CN107375908A - 干扰素κ在制备抗囊膜病毒药物方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种干扰素κ（IFN‑κ）在制备抗囊膜病毒药物中的应用，属于抗病毒药物领域。所述IFN‑κ编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示;所述的囊膜病毒包括但不仅限于流感和寨卡病毒;本发明发现IFN‑κ诱导抗病毒蛋白IFITM3的表达，进而抑制流感病毒和寨卡病毒的感染和复制。IFN‑κ在体外细胞模型中能有效抑制囊膜病毒的感染和复制，减轻由于流感病毒和寨卡病毒大量复制导致的各种病症。上述发现表明IFN‑κ可用于制备抗囊膜病毒的药物，也可用于制备治疗和/或预防囊膜病毒引起的各种病症的药物。

Description

干扰素κ在制备抗囊膜病毒药物方面的应用

技术领域

本发明属生物医学技术领域，具体涉及干扰素-kappa(IFN-κ)在制备抗囊膜病毒药物方面的应用。

背景技术

I型干扰素（IFN-I）家族的多位成员，作为抗病毒药物候选，已经完成临床的药物试验，如重组IFN-α2被应用于抗乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染的治疗药物，IFN-β被应用于治疗多发性硬化症（MS）。I型干扰素家族的另外一位相对较新的成员，于2001年报告的IFN-κ可通过与IFN受体（IFNR）1/2相互作用，激活抗病毒因子的表达。IFN-κ作用机制可能为IFN-κ与受体结合后，刺激酪氨酸激酶2（Tyk2）和Janus激酶1（Jak1）磷酸化，进一步导致信号传导及转录激活因子1/2（STAT1/2）的磷酸化和二聚化，上调干扰素刺激基因（ISG）的表达。这些基因调节广泛的细胞反应，包括抗病毒效应，抗肿瘤效应，增强NK细胞活性以及激活适应性免疫反应。研究表明，在病毒感染或双链RNA刺激，或用IFN-γ和IFN-β处理后，IFN-κ选择性地表达在上皮角质细胞中，活化蛋白激酶R（PKR），2,5-寡腺苷酸合成酶（OAS），和干扰素诱导的GTP结合蛋白（MxA）等抗病毒基因表达，从而抑制脑心肌炎病毒（ECMV）和人类乳头瘤病毒（HPV）的复制。然而，由于ECMV和HPV为无囊膜病毒，其复制机理与囊膜病毒并不一致，无囊膜病毒一般通过受体介导的内吞作用进入细胞，而囊膜病毒通过与细胞膜或内体膜融合，将病毒衣壳和核酸导入细胞中进行复制，因此，无法断定IFN-κ是否同样可以抑制囊膜病毒的复制。

囊膜病毒中的流感病毒和寨卡病毒（ZIKV）导致的流感和寨卡疫情造成了重大的公共卫生安全危险，也给社会经济发展造成沉重的负担, 目前仍然缺乏有效的疫苗预防感染。已有文献报道，流感病毒可通过与IFN上、下游调节因子结合阻断常见IFN-I信号通路，从而逃逸常见IFN-I的抗病毒作用，而寨卡病毒则可通过阻断STAT1和STAT2磷酸化来逃脱常见IFN-I的抗病毒作用，其他抗病毒小分子药物能有效的改善患者预后，但存在药物选择压力下病毒耐药性突变、以及耐药性病毒传播而导致的部分初次感染患者用药选择困难的风险。因此，迫切需要开发新型抗病毒策略和治疗药物。

本发明主要发现IFN-κ可抑制多种囊膜病毒的复制，包括流感病毒、寨卡病毒，显示出广谱抗病毒效果。本发明将着重阐述IFN-κ对囊膜病毒复制的抑制功能。

发明内容

本发明所解决的技术问题是：利用IFN-κ激发宿主的抵抗力，从而抑制囊膜病毒的感染和复制，可用于制备抗囊膜病毒药物。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

提供一种干扰素κ在制备抗囊膜病毒药物方面的应用,IFN-κ的来源包括人源、鼠源及其他哺乳动物来源;所述干扰素κ编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,氨基酸序列如SEQ ID No.2所示.所述的囊膜病毒包括但不仅限于流感病毒(H7N9, PR8和H9N2)和寨卡病毒;利用IFN-κ所制备的抗病毒药物可在感染前预防性给药用以预防病毒感染的严重程度；也可在病毒感染后作为治疗性药物给药以降低病毒感染的严重程度；也可自病毒感染前至感染后连续或间隔给药。所述的制备抗囊膜病毒药物包括含有SEQ ID NO:1基因序列的各种载体与SEQ ID NO:2所述氨基酸序列编码的蛋白。上述载体包括但不限于质粒载体、痘病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯病毒载体、CMV载体、细胞载体、细菌载体;SEQ ID No 2序列编码的蛋白包括单独表达的蛋白与融合表达的蛋白，融合表达的方式包括但不限于与抗体的Fc序列融合、与不同信号肽的融合。此外,SEQ ID No 2序列编码的蛋白可使用PEG修饰.

本发明的有益效果在于：与现有技术相比，本发明发现了IFN-κ的新用途，本发明所述IFN-κ能抑制囊膜病毒，如流感病毒（包括PR8, H7N9和H9N2）和寨卡病毒的复制，对于预防与治疗高致病流感病毒与寨卡病毒等新发突发传染病有重要的临床应用价值。

附图说明

图1显示了IFN-κ真核表达载体的构建及IFN-κ蛋白的表达。a，pSV1.0-IFN-κ真核表达载体质粒构建图谱；b， IFN-κ蛋白在293T细胞和细胞上清中成功表达。

图2显示了IFN-κ抑制流感病毒PR8, H9N2和H7N9在人非小细胞肺癌上皮细胞系A549中复制。a，蛋白质免疫印迹（WB）结果显示过表达IFN-κ能完全抑制PR8（H1N1）流感病毒核蛋白NP和M1蛋白在A549细胞中的表达；b，蛋白质免疫印迹（WB）结果显示过表达IFN-κ能完全抑制H9N2流感病毒核蛋白NP和M1蛋白在A549细胞中的表达；c，蛋白质免疫印迹（WB）结果显示过表达IFN-κ能抑制H7N9流感病毒核蛋白NP和M1蛋白在A549细胞中的表达。

图3显示了IFN-κ抑制寨卡病毒在神经胶质细胞U-251中复制。a，蛋白质免疫印迹（WB）显示转染了IFN-κ质粒的U-251细胞和293T细胞上清都表达大量的IFN-κ蛋白；b，蛋白质免疫印迹（WB）结果显示IFN-κ过表达质粒（左）和细胞上清（右）能抑制寨卡病毒非结构蛋白（NS2b，NS3，NS5）在U-251细胞中的表达；c，免疫荧光统计分析结果显示过表达IFN-κ质粒能抑制寨卡病毒在U-251细胞中复制；d，免疫荧光统计分析结果显示过表达IFN-κ的293T细胞上清能抑制寨卡病毒在U-251细胞中复制。

图4 显示了IFN-κ上调IFITM3 的RNA和蛋白表达水平。 a，qPCR检测IFN-κ诱导IFITM3 RNA水平上调；b，蛋白质免疫印迹（WB）检测IFN-κ显著上调IFITM3的蛋白表达。 注:NC是Native Control的缩写，代表的是对照组。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明.

实施例一：pSV1.0-IFN-κ过表达质粒的构建

本发明从人基因组中克隆获得了IFN-κ，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示, 全长氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，本发明所述IFN-κ属于I型干扰素家族，其与IFN-α和IFN-β仅有30%的同源性。

为了研究IFN-κ的功能，我们构建了IFN-κ的真核表达载体，并在体外细胞系中真核表达出成熟的分泌蛋白，然后检测IFN-κ蛋白对流感病毒和寨卡病毒复制的影响。首先，我们采用真核表达载体pSV1.0构建IFN-κ真核表达质粒，构建方式如下：以A549细胞抽提的RNA反转录生成的cDNA为模板，采用相应的引物进行PCR扩增。

PCR反应程序：

扩增结束后，在1%的琼脂糖凝胶中分离目的基因，切胶回收，采用Sanprep 柱式DNA 胶回收试剂盒进行PCR片断回收，将IFN-κ回收产物与pSV1.0载体都采用内切酶BamHⅠ、XbaⅠ双酶切，酶切后再采用T4 DNA连接酶将片段和载体4℃连接过夜，第2天将连接产物转化至大肠杆菌E.coli TOP10，在含卡那霉素的培养板上过夜生长。第3天，随机挑取单菌落进行PCR鉴定，挑选阳性克隆再进行双酶切鉴定。再经过测序，突变位点校正，验证全部序列正确后，成功克隆出IFN-κ基因，质粒构建图谱如图1a。我们进一步检测了IFN-κ能否表达且被分泌到细胞上清中，我们收集了pSV1.0-IFN-κ质粒转染的细胞和上清，进行蛋白质免疫印迹（WB）鉴定，发现IFN-κ在细胞和上清中都有表达，而pSV1.0对照转染的细胞和上清不能检测到IFN-κ蛋白的表达（图1b）。

实施例二：IFN-κ抑制流感病毒H7N9, PR8和H9N2的复制

肺上皮细胞系A549来源于人非小细胞肺癌上皮细胞，是用于研究流感病毒感染的主要细胞模型，为了验证IFN-κ对于不同亚型流感病毒感染的作用，本实施例采用12孔板在A549细胞系中转染pSV1.0-IFN-κ过表达质粒和对照质粒pSV1.0-GFP，24h后，分别加入100 μL不含血清的培养基稀释的三种流感病毒PR8 (图2a)、H9N2（图2b）、以及H7N9（图2c），平均每个细胞感染病毒的颗粒数（MOI）均为1。在CO₂孵箱中继续孵育2h后弃去病毒液，采用PBS洗2遍，加入DMEM完全培养基继续培养48h后收取细胞，通过蛋白质免疫印迹法分析IFN-κ表达和流感病毒核蛋白NP和M1的表达。所用的一抗分别为Anti-Mx1 mAb (ab22396, 1:1000),anti-NP(bs-4976R, 1:1000), anti-IFN-κ（H00056832-M01, 1:1000）, 与anti-β-Actin(sc-69879, 1:1000)。二抗分别为HRP标记山羊抗小鼠（zb-2305,1:3000）, HRP标记山羊抗兔（zb-2301, 1:3000）。

结果显示，转染对照载体pSV1.0-GFP 24h后，PR8能感染A549细胞，表达流感病毒NP和M1蛋白，而当转染IFN-κ表达载体pSV1.0-IFN-κ 24h后, A549细胞表达IFN-κ蛋白，然而流感病毒NP和M1蛋白不表达，说明IFN-κ能抑制流感病毒蛋白NP和M1的表达（图2a）。另外，采用同样的实验方法证实，IFN-κ也能抑制流感病毒H9N2和H7N9病毒蛋白NP和M1的表达，显示了广谱抗流感病毒复制的效果（图2b-2c）。

实施例三：IFN-κ抑制寨卡病毒的复制

星形胶质细胞U-251细胞，是寨卡病毒感染主要靶细胞之一。为了验证IFN-κ对寨卡病毒感染的作用，采用U-251细胞转染对照质粒pSV1.0和pSV1.0-IFN-κ质粒，转染36h后，收取部分孔的细胞，检测细胞中IFN-κ蛋白表达水平（图3a-左）。其余细胞感染寨卡病毒，感染复数（MOI =2），37 °C感染2h，PBS洗2次，更换新鲜的含有2%FBS的DMEM培养基继续培养。寨卡病毒感染36h后，收取细胞，一部分细胞用于蛋白质免疫印迹（WB）分析寨卡病毒非结构蛋白（NS2b，NS3，NS5）在U-251细胞中的表达水平（图3b-左）。另一部分细胞采用免疫荧光染色技术，分析寨卡病毒包膜（E）蛋白表达水平，三次重复用于统计分析寨卡病毒感染的阳性细胞比例（图3c）。为了在蛋白水平验证IFN-κ蛋白对寨卡病毒复制的作用，我们在293T细胞中转染对照质粒pSV1.0和pSV1.0-IFN-κ质粒，36h后其细胞上清中IFN-κ的表达如图3a-右，将400μL细胞上清加入预先铺好的U-251细胞中，37 °C孵育3h，移除400μL上清，再加入寨卡病毒感染U-251细胞，MOI=2，37 °C感染2h，更换新鲜的含有2%FBS的DMEM培养基。寨卡病毒感染36h后，收取细胞，蛋白质免疫印迹（WB）分析寨卡病毒非结构蛋白（NS2b，NS3，NS5）在U-251细胞中的表达水平（图3b-右）。免疫荧光染色寨卡病毒E蛋白，统计分析寨卡病毒感染的阳性细胞比例（图3d）。所有一抗稀释比例为1:1000，HRP标记山羊抗兔二抗稀释比例为1:3000。免疫荧光一抗为鼠抗黄病毒包膜蛋白抗体（D1-4G2-4-15，1：200），二抗为AlexaFluor 568标记的驴抗鼠IgG (ab175472, 1: 1000)。

结果显示，过表达pSV1.0-IFN-κ质粒，利用蛋白质免疫印迹方法能检测到高表达的IFN-κ蛋白（图3a），而IFN-κ的表达对寨卡病毒非结构蛋白NS2b，NS3和NS5的表达都有明显抑制作用（图3b）。采用免疫荧光技术发现，在寨卡病毒感染后，与对照组比较，IFN-κ过表达质粒抑制了92%的寨卡病毒包膜蛋白表达（图3c）。我们接下来利用真核表达系统293T细胞过表达IFN-κ蛋白，与对照上清相比，IFN-κ过表达的293T细胞上清抑制40% 寨卡病毒包膜蛋白表达（图3d）。这些结果证实IFN-κ能显著抑制寨卡病毒的复制。另外，我们初步探究了IFN-κ抑制病毒复制的机制，发现IFN-κ能上调抗病毒基因IFITM3的RNA水平（图4a）和蛋白水平（图4b）。而IFITM3蛋白能显著抑制寨卡病毒的复制。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市公共卫生临床中心

<120> 干扰素κ在制备抗囊膜病毒药物方面的应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 624

<212> DNA

<213> Human

<220>

<221> gene

<222> (1)..(624)

<400> 1

atgagcacca aacctgatat gattcaaaag tgtttgtggc ttgagatcct tatgggtata 60

ttcattgctg gcaccctatc cctggactgt aacttactga acgttcacct gagaagagtc 120

acctggcaaa atctgagaca tctgagtagt atgagcaatt catttcctgt agaatgtcta 180

cgagaaaaca tagcttttga gttgccccaa gagtttctgc aatacaccca acctatgaag 240

agggacatca agaaggcctt ctatgaaatg tccctacagg ccttcaacat cttcagccaa 300

cacaccttca aatattggaa agagagacac ctcaaacaaa tccaaatagg acttgatcag 360

caagcagagt acctgaacca atgcttggag gaagacaaga atgaaaatga agacatgaaa 420

gaaatgaaag agaatgagat gaaaccctca gaagccaggg tcccccagct gagcagcctg 480

gaactgagga gatatttcca caggatagac aatttcctga aagaaaagaa atacagtgac 540

tgtgcctggg agattgtccg agtggaaatc agaagatgtt tgtattactt ttacaaattt 600

acagctctat tcaggaggaa ataa 624

<210> 2

<211> 207

<212> PRT

<213> Human

<220>

<221> CONFLICT

<222> (1)..(207)

<400> 2

Met Ser Thr Lys Pro Asp Met Ile Gln Lys Cys Leu Trp Leu Glu Ile

1 5 10 15

Leu Met Gly Ile Phe Ile Ala Gly Thr Leu Ser Leu Asp Cys Asn Leu

20 25 30

Leu Asn Val His Leu Arg Arg Val Thr Trp Gln Asn Leu Arg His Leu

35 40 45

Ser Ser Met Ser Asn Ser Phe Pro Val Glu Cys Leu Arg Glu Asn Ile

50 55 60

Ala Phe Glu Leu Pro Gln Glu Phe Leu Gln Tyr Thr Gln Pro Met Lys

65 70 75 80

Arg Asp Ile Lys Lys Ala Phe Tyr Glu Met Ser Leu Gln Ala Phe Asn

85 90 95

Ile Phe Ser Gln His Thr Phe Lys Tyr Trp Lys Glu Arg His Leu Lys

100 105 110

Gln Ile Gln Ile Gly Leu Asp Gln Gln Ala Glu Tyr Leu Asn Gln Cys

115 120 125

Leu Glu Glu Asp Lys Asn Glu Asn Glu Asp Met Lys Glu Met Lys Glu

130 135 140

Asn Glu Met Lys Pro Ser Glu Ala Arg Val Pro Gln Leu Ser Ser Leu

145 150 155 160

Glu Leu Arg Arg Tyr Phe His Arg Ile Asp Asn Phe Leu Lys Glu Lys

165 170 175

Lys Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Val Glu Ile Arg Arg

180 185 190

Cys Leu Tyr Tyr Phe Tyr Lys Phe Thr Ala Leu Phe Arg Arg Lys

195 200 205

Claims (11)

1.干扰素κ在制备抗囊膜病毒药物方面的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述的IFN-κ来源包括人源、鼠源及其他哺乳动物来源。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，人源IFN-κ编码基因的核苷酸序列如SEQID NO:1所示,氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.根据权利要求1和3所述的应用，其特征在于，所述的制备抗囊膜病毒药物包括含有SEQ ID NO:1基因序列的各种载体与SEQ ID NO:2所述氨基酸序列编码的蛋白。

5.根据权利要求4所应用,其特征在于所述的各种载体包括但不限于质粒载体、痘病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯病毒载体、CMV载体、细胞载体、细菌载体。

6.根据权利要求4所述应用,其特征在于所述SEQ ID No 2序列编码的蛋白包括单独表达的蛋白与融合表达的蛋白，融合表达的方式包括但不限于与抗体的Fc序列融合、与不同信号肽的融合。

7.根据权利要求4所述应用,其特征在于,所述SEQ ID No 2序列编码的蛋白可使用PEG修饰。

8.根据权利要求1所述应用,其特征在于,所述的抗囊膜病毒药物可单独使用，也可与其他抗病毒药物或技术联合使用。

9.根据权利要求1所述应用，其特征在于：所述的囊膜病毒包括但不仅限于流感病毒和寨卡病毒。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于：所述的流感病毒包括但不限于H7N9, PR8和H9N2。

11.根据权利要求1所述应用，其特征在于：利用IFN-κ所制备的抗病毒药物可在感染前预防性给药用以预防病毒感染的致病作用；也可在病毒感染后作为治疗性药物给药清除病毒；也可自病毒感染前至感染后连续或间隔给药。