CN107375948B - 延长昆虫寿命的药剂及其鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴别影响昆虫寿命的药剂的方法，采用的装置为玻璃微电极喂食装置，包括以下步骤：1)、经口对昆虫进行药剂递送作为实验组，检测实验组取食量较对照组是否有显著差异；从而获得实验组与对照组试虫的平均每头取食量无显著差异情况下的药剂有效用量；2)、用有效药量的药剂对昆虫进行口服喂药实验，检测试虫的生存情况；若试虫的存活率分析结果显示实验组较对照组平均寿命延长且统计结果有显著性差异，则判定该药剂可延长该昆虫寿命；反之，则判定该药剂会缩短该昆虫寿命。采用上述方法鉴定所得的能延长昆虫寿命的药剂为以下任意一种：MEK1/2抑制剂、FTPase抑制剂、mTOR抑制剂。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于鉴别延长昆虫寿命的药剂的方法，以及由此筛选出的几种药剂。
背景技术
寄生蜂是重要的生物防治材料之一，通过寄生有害生物致其死亡来达到降低害虫数量的防治效果。在利用寄生蜂防治有害生物的过程中，其寿命的长短在很大程度上影响其在生物防治中的实际效果和经济价值。丽蝇蛹集金小蜂(Nasonia vitripennis)是一种蝇类蛹期特异性寄生蜂，通过取食蛹内组织而生长，最终致使蝇蛹死亡，具有很好的生物防治的应用前景。同时，Nasonia是进行发育生物学和进化遗传学研究的一个理想的模式生物，它具有许多优点：首先Nasonia可以在室内继代饲养，其寄主蝇蛹也容易获得；其次它生活周期较短(大概2周)且可以在幼虫状态低温储存长达2年；第三，Nasonia已有报道基因组全序列，具有可视分子标记。基于以上优点，以膜翅目昆虫为模式研究其寿命调控，既可以从基因层面上研究生物寿命的影响因子及其作用程度，模拟延缓衰老的过程，以便控制其寿命以获得更好的经济效益，也可以为其他生物的研究提供参考，帮助我们进一步了解高等生物的衰老过程，为筛选延缓衰老的药物提供理论支持。
目前已有很多对寿命有关键影响作用的基因或基因家族在果蝇中被鉴定出来，这些基因都是在生物生长代谢过程中起重要作用的基因，或者与压力应激调控有关的基因。他们参与了不同信号通路，包括胰岛素/胰岛素样生长因子-1信号通路(insulin/Insulin-like Growth Factor-1(IIS)signaling)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)途径、雷帕霉素靶蛋白(Target of Rapamycin，TOR)途径和Jun氨基端激酶(JNK)途径等。
在衰老机制的研究方面，被研究得最多也最重要的信号通路就是胰岛素/胰岛素样生长因子-1信号通路(IIS)。在酵母、线虫、果蝇、小鼠等模式生物中，抑制胰岛素/胰岛素样生长因子-1信号通路(IIS)都能够健康地延长生物体的寿命。IIS在进化上十分保守，在从酵母到人体内都能发现类似的胰岛素通路，因而被认为是寿命决定中一个非常重要的信号途径。IIS在多细胞有机体中有着广泛的调控功能，IIS上的突变可以影响生物的生长发育、代谢平衡、繁殖力、抗逆性及寿命。
降低IIS而延寿的关键是Foxo转录因子通过PI3K-Akt-Foxo支路的调节作用。然而最近据Slack等报道，Ras-Erk-ETS信号通路中Ras基因及其下游信号影响因子Erk和ETS转录因子对果蝇的衰老调控有关键作用。Ras基因是IIS通路的一个完善的信号中路，这一研究显示，抑制Ras基因足以降低IIS信号，进而延长果蝇寿命。直接降低Ras或Erk的活性也会使果蝇寿命延长。此外，E-twenty six(ETS)的转录阻遏蛋白Anterior open(Aop)因其可造成IIs信号降低而延长寿命。Ras-Erk-ETS和PI3K-Art-Foxo对寿命的调控作用在同一量级。Ras和MEK1/2是Ras-Erk-ETS信号通路上的基因，而FTPase抑制剂作用的靶分子是细胞信号转导通路中的Ras蛋白，FTase抑制剂抑制Ras的活化，也可以通过抑制GGTase进而抑制其他类Ras基因GTPase的活化。
TOR通路是进化上很保守的调控蛋白合成和生长发育的一条信号通路，在人体内调控多种疾病发生，如癌症、糖尿病和心脏功能障碍，同时参与多种生理过程，影响寿命。果蝇TOR(dTOR)也参与了维持果蝇正常生长发育等生物过程。TOR(Target of Rapamycin)通路与IIS有着广泛的相互作用。抑制IIS会降低TOR活性从而延长寿命。在节食条件下编码胰岛素样肽的基因转录水平会降低而延长果蝇寿命(Mair&Dillin,2008；Min,Yamamoto,Buch,Pankratz,&Tatar,2008)，然而去除这些基因却会导致食物消耗水平增加寿命延长(
Clarke,Broughton,Andrews,&Partridge,2010)。节食条件即降低摄食量又不致营养不良，是与IIS和TOR通路相关的。具体地说抑制TOR活性对寿命的效果与节食的效果是相似的(Partridge,Alic,Bjedov,&Piper,2011)。对成虫喂食TOR抑制剂雷帕霉素会导致自我吞噬作用和蛋白合成的变化从而延长寿命。雷帕霉素同样能延长IIS突变型和节食作用下的果蝇的寿命(Bjedov et al.,2010)。另外，dFOXO也被发现参与了节食的反应。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种鉴别影响昆虫寿命的药剂的方法及所得的药剂。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种鉴别影响昆虫寿命的药剂的方法，采用的装置为玻璃微电极喂食装置，包括以下步骤：
1)、经口对昆虫进行药剂递送作为实验组，检测实验组取食量较对照组是否有显著差异；从而获得实验组与对照组试虫的平均每头取食量无显著差异情况下的药剂有效用量；目的是排除因取食量差异对试虫寿命造成的影响；
2)、用有效药量的药剂对昆虫进行口服喂药实验，检测试虫的生存情况(对存活率和取食量进行统计分析和多重比较)；
若试虫的存活率分析结果显示实验组较对照组平均寿命延长且统计结果有显著性差异，则判定该药剂可延长该昆虫寿命；
反之，若试虫的存活率分析结果显示实验组较对照组平均寿命缩短且统计结果有显著性差异，则判定该药剂会缩短该昆虫寿命。
作为本发明的鉴别影响昆虫寿命的药剂的方法的改进：昆虫为寄生蜂。
作为本发明的鉴别影响昆虫寿命的药剂的方法的进一步改进：
所述步骤1)中，对药剂有效成分进行梯度浓度的递送实验，梯度浓度为10μM、50μM和100μM；从而获得实验组与对照组无显著差异情况下的药物有效用量。
备注说明：本发明根据寄生蜂个体大小，参考果蝇药理学试验的药物剂量进行设置。
作为本发明的鉴别影响昆虫寿命的药剂的方法的进一步改进：所述药剂的用途为以下任意一种：
通过降低MEK1/2表达，调控Ras-Erk-ETS信号通路(trametinib)；
通过降低法尼基转移酶表达，抑制Ras蛋白激活(costunolide)；
通过降低mTOR表达，调控TOR信号通路(rapamycin)。
作为本发明的鉴别影响昆虫寿命的药剂的方法的进一步改进：
药剂有效成分(即所用的抑制剂)为：MEK1/2抑制剂；或FTPase抑制剂；或mTOR抑制剂。
作为本发明的鉴别影响昆虫寿命的药剂的方法的进一步改进：
所述药剂为以下任意一种：
作为有效成分的Trametinib(GSK1120212)以及作为辅助成分的DMSO、CremophorEL、PEG400和蔗糖；
作为有效成分的Costunolide以及作为辅助成分的DMSO、Tween-80和蔗糖；
作为有效成分的Rapamycin(Sirolimus)以及作为辅助成分的DMSO、CMC、Tween-80和蔗糖。
作为本发明的鉴别影响昆虫寿命的药剂的方法的进一步改进：
作为有效成分的trametinib的有效用量约为1.5～2ng/头/天(例如为1.66ng/头/天)，
作为有效成分的rapamycin的有效用量约为2.5～3ng/头/天(例如为2.74ng/头/天)，
作为有效成分的costunolide的有效用量约为2～2.5ng/头/天(例如为2.2ng/头/天)。
上述用量是针对寄生蜂而言。
本发明还同时提供了利用上述方法鉴别而得的能延长昆虫寿命的药剂，为以下任意一种：
MEK1/2抑制剂、FTPase抑制剂、mTOR抑制剂。
在本发明中，采用常规的统计学(Statistics)上对数据差异性的评价：P>0.05表示差异性不显著；0.01<P<0.05表示差异性显著；P<0.01表示差异性极显著。
本发明提供了一种快速高效地筛选抗衰老药物的方法，此法筛选出了两种Ras-Erk-ETS途径上一种成分可以显著延长寄生蜂寿命。
另一方面，本发明提供了一种快速高效地筛选抗衰老药物的方法，此法筛选出了一种TOR途径上一种成分可以显著延长寄生蜂寿命。
在本发明的另一方面，提供一种根据Ras-Erk-ETS途径上的位点设计的组合物，所述组合物含有：(1)高特异性、有效的MEK1/2抑制剂；(2)用于经口服递送的药物载体。具体配合成分为：先用DMSO溶解曲美替尼Trametinib(GSK1120212)配制母液，用含有10％Cremophor EL和10％PEG400的10％蔗糖水将母液稀释到有效浓度，对寄生蜂口服给药。
在本发明的另一方面，提供一种根据Ras-Erk-ETS途径上的位点设计的组合物，所述组合物含有：(1)高特异性、有效的FTPase抑制剂；(2)用于经口服递送的药物载体。具体地说，组合物配合成分为：先用DMSO溶解木香烃内酯Costunolide配制母液，用Tween-80作悬浮剂加入10％蔗糖水中将母液稀释到有效浓度，对寄生蜂口服给药。
在本发明的另一方面，提供一种根据TOR途径上的位点设计的组合物，所述组合物含有：(1)高特异性、有效的mTOR抑制剂；(2)用于经口服递送的药物载体。具体地说，组合物配合成分为：先用DMSO溶解雷帕霉素Rapamycin(Sirolimus)配制母液，然后稀释于含有0.2％CMC和0.25％Tween-80的10％蔗糖水中将母液稀释到有效浓度，对寄生蜂口服给药。
在本发明中，应用了玻璃微电极喂食法对Nasonia进行药物递送。用玻璃微电极喂食法饲喂Nasonia时，成蜂从有刻度的玻璃微电极中取食液体食物和药物，随着蜂的取食，玻璃微电极内的液体液面下降，从而实现对Nasonia的取食量进行持续而准确监测。这种喂食方法避免了向昆虫食物中加入染料标记或者其他辅料，同时，由于玻璃微电极可随时取出或替换，最大限度地减小了对昆虫生理活动的干扰，可以时时监测在最接近自然条件下试虫取食情况和取食量。由于玻璃微电极喂食法可以用于量化精确记录试虫整个生活周期中的取食情况，这一方法特别适合用于药物的递送和检测。
本发明的技术优势为：
1、应用玻璃微电极喂食法对Nasonia进行药物递送，可以获得寄生蜂整个成虫期的准确实时摄食量。同时，由于减少了常用的食物染料标记和支持性成分(如棉花和滤纸)的使用和相互污染，本发明最大程度上降低了对试虫的人为干扰，从而实现了实时监测试虫整个成虫期的取食情况和生活行为。
2、通过对寄生蜂进行经口递送相关细胞信号通路因子的抑制剂组合物，快速便捷地观察到相关细胞信号通路因子对寄生蜂寿命和生存率的影响，可初步探明多种信号通路因子对寄生蜂寿命的影响程度。相比于其他分子生物学技术，本发明材料容易获得，操作相对简单，能准确检测寄生蜂整个成虫时期的取食情况与生存情况。
综上所述，本发明基于膜翅目昆虫的口器特点，提供了一种便捷高效的筛选方法来筛选延长寄生蜂寿命的药物，同时根据营养感受途径上的多个作用位点设计不同药物，用玻璃微电极喂食法对寄生蜂进行药物递送，筛选了一系列药物并确定了几种对延长寄生蜂寿命有显著作用的药剂。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为用玻璃微电极喂食法对Nasonia vitripennis饲喂MEK1/2抑制剂组合物的实验结果。结果显示MEK1/2抑制剂组合物对寄生蜂寿命有显著延长的效果。
图2为用玻璃微电极喂食法对Nasonia vitripennis饲喂FTPase抑制剂组合物的实验结果。结果显示FTPase抑制剂组合物对寄生蜂寿命有显著延长的效果。
图3为用玻璃微电极喂食法对Nasonia vitripennis饲喂mTOR抑制剂组合物的实验结果。结果显示mTOR抑制剂组合物对寄生蜂寿命有显著延长的效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1、玻璃微电极喂食法对Nasonia vitripennis饲喂MEK1/2抑制剂组合物：
本发明首先用玻璃微电极喂食法对试虫进行MEK1/2组合物(配制方法见1.2)递送，并记录生存情况。玻璃微电极喂食装置的组装参见(Ja et al.,2007)，对装置进行量化统计分析发现实验组与对照组试虫取食量没有差异，证明由药物引起的试虫寿命变化与其热量摄入无关。
玻璃微电极喂食法也称作毛细管喂养法
是使用一定规格的玻璃微电极，利用其毛细现象对昆虫进行食物或药物递送，从而对某个生物个体或者某一小组生物的食物摄入量进行精确的实时测量的方法。具体操作方法为：根据实验对象的大小选择内径略小于其个体的玻璃微电极(具体地说，本发明使用的玻璃微电极是WPI公司的1B100F-3，长度76mm，外径1.0mm，内径0.58mm)，并准备25*95mm果蝇管、海绵塞和枪头。玻璃微电极穿过枪头固定在海绵塞上，将试虫吹进果蝇管中，并用海绵塞塞住果蝇管即组装完成，随后将组装好的实验装置放入25℃，湿度66％的培养箱中。
1.1试虫与分组
选初羽化(<24h)的Nasonia vitripennis个体相近的健康雌虫30头为一组，每处理重复三次。
1.2药物组合物的获得
根据Trametinib的物理性质，用1.6250mL DMSO溶解10mg Trametinib粉末配制母液(母液的浓度为10mM)，用含有10％Cremophor EL(V/V)和10％PEG400(V/V)的10％蔗糖水(V/V)将母液稀释到10μM。
1.3实验检测方法
记录每日消耗药液的高度，测量使用数显式游标卡尺。并记录每日各处理试虫生存情况。
1.4实验结果
取食量结果见表1，可知药物对试虫每日每头取食量并无显著影响。由实验结果计算得出，每日给药量为1.66ng/头/天(trametinib)。各处理生存曲线见图1，可见饲喂MEK1/2抑制剂组合物的试虫的寿命较对照组有显著延长，统计结果见表2。
表1、MEK1/2抑制剂组合物对取食量的影响
实施例2、玻璃微电极喂食法对Nasonia vitripennis饲喂FTPase抑制剂组合物：
本实施例中，首先用玻璃微电极喂食法对试虫进行FTPase抑制剂组合物递送，并记录生存情况。对装置进行量化统计分析发现实验组与对照组试虫取食量没有差异，证明由药物引起的试虫寿命变化与其热量摄入无关。
2.1试虫与分组
选初羽化(<24h)的Nasonia vitripennis个体相近的健康雌虫30头为一组，每处理重复三次。
2.2药物组合物的获得
先用0.4304mL DMSO溶解5mg Costunolide配制母液(母液的浓度为50mM)，用0.25％Tween-80(V/V)作悬浮剂加入10％蔗糖水(V/V)中将母液稀释到10μM。
2.3实验检测方法
记录每日消耗药液的高度，测量使用数显式游标卡尺。并记录每日各处理试虫生存情况。
2.4实验结果
取食量结果见表3，可知药物对试虫每日每头取食量并无显著影响。由实验结果计算得出，每日给药量为2.2ng/头/天(costunolide)。各处理生存曲线见图2，可见饲喂FTPase抑制剂组合物的试虫的寿命较对照组有显著延长，统计结果见表4。
表3、FTPase抑制剂组合物对取食量的影响
表4、FTPase抑制剂组合物对试虫寿命的影响
实施例3、玻璃微电极喂食法对Nasonia vitripennis饲喂mTOR抑制剂组合物
本实施例中，首先用玻璃微电极喂食法对试虫进行mTOR抑制剂组合物递送，并记录生存情况。对装置进行量化统计分析发现实验组与对照组试虫取食量没有差异，证明由药物引起的试虫寿命变化与其热量摄入无关。结果如图3和表6，可见饲喂mTOR抑制剂组合物的试虫的寿命较对照组有显著延长。
3.1试虫与分组
选初羽化(<24h)的Nasonia vitripennis个体相近的健康雌虫30头为一组，每处理重复三次。
3.2药物组合物的获得
先用0.5469mL DMSO溶解5mg Rapamycin(Sirolimus)配制母液(母液的浓度为10mM)，然后用含有0.2％CMC(V/V)和0.25％Tween-80(V/V)的10％蔗糖水(V/V)将母液稀释到10μM。
3.3实验检测方法
记录每日消耗药液的高度，测量使用数显式游标卡尺。并记录每日各处理试虫生存情况。
3.4实验结果
取食量结果见表5，可知药物对试虫每日每头取食量并无显著影响。由实验结果计算得出，每日给药量为2.74ng/头/天(rapamycin)。各处理生存曲线见图3，可见饲喂FTPase抑制剂组合物的试虫的寿命较对照组有显著延长，统计结果见表6。
表5、mTOR抑制剂组合物对取食量的影响
表6、mTOR抑制剂组合物对试虫寿命的影响
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (5)
1.鉴别影响昆虫寿命的药剂的方法，其特征是：采用的装置为玻璃微电极喂食装置，包括以下步骤：
1）、经口对昆虫进行药剂递送作为实验组，检测实验组取食量较对照组是否有显著差异；从而获得实验组与对照组试虫的平均每头取食量无显著差异情况下的药剂有效用量；目的是排除因取食量差异对试虫寿命造成的影响；
所述昆虫为寄生蜂；
2）、用有效药量的药剂对昆虫进行口服喂药实验，检测试虫的生存情况；
若试虫的存活率分析结果显示实验组较对照组平均寿命延长且统计结果有显著性差异，则判定该药剂可延长该昆虫寿命；
反之，若试虫的存活率分析结果显示实验组较对照组平均寿命缩短且统计结果有显著性差异，则判定该药剂会缩短该昆虫寿命；
所述药剂的用途为以下任意一种：
通过降低MEK1/2表达，调控Ras-Erk-ETS信号通路；
通过降低法尼基转移酶表达，抑制Ras蛋白激活；
通过降低mTOR表达，调控TOR信号通路。
2.根据权利要求1所述的鉴别影响昆虫寿命的药剂的方法，其特征是：
所述步骤1）中，对药剂有效成分进行梯度浓度的递送实验，梯度浓度为10μM、50μM和100μM；从而获得实验组与对照组无显著差异情况下的药物有效用量。
3.根据权利要求1或2所述的鉴别影响昆虫寿命的药剂的方法，其特征是药剂有效成分为：MEK1/2抑制剂；或FTPase抑制剂；或mTOR抑制剂。
4.根据权利要求1或2所述的鉴别影响昆虫寿命的药剂的方法，其特征是：
所述药剂为以下任意一种：
作为有效成分的Trametinib以及作为辅助成分的DMSO、Cremophor EL、PEG400和蔗糖；
作为有效成分的Costunolide以及作为辅助成分的DMSO、Tween-80和蔗糖；
作为有效成分的Rapamycin以及作为辅助成分的DMSO、CMC、Tween-80和蔗糖。
5.根据权利要求4所述的鉴别影响昆虫寿命的药剂的方法，其特征是：
作为有效成分的trametinib 的有效用量为1.5~2 ng/头／天，
作为有效成分的rapamycin的有效用量为2.5~3 ng/头／天，
作为有效成分的costunolide的有效用量为2~2.5 ng/头／天。
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Legal Events
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| GR01 | Patent grant | ||
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