢杆菌获得高效表达pepks基因的枯草芽孢杆菌菌株，通过抗拮实验证实，抑菌圈直径可达15.3mm。通过盆栽实验证实抗病性达到71.38％，通过高效表达体系的分析，证明pepks基因对枯萎病的抗性达到71.38％，比Fosmid表达克隆129C的抑菌活性(63.09％)提高了8.29％，比相应的对照药剂农抗120抗菌素防治效果稍高(70.49％)，差异不显著。说明pepks基因对枯萎病抗性较好。
而亚克隆文库筛选到的unpks基因序列经带有EcoR Ⅰ和Sph Ⅰ酶切位点的引物扩增后，经EcoR Ⅰ和Sph Ⅰ酶切后连接到pWB980载体的EcoR Ⅰ和Sph Ⅰ酶切位点处，同样经大肠杆菌扩增后，通过电转化方法转化枯草芽孢杆菌获得高效表达unpks基因的枯草芽孢杆菌菌株，通过抗拮实验证实，抑菌圈直径可达13.1mm。通过盆栽实验证实抗病性达到60.98％，通过高效表达体系的分析，证明unpks基因对枯萎病的抗性达到60.98％，比Fosmid表达克隆142E的抑菌活性(53.28％)提高了7.7％说明unpks基因对枯萎病具有抗性。
进一步，所述Fosmid文库构建方法包括以下步骤：
步骤一，采用PVPP洗涤，去除杂质后，溶菌酶—蛋白酶K—SDS—CTAB裂解法，提取和纯化大片段的土壤微生物基因组DNA，每次提取7个样品，混合后形成海南岛热带雨林特色环境土壤微生物基因组总DNA；经1％的琼脂糖凝胶低电压电泳和脉冲电泳检测，提取的DNA片段大于23kb；
步骤二，末端修复宏基因组DNA，胶回收23kb以上的片段，将marker和小样切下，在紫外下用牙签作好标记，将大样在日光灯下比着小样和marker切下所要回收达片段；使用Fosmid文库构建试剂盒中自带的Fast-LinkTM DNA连接酶将回收产物连接到Fosmid载体pCC1FOS上；连接反应在2h内完成；
步骤三，连接产物经λ包装提取物包装，EPI300-T1R菌株转染，涂于含12.5μg/mL的氯霉素的LB平板上，37℃，过夜培养。
进一步，所述步骤三中过夜培养，产生了100板，40,000个Fosmid克隆，挑取其中30,624个克隆，摇菌，保存。
进一步，所述Fosmid文库包含21个OTU，以子囊菌和担子菌为主，各占64.7％和15.5％，子囊菌以盘菌为主，占总的47.4％，担子菌中以伞菌为主，占10.4％，接合菌和壶菌较少。
进一步，所述Fosmid文库库容30624个克隆，平均插入片段36.5kb，包含超1Gb微生物基因组，无同源序列87.79％，有利于筛选非培养微生物基因资源；功能驱动筛选出抗西瓜枯萎病活克隆4个：129C、142E、142G和153G；盆栽防效分别为63.09％、53.28％、41.65％和34.80％。
进一步，所述(2)包括：低熔点琼脂糖脉冲电泳后，切取25kb-48kb的条带，溶胶酶法回收DNA，连接，包装，转导入EPI300宿主细胞中，涂到含氯霉素的平板上，保菌克隆，保存至少30 000个以上的克隆；随机抽取文库中的克隆进行插入片段大小检测、克隆稳定性检测和文库中包含的微生物物种多样性检测。
进一步，所述通过抑菌圈法和抑制孢子萌发的方法，筛选Fosmid表达文库，获得Fosmid活性克隆。
进一步，所述(4)包括：抗瓜类枯萎病活性物质的提纯和鉴定，发酵罐或大规模的摇培获得大量的活性克隆发酵液，经石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取后，在旋转蒸发仪去掉部分非活性层，获得较纯的活性层；活性层经正相柱层析、反相柱层析、凝胶层析、薄层层析和重结晶，获得纯化后的抗瓜类枯萎病活性物质；用核磁共振、GC-MS、红外光谱、紫外光谱的手段解析图谱，确定活性物质结构，验证化合物抗瓜类枯萎病的活性。
进一步，所述(4)包括：提取Fosmid活性克隆DNA，构建亚克隆文库，采用筛选活性Fosmid克隆的方法，获得有生物学活性的目的基因克隆并测序。
本发明的另一目的在于提供一种由所述抗瓜类枯萎病活性产物基因的克隆与序列分析方法构建的抗瓜类枯萎病药物基因高效表达体系。
本发明的优点及积极效果为：提取海南岛热带雨林土壤微生物基因组总DNA，构建宏基因组Fosmid表达文库，功能驱动筛选抗瓜类枯萎病天然活性产物，扩大筛选范围，提高筛选成功率，减少重复筛选的现象，突破传统研究方法的局限，为瓜类枯萎病的生物防治提供一个全新的研究平台。结合气相色谱-质谱联用(GC-MS)和四大光谱，鉴定宏基因组Fosmid文库中，通过功能驱动筛选获得的抗瓜类枯萎病天然活性产物，并明确其结构。针对大多数生防菌不能在根部，甚至在维管束部定植，因而大田应用效果不理想的瓶颈问题，并依据瓜类枯萎病侵染的特点，以植株内生菌作为表达株系，筛选和改造内生菌株，建立抗枯萎病天然活性产物的异源高效表达体系。为实现抗枯萎病药物的商品化奠定坚实的基础。
本发明利用分子生物学手段，构建海南岛热带雨林土壤微生物宏基因组组Fosmid文库，建立抗瓜类枯萎病活性产物基因克隆和序列分析方法，并在此基础上利用功能驱动筛选抗瓜类枯萎病的微生物功能基因(簇)。突破了靠培养-筛选生防菌的局限，扩大筛选范围，提高筛选成功率，减少重复筛选的现象。如本研究中筛选出的瓜类枯萎病抗性基因，unpks-5，经序列和系统进化发育分析，发现该基因及其所编码的活性物质极有可能是非培养细菌来源的。因而，为瓜类枯萎病的生物防治提供一个全新的研究手段；同时，构建的宏基因组Fosmid文库，库容大，插入片段长，有利于从中筛选其他活性产物。国内有人研究过青藏高原高寒草甸土壤、河(湖)底沉积土、盐碱土和堆肥等土壤类型，未见有关海南岛热带雨林土壤的报道。而海南岛常年高温高湿，土壤呈酸性，是耐高温、耐酸的极端微生物的“温床”，因而土壤中的微生物更有利于从中找到有益的微生物基因资源。利用构建和筛选亚克隆的方法筛选编码活性产物的完整功能基因(簇)，美国、德国和韩国研究得较多，国内研究报道较少，宏基因组学技术概念的提出以及编码活性产物的基因的克隆与序列分析手段的应用较晚，1998年提出，还不到20年的时间；另外，国外研究者主要以海水样品作研究对象，而国内主要以土壤、化粪池堆积物等未研究对象；环境样品比单一的海水样品复杂多样，其中的腐植酸、腐殖质等都是阻碍因素，因而研究报道较少。最终，通过分离、筛选和改造植株内生菌作为表达株系，并建立从文库中筛选出来的有生物学活性的目的基因(簇)异源高效表达体系，突破传统生防菌不能定植的瓶颈因素，将大大加速抗瓜类枯萎病新药物的研制、开发和商品化进程。
附图说明
图1是本发明实施例提供的抗瓜类枯萎病活性产物基因的克隆与序列分析方法流程图。
图2是本发明实施例提供的Fosmid文库构建方法流程图。
图3A是本发明实施例提供的混合后形成海南岛热带雨林特色环境土壤微生物基因组总DNA。
图3B是本发明实施例提供的经1％的琼脂糖凝胶低电压电泳和脉冲电泳检测。
图4是本发明实施提供的回收末端修复的宏基因组DNA(M:λDNA/HindⅢ1,2:Metagenomic DNA)示意图。
图5是本发明实施提供的Fosmid质粒DNA电泳(M＝λDNA/HindⅢ,1-18:Randomselective Fosmid DNA)示意图。
图6是本发明实施提供的Fosmid DNA经Not Ⅰ酶切后脉冲电泳图谱(M＝Low RangePFG Marke)示意图。
图7是本发明实施提供的Fosmid DNA经EcoR Ⅰ酶切后1％琼脂糖凝胶电泳图谱示意图；A-G分别代表7个不同的克隆；1和5分别代表第1d和第5d(M＝Trans15K)。
图8是本发明实施提供的亚克隆构建中活性Fosmid DNA：129C、142G、142E和153G经EcoR Ⅰ和SPh Ⅰ双酶切后，1％琼脂糖凝胶电泳图谱示意图；1,2,3,4:分别代表129C、142G、142E和153G(M1:λDNA/HindⅢ,M2:Trans 2k plus，Fosmid vector：8.2kbp)。
图9是本发明实施提供的活性Fosmid克隆129C的DNA序列分析及其所包含的pks基因(簇)示意图；克隆序列全长39.145kb，包含38个ORF。其中，pks基因核酸序列全长1641bp，编码547个蛋白质氨基酸；蛋白质分子量59,782Da，等电点5.93，G+C含量57.83％，包含起始密码子ATG和终止密码子TAG。在其5′非编码区无S-D序列(Shine-Dalgarno)，3′非编码区无反向串联重复序列。
图10是本发明实施提供的活性Fosmid克隆129C中包含的PKS基因系统进化发育分析示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明为解决传统筛选生防菌筛选的局限，同时，也为了扩大筛选范围，从不可纯培养的微生物中筛选具有抗瓜类枯萎病的微生物基因资源。本发明从分子生物学的手段入手，通过构建和功能驱动筛选宏基因组Fosmid文库，找到抗瓜类枯萎病的新的活性物质，利用液相色谱和核磁共振的手段鉴定活性产物的结构；通过构建和筛选亚克隆，以及活性亚克隆序列测定和序列分析，获得编码活性物质的完整基因(簇)。本发明将分离、筛选和改造植株内生菌作为表达株系，并建立从文库中筛选出来的有生物学活性的目的基因(簇)异源高效表达体系。为实现抗枯萎病药物的商品化奠定坚实的基础。
Fosmid是宏基因组文库构建载体，本发明中用的pCC1FOS，是一种商品化的载体，购买于美国EPI生物技术公司。宿主菌大肠杆菌E.coli EPI300为商品化菌株，购置于美国EPI生物技术公司。
从活性Fosmid克隆129C中筛选出的功能基因pepks核酸序列SEQ ID NO：1。
从活性Fosmid克隆129C中筛选出的功能基因pepks氨基酸序列SEQ ID NO：2。
从亚克隆文库es142E中筛选出活性功能基因unpks-5核酸序列SEQ ID NO：3。
从亚克隆文库es142E中筛选出活性功能基因unpks-5氨基酸序列SEQ ID NO：4。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的抗瓜类枯萎病活性产物基因的克隆与序列分析方法包括以下步骤：
S101：DNA样品的提取和纯化，异位裂解法提取的土壤微生物基因组DNA片段经低熔点琼脂糖电泳，溶胶酶法回收主带，脉冲场电泳检测DNA分子量大小；
S102：Fosmid文库的构建及检测，低熔点琼脂糖脉冲电泳后，切取25kb-48kb之间的条带，溶胶酶法回收DNA，连接，包装，转导入EPI300宿主细胞中，涂到含氯霉素的平板上，保菌克隆，保存至少30 000个以上的克隆；同时，随机抽取文库中的克隆进行插入片段大小检测、克隆稳定性检测和文库中包含的微生物物种多样性检测；
S103：文库筛选：分离、纯化培养西瓜枯萎病菌株，结合形态学观察和分子生物学手段鉴定该菌株，并通过多次温室盆栽试验，进行抗性鉴定，以确保该菌株为强致病力菌株；同时，通过抑菌圈法和抑制孢子萌发的方法，筛选Fosmid表达文库，获得Fosmid活性克隆；
S104：抗瓜类枯萎病活性物质的提纯和鉴定，发酵罐或大规模的摇培获得大量的活性克隆发酵液，经石油醚、氯仿和乙酸乙酯等萃取后，在旋转蒸发仪的作用下，去掉部分非活性层，获得较纯的活性层；活性层经正相柱层析、反相柱层析、凝胶层析、薄层层析和重结晶等手段，获得纯化后的抗瓜类枯萎病活性物质；用核磁共振、GC-MS、红外光谱、紫外光谱的手段解析图谱，确定活性物质结构，并进一步验证化合物抗瓜类枯萎病的活性；
S105：抗瓜类枯萎病活性产物基因(簇)的克隆与序列分析，提取Fosmid活性克隆DNA，构建亚克隆文库，并按照筛选活性Fosmid克隆的方法，获得有生物学活性的目的基因克隆并测序，并与Genbank中的序列进行比较，明确目的克隆基因的生物学地位；
S106：异源高效表达体系的构建，筛选和改造植物内生菌株，将该基因转化到改造后的内生菌株，通过选择不同的启动子、不同的培养基和发酵条件，建立抗瓜类枯萎病药物基因的高效表达体系。
本发明实施例提供的抗瓜类枯萎病活性产物基因的克隆与序列分析方法具体包括以下步骤：
(1)异位裂解法提取土壤微生物基因组DNA；采集海南岛热带雨林土壤样品30份(五指山和尖峰岭土壤样品各15份)，50目筛孔过筛，去除树枝残根和大颗粒的石块后，-80℃保存备用。每样品称取土样300g，小型搅拌器捣成匀浆，用50mL灭菌离心管分装，1000rpm，离心5min，收集上清。多次重复之后，上清分装于新的50mL灭菌离心管中，差速离心法，11000rpm，离心15min，去上清，沉淀用无菌水混匀后往底部加入Nycodenz密度梯度介质(与水1:1配置)，密度梯度法离心，取中间菌层。约5mL菌悬液，加入5mL DNA提取液。加入溶菌酶100μL，37℃水浴30min。加入蛋白酶K 140μL，加入终浓度为1％SDS，55℃，水浴2h。接下来用氯仿抽提，异丙醇沉淀，70％乙醇洗涤和TE溶解DNA。
(2)宏基因组Fosmid文库构建及其质量检测；文库构建：采用PVPP洗涤，去除腐植酸等杂质后，溶菌酶—蛋白酶K—SDS—CTAB裂解法，提取和纯化大片段的土壤微生物基因组DNA。每次共提取7个样品，混合后形成海南岛热带雨林特色环境土壤微生物基因组总DNA。经1％的琼脂糖凝胶低电压电泳和脉冲电泳检测，发现提取的DNA片段大于23kb，最大达到150kb左右，均适合构建大的插入片段的宏基因组Fosmid文库。末端修复宏基因组DNA后，采用溶胶酶法，不通过过柱，回收DNA片段，很好地保证了片段的完整性，胶回收23kb以上的片段。然后，使用Fosmid文库构建试剂盒中自带的Fast-LinkTM DNA连接酶将回收产物连接到Fosmid载体pCC1FOS上。连接反应在2h内完成。连接产物经λ包装提取物包装，EPI300-T1R菌株转染，涂于含12.5μg/mL的氯霉素的LB平板上，37℃，过夜培养。最终，产生了100板，约40,000个Fosmid克隆，挑取其中30,624个克隆，摇菌，保存。
质量检测：一、克隆阳性率检测：随机挑取18个Fosmid克隆，经初摇和诱导多拷贝之后，按照Fosmid DNA提取和纯化试剂盒(FosmidMAXTM DNA Purification Kit)上的使用说明提质粒。16个克隆质粒都有清晰的条带，且片段大小大于23kb，说明插入片段正常，文库的阳性率较高，达89％；
二、插入片段大小检测：随机挑取14个Fosmid克隆，提质粒，用Not Ⅰ酶切进行酶切。所有克隆在6.5-9.4kb之间有一条8.2kb的载体条带，而插入片段则被消化成大小不一的多个片段，这可能是由于土壤微生物基因组DNA的G+C含量较高，各种酶切位点较多所致。通过叠加各泳道中除了载体带以外的条带，发现各插入片段至少在30kb以上；
三、克隆稳定性检测：随机挑取了7个Fosmid克隆，取1mL继代培养1d和培养5d后，分别提质粒，然后用EcoR Ⅰ37℃酶切4h，结果发现培养1d和培养5d的质粒酶切条带基本一致。因此，可以断定外源插入片段没有出现丢失或重排的现象，如E号克隆的第100代和第0代在1.5kb-5kb之间均有相同的酶切条带。说明所构建的Fosmid文库是稳定的。
四、文库包含的微生物物种多样性检测：158个末端随机测序结果中，有7个分别比对上厌氧粘细菌、拜叶林克氏菌、慢生根瘤菌、假单胞菌、沼泽红假单胞菌、大豆根瘤菌和尚未确定分类地位的细菌，占4.07％。其中，2个比对上假单胞菌属。无同源序列的克隆共151个，占到87.79％。这表明该宏基因组文库覆盖的微生物多样性极其丰富。其次，7个比对上同源序列的都是细菌序列，这可能是有两方面的原因，其一，细菌是该环境样品的优势菌群，其物种丰度远远高于古菌、真菌以及其他微生物；其二，间接提取DNA的方法得到细菌比例更大一些。此外由测序结果分析出该文库的空载率低为1.7％，随机性为98.1％。
(3)筛选宏基因组Fosmid表达文库，获得Fosmid活性克隆；构建用于文库筛选的12合1、8合1文库和96合1文库，即二级池和超级池，大大地缩短了工作量，避免了单个克隆筛选的麻烦。如将文库克隆全部平行转接一套筛选文库，再将筛选文库中每个96孔板中的8排、12列各混在一起，成为复筛库；再将板中每排、列各克隆混合，作为一个初筛库进行初筛。若96孔合一的初筛库有目标克隆则在复筛库中各排、列分别进行筛选，可直接获得目标菌位点。
通过功能驱动筛选(双琼脂层法)初步筛选出对西瓜枯萎病XGW-1菌丝生长有抑制作用的Fosmid克隆4个，编号分别为：129C、142E、142G和153G，并采用牛津杯法和对峙培养法反复验证Fosmid活性克隆129C、142E、142G和153G对西瓜枯萎病菌丝生长的抑制作用。研究发现：129C和142E对西瓜枯萎病菌丝生长的抑制作用最强、最稳定，在牛津杯法室内生物测定中，平均抑菌圈直径能达5.9mm和5.1mm。
(4)活性物质的提纯和鉴定，确定活性物质结构，验证化合物抗瓜类枯萎病的活性；一、亚克隆文库构建、筛选和序列分析：提取Fosmid克隆142G、142E和153G的DNA，经EcoRⅠ和SPh Ⅰ双酶切后，胶回收1.5—5kb大小的片段，连接到用相应的酶双酶切后的pUC19载体上，转化(用E.coli DH5α)后，涂板于LB固体培养基(含50μg/mL氨苄青霉素)上，37℃，12h后，挑取尽量多的亚克隆，37℃，摇菌培养12h，加终浓度为15％的甘油，-20℃冰箱中保存备用。构建了亚克隆表达文库es142E、es142G和es153G，各库库容均包含576个克隆。以西瓜枯萎病菌为靶标菌，采用双琼脂层法，根据是否产生透明圈的表型，从亚克隆文库es142E中，筛选出活性亚克隆unpks-5，其抑菌圈直径为4.5mm。此外，随着测序技术的发展，测序成本、价格等方面降低，我们直接测通了温室盆栽防效最好的活性Fosmid克隆129C。提取克隆隆unpks-5质粒，送北京华大基因研究中心测序。序列分析在生物学软件DNAman和DNAstar中进行。亚克隆中包含的基因数和核酸序列运用在线分析页面(http://linux1.softberry.com/berry.phtml？topic＝fgenesb&group＝help&subgroup＝gfindb)中进行。同时，在CBS SignalP 4.1server界面(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)中分析其信号肽劈开位点，通过BDGP Neural network promoter prediction界面http://www.fruitXy org/seq_tools/
Promoter.html.预测其是否含有独立的启动子。
二、129C序列分析和活性产物鉴定：提取和纯化Fosmid克隆129C的DNA序列，送华大基因测序和序列分析。得到39.145kb的完整序列，包含38个ORF。其中，8个ORF在同一转录单元，可能参与抗枯萎病活性产物基因的表达。经注释，其氨基酸序列包含乙酰辅酶A水解酶、酰基辅酶A脱氢酶、聚酮合成酶(polyketide synthetases,pks)、聚酮化合物环化酶(polyketide cyclase)、辅酶A转移酶等。其中，pks基因核酸序列全长1641bp，编码547个蛋白质氨基酸；蛋白质分子量59,782Da，等电点5.93，G+C含量57.83％，包含起始密码子ATG和终止密码子TAG。在其5′非编码区无S-D序列(Shine-Dalgarno)，3′非编码区无反向串联重复序列(Tandem inverted repeat sequences)，无独立的启动子序列。在氨基酸序列中，34和35个氨基酸序列之间是其信号肽劈开位点。
三、活性产物提纯与鉴定：对活性Fosmid克隆129C发酵液110L采用乙酸乙酯萃取后，获得38.5g浅黄色粗提物，取少量(约5mg)用甲醇配成浓度为10mg/mL的粗提物，采用含毒培养基法对西瓜枯萎病菌进行室内生物测定，同时，设定只加甲醇溶液的PDA对照，每处理重复4次。28℃，培养7d后，采用十字交叉法测定处理和对照的菌丝生长直径。甲醇对照的菌丝生长直径为60mm左右，而初提物处理的菌丝生长直径均不超过35mm。经三次柱层析分离，分离得到1012个流分。取不同流分段(浓度为1mg/mL)采用抑菌圈法对西瓜枯萎病菌分别进行室内生物测定，仅S331～432流分有活性，合并活性流分共5.8g。其中，S331流分抑菌圈直径达到11.2mm，S432流分抑菌圈直径达到12.4mm，抑菌圈边缘菌丝生长受到明显抑制。
四、GC-MS及纯化物的生物活性测定：经与NIST 08.L标准质谱图库进行比对检索，并结合有关文献和人工解析，将该化合物鉴定为2,4,-二乙酰基间苯三酚(2,4-Diacetylphloroglucinol)，分子式为C10H10O5，分子量为210.181。采用菌丝生长速率法，测定了2,4,-二乙酰基间苯三酚对西瓜枯萎病菌XGW-1的生物活性。2,4,-二乙酰基间苯三酚对西瓜枯萎病菌的毒力回归方程Y＝1.188X+3.3208，其EC50和EC95分别为25.91μg/mL和622.16μg/mL，与对照生物防治药剂农抗120抗菌素的效果(EC50和EC95分别为25.22μg/mL和682.02μg/mL)相当；比对照化学药剂50％多菌灵可湿性粉剂的防治效果(EC50和EC95分别为13.44μg/mL和330.22μg/mL)要差。然而，该化合物分离于环境微生物样品，与环境的兼容性较好，因而具有较好的生防潜力。
(5)筛选和改造植物内生菌株，将基因转化到改造后的内生菌株，通过选择不同的启动子、不同的培养基和发酵条件，建立抗瓜类枯萎病药物基因的高效表达体系。从健康的西瓜植株分离出1株内生菌株YA-1，并对其进行了形态鉴定。在LB固体培养基表面菌落为椭圆形或柱形，表面粗糙不透明，污白色到浅黄色，30℃温箱中培养1d后，用牙签挑起，能看到粘稠状菌脓；培养3d后，菌落表面能看到大量褶皱。据其在LB培养基上的生长表型，以及其他形态、生理生化特性和分子生物学手段，将其鉴定为枯草芽孢杆菌。利用分离到的内生菌株YA-1，分别表达从Fosmid文库中筛选到的pepks基因和亚克隆文库筛选到的3-oxoacyl-ACP synthase基因：unpks，实现抗病菌株介导抗病基因表达外源基因联合高效抗病体系。采用质粒的形式在枯草芽孢杆菌中表达外源基因，选择在大肠杆菌和芽孢杆菌中穿梭质粒载体载体pWB980作为表达载体，该载体在枯草芽孢杆菌细胞内拷贝数高，同时该载体采用枯草芽胞杆菌胞苷脱氢酶(Cdd)基因的启动子P43作为外援基因表达的启动子，该启动子属于重叠启动子，能被两种σ因子识别，是一种组成型启动子，具有高效表达的特点。Fosmid文库筛选到的pepks基因序列经带有HindⅢ和kpnⅠ酶切位点的引物扩增后，经HindⅢ和kpnⅠ酶切后连接到pWB980载体的HindⅢ和kpnⅠ酶切位点处，经大肠杆菌扩增后，通过电转化方法转化枯草芽孢杆菌获得高效表达pepks基因的枯草芽孢杆菌菌株，通过抗拮实验证实，抑菌圈直径可达15.3mm。通过盆栽实验证实抗病性达到71.38％，通过高效表达体系的分析，证明pepks基因对枯萎病的抗性达到71.38％，比Fosmid表达克隆129C的抑菌活性(63.09％)提高了8.29％，比相应的对照药剂农抗120抗菌素防治效果稍高(70.49％)，差异不显著。说明pepks基因对枯萎病抗性较好。
而亚克隆文库筛选到的unpks基因序列经带有EcoR Ⅰ和Sph Ⅰ酶切位点的引物扩增后，经EcoR Ⅰ和Sph Ⅰ酶切后连接到pWB980载体的EcoR Ⅰ和Sph Ⅰ酶切位点处，同样经大肠杆菌扩增后，通过电转化方法转化枯草芽孢杆菌获得高效表达unpks基因的枯草芽孢杆菌菌株，通过抗拮实验证实，抑菌圈直径可达13.1mm。通过盆栽实验证实抗病性达到60.98％，通过高效表达体系的分析，证明unpks基因对枯萎病的抗性达到60.98％，比Fosmid表达克隆142E的抑菌活性(53.28％)提高了7.7％说明unpks基因对枯萎病具有抗性。
如图2所示，本发明提供的Fosmid文库构建方法包括以下步骤：
S201：采用PVPP洗涤，去除腐植酸等杂质后，溶菌酶—蛋白酶K—SDS—CTAB裂解法，提取和纯化大片段的土壤微生物基因组DNA，每次共提取7个样品，混合后形成海南岛热带雨林特色环境土壤微生物基因组总DNA；经1％的琼脂糖凝胶低电压电泳和脉冲电泳检测，提取的DNA片段大于23kb；
S202：末端修复宏基因组DNA后，胶回收23kb以上的片段，先将marker和小样切下，在紫外下用牙签作好标记，将大样在日光灯下比着小样和marker切下所要回收达片段；使用Fosmid文库构建试剂盒中自带的Fast-LinkTM DNA连接酶将回收产物连接到Fosmid载体pCC1FOS上；连接反应在2h内完成；
S303：连接产物经λ包装提取物包装，EPI300-T1R菌株转染，涂于含12.5μg/mL的氯霉素的LB平板上，37℃，过夜培养，产生了100板，约40,000个Fosmid克隆，挑取其中30,624个克隆，摇菌，保存。
热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库包含21个OTU，以子囊菌和担子菌为主，各占64.7％和15.5％，子囊菌以盘菌为主，占总的47.4％，担子菌中以伞菌为主，占10.4％，接合菌和壶菌较少。
热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库库容30624个克隆，平均插入片段36.5kb，包含超1Gb微生物基因组，无同源序列87.79％，有利于筛选非培养微生物基因资源；功能驱动筛选出抗西瓜枯萎病活克隆4个：129C、142E、142G和153G；盆栽防效分别为63.09％、53.28％、41.65％和34.80％。
下面结合附图对本发明的应用原理作进一步的描述。
1.热带雨林土壤宏基因组Fosmid文库构建与特征分析
采集海南岛热带雨林土壤样品30份(五指山和尖峰岭土壤样品各15份)，50目筛孔过筛，去除树枝残根和大颗粒的石块后，-80℃保存备用。
1.1热带雨林土壤宏基因组Fosmid文库构建
采用PVPP洗涤，去除腐植酸等杂质后，溶菌酶—蛋白酶K—SDS—CTAB裂解法，提取和纯化大片段的土壤微生物基因组DNA。每次共提取7个样品，混合后形成海南岛热带雨林特色环境土壤微生物基因组总DNA(图3A)。经1％的琼脂糖凝胶低电压电泳和脉冲电泳检测，提取的DNA片段大于23kb，最大达到150kb左右(图3B)，说明提取的基因组DNA在纯度(经PVPP洗涤去腐植酸)和片段大小上(基因组DNA完整性)，均适合构建大的插入片段的宏基因组Fosmid文库。
末端修复宏基因组DNA后，胶回收23kb以上的片段。如图4，为防止DNA片段在紫外下长期照射，影响后续实验，先将marker和小样切下，在紫外下用牙签作好标记，然后将大样在日光灯下比着小样和marker切下所要回收达片段。然后，使用Fosmid文库构建试剂盒中自带的Fast-LinkTM DNA连接酶将回收产物连接到Fosmid载体pCC1FOS上。连接反应在2h内完成，一般情况下，连接反应时间的延长并不影响连接效果。连接效率高低主要取决于回收DNA的质量，其中，DNA片段的完整性时关键，如果在回收过程中DNA片段有机械损伤，造成DNA片段化，那么将直接影响到与载体的连接。采用溶胶酶法，不通过过柱，回收DNA片段，很好地保证了片段的完整性。
连接产物经λ包装提取物包装，EPI300-T1R菌株转染，涂于含12.5μg/mL的氯霉素的LB平板上，37℃，过夜培养。最终，产生了100板，约40,000个Fosmid克隆，挑取其中30,624个克隆，摇菌，保存。
1.2宏基因组Fosmid文库特征分析
1.2.1文库中克隆阳性率检测
随机挑取18个Fosmid克隆，经初摇和诱导多拷贝之后，按照Fosmid DNA提取和纯化试剂盒(FosmidMAXTM DNA Purification Kit)上的使用说明提质粒。如图5所示，除了11和12号克隆由于操作过程中人为的打翻，没有提出质粒外，其他16个克隆质粒都有清晰的条带，且片段大小大于23kb，说明插入片段正常，文库的阳性率较高。
1.2.2文库插入片段大小检测
随机挑取14个Fosmid克隆，提质粒，用Not Ⅰ酶切进行酶切。如图6所示，所有克隆在6.5-9.4kb之间有一条8.2kb的载体条带，而插入片段则被消化成大小不一的多个片段，这可能是由于土壤微生物基因组DNA的G+C含量较高，各种酶切位点较多所致。通过叠加各泳道中除了载体带以外的条带，各插入片段至少在30kb以上。这也正好印证了λ包装提取物只包装40kb左右的外源插入片段的理论。
1.2.3克隆的稳定性检测
随机挑取了7个Fosmid克隆，取1mL继代培养1d和培养5d后，分别提质粒，然后用EcoR Ⅰ37℃酶切4h，结果培养1d和培养5d的质粒酶切条带基本一致(图7)。因此，可以断定外源插入片段没有出现丢失或重排的现象，如E号克隆的第100代和第0代在1.5kb-5kb之间均有相同的酶切条带。说明所构建的Fosmid文库是稳定的。
1.2.4文库包含物种多样性检测
158个末端随机测序结果中，有7个分别比对上厌氧粘细菌、拜叶林克氏菌、慢生根瘤菌、假单胞菌、沼泽红假单胞菌、大豆根瘤菌和尚未确定分类地位的细菌，占4.07％。其中，2个比对上假单胞菌属。无同源序列的克隆共151个，占到87.79％。这表明该宏基因组文库覆盖的微生物多样性极其丰富。其次，7个比对上同源序列的都是细菌序列，这可能是有两方面的原因，其一，细菌是该环境样品的优势菌群，其物种丰度远远高于古菌、真菌以及其他微生物；其二，间接提取DNA的方法得到细菌比例更大一些。此外由测序结果分析出该文库的空载率低为1.7％，随机性为98.1％。检测结果见表1。
表1宏基因组文库末端测序分析物种多样性。
Figure GDA0002775240890000231
成功得到了一个包含30624个克隆的热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库Hnsfba，平均插入片段为36.5kb左右，库容量超过1Gb微生物基因组信息。经验证两个宏基因组文库插入效率和克隆的稳定性都较为理想。末端测序结果(表1)表明文库的插入片段大多数来源于未培养微生物基因组，随机性良好。有利于从不可培养热带雨林土壤微生物中筛选出抗瓜类枯萎病基因资源。
本发明实施例提供的抗瓜类枯萎病活性产物基因的克隆与序列分析方法具体包括：
(1)热带雨林土壤微生物宏基因组Fosmid文库的构建，采集海南热带雨林土壤，直接裂解法(也称原位裂解法)和间接裂解法(也称异位裂解法)提取DNA片段，比较两种方法在DNA产量、纯度和片段长度等方面的差异，选取合适的DNA提取方法提取土样中的DNA，经脉冲电泳，溶胶酶法胶回收25-48kb大小的DNA片段，构建土壤微生物的宏基因组Fosmid表达文库，并对所构建的Fosmid文库质量和克隆的稳定性进行评价。
(2)基于Fosmid表达文库的抗瓜类枯萎病活性产物筛选与鉴定，分离、纯化培养西瓜枯萎病菌株，结合形态学观察和分子生物学手段鉴定该菌株，并通过多次温室盆栽试验，进行抗性鉴定，以确保该菌株为强致病力菌株；同时，通过抑菌圈法和抑制孢子萌发的方法，筛选Fosmid表达文库，获得Fosmid活性克隆，采用GC-MS和四大光筛选谱鉴定活性产物。
(3)抗瓜类枯萎病活性产物基因(簇)的克隆与序列分析，提取Fosmid活性克隆DNA，构建亚克隆文库，并按照筛选活性Fosmid克隆的方法，获得有生物学活性的目的基因克隆并测序，并与Genbank中的序列进行比较，明确目的克隆基因的生物学地位。
(4)抗瓜类枯萎病药物合成基因(簇)异源高效表达体系的构建，将目的基因克隆首先在大肠杆菌中表达，利用亲和层析分离纯化该活性产物，与(2)所确认的活性产物进行比较，进一步确认该目的基因；筛选和改造植物内生菌株，将该基因转化到改造后的内生菌株，通过选择不同的启动子、不同的培养基和发酵条件，建立抗瓜类枯萎病药物基因的高效表达体系并探讨其产业化前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110> 海南省农业科学院植物保护研究所
<120> 一种抗瓜类枯萎病活性产物基因的克隆与序列分析方法
<160> 4
<210> 1
<211> 1641
<212> DNA
<213>功能基因pepks
<400> 核苷酸序列
ATGGCTGGCAAGGCAAGCTTCAACTGGATCGATCCACTGCTGCTCGATCAACAGCTCACCGAAGAAGAGCGCATGGTGCGCGACAGTGCTGAGCAGTTCGCCCAGGACAAGTTGGCCCCGCGTGTGCTCGAAGCCTTTCGCCATGAAAAGACCGACCCTGCTATTTTTCGCGAGATGGGCGAGACCGGTTTGCTCGGTGCGATGATCCCTGAGCAGTACGGTGGCAGCGGCTTGAATTACGTCAGCTATGGGTTGATCGCGCGCGAAGTGGAGCGTGTCGACTCCGGCTATCGCTCGATGATGAGTGTGCAGTCGTCACTGGTCATGGTGCCGATCAACGAGTTCGGCACTGAGGCACAGAAACAGAAGTACCTGCCGAAGCTGGCTTCTGGCGAATGGATTGGTTGTTTCGGCTTGACTGAGCCCAATCATGGCTCCGATCCGGGTGCGATGATCACTCGTGCTCGCAAGGTCGAGGGGGGTTATAGCCTGACGGGCGCGAAGATGTGGATCACCAATAGCCCGATCGCGGATGTGTTTGTGGTCTGGGGTAAGGACGATGCTGGCGATATTCGTGGGTTTGTCCTGGAGAAAGGCTGGAAGGGCCTGAGCGCTCCGGCGATTCATGGCAAGGTCGGGCTGCGCGCCTCCATCACCGGTGAAATCGTCATGGATAACGTGTTTGTTCCGGAAGAGAACATCTTTCCGGATGTGCGCGGTTTGAAGGGGCCCTTCACCTGCCTTAACTCGGCACGCTATGGCATCTCCTGGGGGGCGTTGGGGGCCGCCGAGTTTTGCTGGCATACCGCCCGCCAATACACGCTTGATCGCCATCAATTCGGCCGCCCATTGGCGGCGACCCAGTTGATCCAGAAGAAGCTGGCCGATATGCAGACTGAGATCACCCTGGCCCTGCAAGGTTGCCTGCGTTTGGGGCGGATGAAGGACGAAGGTACGGCGGCGGTTGAAATCACGTCGATCATGAAGCGCAACTCGTGTGGCAAGTCCCTGGATATCGCACGCATGGCGCGTGACATGCTGGGTGGCAACGGTATTTCCGACGAGTTCGGGGTGGCACGTCATCTGGTCAACCTGGAGGTGGTGAATACCTATGAAGGTACTCATGACGTGCATGCGCTGATTCTGGGGCGTGCGCAAACCGGTCTTCAGGCGTTCTATTAAATGAAACCGCTGCAACCCGATACATTGATTCACAACCCAACTGGCATGCCGGTGGTGGCCTCTGTCGTGGTCAACTGCGAGGCCATGCGACTGTGGGGGGTGGTGGGTCACTTTGCAGGCTTTGATGCCTTTATTCCGGCCCTGTCGCACATCGAAATGACGGGGGACGGCGTGGGCGCTTTGCGCACCAAGTTTTTCCACGATGGTCATCGCGTCGTGGAGCAACTCAATAGCCGGGACGAAGATGCCATGAGCATGACCTGGACAACGATCTATAACACGCTGGGCGTAGCTCGATTGTGGGCGGCGATGCGCGTGGAAGCACTCGGTTCAAGCGGTTCAAGGGCGACCTGGACGCTGATCGGCGAGCCAGCAGAAATGGCGCAGGCGGAGTTTGAACAGTTTGTACAAACATTCGCCGACAACGCTTTGGGAAATGTGCGCCATATGCTGGGTTGA
<210> 2
<211> 546
<212> PRT
<213>功能基因pepks
<400> 氨基酸序列
MAGKASFNWIDPLLLDQQLTEEERMVRDSAEQFAQDKLAPRVLEAFRHEKTDPAIFREMGETGLLGAMIPEQYGGSGLNYVSYGLIAREVERVDSGYRSMMSVQSSLVMVPINEFGTEAQKQKYLPKLASGEWIGCFGLTEPNHGSDPGAMITRARKVEGGYSLTGAKMWITNSPIADVFVVWGKDDAGDIRGFVLEKGWKGLSAPAIHGKVGLRASITGEIVMDNVFVPEENIFPDVRGLKGPFTCLNSARYGISWGALGAAEFCWHTARQYTLDRHQFGRPLAATQLIQKKLADMQTEITLALQGCLRLGRMKDEGTAAVEITSIMKRNSCGKSLDIARMARDMLGGNGISDEFGVARHLVNLEVVNTYEGTHDVHALILGRAQTGLQAFYKMKPLQPDTLIHNPTGMPVVASVVVNCEAMRLWGVVGHFAGFDAFIPALSHIEMTGDGVGALRTKFFHDGHRVVEQLNSRDEDAMSMTWTTIYNTLGVARLWAAMRVEALGSSGSRATWTLIGEPAEMAQAEFEQFVQTFADNALGNVRHMLG
<210> 3
<211> 1494
<212>DNA
<213>功能基因unpks-5
<400>核苷酸序列
AGCGCTTCCCGTTCCTGCCCGCCGACTTCGACGAGCGCTACTTCCAGTCCGCGCCGGCCGACCAGTGGACCGACCATCTGCGCGGCGGCGAGGAGGTCCTGCTGCTCAACCTCACCGGCGAGGAGCGCGCGGCCTTCCGCGTGCCGCGCAGGGAGGTCCCGGTGACCTTCTTCCTGAAAAAGGGTGGCCACGAAACCGCGCAGGCACGGATCGATACCCTGCTGGTGGACTGCGACGCCCGTCGCGTGGAAGTCACCTGGCGCATTCGCCGGCTGAATGAGCCAGGCCCTGAGCATCGTCGCCTCCGGCATGGTCAGCGCGGTCGGTCTCAGCGCGCCGGCCAGCTGAGCGCCGTTCGGTTCAGCTCTGTTCTACTGCTCGGTTGCTCGAGACATCTTCCACTGCGTCGCACGTTTGCTTCGAGATAGAGCTCAGCTGGAGTCACGCTCACGCTGCTCACTCTGCTGCTCACGACGTCTGCGCTCGCTATCGAGAAGGCGTAGTCAGACTCGTCGGACCTCTCTTGTAAGGACCTGCTGCTGTTGCTGTGCGTATCGGATGCTGTCAGCGGCATACTCTGCGTGTCGTTCGATGATTCTCACGTGCGTCTCGTGACAGCCTGTCTTCCTCCACTCGGCGTCCTCACTTCTGCACACTTCTACTGTGTCAGTGTCTATCTCTGTGCGACTCAGATACTCTACCTCTCGCTCATCGAGAGCTCACTTCATCACGTGCTCTACGCAGGCGTCGACTCCTTCGCCTGTCTCGCGTCGCAGACTCGCAACAACACTCTCTCTACTCACTACTCTATCTGTTCTTCGACTGTCTCATCTCTGTGACTCTTCTTGTTCTACCACGCTCTGCCTCTCCGACTCTGTATCTTGTGCGATCTCGCACATCGTCTACTTCAGCTACGTCTTCGAGTTGCCGACTGTCTAACTCTATCACGTGTCATCATCATCCGTATCACTCATCGAGCTCTACATCTCTACGCTCACTCACTCTCACTGTCATCTGTCGTTCCTGTCCTATCTCTACTTCGTCCATCGCTGCTTCACGCATCTACGCTTCCGGAATTCGGCAATTCCTCACTGCTTCACGCTACGTTCACACTCTACATCACCTGCACTCTTGGCCTATCAGCATATCATCCACCTTCCACTTGCTCACGTCTCTGTACCTCTCCTTCAGCGTCTCCACTCGGAGCTCATCTGTACCTGTGCTACATCTCTACACCACTGTCTGCTCCGCTACGTTGCCGGCTAACGCGCCGCCGGTCTGCTCCCTCATCGACTACTCTGCGCTGCCTGAATGGCCAACGAGGTGTACGCCAACAACATGGAGATCTCCTGCAAGGCGGCGAACGGCAAGTCCATCGCGGCCTTCCCGGATGTCTGCTTCACCCCGCCGCAGGCGCCGCCGACGCCGTTGGGGGTACCGATCCCCTACCCCAATACCGGCCTGTCCAAGGACACCACCAAAGGCACCCGGACC
<210> 4
<211> 346
<212> PRT
<213>功能基因unpks-5
<400> 氨基酸序列
MSQALSIVASGMVSAVGLSAPASCAPFGSALFYCSVARDIFHCVARLLRDRAQLESRSRCSLCCSRRLRSLSRRRSQTRRTSLVRTCCCCCAYRMLSAAYSACRSMIDESFLRDLEGELGRRFHPSSHTRPVSIPVRLRYSTSRSSRAHQITCSTQHSTPSPTSHHPLATTRSLLTHLSALRLSHLCPSSQSTTLRAAAVLVAAPLHEEAPQLLCISQTTLSHTTPHSEDLPLSRSTLLRSLHHTRICRSCPISTMDYRLTDIPQSGTRPFLTASRYFKEASLTLSRNLRVLKPKFDLLTSLYLSFSVSTRHPQVPTLPHIRTCCHSTHAGERAAALLSYRYSALK

Claims (1)

1.一种瓜类枯萎病抗性基因unpks-5，其特征在于，所述瓜类枯萎病抗性基因unpks-5氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，通过电转化方法转化枯草芽孢杆菌获得表达unpks基因的枯草芽孢杆菌菌株，通过抗拮实验证实，抑菌圈直径达13.1mm，通过盆栽实验证实抗病性达到60.98％。
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《土壤宏基因组文库的构建及格尔德霉素类》;林灵等;《中国抗生素杂志》;20110630;第36卷(第6期);全文 *
《宏基因组学：热带冬季瓜菜病害生物防治新策略》;赵志祥等;《分子植物育种》;20150531;第13卷(第5期);参见对比文件1摘要、第1170段左栏第4段、第1173页第3"宏基因组学在热带冬季瓜菜病害防治上的应用"、第1171页第1.3、1.4节、第1172页右栏第4段 *
《植物益生菌对植物的益生效应及其应用》;林吉恒等;《中国生物防治》;20101130(第26期);参见参考文献1摘要第101页第1段、第104页最后一段 *
赵志祥等.《宏基因组学：热带冬季瓜菜病害生物防治新策略》.《分子植物育种》.2015,第13卷(第5期),第1169-1176页. *

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