CN107384997A - 一种简易微量化无细胞蛋白质快速合成的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种简易微量化无细胞蛋白质快速合成的方法，步骤：将乳化剂加入到油性溶剂中配成油相乳化剂体系；将无细胞表达体系与油相乳化剂体系混合，搅拌得到油包水乳化体系；(2)将油包水乳化体系在4℃‑37℃，搅拌5min～300min，得到含有表达蛋白的乳液滴。本发明操作简便，耗时短，低成本，微量化并可及时反馈无细胞蛋白质生产情况，以乳液滴为无细胞蛋白生产模型，可明显缩短蛋白生产时间，节省时长为原体系的1/3～4/5，油包水乳液滴体系可实现微升至毫升级(5μL‑1000mL)的乳液滴内蛋白质生产；有利于精确研究无细胞乳液滴体系随时间变化的整个过程，尤其是前期生化反应过程。
Description
技术领域
本发明属于生物反应系统领域，具体涉及一种简易微量化无细胞蛋白质快速合成的方法。
背景技术
无细胞蛋白表达体系(Cell-free Protein Synthesis，CFPS)一直以来被广泛应用于基础合成生物学领域，与传统的细胞基的蛋白表达体系相比，无细胞体系摆脱细胞本身所带来的生理限制，有较强的可调控性，可用于毒性蛋白的生产及制备，使众多不能在细胞内完成的蛋白表达变成了现实，真正实现了生命系统的体外构建及高效表达(贾晓歌,邓子新,刘天罡.微生物学报,2016,56(3):530-542)。此外，无细胞体系作为一种快速、简洁的体外蛋白合成媒介，通过多种细胞抽提物的合理设计与配合，实现基因(质粒)在体外特定环境下复制、转录与翻译表达，实现蛋白质的高通量性表达。近些年来，随着研究人员对无细胞体系的不断优化及研究，无细胞体系已经实现生产效率高、成本低廉和反应体积大等特点，凭借这些特点，无细胞体系在生物制药领域、高通量药物筛选、重组蛋白药物生产及个体化定制肿瘤疫苗等领域具有极大的应用潜力(Zhu F Y,Zhong X F,Hu M Z,etal.Biotechnology&Bioengineering,2014,111(7):1396-405.)。
细胞为生命体的基本功能单元，其由众多生物分子(DNA、RNA、蛋白质、代谢产物)和生化酶催化反应生成的复杂分子网络，难以对其进行精确构建与模拟。而作为细胞的简化模型，原型细胞(Protocell)具有最简单、最基本的细胞结构，但同时具备重要的生化功能，例如基因的转录翻译过程。因此，构建原型细胞模型对于精确构建细胞结构与调控细胞复杂网络提供了新的思路，有利于进一步理解与研究存在于细胞尺度下的生化反应机制；从生物进化的角度，原型细胞是从生物小分子到现代细胞进化的中间阶段，研究原型细胞对于揭示生命进化起源、进化等过程具有十分重要的指导意义。而现有的原型细胞模拟构建的方法过于强调微液滴构建的均一性与形似性，这也导致现有的方法大多数都较为繁琐与耗时，不利于精确研究无细胞乳液滴体系随时间变化的整个表达过程，往往可能会因此忽视十分重要的前期生化反应过程。同时，原始的环境中，特别是海洋为媒介的环境下，原型细胞形成初期往往是不均匀的分布体系，经过长期的自然选择与演化，才形成如今的形态均一的细胞及生命体。因此，亟需一种简易微量化无细胞蛋白质快速合成的方法，以乳液滴的形式将细胞反应原料有效分隔，以实现简易微量化的的蛋白质快速合成。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种简易微量化无细胞蛋白质快速合成的方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种简易微量化无细胞蛋白质快速合成的方法，其特征是包括如下步骤：
(1)油包水乳化体系的制备：
将乳化剂加入到油性溶剂中配成质量分数为1％～10％的油相乳化剂体系；按体积比1：1000～5的比例，将无细胞表达体系与油相乳化剂体系混合，搅拌得到油包水乳化体系；
(2)蛋白表达：
将步骤(1)获得的油包水乳化体系在4℃-37℃，转速为320rpm～1120rpm搅拌5min～300min，得到含有表达蛋白的乳液滴。
乳化剂优选span 20，span 40，pan 60，span 80，聚乙二醇二聚羟基硬脂酸酯，泊洛沙姆F68，泊洛沙姆L65，泊洛沙姆PE3100，泊洛沙姆PE6100，泊洛沙姆PE6200，泊洛沙姆PE6400，泊洛沙姆PE6800，泊洛沙姆PE10100，泊洛沙姆PE10500，泊洛沙姆407，泊洛沙姆188，泊洛沙姆2000，鲸蜡基聚乙二醇90，鲸蜡基聚乙二醇180中的至少一种；
油性溶剂优选矿物油，石蜡油，二氯甲烷，石油醚，乙酸乙酯，丁醇，苯，四氯化碳，甲苯，丁酮，松香树脂和达玛树脂中的至少一种。
无细胞表达体系是将组合物1、组合物2和基因按体积比为(10-20):(20-30):1比例混匀制得；
组合物1按比例为1g:0.01～0.1mL:1～3mL包括细胞破碎产物、缓冲溶液1和缓冲溶液2；
组合物2按体积比为(2-8):(20-30):(2-5):1包括氨基酸混合液、反应缓冲液、能量补充液和浓度为5-150μg/mL的核糖核酸聚合酶水溶液。
基因的存在形式优选基因组、质粒、带有目的基因的线性双链脱氧核糖核酸、单链脱氧核糖核酸片段和核糖核酸中的至少一种。
细胞破碎物产物所述细胞为真核细胞或原核细胞。
真核细胞优选酵母菌、麦胚细胞、烟草细胞、甲壳类昆虫细胞、兔网织红细胞、仓鼠卵巢细胞或人类组织细胞系；原核细胞优选大肠杆菌。
缓冲溶液1的配方优选：5-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷，30-100mmol/L谷氨酸钾，10-20mmol/L谷氨酸镁，0.5-2mmol/L二硫苏糖醇，5-10mmol/L 2-巯基乙醇；溶剂是去离子水；所述缓冲溶液2的配方为：5-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷，30-100mmol/L谷氨酸钾，10-20mmol/L谷氨酸镁，0.5-2mmol/L二硫苏糖醇；溶剂是去离子水。
氨基酸混合液优选用甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸加入水配成的等摩尔浓度的、摩尔浓度为5-20mmol/L的混合液。
反应缓冲液的配方优选：40-60mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、80-120mmol/L谷氨酸钾、10-25mmol/L谷氨酸镁、10-40mmol/L 3-磷酸甘油酸、5-10mmol/L环磷酸腺苷、2-4mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、1-4mmol/L辅酶A、0.4-0.8mmol/L亚叶酸、1-5mg/mL转运核糖核酸、0.4-0.8mmol/L亚精胺；溶剂是去离子水。
能量补充液包括：1-3mmol/L三磷酸尿苷，1-3mmol/L三磷酸胞苷，1-3mmol/L三磷酸腺苷，3-9mmol/L三磷酸鸟苷，溶剂是去离子水。
本发明的优点是：操作简便，耗时短，低成本，微量化并可及时反馈无细胞蛋白质生产情况的特点，以乳液滴为无细胞蛋白生产模型，可明显缩短蛋白生产时间，节省时长为原体系的1/3～4/5，显示出其在蛋白质快速筛选与快速合成领域重要的应用潜力；所述油包水乳液滴体系可实现微升至毫升级(5μL-1000mL)的乳液滴内蛋白质生产；有利于精确研究无细胞乳液滴体系随时间变化的整个过程，尤其是前期生化反应过程。
附图说明
图1为本发明在320rpm转速下制备的乳液滴的明场照片。
图2为本发明在1120rpm转速下制备的乳液滴的明场照片。
图3为本发明的含有表达蛋白的乳液滴在反应1～4h时间范围内的绿色荧光蛋白表达的荧光显微镜图像。
图4为溶液无细胞蛋白表达体系绿色荧光蛋白随时间变化量。
图5为含有表达蛋白的乳液滴的光密度在不同时间段下的荧光强度随时间变化曲线。
具体实施方式
各实施例中所用矿物油购自Sigma-Aldrich公司，密度为0.838g/ml，颜色为白色；鲸蜡基聚乙二醇(EM90)购自国内化妆品公司，用作油相乳化剂；实验所用乳化剂span系列购自西安裕华生物科技有限公司。
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。
实施例1-3为缓冲溶液1，见表1
表1
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | |
| 三羟甲基氨基甲烷 | 20mmol/L | 10mmol/L | 5mmol/L |
| 谷氨酸钾 | 100mmol/L | 60mmol/L | 30mmol/L |
| 谷氨酸镁 | 20mmol/L | 15mmol/L | 10mmol/L |
| 二硫苏糖醇 | 2mmol/L | 1mmol/L | 0.5mmol/L |
| 2-巯基乙醇 | 10mmol/L | 8mmol/L | 5mmol/L |
| 溶剂是去离子水 | 补足至1L | 补足至1L | 补足至1L |
实施例4-6为缓冲溶液2，见表2
表2
| 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | |
| 三羟甲基氨基甲烷 | 20mmol/L | 10mmol/L | 5mmol/L |
| 谷氨酸钾 | 100mmol/L | 60mmol/L | 30mmol/L |
| 谷氨酸镁 | 20mmol/L | 15mmol/L | 10mmol/L |
| 二硫苏糖醇 | 2mmol/L | 1mmol/L | 0.5mmol/L |
| 溶剂是去离子水 | 补足至1L | 补足至1L | 补足至1L |
实施例7
细胞破碎产物的制备：
将培养后的大肠杆菌(大肠埃希氏菌BL21(DE3)CICC 23796，购买于CICC)收集、悬浮、离心、用机械法破碎、保存。
细胞破碎的方法除机械法外，还可以采用反复冻融法、超声处理法、酶解法、碱裂解法或化学渗透法。
实验证明，细胞破碎产物的细胞还可以是：酵母菌、麦胚细胞、烟草细胞、甲壳类昆虫细胞、兔网织红细胞、仓鼠卵巢细胞或人类组织细胞系等真核细胞，也可以是其它的原核细胞。
实施例8-10为组合物1，见表3
表3
| 实施例8 | 实施例9 | 实施例10 | |
| 细胞破碎产物 | 实施例7制备1g | 实施例7制备1g | 实施例7制备1g |
| 缓冲溶液1 | 实施例1制备0.1ml | 实施例2制备0.05ml | 实施例3制备0.01ml |
| 缓冲溶液2 | 实施例4制备3ml | 实施例5制备2ml | 实施例6制备1ml |
实施例11-13为氨基酸混合液，见表4
表4
| 实施例11 | 实施例12 | 实施例13 | |
| 甘氨酸 | 20mmol/L | 10mmol/L | 5mmol/L |
| 丙氨酸 | 20mmol/L | 10mmol/L | 5mmol/L |
| 缬氨酸 | 20mmol/L | 10mmol/L | 5mmol/L |
| 亮氨酸 | 20mmol/L | 10mmol/L | 5mmol/L |
| 异亮氨酸 | 20mmol/L | 10mmol/L | 5mmol/L |
| 脯氨酸 | 20mmol/L | 10mmol/L | 5mmol/L |
| 苯丙氨酸 | 20mmol/L | 10mmol/L | 5mmol/L |
| 色氨酸 | 20mmol/L | 10mmol/L | 5mmol/L |
| 甲硫氨酸 | 20mmol/L | 10mmol/L | 5mmol/L |
| 酪氨酸 | 20mmol/L | 10mmol/L | 5mmol/L |
| 丝氨酸 | 20mmol/L | 10mmol/L | 5mmol/L |
| 苏氨酸 | 20mmol/L | 10mmol/L | 5mmol/L |
| 半胱氨酸 | 20mmol/L | 10mmol/L | 5mmol/L |
| 天冬酰胺 | 20mmol/L | 10mmol/L | 5mmol/L |
| 谷氨酰胺 | 20mmol/L | 10mmol/L | 5mmol/L |
| 天冬氨酸 | 20mmol/L | 10mmol/L | 5mmol/L |
| 谷氨酸 | 20mmol/L | 10mmol/L | 5mmol/L |
| 赖氨酸 | 20mmol/L | 10mmol/L | 5mmol/L |
| 精氨酸 | 20mmol/L | 10mmol/L | 5mmol/L |
| 组氨酸 | 20mmol/L | 10mmol/L | 5mmol/L |
| 溶剂为去离子水 | 补足至1L | 补足至1L | 补足至1L |
实施例14-16为反应缓冲液，见表5
表5
| 实施例14 | 实施例15 | 实施例16 | |
| 4-羟乙基哌嗪乙磺酸 | 60mmol/L | 50mmol/L | 40mmol/L |
| 谷氨酸钾 | 120mmol/L | 100mmol/L | 80mmol/L |
| 谷氨酸镁 | 25mmol/L | 18mmol/L | 10mmol/L |
| 3-磷酸甘油酸 | 40mmol/L | 25mmol/L | 10mmol/L |
| 环磷酸腺苷 | 10mmol/L | 8mmol/L | 5mmol/L |
| 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 | 4mmol/L | 3mmol/L | 2mmol/L |
| 辅酶A | 4mmol/L | 3mmol/L | 1mmol/L |
| 亚叶酸 | 0.8mmol/L | 0.6mmol/L | 0.4mmol/L |
| 转运核糖核酸 | 5mg/ml | 3mmol/L | 1mmol/L |
| 亚精胺 | 0.8mmol/L | 0.6mmol/L | 0.4mmol/L |
| 去离子水 | 补足至1L | 补足至1L | 补足至1L |
实施例17-19为能量补充液，见表6
表6
| 实施例17 | 实施例18 | 实施例19 | |
| 三磷酸尿苷 | 3mmol/L | 2mmol/L | 1mmol/L |
| 三磷酸胞苷 | 3mmol/L | 2mmol/L | 1mmol/L |
| 三磷酸腺苷 | 3mmol/L | 2mmol/L | 1mmol/L |
| 三磷酸鸟苷 | 9mmol/L | 6mmol/L | 3mmol/L |
| 去离子水 | 补足至1L | 补足至1L | 补足至1L |
实施例20-22为组合物2(各组份为体积比)见表7
表7
| 实施例20 | 实施例21 | 实施例22 | |
| 氨基酸混合液 | 8mL实施例11制备 | 5mL实施例12制备 | 2mL实施例13制备 |
| 反应缓冲液 | 30mL实施例14制备 | 25mL实施例15制备 | 20mL实施例16制备 |
| 能量补充液 | 5mL实施例17制备 | 3mL实施例18制备 | 2mL实施例19制备 |
| 核糖核酸聚合酶水溶液 | 1mL 150μg/ml | 1mL 70μg/ml | 1mL 5μg/ml |
基因质粒可以购买或通过基因改造获得。
pRset-CFP(购于：Promega Corporation)
pRset-YFP(购于：Promega Corporation)
pRset-eGFP(购于：Promega Corporation)
上述质粒的举例是为了使本领域技术人员能够更好地理解本发明，但并不对其进行限定，其它质粒也可以用于本发明。
还可以选用基因组、带有目的基因的线性双链脱氧核糖核酸、单链脱氧核糖核酸片段和核糖核酸中的至少一种。
实施例23(对比)
油包水乳化体系的制备：
将鲸蜡基聚乙二醇90加入矿物油中，使用涡旋振荡器混匀乳化体系至澄清，之后将乳化体系通过0.22μm的过滤膜过滤实现纯化，配成质量分数为10％(g/mL)油相乳化剂体系；
将油相乳化剂体系、高纯水、枪头及反应过程中用到的EP管，磁子等置于121℃下高压灭菌20分钟，进行无菌化处理；
按体积比1：1000的比例，将高纯无菌水和油相乳化剂体系混合，置于37℃恒温水浴中，密封反应装置，开启搅拌，控制转速为320rpm，搅拌时间为5min，得到油包水乳化体系；取油包水乳化体系5μL于载玻片中，用倒置荧光显微镜进行荧光模式下观察，拍摄记录乳液滴分布及粒径。见图1。从图1中可以看出，在较低转速下倾向于得到10-30μm分布的乳液滴，且分布较均匀。
实施例24(对比)
油包水乳化体系的制备：
将鲸蜡基聚乙二醇90加入矿物油中，使用涡旋振荡器混匀乳化体系至澄清，之后将乳化体系通过0.22μm的过滤膜过滤实现纯化，配成质量分数为10％(g/mL)油相乳化剂体系；
将油相乳化剂体系、高纯水、枪头及反应过程中用到的EP管，磁子等置于121℃下高压灭菌20分钟，进行无菌化处理；
按体积比1：1000的比例，将高纯无菌水和油相乳化剂体系混合，置于37℃恒温水浴中，密封反应装置，开启搅拌，控制转速为1120rpm，搅拌时间为5min，得到油包水乳化体系；取油包水乳化体系5μL于载玻片中，用倒置荧光显微镜进行荧光模式下观察，拍摄记录乳液滴分布及粒径。见图2，从图2中可以看出，在较高转速下倾向于得到2-5μm分布的乳液滴，且分布比在低转速下更均匀。
实施例25(对比)
无细胞表达体系的构建是将组合物1、组合物2和基因按体积比为20:30:1比例混匀制得；
其中基因为能表达绿色荧光蛋白的重组质粒(pRset-eGFP)；组合物1配方实施例8；组合物2配方见实施例20；将配制好的无细胞表达体系溶液置于30℃下，通过酶标仪对其绿色荧光强度进行实时定量检测，检测时长12h(图4)，以绿色荧光间接反应蛋白的表达量，该体系需6～8h达到平衡状态。
实施例26
一种简易微量化无细胞蛋白质快速合成的方法，包括如下步骤：
(1)油包水乳化体系的制备：
将鲸蜡基聚乙二醇90加入矿物油中，使用涡旋振荡器混匀乳化体系至澄清，之后将乳化体系通过0.22μm的过滤膜过滤实现纯化，配成质量分数为10％(g/mL)油相乳化剂体系；
将油相乳化剂体系、枪头及反应过程中用到的EP管，磁子等置于121℃下高压灭菌20分钟，进行无菌化处理；
按体积比1：1000的比例，将无细胞表达体系和油相乳化剂体系混合；搅拌得到油包水乳化体系；
(2)蛋白表达：
将步骤(1)获得的油包水乳化体系在37℃恒温水浴中，密封反应装置，开启搅拌，控
制转速为720rpm，搅拌200min，得到含有表达蛋白的乳液滴。
取实施例获得的产品5μL于载玻片中，用倒置荧光显微镜进行荧光模式下观察,调节室内温度为30℃，分别在表达1h，2h，3h和4h时拍摄荧光照片，记录绿色荧光蛋白基因的表达情况，见图3，从图3中可以看出，利用搅拌的方法可以实现较均匀表达蛋白的乳液滴的制备，并借助绿色荧光强度的变化来间接反映蛋白质表达进程，实现蛋白质快速合成。
无细胞表达体系是将组合物1(实施例9制备)、组合物2(实施例21制备)和基因(pRset-eGFP)按体积比为15:25:1比例混匀制得。
由图3的表达蛋白的乳液滴的光密度得到不同时间段下的荧光强度随时间变化曲线见图5，分析可知，表达蛋白的乳液滴大小较正常细胞尺寸相近，可在细胞尺度下进行无细胞蛋白表达。随着观察时间延长，表达蛋白的乳液滴绿色荧光蛋白强度及光密度在逐渐增加，体系转录翻译过程得到加强，直至4h体系达到平衡，蛋白表达不再增加，与实施例25的达到平衡状态6～8h相比，本实施例可缩短无细胞蛋白表达到达平衡的时间，实现快速药物筛选。
实施例27
一种简易微量化无细胞蛋白质快速合成的方法，包括如下步骤：
(1)油包水乳化体系的制备：
将span 80加入二氯甲烷中，使用涡旋振荡器混匀乳化体系至澄清，之后将乳化体系通过0.22μm的过滤膜过滤实现纯化，配成质量分数为1％(g/mL)油相乳化剂体系；
将油相乳化剂体系、枪头及反应过程中用到的EP管，磁子等置于121℃下高压灭菌20分钟，进行无菌化处理；
按体积比1：5的比例，将无细胞表达体系和油相乳化剂体系混合，搅拌得到油包水乳化体系；
(2)蛋白表达：
将步骤(1)获得的油包水乳化体系在4℃恒温水浴中，密封反应装置，开启搅拌，控制转速为1120rpm，搅拌5min，得到含有表达蛋白的乳液滴。
无细胞表达体系是将组合物1(实施例8制备)、组合物2(实施例20制备)和基因(pRset-CFP)按体积比为20:30:1比例混匀制得。
随着观察时间延长，表达蛋白的乳液滴青色荧光蛋白强度及光密度在逐渐增加，体系转录翻译过程得到加强，4h左右体系达到平衡，蛋白表达不再增加。
实施例28
一种简易微量化无细胞蛋白质快速合成的方法，包括如下步骤：
(1)油包水乳化体系的制备：
将泊洛沙姆L65加入石蜡油中，使用涡旋振荡器混匀乳化体系至澄清，之后将乳化体系通过0.22μm的过滤膜过滤实现纯化，配成质量分数为5％(g/mL)油相乳化剂体系；
将油相乳化剂体系、枪头及反应过程中用到的EP管，磁子等置于121℃下高压灭菌20分钟，进行无菌化处理；
按体积比1：500的比例，将无细胞表达体系和油相乳化剂体系混合，搅拌得到油包水乳化体系；
(2)蛋白表达：
将步骤(1)获得的油包水乳化体系在25℃恒温水浴中，密封反应装置，开启搅拌，控制转速为320rpm，搅拌时间为300min，得到含有表达蛋白的乳液滴。
无细胞表达体系是将组合物1(实施例10制备)、组合物2(实施例22制备)和基因(pRset-YFP)按体积比为10:20:1比例混匀制得。
随着观察时间延长，表达蛋白的乳液滴黄色荧光蛋白强度及光密度在逐渐增加，体系转录翻译过程得到加强，4h左右体系达到平衡，蛋白表达不再增加。
实验证明，用span 20，span 40，pan 60，聚乙二醇二聚羟基硬脂酸酯，泊洛沙姆F68，泊洛沙姆PE3100，泊洛沙姆PE6100，泊洛沙姆PE6200，泊洛沙姆PE6400，泊洛沙姆PE6800，泊洛沙姆PE10100，泊洛沙姆PE10500，泊洛沙姆407，泊洛沙姆188，泊洛沙姆2000，鲸蜡基聚乙二醇180，质量比为1：1的span 20和span 40的混合物替代本实施例的泊洛沙姆L65，其它同本实施例，可以快速合成蛋白质。
实验证明，用石油醚，乙酸乙酯，丁醇，苯，四氯化碳，甲苯，丁酮，松香树脂，达玛树脂，体积比为1：1的乙酸乙酯和丁醇的混合液替代本实施例的石蜡油，其它同本实施例，可以快速合成蛋白质。
Claims (10)
1.一种简易微量化无细胞蛋白质快速合成的方法，其特征是包括如下步骤：
(1)油包水乳化体系的制备：
将乳化剂加入到油性溶剂中配成质量分数为1％～10％的油相乳化剂体系；按体积比1：1000～5的比例，将无细胞表达体系与油相乳化剂体系混合，搅拌得到油包水乳化体系；
(2)蛋白表达：
将步骤(1)获得的油包水乳化体系在4℃-37℃，转速为320rpm～1120rpm搅拌5min～300min，得到含有表达蛋白的乳液滴。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述乳化剂为span 20，span 40，pan 60，span80，聚乙二醇二聚羟基硬脂酸酯，泊洛沙姆F68，泊洛沙姆L65，泊洛沙姆PE3100，泊洛沙姆PE6100，泊洛沙姆PE6200，泊洛沙姆PE6400，泊洛沙姆PE6800，泊洛沙姆PE10100，泊洛沙姆PE10500，泊洛沙姆407，泊洛沙姆188，泊洛沙姆2000，鲸蜡基聚乙二醇90，鲸蜡基聚乙二醇180中的至少一种；
所述油性溶剂为矿物油，石蜡油，二氯甲烷，石油醚，乙酸乙酯，丁醇，苯，四氯化碳，甲苯，丁酮，松香树脂和达玛树脂中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述无细胞表达体系是将组合物1、组合物2和基因按体积比为(10-20):(20-30):1比例混匀制得；
所述的组合物1按比例为1g:0.01～0.1mL:1～3mL包括细胞破碎产物、缓冲溶液1和缓冲溶液2；
所述的组合物2按体积比为(2-8):(20-30):(2-5):1包括氨基酸混合液、反应缓冲液、能量补充液和浓度为5-150μg/mL的核糖核酸聚合酶水溶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是基因的存在形式为基因组、质粒、带有目的基因的线性双链脱氧核糖核酸、单链脱氧核糖核酸片段和核糖核酸中的至少一种。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征是细胞破碎物产物所述细胞为真核细胞或原核细胞。
6.根据权利要求5所述方法，其特征是所述真核细胞为酵母菌、麦胚细胞、烟草细胞、甲壳类昆虫细胞、兔网织红细胞、仓鼠卵巢细胞或人类组织细胞系；所述原核细胞为大肠杆菌。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征是所述缓冲溶液1的配方为：5-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷，30-100mmol/L谷氨酸钾，10-20mmol/L谷氨酸镁，0.5-2mmol/L二硫苏糖醇，5-10mmol/L 2-巯基乙醇；溶剂是去离子水；所述缓冲溶液2的配方为：5-20mmol/L三羟甲基氨基甲烷，30-100mmol/L谷氨酸钾，10-20mmol/L谷氨酸镁，0.5-2mmol/L二硫苏糖醇；溶剂是去离子水。
8.根据权利要求3所述的的方法，其特征是所述氨基酸混合液为用甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸加入水配成的等摩尔浓度的、摩尔浓度为5-20mmol/L的混合液。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征是所述反应缓冲液的配方是：40-60mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、80-120mmol/L谷氨酸钾、10-25mmol/L谷氨酸镁、10-40mmol/L 3-磷酸甘油酸、5-10mmol/L环磷酸腺苷、2-4mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、1-4mmol/L辅酶A、0.4-0.8mmol/L亚叶酸、1-5mg/mL转运核糖核酸、0.4-0.8mmol/L亚精胺；溶剂是去离子水。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征是所述能量补充液包括：1-3mmol/L三磷酸尿苷，1-3mmol/L三磷酸胞苷，1-3mmol/L三磷酸腺苷，3-9mmol/L三磷酸鸟苷，溶剂是去离子水。
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