CN107371365B - 靶向克雷伯氏肺炎菌半乳聚糖类o-抗原的抗体 - Google Patents

靶向克雷伯氏肺炎菌半乳聚糖类o-抗原的抗体 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种特异性识别克雷伯氏肺炎菌脂多糖(LPS)O‑抗原结构的半乳聚糖‑III表位的分离抗体，所述表位包括在半乳聚糖‑III重复单元内，其中所述半乳聚糖‑III重复单元是式(I)的支链半乳糖均聚物。本发明进一步提供一种包含所述抗体的药物或诊断制备物，及一种产生所述抗体的方法。

Description

靶向克雷伯氏肺炎菌半乳聚糖类O-抗原的抗体
技术领域
本发明涉及一种特异性识别独特半乳聚糖类O-抗原结构的单克隆抗体，所述抗体与大多数传染性耐多药克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)ST258结合。
背景技术
克雷伯氏肺炎菌是一种重要的肠道菌病原体，会引发尿路感染、肺炎和败血症，导致严重的发病率和死亡率。最近，出现了耐多药(MDR)菌株，并且在全球扩散，这种菌株的治疗方法非常有限。
脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌(如克雷伯氏肺炎菌)外膜外叶的主要成分。LPS拥有结构上和功能上不同的三大部分：i)脂质A，亦称为内毒素，ii)核心寡糖，及iii)由寡糖嵌段(oligosaccharide block)重复单元构成的O-抗原。
克雷伯氏肺炎菌O-抗原是定义不同O-型的不同结构的表面抗原。在目前识别的7种O-型中，最常见的血清型是O1和O2，据报道，这两者被大多数(即>50％)分离株表达(1；2)。O1和O2抗原由半乳糖聚合物(即半乳聚糖)组成。O2抗原(亦称为O2a或O2ab，以与下文所述O2ac区分)由所谓的半乳聚糖-I二糖重复单元组成(参见图3)。与此相反，O1和O2ac抗原除包含半乳聚糖-I以外确实还包含其它以下不同结构：LPS核-近端部分由半乳聚糖-I重复单元组成，采用半乳聚糖-II(半乳糖的不同均聚物，O1时)加帽，或采用非半乳聚糖重复单元加帽(O2ac时)。
共有半乳聚糖-I O-亚基的血清型携带编码合成和输出这种结构的高度类似rfb基因座。已经部分确定了编码半乳聚糖-I的操纵子的核苷酸序列(3)。根据描述，该基因座长7.3kb，包括6个基因。克隆的rfb基因座互补的克雷伯氏肺炎菌O1、大肠杆菌K-12或肠道沙门氏菌血清型鼠伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium)的粗糙型突变体恢复了由半乳聚糖-I O-抗原重复单元组成的光滑型LPS的生产。表明这6个基因是产生半乳聚糖-I O-抗原侧链必须的，也是足够的(3)。Kelly等公开了不同O2克雷伯氏菌菌株中D-半乳聚糖-I的结构修饰(5)。然而，仍然需要对这些修饰的遗传背景进行阐明。最近，有人对编码半乳聚糖-II重复单元(即，采用此处所述的对半乳聚糖-I或半乳聚糖-III加帽的那些)的遗传定子进行了描述(4)。重要的是，这些基因与引发半乳聚糖-I单元向半乳聚糖-III转化的遗传定子不相关。因此，O1血清型菌株，除了表达半乳聚糖-II重复单元的血清型决定表面之外，还可以表达连接脂质A-核和半乳聚糖-II重复单元的半乳聚糖-I或半乳聚糖-III重复单元。
最近出现的克雷伯氏肺炎菌耐多药(MDR)菌株引发的感染占克雷伯氏肺炎菌感染的很大一部分。由于这些MDR菌株已经演变为对临床使用的大多数抗生素具有耐药性，因此，它们的治疗方法非常受限制。因此，替代的治疗方法，如单克隆抗体(mAb)被动免疫法将来拥有良好的前景。
人们需要克雷伯氏肺炎菌的新靶标。特别是，需要鉴定免疫相关、可用于治疗和诊断的靶标。
发明内容
本发明的目的是提供一种直接对抗克雷伯氏肺炎菌，特别是MDR菌株的抗体，其靶向病原体的相关性得到改善，用于预防或治疗克雷伯氏肺炎菌感染。本发明进一步的目的是提供能够快速、可靠地诊断克雷伯氏肺炎菌(如MDR菌株)的手段和方法。
本发明的目的通过本发明的主题实现。
根据本发明，提供一种特异性识别克雷伯氏肺炎菌脂多糖(LPS)O-抗原结构的半乳聚糖-III(gal-III)表位的分离抗体，所述表位包括在半乳聚糖-III重复单元内，其中所述半乳聚糖-III重复单元是式(I)的支链半乳糖均聚物：
Figure BDA0001373016120000021
特别是，所述半乳聚糖-III表位被包括在包含至少2个gal-III重复单元，或至少3、4或5个gal-III重复单元的O-抗原结构中。
根据一个特定方面，相对半乳聚糖-I表位，所述抗体优先与半乳聚糖-III表位结合，或不与半乳聚糖-I表位交叉反应，其中半乳聚糖-I(gal-I)表位被包括在克雷伯氏肺炎菌LPS O2a-抗原结构的半乳聚糖-I重复单元中，其中半乳聚糖-I重复单元是式(II)的线性半乳糖均聚物。
[→3)-β-D-Galf-(1→3)-α-D-Galp-(1→]
式(II)。
例如，本发明的抗体是gal-III特异性抗体，特异性识别或结合包括gal-III抗原的O-抗原结构。示例性抗体，或这些抗体的变体在图1和图2中列出。为了提供变体起见，此处的抗体被称为亲代(parent)抗体，CDR或构架(framework)序列在此处被称为亲代CDR序列或亲代构架序列。
根据一个特定方面，所述抗体包括重组CDR序列和构架序列，例如，不同来源的序列，其中CDR序列和构架序列中的至少一个序列包括人、人源化、嵌合、鼠源或亲和力成熟的序列，优选其中的构架序列是任何免疫球蛋白同种型的构架序列，特别是IgG抗体的构架序列。
特别是，本发明的抗体与gal-III表位及gal-I表位交叉特异性结合，相对克雷伯氏肺炎菌O2-抗原的gal-I抗原结构，优先与gal-III抗原结构结合，例如，与gal-III抗原结合的亲和力高于与gal-I抗原结合的亲和力。根据一个具体实施例，所述抗体与gal-III抗原结合的亲和力比与gal-I抗原结合的亲和力至少大2倍，特别是两者的亲和力与/或亲合力相差至少两倍，或至少三倍，至少四倍，至少五倍，或甚至至少10倍。例如，与gal-I抗原相比，优先与gal-III抗原结合的Kd差至少是0.5或1log，或甚至是至少2log，或至少是3log，采用免疫试验法，优选免疫印迹法、ELISA或其它免疫学方法测定。
特别是，本发明抗体的特征还在于其不与任何其它克雷伯氏肺炎菌抗原交叉反应，与/或所述抗体与任何其它克雷伯氏肺炎菌抗原结合的亲和力较低，例如，与其它克雷伯氏肺炎菌抗原(除gal-III或gal-I以外的抗原)相比，优先与gal-III抗原结合的Kd差是至少2log，优选至少3log。
特别是，功能活性变体是亲代CDR序列中包含至少一个点突变的功能活性CDR变体，并且包含与亲代CDR序列具有至少60％序列一致性，优选至少70％、至少80％、至少90％序列一致性的氨基酸序列或由这样的氨基酸序列组成。
特定的变体是，例如，所述亲代抗体的人源化变体，其中亲代CDR序列掺入到人或人源化构架序列中，其中每个亲代CDR序列的任选1、2、3或4个氨基酸残基可以通过引入点突变进一步突变，从而改善亲代或人源化抗体的稳定性、特异性和亲和力。
特别是，这些变体的VH或重链(HC)序列可以分别被另一个变体的VH和HC序列代替，特别是其中另一变体是同一亲代抗体的任何其它变体。
特别是，这些变体的VL或轻链(LC)序列可以分别被另一个变体的VL和LC序列代替，特别是其中另一变体是同一亲代抗体的任何其它变体。
特别是，半乳聚糖-III表位被耐多药(MDR)克雷伯氏肺炎菌表达，更特别被MDR克隆ST258表达。特别是，半乳聚糖-III表位是耐多药(MDR)克雷伯氏肺炎菌的表位。
根据一个具体实施例，所述抗体与半乳聚糖-III表位结合的亲和力Kd小于10-7M，优选小于10-8M，甚至更优选小于10-9M。
亲和力成熟产生的亲代抗体的变体，在此处被称为亲和力成熟变体，其结合亲和力可能增加，与亲代抗体相比，Kd差至少是1log，或2log或3log。亲和力成熟变体与gal-III抗原结合的亲和力Kd通常小于10-8M，或小于10-9M。如果亲代抗体的亲和力Kd小于10-8M，或小于10-9M，且亲代抗体经历亲和力成熟，则亲和力成熟变体的亲和力甚至更高，Kd分别小于10-9M和小于10-10M。
根据一个特定方面，所述抗体是中和抗体。特别是，正如采用体外或体内检测方法测定的那样，所述抗体中和表达半乳聚糖-III表位的克雷伯氏肺炎菌菌株的内毒素(即LPS)。特别是，所述抗体体外中和特定LPS分子的内毒素效应。
特别是，所述抗体中和表达半乳聚糖-III表位的克雷伯氏肺炎菌菌株的内毒素，其中中和效力至少与参考抗体(如参考抗体2D8-A10)的效力相同，其包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 10组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 11组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 12组成的CDR3；和
d)由氨基酸序列SEQ ID 19组成的CDR4；和
e)由氨基酸序列SEQ ID 17组成的CDR5；和
f)由氨基酸序列SEQ ID 18组成的CDR6；采用Kabat命名法命名。这些CDR序列都按照Kabat编号体系进行命名。
在下文中，除非另外说明，提到的CDR序列都是按照Kabat编号，即按照Kabat命名法确定(参见Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,U.S.Department of Health and Human Services.(1991))，特别是表1列出的那些CDR序列。本发明及权利要求的范围也包括CDR区采用不同编号和命名(其中CDR区按照IMGT系统(The international ImMunoGeneTics,Lefranc et al.,1999,Nucleic Acids Res.27:209-212)定义)的相同抗体和CDR，这是很好理解的。
特别地，本发明抗体靶向的克雷伯氏肺炎菌菌株的特征在于包含额外的糖基转移酶(gtr)基因的rfbgal-I基因座。
根据一个特定方面，所述抗体识别MDR克雷伯氏肺炎菌克隆ST258，特别是，识别表达半乳聚糖-III表位的菌株。
一个具体的实施例涉及一种抗体，所述抗体是全长单克隆抗体、其抗体片段或融合蛋白中的任一种，所述抗体片段包含带所述结合位点的至少一个抗体域，所述融合蛋白包含带所述结合位点的至少一个抗体域，特别是，其中所述抗体是包含随机化或人工氨基酸序列的非天然抗体。
特别地，所述抗体选自鼠、羊驼、兔子、山羊、牛、嵌合、人源化或人抗体、重链抗体、Fab、Fd、scFv和单域抗体，如VH、VHH或VL，优选人lgG抗体或鼠源IgG抗体。
特别地，所述抗体是单克隆抗体。
根据一个具体实施例，所述抗体包含至少一个抗体重链可变区或域(VH)，其特征在于按照Kabat编号系统命名的表1所列CDR1至CDR3序列中的任一个序列，或其功能活性CDR变体。
根据一个特定方面，本发明提供附图详细列出的示例性(亲代)抗体，及进一步提供这些亲代抗体的抗体变体，特别是包括与亲代抗体基本上相同表位结合的变体，其特征在于图2的VH和VL氨基酸序列或表1各CDR序列形成的特异性结合位点。这些抗体可以是例如通过修饰亲代抗体各CDR或抗体序列得到的功能活性变体抗体。此处所描述的任何抗体序列都被视为经历改变(例如，通过点突变改变)的“亲代”序列，这是很好理解的。
实例中描述的抗体是其鼠源或人源化形式。人源化和任选亲和力成熟获得的变体可以采用人们熟悉的技术改造得到。这些变体抗体与靶抗原结合，因此，被视为具有功能活性。此外，使用，例如，各FR或CDR序列中存在修饰，且具有功能活性(例如，结合表位与亲代抗体相同或包括与亲代抗体相同的结合位点或与亲代抗体具有相同的结合特点)的变体VH或VL域也是可行的。另外，此处所描述抗体的某些FR或CDR序列可与其它抗体的FR或CDR序列交换，例如，与表1所列抗体的FR或CDR序列交换，也是可行的。
特别是，本发明的抗体包括图1(表1)所描述抗体重链可变区的任何CDR序列或其功能活性CDR变体与/或选自图2所描述任何VH序列的VH氨基酸序列或其功能活性变体，例如，包括CDR1、2和3的抗体重链(HC)或VH氨基酸序列，其中CDR1序列1、4、7或10中的任一个序列；与/或CDR2序列2、5、8或11中的任一个序列；与/或CDR3序列3、6、9或12中的任一个序列；或包括VH序列19、21、23或25中的任一个序列。
特别是，所述抗体是
A)
选自由i)至iv)组员组成的组，其中
i)
是一种抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 1组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 2组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 3组成的CDR3；
ii)
是一种抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 4组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 5组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 6组成的CDR3；
iii)
是一种抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 7组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 8组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 9组成的CDR3；
iv)
是一种抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 10组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 11组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 12组成的CDR3；
或
B)一种抗体，所述抗体是A中任一组员亲代抗体的功能活性变体，包括所述亲代抗体CDR1、CDR2或CDR3中任一个的至少一个功能活性CDR变体。
特别是，所述功能活性变体是亲代CDR序列中包括至少一个点突变的功能活性CDR变体，其包含与亲代CDR序列具有至少60％序列一致性，优选至少70％、至少80％、至少90％序列一致性的氨基酸序列或由这样的氨基酸序列组成。
特别是，所述抗体包括选自图2所描述任一VH序列的VH氨基酸序列。
根据一个具体实施例，所述抗体进一步包含抗体轻链可变区或域(VL)，其包括按照Kabat编号系统命名的表1所列CDR4至CDR6序列中的任一序列，或其功能活性CDR变体。
特别地，本发明的抗体包括图1(表1)所描述抗体轻链可变区的任何CDR序列或其功能活性CDR变体与/或选自图2所描述任何VL序列的VL氨基酸序列或其功能活性变体，例如，包括CDR4、5和6的抗体轻链(LC)或VL氨基酸序列，其中CDR4序列13、16或19中的任一个序列；CDR5序列14、17或20中的任一个序列；与/或CDR6序列3、6、9或12中的任一个序列；或包括VH序列15或18中的任一个序列，或包括VL序列20、22、24或26中的任一个序列。
特别地，所述抗体是
A)
选自由i)至iv)组员组成的组，其中
i)
是一种抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 13组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 14组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 15组成的CDR6；
ii)
是一种抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 16组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 17组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 18组成的CDR6；
iii)
是一种抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 19组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 20组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 18组成的CDR6；
iv)
是一种抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 19组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 17组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 18组成的CDR6；
或
B)一种抗体，所述抗体是A中任一组员亲代抗体的功能活性变体，其包含亲代抗体CDR4、CDR5或CDR6中任一个的至少一个功能活性CDR变体。
特别地，所述功能活性变体是亲代CDR序列中包含至少一个点突变的功能活性CDR变体，并包含与亲代CDR序列具有至少60％序列一致性，优选至少70％、至少80％、至少90％序列一致性的氨基酸序列或由这样的氨基酸序列组成。
特别地，所述抗体包含VL域，其特征在于：
a)由氨基酸序列SEQ ID 19组成的CDR4或所述CDR4的功能活性CDR变体；及
b)由氨基酸序列SEQ ID 20组成的CDR5或所述CDR5的功能活性CDR变体；及
c)由氨基酸序列SEQ ID 18组成的CDR6或所述CDR6的功能活性CDR变体；
优选与本发明所描述的任何VH序列组合。
特别地，所述抗体包含选自图2所描述任一VL序列的VL氨基酸序列。
特别地，所述抗体包含VH和VL氨基酸序列两者，及任选的进一步的全长抗体或抗体片段的构架序列，特别是任何全长抗体或Fab片段的构架序列。
特别地，所述抗体包括
a)表1所列任何抗体的CDR1-CDR6序列；或
b)图2所示任何抗体的VH和VL序列；或
c)以a)-c)序列为特征的亲代抗体的功能活性变体，
优选其中
i.所述功能活性变体包含亲代抗体的任何CDR1-CDR6的至少一个功能活性CDR变体；和/或
ii.所述功能活性变体在VH和VL序列的任一序列的构架区包括至少一个点突变；
及进一步其中
iii.所述功能活性变体具有结合与亲代抗体相同表位的特异性；与/或
iv.所述功能活性变体是亲代抗体的人变体、人源化变体、嵌合变体或鼠源变体与/或亲和力成熟变体。
特别是，所述抗体选自由下述抗体组成的组：
a)抗体，包括：
a.SEQ ID 1的CDR1序列；及
b.SEQ ID 2的CDR2序列；及
c.SEQ ID 3的CDR3序列；及
d.SEQ ID 13的CDR4序列；及
e.SEQ ID 14的CDR5序列；及
f.SEQ ID 15的CDR6序列；
b)抗体，包括：
a.SEQ ID 4的CDR1序列；及
b.SEQ ID 5的CDR2序列；及
c.SEQ ID 6的CDR3序列；及
d.SEQ ID 16的CDR4序列；及
e.SEQ ID 17的CDR5序列；及
f.SEQ ID 18的CDR6序列；
c)抗体，包括：
a.SEQ ID 7的CDR1序列；及
b.SEQ ID 8的CDR2序列；及
c.SEQ ID 9的CDR3序列；及
d.SEQ ID 19的CDR4序列；及
e.SEQ ID 20的CDR5序列；及
f.SEQ ID 18的CDR6序列；
d)抗体，包括：
a.SEQ ID 10的CDR1序列；及
b.SEQ ID 11的CDR2序列；及
c.SEQ ID 12的CDR3序列；及
d.SEQ ID 19的CDR4序列；及
e.SEQ ID 17的CDR5序列；及
f.SEQ ID 18的CDR6序列；
e)抗体，包括：
a.SEQ ID 4的CDR1序列；及
b.SEQ ID 5的CDR2序列；及
c.SEQ ID 6的CDR3序列；及
d.SEQ ID 19的CDR4序列；及
e.SEQ ID 20的CDR5序列；及
f.SEQ ID 18的CDR6序列；
f)抗体，包括：
a.SEQ ID 10的CDR1序列；及
b.SEQ ID 11的CDR2序列；及
c.SEQ ID 12的CDR3序列；及
d.SEQ ID 19的CDR4序列；及
e.SEQ ID 20的CDR5序列；及
f.SEQ ID 18的CDR6序列；
或前述任一CDR序列的功能活性CDR变体，其与gal-III抗原结合的亲和力Kd小于10-8M，优选小于10-9M，优选小于10-10M，优选小于10-11M，例如，亲和力是皮摩尔范围。
特别地，所述抗体包括表1所列任一CDR序列的功能活性CDR变体，其中所述功能活性CDR变体包括以下中的至少一项：
a)亲代CDR序列中有1、2或3个点突变；与/或
b)亲代CDR序列的四个C-端或四个N-端，或四个中心氨基酸位置中的任一个有1或2个点突变；与/或
c)与亲代CDR序列具有至少60％序列一致性；
优选其中所述功能活性CDR变体在由4或5个以下氨基酸序列组成的任何CDR序列中包含1或2个点突变。
特别地，所述功能活性变体抗体包括本发明的至少一个功能活性CDR变体。特别地，包括一个或多个功能活性CDR变体的功能活性变体抗体具有与亲代抗体相同表位结合的特异性。
特别地，功能活性变体是CDR变体，例如，其包含CDR，更特别地是包含CDR环序列，氨基酸序列具有至少60％，优选至少70％、80％或90％的序列一致性。
根据一个特定方面，至少一个点突变是氨基酸取代、删除与/或插入一个或多个氨基酸。
特别地，功能活性变体不同于亲代抗体的地方在于氨基酸序列中，优选CDR中至少有一个点突变，其中每个CDR氨基酸序列中点突变的数量是0、1、2或3。
特别地，抗体源自这样的抗体，采用各CDR序列，或CDR突变体，包括功能活性CDR变体，例如，在一个CDR环中，例如，在5-18个氨基酸的CDR长度内，例如，在5-15个氨基酸或5-10个氨基酸的CDR区域内，有1、2或3个点突变。或者，在一个CDR环中，例如，在小于5个氨基酸的CDR长度内，有1至2个点突变，从而提供包括功能活性CDR变体的抗体。具体的CDR序列可能比较短，例如，CDR2或CDR5序列。根据一个具体实施例，功能活性CDR变体在由4或5个以下氨基酸组成的任何CDR序列中包括1或2个点突变。
根据一个特定方面，本发明的抗体包含CDR序列和构架序列，其中CDR序列和构架序列中的至少一个序列包括人、人源化、嵌合、鼠源或亲和力成熟的序列，优选其中构架序列是IgG抗体的构架序列，例如，是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型的构架序列，或是IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体的构架序列。
特定的抗体以构架突变抗体的形式提供，例如，从而改善亲代抗体的可制造性或耐受性，例如，从而提供一种免疫原性潜力低的改进(突变)抗体，例如，与亲代抗体相比，CDR序列与/或构架序列中的任一序列存在突变的人源化抗体。
另一个特定的抗体是以CDR突变抗体的形式提供，例如，从而改善抗体的亲和力与/或靶向与亲代抗体相同的表位或靶向亲代抗体所靶向表位附近的表位(表位转移(epitopeshift))。
因此，表1或图2所列任何抗体可以作为制造改善抗体的亲代抗体。
根据一个特定方面，本发明的抗体包括图1(表1)所列CDR组合，条件是所述抗体仍然是功能活性的。
特别地，本发明的抗体包含表1所列任何抗体的CDR1-6。但是，根据一个替代实施例，所述抗体可以包含不同的CDR组合，例如，其中表1所列的抗体包含一个抗体的至少一个CDR序列，如1、2、3、4、5或6个CDR序列，及表1所列任何不同抗体的至少一个其它CDR序列。根据一个具体实例，抗体包含1、2、3、4、5或6个CDR序列，其中CDR序列是1个以上，例如，2、3、4、5或6个不同抗体的CDR组合。例如，CDR序列可以组合，优选包含表1所列任何抗体的CDR1-3中的1、2或全部3个CDR，及表1所列相同或任何其它抗体的CDR4-6中的1、2或全部3个CDR。
例如，CDR序列可以组合，优选包含表1所列任何抗体的至少CDR1-3，例如，名称为8E3-E5、9H9-H7、5A4-A7或2D8-A10的任何抗体的，与/或表1所列任何(其它)抗体的至少CDR4-6，例如，名称为5A4-A7的抗体的，或至少其CDR4和CDR6序列与其CDR5的功能活性CDR变体的组合。根据一个具体实施例，本发明的抗体包含表1所列任一抗体的CDR1-6，例如，名称为8E3-E5、9H9-H7、5A4-A7或2D8-A10的任一抗体的CDR1-6。但是，根据另一个特定方面，所述抗体可以包括不同的CDR组合，例如，其中表1所列抗体，例如，名称为8E3-E5、9H9-H7、5A4-A7或2D8-A10的任一抗体包含不同抗体的至少一个CDR序列，如1、2、3、4、5或6个CDR序列，例如，表1所列任一不同抗体的CDR序列。例如，所述抗体包含1、2、3、4、5或6个CDR序列，其中所述CDR序列是1个以上抗体，例如，2、3、4、5或6个不同抗体的CDR组合。包含不同抗体CDR序列的示例性抗体如图2所示。
特别地，
i.抗体G3-77包含抗体9H9-H7的VH-CDR序列(CDR1、2和3)；及抗体5A4-A7的VL-CDR序列(CDR4、5和6)；
ii.抗体G3-78包含抗体9H9-H7的VH-CDR序列(CDR1、2和3)；及抗体5A4-A7的VL-CDR序列(CDR4、5和6)；
iii.抗体G3-97包含抗体2D8-A10的VH-CDR序列(CDR1、2和3)；及抗体5A4-A7的VL-CDR序列(CDR4、5和6)。
根据一个具体实施例，所述抗体仅包含VH域作为抗原结合部分(moiety)，因此，包括CDR1-3，但没有相应的VL域。
此处特别应该理解的是，编号为CDR1、2、3的CDR代表的是VH域的结合区，而CDR4、5和6代表的是VL域的结合区。
根据一个特定方面，本发明的抗体包括图2所示的任何VH和VL氨基酸序列组合，或由所述VH和VL氨基酸序列组合形成的结合位点。或者，可以采用两种不同抗体的免疫球蛋白功能域的组合，只要所述抗体仍然具有功能活性即可。例如，一个抗体的VH序列可以与另一个抗体的VL序列组合。根据另一个具体实施例，图2提供的任何构架区可作为此处所描述任何CDR序列与/或VH/VL组合的构架。
根据一个特定方面，本发明的抗体包括图2所示的任何VH和VL氨基酸序列组合，或由这样的VH和VL氨基酸序列组合形成的结合位点。
应该理解的是，本发明的抗体任选包括图2这样的氨基酸序列，拥有或没有合适的信号序列或前导序列。
根据一个特定方面，图2每个序列的恒定区可以末端加长或删除，例如，删除一个或多个或C-端氨基酸。
图2示出了称为8E3-E5、9H9-H7、5A4-A7、2D8-A10、G3-43、G3-46、G3-77、G3-78和G3-97的亲代抗体的不同VH序列和不同VL序列，并支持任何VH/VL组合，从而支持每个亲代抗体的一系列不同VH/VL组合，例如，如图9所示。因此，亲代抗体的特定变体可以包括一个亲代抗体的VH序列和另一个亲代抗体的VL序列，或这样的VH序列和VL序列的功能活性变体组合，例如，功能活性变体来源于同一亲代抗体。
特别是，图2示出了称为8E3-E5、9H9-H7、5A4-A7、2D8-A10、G3-43、G3-46、G3-77、G3-78和G3-97的亲代抗体的不同VH序列和不同VL序列。组合一个亲代抗体的VH序列和另一个亲代抗体的VL序列，共有81种不同VH/VL组合是可行的，而且更多变体也是可能的，例如，如果VH或VL序列中任一序列是亲代序列的功能活性变体的话，例如，包括任何CDR突变与/或构架突变的变体。
图2VH和VL序列中包含的CDR序列与图1所列的相应CDR序列相同。
本发明进一步提供一种制备亲代抗体是本发明任一抗体(如表1所列抗体，或包括图2所示任何VH或VL氨基酸序列组合的抗体，或包括VH和VL氨基酸序列这样的组合形成的结合位点的抗体)的功能活性抗体变体的方法，所述方法包括在任何构架区(FR)或恒定区，或互补决定区(CDR1至CDR6)制造至少一个突变点，得到变体抗体，并测定所述变体抗体的功能活性，特别是由与gal-III表位结合的亲和力来确定功能活性，Kd小于10-6M，优选小于10-7M，或小于10-8M，或小于10-9M，甚至小于10-10M，或小于10-11M，例如，亲和力在皮摩尔范围。在测定功能活性之后，选择功能活性变体，将其用于进一步用途和任选用于通过重组产生方法来产生。
根据一个特定方面，变体抗体结合的表位与亲代抗体相同。
根据另一个特定方面，变体抗体包含与亲代抗体相同的结合位点。
功能活性变体抗体在VH或VL序列方面可能不同，或者拥有共同的VH和VL序列，并在相应的FR中包含修饰。可以采用本领域熟悉的方法使亲代抗体产生突变而得到变体抗体。
示例性亲代抗体在下面的实例部分和图1(表1)及图2中进行描述。特别是，所述抗体是特征在于表1或图2所列序列的亲代抗体的功能活性衍生物。可以工程改造得到带一个或多个修饰CDR序列，与/或带一个或多个修饰FR序列，如FR1、FR2、FR3或FR4序列，或修饰恒定域序列的变体。
例如，功能活性变体抗体可以通过突变，特别是通过亲和力成熟与/或人源化得到。虽然变体抗体可能拥有与亲代抗体共同的CDR序列CDR1-6或共同的VH和VL序列，但是，产生各FR或CDR序列中有修饰且具有功能活性的变体抗体或抗体域也是可行的。
亲代抗体的示例变体抗体在CDR1-CDR6的任何一个中包含至少一个点突变，与/或在任何FR序列中包含至少一个点突变，优选其中所述抗体的表位结合特异性与亲代抗体相同。
在某些方面，本发明提供这样的功能活性变体抗体，优选单克隆抗体，更优选人源化或人抗体，包括重链和轻链，其中任何轻链或VL可变区或各CDR包括获自亲本抗体的氨基酸序列，所述亲代抗体是名为8D5-1G10或4D5-D4的抗体或表1或图2所列的任何其它抗体，通过至少一个FR或CDR序列的修饰获得。
本发明进一步提供本发明抗体，用于治疗存在克雷伯氏肺炎菌感染或定殖风险或存在克雷伯氏肺炎菌感染或定殖的主体，包括给予所述主体有效量的抗体，以限制主体的感染或减轻所述感染引起的疾病状况，优选用于治疗或预防任何原发性和继发性菌血症、肺炎、尿路感染、肝脓肿、腹膜炎或脑膜炎。
因此，本发明进一步涉及治疗存在克雷伯氏肺炎菌感染或定殖风险或患有克雷伯氏肺炎菌感染或定殖的主体的方法，包括给予所述主体有效量的抗体，以限制主体的感染或减轻所述感染引起的疾病状况，优选用于治疗或预防任何原发性菌血症和继发性菌血症、肺炎、尿路感染、肝脓肿、腹膜炎或脑膜炎。
所述抗体可以特异性中和致命的内毒素血症。这种功能活性可以在合适的体内模型中测定(采用纯化的LPS攻击)。
特别地，所述抗体可以提供针对gal-III O-型克雷伯氏肺炎菌，特别是MDR克雷伯氏肺炎菌，优选克雷伯氏肺炎菌ST258的杀菌活性。
根据一个特定方面，采用本发明抗体的免疫疗法可以有效对抗活细菌攻击，正如各种动物模型中测定的那样。
所述抗体在通过补体介导杀灭来对抗gal-III O-型的克雷伯氏肺炎菌方面特别有效，例如，如体外血清杀菌试验(SBA)测定的那样，例如，杀灭细菌比对照样品(不加入抗体或加入不相关对照mAb)高至少20％。
所述抗体在通过抗体介导吞噬作用来对抗gal-III O-型的克雷伯氏肺炎菌方面特别有效，例如，体外调理吞噬杀菌试验(OPK)测定的那样，例如，与对照样品(不加入抗体或加入不相关对照mAb)相比，摄入输入细菌要高至少20％，或最终CFU计数低20％。
所述抗体在通过中和内毒素功能来对抗gal-III O-型克雷伯氏肺炎菌方面特别有效，例如，如体外LAL试验所测定的那样，或toll–样受体4(TLR4)报告子试验测定的那样，例如，与对照样品(不加入抗体或加入不相关对照mAb)相比，内毒素活性下降至少20％。
根据本发明另一个特定方面，所述抗体中和动物(包括人和非人动物)中的靶定病原体，并抑制体内发病，优选任何原发性和继发性菌血症、肺炎、尿路感染、肝脓肿、腹膜炎和脑膜炎的模型。
作为测定中和效力的参考(阳性对照)，可以采用实例部分描述的任何抗体。优选本发明抗体的中和效力等于或高于以此处称为2D8-A10的抗体的CDR1-6序列为特征的抗体，特别是实例中所描述的嵌合IgG1抗体。
本发明进一步提供包括本发明抗体的药物制备物，优选包括肠胃外或粘膜制剂，任选包含药学上可接受的载体或赋形剂。
这样的药物组合物可以包含抗体作为唯一的活性物质，或与其它活性物质组合，或活性物质的混合，如至少两种或三种不同抗体的组合或混合。
根据本发明，本发明的抗体特别提供用于医疗、诊断或分析用途。
本发明进一步提供本发明抗体用于诊断目的的用途，特别是用于诊断主体中克雷伯氏肺炎菌(特别是ST258)感染或定殖，或相关疾病，如原发性和继发性菌血症、肺炎、尿路感染、肝脓肿、腹膜炎或脑膜炎。
特别地，主体是人类，特别是免疫受损(immunocompromise)或免疫抑制患者，或其接触人。
特别地，所述抗体提供用于根据本发明的用途，其中通过用所述抗体接触所述主体的生物样品，离体测定主体中gal-III O-型的克雷伯氏肺炎菌全身性感染或定殖，其中抗体的特异性免疫反应确定感染或定殖。
特别地，生物样品是体液或组织样品，优选样品选自血样、粪便样品、皮肤样品、尿样、脑脊液和呼吸道标本，如气管内吸取物、胸膜液、肺tap、鼻拭子或痰，或来源于上述任何样品的克雷伯氏肺炎菌分离物。特别是，测试体液样品的特异性免疫反应，所述样品选自尿、血、血液分离物或血液培养物、抽出物、痰、插管主体的灌洗液和大便。
特别地，处理生物样品，产生来源于生物样品的克雷伯氏肺炎菌分离物，可以进一步鉴定所述分离物的gal-III基因型或表型，与/或gal-III抗原表达水平。优选的细菌分离物的样品制备方法采用细菌富集和培养步骤。
特别地，处理生物样品，以直接测定样品中gal-III的含量，任选在富集或纯化的准备步骤之后，以降低基质的影响，并提高试验的特异性和灵敏性。准备步骤包括按照标准培养程序培养生物标本，例如但不仅仅是，在日常微生物实验室开展标准生长培养基中的血培养以及固体琼脂上的标本培养(包括表型分型–即抗菌谱)。细菌可以传代培养，在不同生长培养基(标准培养基与/或化学定义培养基；高营养、低营养、限制生长培养基组成)中扩增CFU，以增强毒力因子的表达。可以制备细菌悬浮液，并在标准缓冲溶液中洗涤，消除潜在的基质影响。
特别地，gal-III抗原采用至少一种免疫试验测定，优选采用ELISA、CIA、RIA、IRMA、凝集试验、免疫层析法、试纸测定和蛋白质印迹分析法，或质谱法、核磁共振法(NMR)中的任一种方法测定，或采用测定指示gal-III表达的相应DNA或RNA的方法，特别是测定对gtr基因具有特异性的核酸序列的方法，优选采用核酸杂交法或核酸扩增法。
特别地，本发明的诊断用途涉及从临床标本中回收的纯克雷伯氏肺炎菌培养物，体外测定克雷伯氏肺炎菌的血清型，以测定细菌是否是gal-III O-型。
本发明进一步提供包括本发明抗体的诊断制备物(preparation)，在组合物或多组件试剂盒中包含抗体和其它诊断剂，包括以下组分：
a)抗体；及
b)其它诊断剂；
c)及任选的固相，以固定所述抗体和诊断剂中的至少一种。
诊断制备物任选在组合物或多组件试剂盒中包含本发明的抗体和其它诊断剂。
诊断试剂盒优选包含测定生物样品中gal-III表达所需的所有必要组分，任选不含普通或非特定物质或组分，如水、缓冲溶液或赋形剂。储存稳定的试剂盒优选储存至少6个月，更优选至少1年或2年。它可以由干(如冻干)组分组成，与/或包含防腐剂。
优选诊断试剂盒以包装或预包装单位提供，例如，其中各组分只包含在一个包装中，方便日常实验。此类包装可以包括一种或多种试验必须的试剂，例如，适合执行一系列生物样品试验的试剂。试剂盒可以进一步适合地包含gal-III抗原制剂作为标准或参考对照。
诊断组合物可以是在与生物样品的反应混合物中即时可用的试剂，或此类试剂的保存形式，例如，储存稳定的形式，如冻干形式；速冻(如液氮中)、超低温储存(-70℃和-80℃)、冷藏(-20℃和5℃)和受控室温(15℃-27℃)形式；作为，例如甘油储备液、组织石蜡块、(口腔内)拭子的标准样品储存和其它标准生物样品储存方法，试剂的保存形式可以通过重建或制备，得到即用型试剂。这种即用型试剂通常是水溶液形式，特别是(生理学上)缓冲液形式(如EDTA缓冲液、磷酸盐缓冲液、HBSS、柠檬酸盐缓冲液等)。
特别是，其它诊断剂是与抗体和/或抗体与其抗原结合的反应产物特异性反应的试剂。合适的诊断剂适合用于执行免疫试验，用于诊断或监测主体内的克雷伯氏肺炎菌感染或定殖。合适的诊断剂可以是溶剂、缓冲溶液、染料、抗凝血剂、与本发明的抗体和/或抗体-抗原免疫复合物特异性结合的配体。
特别是，本发明提供本发明抗体的诊断制备物，任选包含带标记的抗体与/或其它带标记的诊断剂，如特异性识别抗体或抗体与各靶抗原的免疫复合物的试剂，与/或固定抗体和诊断剂这两种中至少一种的固相。
抗体或诊断剂可以直接标记或间接标记。间接标记可以包括与抗体或gal-III抗原诊断剂形成复合物的标记结合剂。
标记通常是试验中可检测的分子或分子的一部分。示例性标记有生色团、荧光染料或放射性分子。在一些实施例中，抗体或诊断剂与可检测标记缀合，可检测标记可包括本身可以检测的分子(如荧光部分、电化学标记、金属螯合物等)以及通过产生可检测反应产物(例如酶，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)或通过本身可检测的特异性结合分子(如生物素、地高辛、麦芽糖、寡聚组氨酸、2,4-二硝基苯、苯基砷酸盐、ssDNA、dsDNA等)而可以间接检测的分子。
优选的诊断制备物或试验包括固定在固相上(例如，乳胶珠粒、金颗粒等)的本发明抗体，例如，以通过利用从待测试样品得到的gal-III型细菌抗体来测试凝集作用。
本发明进一步提供一种诊断克雷伯氏肺炎菌菌株在主体内引起的克雷伯氏肺炎菌感染或定殖的方法，包括：
a)提供一种本发明的抗体，及
b)检测所述抗体是否与待测主体生物样品中的半乳聚糖-III表位特异性免疫反应，从而诊断是否存在克雷伯氏肺炎菌感染或定殖。
此类诊断特异性指示在MDR克雷伯氏肺炎菌感染或定殖的情况中，特别是处理gal-III型MDR克雷伯氏肺炎菌。任选地，诊断试验可以包括两种不同的抗体，这两种抗体与gal-III与/或gal-I结合的特异性与/或亲和力不同，从而可能区分gal-III和gal-I抗原。
根据一个特定方面，本发明提供伴随诊断，利用本发明的诊断或诊断方法，确定主体是否感染克雷伯氏肺炎菌，特别是MDR克雷伯氏肺炎菌，提供用治疗剂治疗这种感染的依据，例如，采用免疫疗法，如采用本发明的抗体治疗。
根据一个特定方面，本发明提供一种灵敏的床边诊断，通过从例如活细菌数量有限的临床标本测定游离LPS，诊断主体是否感染克雷伯氏肺炎菌，特别是MDR克雷伯氏肺炎菌。这种试验的灵敏度特别是100ng LPS以下，优选10ng LPS以下。
本发明进一步提供一种编码本发明任何抗体的分离核酸。
本发明进一步提供一种包括编码序列的表达盒或质粒，用于表达包括本发明抗体VH与/或VL的蛋白质。
本发明进一步提供一种包含本发明表达盒或质粒的宿主细胞。
本发明进一步提供一种产生本发明抗体的方法，其中将本发明的宿主细胞在产生所述抗体的条件下培养或维持。
特别优选的是宿主细胞和采用这样的宿主细胞的产生方法，所述宿主细胞包含：
-本发明的质粒或表达盒，其包含表达所述抗体轻链的编码序列；及
-本发明的质粒或表达盒，其包含表达所述抗体重链的编码序列。
根据本发明的另一个方面，本发明提供一种产生本发明抗体的方法，包括：
a)采用克雷伯氏肺炎菌的gal-III抗原免疫接种非人类动物并分离产生抗体的B-细胞；
b)从分离的B-细胞形成永生化细胞系；
c)筛选细胞系，鉴定产生单克隆抗体的细胞系，所述单克隆抗体特异性结合gal-III抗原及任选gal-I抗原；例如其中确定了相对gal-I，优先与gal-III结合；及
d)产生所述单克隆抗体，或该抗体的人源化或人形式，或其与所述单克隆抗体具有相同表位结合特异性的衍生物。
本发明进一步提供一种鉴定候选抗体的方法，包括：
a)提供包含抗体或抗体产生细胞的样品；及
b)评价样品中的抗体或样品产生的抗体与半乳聚糖-III表位的结合，其中抗体和表位之间的阳性反应将该抗体鉴定为候选抗体。
本发明进一步提供一种鉴定候选抗体的方法，包括：
a)提供包含抗体或抗体产生细胞的样品；及
b)评价样品中的抗体或样品产生的抗体与半乳聚糖-III表位的结合，其中相对半乳聚糖-I表位，抗体和半乳聚糖-III表位之间的特异性阳性反应将该抗体鉴定为候选抗体。
本发明进一步提供一种产生本发明抗体的方法，包括：
a)提供根据本发明鉴定的候选抗体；及
b)产生单克隆抗体，或该候选抗体的人源化或人形式，或其与候选抗体具有相同表位结合特异性的衍生物。
附图说明
图1.表1：名称为8E3-E5、9H9-H7、5A4-A7和2D8-A10的抗体的CDR序列(Kabat命名法)。
图1采用的命名应具有下述含义：
VH CDR1＝CDR1
VH CDR2＝CDR2
VH CDR3＝CDR3
VL CDR4＝CDR4＝VL CDR1
VL CDR5＝CDR5＝VL CDR2
VL CDR6＝CDR6＝VL CDR3
图2.以下抗体的VH和VL序列：
·嵌合抗体(含有小鼠可变区)8E3-E5、9H9-H7、5A4-A7和2D8-A10，包括表1的CDR序列及构架序列。
·人源化抗体G3-43、G3-46、G3-77、G3-78、G3-97
G3-43VH：(包括5A4-A7VH的CDR序列)
G3-43VL：(包括5A4-A7VL的CDR序列)
G3-46VH：(包括5A4-A7VH的CDR序列)
G3-46VL：(包括5A4-A7VL的CDR序列)
G3-77VH：(包括9H9-H7VH的CDR序列)
G3-77VL：(包括5A4-A7VL的CDR序列)
G3-78VH：(包括9H9-H7VH的CDR序列)
G3-78VL：(包括5A4-A7VL的CDR序列)
G3-97VH：(包括2D8-A10VH的CDR序列)
G3-97VL：(包括5A4-A7VL的CDR序列)
VH的FR序列：FR1(位于CDR1的N-端)、FR2(位于CDR1和CDR2之间)、FR3(位于CDR2和CDR3之间)及FR4(位于CDR3的C-端)。
VL的FR序列：FR1(位于CDR4的N-端)、FR2(位于CDR4和CDR5之间)、FR3(位于CDR5和CDR6之间)及FR4(位于CDR6的C-端)。
图3.克雷伯氏肺炎菌O1、O2ab和O2ac O-抗原侧链的示意结构和糖组成。根据本发明，在所有情况下，半乳聚糖-I亚基可以被半乳聚糖-III亚基代替。
图4.经测序的克雷伯氏肺炎菌菌株中rfb(wb)操纵子的长度(A)和编码半乳聚糖-I的不同rfb(wb)基因座的遗传组织的示意比较(B)。黑色表示的基因代表Clarke等人(3)描述的那些基因。空箭头代表gtr-样基因，而两个rfb(wb)变体之间的灰色箭头代表非保守假定糖苷转移酶基因。
图5.修饰的半乳聚糖-I(此处称为半乳聚糖-III)重复单元的结构(5)。
图6.检测O1、O2和O2ac的rfb(wb)操纵子中gtr-样基因的PCR反应结果。～2kb大小的扩增子证实没有gtr-样基因，但是，～5kb的扩增子表明wbbO和hisl之间存在gtr-样基因。
图7.mAb 9H9-H7识别D-半乳聚糖III分子的免疫印迹。
图8.采用从一组等基因的菌株(an isogenic panel of strains)纯化的LPS的免疫印迹证实了gtr基因存在时mAb的反应性。
图9.所测人源化mAb的VH和VL组成。人源化mAb的CDR区来源于所示嵌合亲代。所示CDR区接枝到人构架序列内。采用流式细胞术测定表达gal-III的克雷伯氏肺炎菌的表面染色，证实了人源化mAb保持了结合特点(最后一列)。
图10.在菌血症GaIN敏化小鼠模型中针对后续活的克雷伯氏肺炎菌的致命攻击，嵌合(面板A)或人源化(面板B)半乳聚糖-III特异性mAb(剂量分别是1或2μg/小鼠)引起的保护。该图表明了两个独立实验的综合结果，每组5只小鼠。
图11.1μg/ml浓度人源化gal-III特异性mAb的内毒素中和效力。参见文本中的详细说明。
图12.选定的人源化和亲代嵌合gal-III特异性mAb显示的内毒素中和效力的剂量滴定。采用多粘菌素B作为中和标准。
具体实施方式
本发明中使用的词语“抗体”指的是由抗体域组成或包括抗体域的多肽或蛋白质，抗体域理解为具有或不具有连接序列的免疫球蛋白的重链与/或轻链的恒定域与/或可变域。如果多肽包含β-桶状结构，所述β-桶状结构由环序列连接的至少两条抗体域结构的β-链(β-strand)组成，则多肽理解为抗体域。抗体域可以是天然结构或经突变或衍生修饰，例如，以修饰抗原的结合性质或其它任何性质，如稳定性或功能性，例如，与Fc受体FcRn与/或Fcγ受体的结合。
此处使用的抗体具有与一个或多个抗原或这些抗原的一个或多个表位结合的特异性结合位点，特别是包括单一可变抗体域(如VH、VL或VHH)的CDR结合位点，或可变抗体域对的结合位点，如VL/VH对，包含VL/VH域对和恒定抗体域的抗体，如Fab、F(ab')、(Fab)2、scFv、Fv或全长抗体。
本发明所述“抗体”特别指的是包含单一可变抗体域或由单一可变抗体域组成的抗体形式，如VH、VL或VHH，或可变与/或恒定抗体域的组合，带或不带连接序列或铰链区，包括可变抗体域对，如VL/VH对，包含VL/VH域对和恒定抗体域或由VL/VH域对和恒定抗体域组成的抗体，如重链抗体、Fab、F(ab')、(Fab)2、scFv、Fd、Fv或全长抗体，例如IgG型(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体。词语“全长抗体”可用于指任何包含至少大部分Fc域及天然抗体单体中通常发现的其它域的任何抗体分子。本发明使用此术语强调具体的抗体分子并非抗体片段。
词语“抗体”应特别包括分离形式的抗体，其基本上不含针对不同靶抗原的其它抗体，或包含抗体域的不同结构安排。但是，分离抗体可能包含在组合制备物中，所述组合制备物含分离抗体，例如，与至少一种其它抗体如具有不同特异性的单克隆抗体或抗体片段的组合。
词语“抗体”应适用于包括人类的动物来源(如哺乳动物，包括人类、鼠科动物、兔子、山羊、羊驼(lama)、牛和马，或鸟类，如母鸡)的抗体，这一词语应特别包括基于动物来源序列如人序列的重组抗体。
词语“抗体”进一步适用于具有不同物种来源序列(如鼠科动物和人类来源的序列)的嵌合抗体。
谈到抗体时使用的词语“嵌合”指的是重链和轻链的每个氨基酸序列的一部分与源自特定物种的抗体或属于特定类别的抗体中的对应序列同源，而链的其余片段与另一物种或类别的对应序列同源。一般说来，轻链和重链的可变区模拟源自一种哺乳动物的抗体可变区，而恒定部分与源自另一种动物的抗体序列同源。例如，可变区利用容易获得的B-细胞或来自非人类宿主有机体的杂交瘤，从目前已知的源获得，与恒定区组合，恒定区源自，例如，人类细胞制备物。
词语“抗体”进一步适用于人源化抗体。
谈及抗体时的词语“人源化”指的是具有抗原结合位点的分子，其基本上源自非人类物种的免疫球蛋白，其中所述分子的其余免疫球蛋白结构是基于人类免疫球蛋白的结构与/或序列。抗原结合位点可以包括融合到恒定域上的完整可变域或仅仅是接枝到可变域合适构架区的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型或修饰型，例如，被一个或多个氨基酸替换修饰，优选经修饰后更接近人类免疫球蛋白。人源化抗体的某些形式保留了所有CDR序列(例如，人源化小鼠抗体包含了来自小鼠抗体的全部六个CDR)。其它形式相对原抗体有一个或多个CDR被更改。
词语“抗体”进一步适用于人抗体。
谈及抗体时使用的词语“人”理解为包括源自人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体包括，例如，CDR中不采用人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，体外随机或定点诱导引入的突变或体内体细胞突变引入的突变)。人抗体包括从人免疫球蛋白文库中分离的抗体或包括从转基因用于一个或多个人免疫球蛋白的动物分离的抗体。
词语“抗体”特别适用于任何类别或子类别的抗体。根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体可以分为抗体IgA、IgD、IgE、IgG和IgM主类，这些主类中的几个类别可以进一步分为几个子类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
该词语进一步适用于单克隆或多克隆抗体，特别是重组抗体，重组抗体包括通过重组手段制备、表达、创造或分离的所有抗体和抗体结构，例如，源自动物的抗体，如哺乳动物，包括人类，包括来自不同来源的基因或序列，例如，鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或杂交瘤衍生抗体。进一步的实例涉及从经转化用于表达该抗体的宿主细胞分离的抗体，或从抗体或抗体域的重组、组合文库分离的抗体，或通过任何其它将抗体基因序列拼接到其它DNA序列上的方法制备、表达、创造或分离的抗体。
词语“抗体”还应理解为指的是抗体的衍生物，尤其是功能活性衍生物。抗体衍生物理解为一个或多个抗体域或抗体的任何组合与/或融合蛋白，其中抗体的任何域可在一种或多种其它蛋白(如其它抗体)的任何位置融合，如包含CDR环、受体多肽，还有配体、支架蛋白、酶、毒素等的结合结构。可采用各种化学方法，如共价偶联、静电相互作用、二硫键连接等将抗体与其它物质缔合或结合而得到抗体的衍生物。与抗体结合的其它物质可以是脂质、糖类、核酸、有机和无机分子或它们的任何组合(例如PEG、药物前体或药物)。在具体实施例中，抗体是衍生物，包含与生物学上可接受的化合物特异性相互作用的额外标签。本发明可以使用的标签并没有特别的限制，只要其对抗体与其靶标的结合没有任何不良影响或不良影响可以忍受即可。合适的标签实例包括His-标签、Myc-标签、FLAG-标签、Strep-标签、钙调蛋白-标签、GST-标签、MBP-标签和S-标签。在本发明的另一个具体实施例中，抗体是包含标记的衍生物。词语“标记”指的是可以检测的化合物或组合物，其与抗体直接或间接缀合，从而产生“标记的”抗体。标记可以是本身可以检测的标记，例如，放射性同位素标记或荧光标记，或者，在酶标记时，标记可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学变化。
本发明所描述的优选衍生物在抗原结合方面是功能活性的，优选具有抗克雷伯氏肺炎菌的效力，例如，正如SBA、OPK或LAL试验中测定的那样，或者防御细菌攻击或中和内毒素血症。
特别是，源自本发明抗体的抗体可以包括至少一个或多个CDR区或其功能活性的CDR变体，其与gal-III抗原区别性结合，例如，与gal-III抗原特异性或选择性结合。
源自亲代抗体或抗体序列的抗体，例如亲代CDR或FR序列，在本发明中尤其理解为例如，通过计算机模拟(in silico)或重组工程或化学衍化或合成得到的突变体或变体。
应该理解的是，词语“抗体”还指的是抗体的变体，包括具有亲代CDR序列的功能活性CDR变体的抗体，及亲代抗体的功能活性变体抗体。
特别地，源自本发明抗体的抗体可以包括至少一个或多个CDR区或其CDR变体，例如，重链可变区的至少3个CDR与/或轻链可变区的至少3个CDR，其在CDR或FR区中的至少一个区，或在HC或LC的恒定区中有至少一个点突变，所述抗体是功能活性的，例如，与gal-III抗原特异性结合。
词语“变体”应尤其指的是抗体，如突变抗体或抗体片段，例如，通过突变方法获得，特别是例如，在恒定域中删除、交换氨基酸序列、插入氨基酸序列到特定抗体氨基酸序列或区中或化学衍生氨基酸序列，以改造抗体稳定性、效应子功能或半衰期，或在可变域中发生，以改善抗原结合性质，例如采用本领域熟悉的亲和力成熟技术。可以采用本领域知道的任何突变方法，包括期望位置的点突变，例如，采用随机化技术获得。在某些情况下，随机选择位置，例如，采用任何可能的氨基酸或选择优选的氨基酸来随机化抗体序列。词语“突变”指的是本技术领域认可的改变多核苷酸或多肽序列的任何方法。优选的突变类型包括易错PCR突变、饱和突变或其它定点突变。
词语“变体”应特别包括功能活性变体。
本发明谈到CDR序列时使用的词语“功能活性变体”理解为“功能活性CDR变体”，谈到抗体时使用的词语“功能活性变体”理解为“功能活性抗体变体”。功能活性变体指的是通过插入、删除或替换一个或多个氨基酸，或化学衍化氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基，或核苷酸序列内的一个或多个核苷酸，或在序列的任一个或两个远端，例如，CDR序列中，N-端与/或C-端的1、2、3或4个氨基酸，与/或中心1、2、3或4个氨基酸(即在CDR序列中间)，对序列(亲代抗体或亲代序列)进行修饰，且这种修饰并不会影响(特别是不会损害)该序列的活性，而得到的序列。在结合位点对选定靶标抗原具有特异性的情况下，抗体的功能活性变体将仍然具有预定的结合特异性，虽然这可以改变，例如，改变与特定表位的精细特异性、亲和力、亲合力、Kon或Koff率等。例如，亲和力成熟抗体特别理解为功能活性变体抗体。因此，亲和力成熟抗体中的修饰CDR序列理解为功能活性CDR变体。
特别地，本发明抗体的功能活性变体具有结合gal-III抗原的效力及相对于克雷伯氏肺炎菌其它抗原优先结合gal-III抗原的特异性或选择性，例如，与克雷伯氏肺炎菌的gal-III抗原结合而不与gal-I抗原结合，或者不显著与gal-I抗原结合，与/或不与克雷伯氏肺炎菌的其它抗原结合。
功能活性变体可以通过以下方法得到：例如通过改变亲代抗体的序列得到，例如，抗体包含的结合位点与表1和图2所列任一抗体相同，但除结合位点之外，抗体区内还有修饰，或抗体源自这样的亲代抗体，结合位点有修饰，但不损害抗原结合，并且生物活性优选与亲代抗体具有基本上相同，或甚至有改善的活性，包括特异性或选择性结合gal-III抗原的能力，例如，与克雷伯氏肺炎菌的gal-III抗原结合而不与gal-I抗原结合，或者不与gal-I抗原显著结合，与/或不与克雷伯氏肺炎菌的其它抗原结合。任选地，所述功能活性变体可以进一步包括中和效力与/或在SBA试验中的补体介导杀菌效力，与/或任选进一步包括OPK试验中的抗体介导噬菌作用的效力，与/或任选进一步包括LAL试验中的内毒性中和功能，例如，具有基本上相同的生物活性，如采用靶向(MDR)克雷伯氏肺炎菌的特异性结合试验或功能试验所确定的。
此处所用的词语“基本上相同的生物活性”指的是基本相同的活性表示的活性是比较抗体或亲代抗体测定活性的至少20％，至少50％，至少75％，至少90％，例如，至少100％，或至少125％，或至少150％，或至少175％，或者例如高达200％，甚至更高的活性。
本发明所描述的优选变体或衍生物在抗原结合方面具有功能活性，优选具有与克雷伯氏肺炎菌gal-III抗原结合而不与其它抗原结合的效力，例如，与克雷伯氏肺炎菌的gal-III抗原结合而不与gal-I抗原结合，或者不与gal-I抗原显著结合，或者相对gal-I，优先与gal-III抗原结合，或与目前针对gal-I菌株建立的多克隆分型血清相比，与gal-III结合的亲和力较高。优选的变体不与克雷伯氏肺炎菌的其它抗原结合，Kd值相差至少2个log，优选相差至少3个log，及任选进一步包括SBA试验的补体介导杀菌效力，例如，与不含抗体的对照样相比，显著降低细菌数，与/或任选进一步包括OPK试验的抗体介导噬菌作用效力，如，与不含抗体的对照样相比，显著降低细菌数，与/或任选进一步包括LAL或TLR4信号试验的内毒素中和功能，如与不含抗体的对照样相比，显著降低内毒性活性，例如，具有基本上相同的生物活性，如采用靶向克雷伯氏肺炎菌的特异性结合试验或功能测试确定的。各种试验中活性显著降低通常指的是降低至少50％，优选至少60％、70％、80％、90％、95％或98％至完全降低大约100％(+/-1％)。
在优选的实施例中，亲代抗体的功能活性变体是：
a)抗体的生物活性片段，所述片段包括分子序列的至少50％，优选至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，或至少95％，及最优选至少97％、98％或99％；
b)源自抗体，其中至少一个氨基酸替换、加入与/或删除，其中功能活性变体与该分子或分子的一部分具有序列一致性，如抗体的序列一致性为至少50％，优选至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，及最优选至少97％、98％或99％；与/或
c)由抗体或其功能活性变体及额外的至少一个与多肽或核苷酸序列同源的氨基酸或核苷酸组成。
在本发明一个优选的实施例中，本发明抗体的功能活性变体基本上与上面描述的变体相同，但是，其多肽或核苷酸序列分别不同，不同之处在于其源自不同物种(species)的同源序列。这些都称为天然变体或类似物。
词语“功能活性变体”还包括天然等位基因变体，以及突变体或任何其它非天然变体。正如本技术领域熟悉的那样，等位基因变体是一种(多)肽替代形式，其特征在于替换、删除或加入一个或多个氨基酸，基本上不改变多肽的生物学功能。
功能活性变体可通过多肽或核苷酸序列中的序列改变得到，例如，通过一个或多个点突变，其中当与本发明一起使用时，所述序列改变保留或改善了未改变多肽或核苷酸序列的功能。此种序列改变包括但不限于(保守)替换、加入、删除、突变和插入。
特定的功能活性变体是CDR变体。CDR变体包括CDR区中被至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列，其中所述修饰可以是氨基酸序列的化学或部分改变，所述修饰使变体保留未修饰序列的生物学特性。CDR氨基酸序列的部分改变可以是删除或替换一个至几个氨基酸，例如，1、2、3、4或5个氨基酸，或加入或插入一个至几个氨基酸，例如1、2、3、4或5个氨基酸，或化学衍生一个至几个氨基酸，例如，1、2、3、4或5个氨基酸，或它们的组合。氨基酸残基的替换可以是保守替换，例如，以另一个疏水氨基酸替换一个疏水氨基酸。
保守替换是在其侧链和化学性质相关的氨基酸家族内发生的替换。这些家族的实例有带碱性侧链的氨基酸、带酸性侧链的氨基酸、带非极性脂肪族侧链的氨基酸、带非极性芳香侧链的氨基酸、带不带电极性侧链的氨基酸、带小侧链的氨基酸及带大侧链的氨基酸等。
点突变尤其理解为多核苷酸的改造，导致与非改造氨基酸序列不同的氨基酸序列的表达，不同之处在于将一个或多个单(非连续)或双氨基酸替换或交换、删除或插入成不同的氨基酸。
优选的点突变指的是相同极性与/或电荷的氨基酸的交换。在这方面，氨基酸指的是六十四个三联体密码子编码的20种天然氨基酸。这20种氨基酸可以分成带中性电荷、正电荷和负电荷的氨基酸：
下面给出了“中性”氨基酸及其各自的三字母和单字母的代码和极性：
丙氨酸：(Ala，A)非极性，中性；
天冬酰胺：(Asn，N)极性，中性；
半胱氨酸：(Cys，C)非极性，中性；
谷氨酰胺：(Gln，Q)极性，中性；
甘氨酸：(Gly，G)非极性，中性；
异亮氨酸：(Ile，I)非极性，中性；
亮氨酸：(Leu，L)非极性，中性；
蛋氨酸：(Met，M)非极性，中性；
苯丙氨酸：(Phe，F)非极性，中性；
脯氨酸：(Pro，P)非极性，中性；
丝氨酸：(Ser，S)极性，中性；
苏氨酸：(Thr，T)极性，中性；
色氨酸：(Trp，W)非极性，中性；
酪氨酸：(Tyr，Y)极性，中性；
缬氨酸：(Val，V)非极性，中性；及
组氨酸：(His，H)极性，带正电荷(10％)，中性(90％)。
带“正”电荷的氨基酸有：
精氨酸：(Arg，R)极性，带正电荷；及
赖氨酸：(Lys，K)极性，带正电荷。
带“负”电荷的氨基酸有：
天冬氨酸：(Asp，D)极性，带负电荷；及
谷氨酸：(Glu，E)极性，带负电荷。
谈及抗体序列和同源物时所称“氨基酸序列一致性的百分数(％)”定义为为了得到最大的序列一致性百分数，在比对序列和引入缺口(如果需要)后，候选序列中与特定多肽序列中氨基酸残基一致的氨基酸残基百分数，任何保守替换并不视为序列一致性的一部分。熟悉本领域的技术人员能够确定衡量比对的合适参数，包括待比较序列全长实现最大比对所需的任何算法。
抗体变体特别理解为包括同源物、类似物、片段、具有特定糖基化模式(例如，通过糖工程产生的)的修饰或变体，它们具有功能性及可以作为功能等同物，例如，与特定靶标结合和具有功能性质。
本发明的抗体可以具有或不具有Fc效应子功能。虽然作用模式主要通过中和抗体调节，不带Fc效应子功能，但是，Fc可以募集补体，通过形成免疫复合物，帮助从循环内消除靶抗原(如毒素)。
特异性抗体可以没有活性Fc部分，因此，由不含抗体Fc部分或不包含Fcγ受体结合位点的抗体域组成，或包括没有Fc效应子功能的抗体域，例如，通过修饰，减少Fc效应子功能，特别是，消除或降低ADCC与/或CDC活性。可以制造替代抗体，以掺入修饰，增加Fc效应子功能，尤其是增强ADCC与/或CDC活性。
这种修饰可能受突变，例如，Fcγ受体结合位点中的突变的影响，或受衍生物或试剂的影响，从而干扰抗体形式的ADCC与/或CDC活性，以减少或增加Fc效应子功能。
Fc效应子功能显著降低通常理解为指的是以ADCC与/或CDC活性衡量的Fc效应子功能低于未修饰(野生型)形式的10％，优选低于5％。Fc效应子功能显著增加通常理解为指的是以ADCC与/或CDC活性衡量的Fc效应子功能的增加是未修饰(野生型)形式的至少10％，优选至少20％、30％、40％或50％。
谈及抗体序列时使用的词语“糖基化改造”变体指的是因糖基化改造而具有修饰的免疫原性或免疫调节(例如，抗炎)特性、ADCC与/或CDC的糖基化变体。所有抗体在重链恒定区的保守位置含有糖类结构，每个同种型具有N-连接糖类结构的不同排列，可变地影响蛋白质的组装、分泌或功能活性。IgG1型抗体是每个CH2域中Asn297处具有保守的N-连接糖基化位点的糖蛋白。与Asn297连接的两个复合双天线(bi-antennary)寡糖隐蔽在CH2域之间，与多肽骨架形成广泛的接触，它们的存在对抗体介导效应子功能，例如，抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)是必不可少的。脱除N297处的N-聚糖，例如通过使N297突变，例如，突变到A，或突变T299，通常得到ADCC下降的无糖基化抗体形式。特别是，本发明的抗体可以是糖基化或糖基化改造或无糖基化抗体。
抗体糖基化的主要差别发生在细胞系之间，甚至给定细胞系在不同培养条件下也会出现小的差别。菌细胞的表达通常提供无糖基化抗体。据报道，具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII)(催化平分型GlcNAc形成的糖基转移酶)的四环素调控表达的CHO细胞具有改善的ADCC活性(Umana et al.,1999,Nature Biotech.17:176-180)。除宿主细胞选择之外，影响抗体重组产生期间糖基化的因素包括生长模式、培养基配方、培养密度、氧合作用、pH、纯化方案等。
词语“抗原结合位点”或“结合位点”指的是抗体参与抗原结合的部分。抗原结合位点由重链(“H”)与/或轻链(“L”)N-端可变(“V”)区或其可变域的氨基酸残基形成。重链和轻链V区内三个高度分散的延伸(称为“高变区”)插较更保守的侧翼伸展(称为构架区)之间。抗原结合位点提供与被结合的表位或抗原的三维表面互补的表面，高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。CDR中掺入的结合位点在本发明中亦称为“CDR结合位点”。
本发明使用的词语“抗原”可与词语“靶标”或“靶抗原”互换，指的是抗体结合位点识别的整个靶分子或所述靶分子的片段。特别是，抗原的子结构，例如，多肽或糖类结构，通常称为“表位”，例如，B-细胞表位或T-细胞表位，这些表位与免疫有关，可由所述结合位点识别。gal-III抗原或gal-I抗原等特定抗原是糖类结构，可能以分离抗原提供，任选在人造载体上提供，或者是以表达抗原的克雷伯氏肺炎菌细胞或其细胞碎片的形式提供。
本发明使用的词语“表位”应特别指的是完全构成抗体结合位点的特异性结合伴侣或特异性结合伴侣一部分的分子结构。表位可由糖类、肽结构、脂肪酸、有机物质、生化物质或无机物质或它们的衍生物和它们的任何组合组成。如果表位包括在肽结构，如肽、多肽或蛋白质中，则其通常包括至少3个氨基酸，优选5至40个氨基酸，更优选大约10-20个氨基酸。表位可以是线性表位或构象表位。线性表位由多肽或糖链一级序列的单片段组成。线性表位可以是连续的或重叠的。
构象表位由将多肽重叠形成三级结构而集合在一起的氨基酸或糖类组成，并且在线性序列中，氨基酸不一定彼此相邻。特别是，关于多肽抗原，构象或非连续表位的特征在于存在两个或多个在一级序列中被分开的离散氨基酸残基，但是，当多肽折叠成天然蛋白质/抗原时，它们在分子表面上组装形成一致的结构。
此处词语“表位”应尤其指的是抗体识别的单一表位，或被至少两个不同抗原共享且任选被交叉反应性抗体识别的交叉反应性表位。
词语“表达”应按下述方式理解。含需要的表达产物(如本发明所述抗体)的编码序列和控制序列(如可操作连接的启动子)的核酸分子可用于表达目的。这些序列转化或转染的宿主能够产生编码蛋白质。为了引起转化，表达系统可以包括在载体中；但是，相关DNA也可以整合到宿主染色体内。特别是，该词语指的是合适条件下的宿主细胞和相容的载体，例如，通过载体携带且引入到宿主细胞内的外来DNA，表达编码的蛋白质。
编码DNA是一种DNA序列，对特定多肽或蛋白质(如抗体)的特定氨基酸序列进行编码。启动子DNA是引发、调节或介导或控制编码DNA表达的DNA序列。启动子DNA和编码DNA可以来自同一基因或不同基因，可以来自同一有机体或不同有机体。重组克隆载体通常包括一种或多种用于克隆或表达的复制系统、一种或多种用于在宿主中选择的标记(例如，抗生素抗性)，及一种或多种表达盒。
此处使用的词语“载体”定义为合适的宿主有机体中克隆重组核苷酸序列转录，即重组基因转录及其mRNA翻译所需的DNA序列。
“表达盒”指的是可规定限制位点处插入到载体内的对表达产物进行编码的DNA编码序列或DNA片段。表达盒限制位点设计用于确保表达盒插在合适的阅读框内。通常，外来DNA在载体DNA的一个或多个限制位点处插入，然后，随同传播载体DNA一起由载体携带进入到宿主细胞内。具有插入的或增加的DNA的DNA片段或序列，如表达载体，也可以称为“DNA构建体”。
表达载体包括表达盒和额外通常包括宿主细胞中自主复制的起始点或基因组整合位点、一个或多个可选择的标记(例如，氨基酸合成基因或抗生素抗性基因，如博来霉素(zeocin)、卡那霉素、G418或潮霉素)、多个限制性酶切位点、合适的启动子序列及转录终止子，这些组件可以可操作地连接在一起。此处使用的词语“载体”包括自主复制的核苷酸序列以及基因组整合核苷酸序列。载体的常见类型是“质粒”，质粒通常是双链DNA的自包含分子，容易接受额外(外来)DNA和容易被引入到合适的宿主细胞内。质粒载体通常包含编码DNA和启动子DNA，并具有一个或多个适合外来DNA插入的限制位点。特别是，词语“载体”或“质粒”指的是一种媒介体，DNA或RNA序列(例如，外来基因)通过该媒介体可以被引入到宿主细胞内，从而转化宿主并促进引入序列的表达(例如，转录和翻译)。
此处使用的词语“宿主细胞”应指的是经转化产生特定重组蛋白质(如本发明所述的抗体)的原代主体细胞，及其任何子代。应该理解的是，并非所有子代都与亲代细胞完全相同(由于有意或无意的突变或环境差异)，但是，只要子代保留了与原转化细胞相同的功能性，这些词语即包括这些改变的子代。词语“宿主细胞系”指的是用于表达重组基因，产生重组多肽(如重组抗体)的宿主细胞细胞系。此处使用的词语“细胞系”指的是已经获得了长期增殖能力的特定细胞类型的已建立的克隆。这种宿主细胞或宿主细胞系可以在细胞培养中维持与/或经培养以产生重组多肽。
此处谈到核酸、抗体或其它化合物时使用的词语“分离的”或“分离”应指的是此种化合物已经与其自然相关的环境充分分离，从而以“基本上纯”的形式存在。“分离的”并不一定排除与其它化合物或材料的人工或合成混合物，或不干扰基本活性的杂质的存在，及例如，因不完全纯化而可能存在的杂质。特别是，本发明的分离核酸分子还包括非天然存在的那些核酸，例如，密码子优化的核酸或cDNA，或化学合成的核酸。
同样，本发明的分离抗体特别是非天然存在的抗体，例如，抗体是在与另一种抗体或活性剂的组合制备物中提供，所述组合并非天然存在的，或者是天然存在抗体的优化或亲和力成熟变体，或者抗体具有经工程改造的构架区从而改善抗体的可制造性。通过这样的优化或工程改造，所述抗体包括一个或多个合成序列或特点，这些是天然抗体没有的。
谈及本发明的核酸时，有时采用词语“分离核酸”。应用于DNA时，该词语指的是与其起源的有机体的天然基因组紧邻的序列分开的DNA分子。例如，“分离核酸”包括插入到载体(如质粒或病毒载体)内的DNA分子，或整合到原核或真核细胞或宿主有机体基因组DNA内的DNA分子。当应用于RNA时，词语“分离核酸”主要指的是由上文定义的分离DNA分子编码的RNA分子。或者，该词语指的是在其自然状态(即在细胞中或组织中)下与其缔合的其它核酸充分分离的RNA分子。“分离核酸”(DNA或RNA)可进一步指的是采用生物或合成手段直接产生并与其产生期间存在的其它组分分开的分子。
谈到多肽或蛋白质，如本发明的分离抗体或表位时，词语“分离”特别指的是化合物不含或基本不含其自然相关的材料，如在其自然环境中，或其制备环境(如细胞培养)中发现的其它化合物，所述制备是采用重组DNA技术在体外或体内进行。分离化合物可以采用稀释剂或佐剂配制，但对于实际目的来说仍然是分离的–例如，当用于诊断或治疗时，多肽或多核苷酸可以与药学上可接受的载体或赋形剂混合。特别是，本发明的分离抗体与针对克雷伯氏肺炎菌菌株建立的多克隆血清制备物不同，因为本发明的分离抗体是以分离、纯化的形式提供，优选以包含分离抗体作为唯一活性物质的制备物提供。但是，这并不排除以包括有限数量其它明确定义的(分离)抗体的组合产品形式提供分离抗体。分离抗体也可以在固体、半液体或液体载体(如珠粒)上提供。
此处使用的词语“中和”或“中和作用”指的是广义，指的是抑制病原体的任何分子，如抑制克雷伯氏肺炎菌感染主体，或抑制病原体通过产生内毒素促进感染，或抑制内毒素发挥其生物活性，而不管实现中和的机制是什么。例如，可以通过抗体抑制宿主粘膜表面克雷伯氏肺炎菌定殖、侵入无菌体内部位和诱发不良生物信号(最糟的情况是诱发脓毒性休克)来实现中和。
从严格意义上来说，中和指的是抑制特异性LPS与其同源受体(例如，与Toll-样受体-4复合物)结合，从而诱发生物活性。这种中和效力一般采用标准试验测定，例如，采用体外或体内中和试验，例如LAL试验，或TLR-4试验测定，在这些试验中，例如采用比色法，测定内毒性生物活性的抑制情况。
抵抗或中和克雷伯氏肺炎菌的抗体干扰病原体和病原反应，从而能够限制或预防感染与/或改善这种感染引起的疾病状况，或者抑制克雷伯氏肺炎菌发病，尤其是抑制克雷伯氏肺炎菌散播和复制到宿主的无菌体腔内/身体部位或抑制其在宿主的无菌体腔内/身体部位内的散播和复制。在这方面，中和抗体还理解为“保护性抗体”，指的是对主动或被动免疫中观察到的感染剂引发免疫的抗体。特别是，本发明所描述的中和或保护性抗体可用于治疗目的，例如，用于预防或治疗，从而预防、改善、治疗或至少部分抑制病原体诱导的疾病症状、副作用或进展。特别是，保护性抗体能够在治疗应用后(即，施用在已有感染上)，通过，例如，诱导血清杀菌或调理吞噬活动杀灭或阻止活克雷伯氏肺炎菌细胞的复制，或从无菌的体内位点清除全部菌细胞或其LPS分子。或者，预防施用的保护性抗体通过上面提到的其中一种机制或其它机制，阻止感染的发生(即克雷伯氏肺炎菌从非无菌位点扩散到无菌体腔)。
此处使用的词语“生物样品”应指的是取自主体(如人类)的任何材料，是包含或可能包含克雷伯氏肺炎菌的生物材料。生物样品可以是组织、液体或细胞培养样品。本发明使用的样品实例包括但不限于患者样品，如组织或体液，特别是呼吸道标本，如气管内吸取物、胸膜液、肺部tap、鼻拭子或痰，血样、粪便样品、皮肤样品、尿样或脑脊液。
生物样品通常包括复杂的生物基质，如包含多类生物有机小分子的复合粘稠生物液体，如富含蛋白物质的粘液渗出物。可以采用合适的添加剂或萃取程序降低与样品中基质结合的非特异性结合与/或通过溶解与/或分解样品基质中的粘稠或固体组分而降低基质粘度。可以采用从有机体释放出标志物与/或降解与/或液化生物基质的样品制备方法。可以分析的生物基质包括含粘液的样品，如鼻分泌物、痰(sputum)、痰液(phlegm)、咽部分泌物、尿道或阴道分泌物及这些膜表面的洗涤物。
合适的样品制备方法包括降低生物基质对试验的影响的方法步骤。所述方法步骤可以包括但不限于，例如，捕获、层析、旋转-离心和透析。
取自主体的材料还可以是细菌分离物的形式，如用于培养分离的克雷伯氏肺炎菌的细胞培养物或细胞培养产品的形式。培养基可以具有选择性，仅富集克雷伯氏肺炎菌菌群，或不具有选择性。
细菌分离物制备通常涉及一个孵育步骤，以将样品保持在增强克雷伯氏肺炎菌增殖的条件下，从而富集样品中的克雷伯氏肺炎菌群。
一旦得到分离物，可以采用生物化学与/或血清学试验，进一步对细菌进行研究，例如，以确定O型和gal-III表达水平。研究克雷伯氏肺炎菌菌株的分型方法有几种。这些方法通常包括血清分型、遗传关系/系统发育标准分型，包括多位点序列分型(MLST)或脉冲场凝胶电泳(PFGE)。
在本发明中，词语“半乳聚糖-III”亦称为“gal-III”，应指的是包括半乳糖聚合物的克雷伯氏肺炎菌LPS O-抗原的糖类结构及包括至少一个式(I)重复单元的结构。这样的重复单元包括支链半乳糖聚合物，参见图5。所述结构与gal-I抗原类似，但是有区别。Gal-III在此处理解为一种新的血清型决定子，与特征在于存在gal-I抗原且不存在gal-III结构的O2a血清型类似，但是有区别。
此处包含gal-III结构的各O-抗原被称为“gal-III抗原”，包括本发明gal-III特异性抗体识别的“gal-III表位”。gal-III抗原理解为gal-III O-型克雷伯氏肺炎菌LPS的外面部分，是其中包括一个或多个特异性gal-III表位的表面可接近抗原糖类结构。
gal-III O-型克雷伯氏肺炎菌的基因型的特征在于gtr基因补充的rfbgal-I基因座(图4B)，即由额外的gtr基因延长的rfb位点，负责表达与gal-I型线性的那些不同的支链三-半乳糖重复单元。
在本发明中，特征在于包括至少一种gal-III结构的LPS O-抗原的任何克雷伯氏肺炎菌被称为gal-III O-型克雷伯氏肺炎菌。gal-III O-型克雷伯氏肺炎菌的LPS可以只包括gal-III结构，或包括gal-III和gal-I两种结构。
在本发明中，词语“半乳聚糖-I”亦称为“gal-I”，应指的是包括半乳糖聚合物的克雷伯氏肺炎菌LPS O-抗原的糖类结构及包括至少一个式(II)重复单元但不包括式(I)重复单元的结构。这样的重复单元包括线性半乳糖聚合物。Gal-I是不包括任何gal-III抗原的O2a血清型的特点。
此处包含gal-I结构的各O-抗原被称为“gal-I抗原”，包括本发明gal-I特异性抗体识别的“gal-I表位”。gal-I O-型克雷伯氏肺炎菌基因型的特征在于不包含gtr基因的rfbgal-I基因座，负责表达与gal-lII型支链的那些不同的线性三-半乳糖重复单元。
gal-I抗原理解为gal-I O-型克雷伯氏肺炎菌LPS的外面部分，是其中包括一个或多个特异性gal-I表位但不包括任何gal-III结构的表面可接近抗原糖类结构。
此处使用的“特异性”结合、识别或靶向，指的是结合物，例如，抗体或其抗原结合部分，对异质分子群体中的靶抗原或各表位表现出明显的(appreciable)亲和力。因此，在指定条件下(例如，免疫试验)，结合物与靶标gal-III抗原特异性结合，并且不以显著量与样品中存在的其它分子结合。特异性结合指的是就靶标本身而言，结合是选择性的，根据选择，具有高、中或低的结合亲和力或亲合力。如果与另一个靶标相比，结合常数或结合动力学相差至少10倍(理解为相差至少1log)，优选相差至少100倍(理解为至少相差2log)，更优选相差至少1000倍(理解为相差至少3log)，通常实现选择性结合。
词语“特异性”还理解为适用于与一个或多个分子结合的结合物，如交叉特异性结合物。优选的交叉特异性(亦称为多特异性或交叉反应性)结合物靶向至少两种不同的靶标或所述靶标的表位或核苷酸序列或靶向至少两种不同靶标上的交叉反应性表位或核苷酸序列，以基本上类似的结合亲和力与靶标特异性结合，例如，亲和力相差小于100-倍或甚至小于10-倍，或者，以基本上不同的结合亲和力与靶标特异性结合，例如，相差至少10倍或至少100倍。交叉特异性结合物识别两种靶标，第一(例如gal-III)和第二(例如gal-I)靶标，相对第二靶标，优先与第一靶标结合，通常其特征在于，相对第二靶标，与第一靶标结合的亲和力相同或更高，特别是，其中相对第二抗原优先与第一抗原结合的差别结合亲和力特别是至少相等，或不相等，例如，相差至少1.5倍，或至少2倍，或至少3倍，或至少4倍，或至少5倍，或至少6倍，或至少7倍，或至少8倍，或至少9倍，或至少10倍。这种差别结合可通过免疫试验测定，优选采用免疫印迹法、ELISA或其它免疫学方法测定。
本发明的优选抗体以高亲和力与gal-III抗原结合(只与gal-III结合，或相对gal-I抗原，优先与gal-III结合)，特别是具有高结合速率与/或低解离速率，或较高结合亲合力。抗体的结合亲和力通常以抗体的浓度表征，即一半抗原结合位点被占据时的抗体浓度被称为解离常数(Kd或KD)。通常，Kd<10-7M的结合物被视为高亲和力结合物，在一些情况下，例如，以较高亲和力用于治疗目的，例如，Kd<10-8M，优选Kd<10-9M，甚至更优选Kd<10- 10M。
然而，在特别优选的实施例中，单个抗原的结合亲和力是中等亲和力，例如，当与至少两个抗原结合时，Kd小于10-6M且不超过10-8M。
本发明可以提供中等亲和力的结合物，优选同时提供亲和力成熟过程，如果需要。
亲和力成熟是抗体针对靶抗原的亲和力增加的过程。根据此处公开的本发明各种实施例，为了产生亲和力成熟的抗体，可以采用本领域的任何一种或多种制备方法与/或利用亲和力成熟文库。示例性的亲和力成熟方法和用途，如随机突变、细菌增变株传代、定点突变、突变热点靶向、限定性突变、抗体替换(shuffling)、轻链替换、重链替换、CDR1与/或CDR1突变，及可用于实施此处公开的本发明各种实施例的方法和用途的产生和利用亲和力成熟文库的方法，包括，例如，Prassler等(2009)；Immunotherapy,Vol.1(4),pp.571-583；Sheedy等(2007)，Biotechnol.Adv.,Vol.25(4),pp.333-352；WO2012/009568；WO2009/036379；WO2010/105256；US2002/0177170；WO2003/074679公开的方法。
随着抗体结构的变化，包括氨基酸突变发生或作为免疫球蛋白基因片段体细胞突变的结果，产生和选择较大亲和力的抗原结合位点变体。亲和力成熟抗体的亲和力比亲代抗体大几个log。单个亲代抗体可以经历亲和力成熟。或者，与靶抗原具有类似结合亲和力的抗体库可以视为亲代结构，这些亲代结构经过变化得到亲和力成熟的单个抗体或亲和力成熟的抗体库。
本发明优选的亲和力成熟的抗体变体，其结合亲和力至少增加2倍，优选至少增加5倍，优选至少增加10倍，优选至少增加50倍，或优选至少增加100倍。在采用各亲代分子文库的筛选活动中，可以采用具有中等亲和力的抗体，通过亲和力成熟，得到本发明具有特异性靶标结合性质、结合亲和力Kd<10-8M的抗体。或者，可以通过本发明抗体的亲和力成熟，甚至进一步提高亲和力，得到亲和力高的抗体，对应的Kd小于10-9M，优选小于10-10M，或甚至小于10-11M，最优选处于皮摩尔范围。
在某些实施例中，结合亲和力通过亲和力ELISA试验测定。在一些实施例中，结合亲和力通过BIAcore、ForteBio或MSD试验测定。在一些实施例中，结合亲和力通过动力学方法测定。在一些实施例中，结合亲和力通过平衡/溶液法测定。
词语“具有相同的特异性”、“具有相同的结合位点”或“结合相同的表位”指的是相当的单克隆抗体表现出相同的或基本相同的，即类似的免疫反应(结合)特点，与预先选择的靶结合序列竞争结合。抗体分子对特定靶标的相对特异性可以通过竞争试验相对测定，例如，Harlow,et al.,ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988)所描述的试验。
此处谈及抗体时使用的词语“竞争”指的是第一抗体或其抗原结合部分与表位结合的方式与第二抗体或其抗原结合部分与表位结合的方式足够类似，从而与不存在第二抗体时第一抗体与其同源表位的结合相比，第二抗体存在时第一抗体与其同源表位的结合减少，这种减少是可以检测的。或者，其中在第一抗体存在时，第二抗体与其表位的结合也减少，这种减少是可以检测的，可以是这样，但是，并不要求一定如此。也就是说，第一抗体可以抑制第二抗体与其表位的结合，而第二抗体并不抑制第一抗体与其相应表位的结合。但是，若每个抗体可检测地抑制其它抗体与其同源表位的结合，不管其程度是相同、更大或更少，都称抗体彼此“竞争”与其相应表位结合。本发明尤其包括那些与任何示例性抗体竞争结合gal-III抗原的抗体。
此处的竞争指的是采用竞争性ELISA分析或ForteBio分析测定的相对抑制大于大约30％。在特定的环境中，例如，在竞争分析用于选择或筛选设计具有想要的抗原结合功能的新抗体时，设定较高的相对抑制阈值作为合适竞争水平的标准是符合要求的。因此，例如，可以设定竞争性结合的标准，其中检测到至少40％相对抑制，或至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或甚至至少100％时，抗体被视为充分竞争。
此处使用的词语“诊断试剂盒”指的是一套或一组组件，各组件组合或混合可用于开展一种或多种分析物或标志物的测定/检测，以确定疾病或疾病状况，或预测疾病或疾病进展。特别是，试剂盒包含至少一种检测分子与/或结合物，其中检测分子与/或结合物特异性识别分析物或标志物，或所述分析物或标志物的反应产物。此外，试剂盒中可以包括各种不同的试剂或工具。诊断试剂盒可能包括对开展主题方法有用的试剂，包括基质，如微珠或平面阵列或孔、生物标记物分离试剂、针对特定靶标的检测分子、试剂如用于核酸测序或放大的引物、核酸杂交阵列、可检测标记、溶剂或缓冲溶液等，各种接头、各种试验组分、封闭剂等。
试剂盒还可以包括诊断方法说明书。所述说明书可以，例如，提供在试剂盒内包含的器械上，例如，准备诊断用生物样品(如在测定标志物之前分离含细胞与/或蛋白质的部分)的工具或器械上。试剂盒可以方便地以储存稳定的形式提供，如保存期限至少6个月的商业试剂盒。
特定的诊断试剂盒还包括固体载体，所述固体载体包括检测分子，或具有针对目标标志物的检测分子的固定的图形化(patterned)阵列，优选包括第一区及第二区，所述第一区包含针对第一标志物的第一结合试剂，所述第二区包含针对第二标志物的第二结合试剂。
特别是，可以采用夹心形式。例如，一种或多种结合物在与生物样品接触之前先与底物缀合。一种或多种结合物可以与可检测标记缀合，以充当检测分子。在其它实施例中，一种或多种结合物与可检测标记缀合。在此情况中，一种或多种结合物在与生物样品接触之前，可与底物缀合，充当捕获剂。此外，一种或多种结合物在与生物样品接触之前，可与底物缀合，与/或一种或多种结合物与可检测标记缀合。在此种情况下，一种或多种结合物可充当捕获剂或检测剂或充当两者。
诊断试剂盒特别提供用于免疫试验，其中检测分子是通过免疫反应与分析物或标志物结合的特异性结合物。这样的结合物可以是与靶抗原结合的抗体或抗体片段或类抗体支架。
合适的免疫试验是ELISA、CIA、RIA、IRMA、凝集试验、免疫层析法、快速试纸法和蛋白质印迹分析法中的任一种。
词语“克雷伯氏肺炎菌感染”和“克雷伯氏肺炎菌定殖”按下述方式理解：克雷伯氏肺炎菌是一种革兰氏阴性菌，是肠杆菌家族的一员。它是一种普遍存在的细菌，还可以在人类宿主体内定殖，通常是在肠内或上呼吸道内定殖。它是一种条件致病菌，若免疫系统不能适当控制的话，它可以从这些部位侵入到无菌的体内部位中。该细菌在这些无菌部位不受控制的复制将引发炎症，在很大程度上，炎症是通过克雷伯氏肺炎菌释放的内毒素(即LPS)分子介导的。在菌血症的情况下，内毒素分子可能引发脓毒性休克。
克雷伯氏肺炎菌定殖指的是主体在可检测部位的克雷伯氏肺炎菌的浓度足够高，但细菌并未引发体征或症状。定殖可以持续较长时间，其消退受有机体免疫应答、此部位其它有机体的竞争，及有时候抗菌剂使用的影响。
一般说来，克雷伯氏肺炎菌引发的菌血症可以采用已知的传统抗菌治疗法成功治疗，例如，采用抗生素、甾体和非甾体炎症抑制剂治疗。本发明提供一种采用特异性识别克雷伯氏肺炎菌的抗体的新免疫治疗法，任选与抗菌或消炎治疗法相结合。用于治疗克雷伯氏肺炎菌感染患者的示例性抗生素有氨基糖苷类抗生素、头孢菌素、氨基青霉素、碳青霉烯类抗生素、氟喹诺酮类抗生素、替加环素(tygecycline)、粘菌素等。
耐多药(MDR)克雷伯氏肺炎菌尤其理解为那些对三类或更多类抗生素，例如下述试剂/组表现出耐药性的菌株：盘尼西林、头孢菌素、碳青霉烯、氨基糖苷、四环素、氟喹诺酮、硝基呋喃妥英、三甲氧苄二氨嘧啶(及其组合)、磷霉素、多粘菌素、氯霉素、氨曲南或替加环素。
随着最新出现的耐抗生素菌株，治疗这种性质菌血症的难度明显加大。与无克雷伯氏肺炎菌疾病的患者相比，患MDR克雷伯氏肺炎菌疾病的患者呆在医院和ICU的时间更长，死亡率高，且保健费用更高。当患者出现MDR克雷伯氏肺炎菌严重定殖时，通过预防而非治疗，开展克雷伯氏肺炎菌疾病预防，可以改善患者护理和降低医院感染。
克雷伯氏肺炎菌疾病特别理解为克雷伯氏肺炎菌感染引发的疾病。此类疾病包括局部性和全身性疾病。严重的疾病是，例如，原发性和继发性菌血症、肺炎、尿路感染、肝脓肿、腹膜炎或脑膜炎。
此处使用的词语“重组”应指的是“基因工程制备的或基因工程导致的”。重组宿主特别包括表达载体或克隆载体，或其已经通过基因工程而包含重组核酸序列，尤其是采用对于宿主来说是外来的核苷酸序列。重组蛋白通过在宿主中表达相应重组核酸而产生。此处使用的词语“重组抗体”包括采用重组手段制备、表达、创造或分离的抗体，如(a)从转基因或转染色体用于人免疫球蛋白基因的动物(如小鼠)或从其制备的杂交瘤分离的抗体，(b)从经转化而表达抗体的宿主细胞分离的抗体，如从转染瘤分离的抗体，(c)从重组、组合人抗体文库或抗体的抗原结合序列文库分离的抗体，及(d)采用涉及剪接人免疫球蛋白基因序列到其它DNA序列的任何其它手段制备、表达、创造或分离的抗体。这样的重组抗体包括经改造以包含抗体成熟期间发生的重排和突变的抗体。根据本发明，可能采用本领域内的传统分子生物学、微生物学，及重组DNA技术。这些技术在文献中进行了全面的解释。参见，例如，Maniatis,Fritsch&Sambrook,"Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor,(1982)。
采用本领域已知的重组抗体优化方法，可以进一步改善选择性结合。例如，此处所述免疫球蛋白链可变区的某些区域可以采用一种或多种优化策略，包括轻链替换、目标突变、CDR合并及选定CDR与/或构架区的定向突变。
此处使用的词语“主体”应指的是温血哺乳动物，特别是人类或非人类动物。克雷伯氏肺炎菌是非常重要的人类病原体，在兽医学中也引起了人们的关注。它在范围广泛的非人类动物物种中存在。因此，词语“主体”还特别指的是包括狗、猫、兔子、马、牛、猪和家禽的动物。特别是，本发明的医学用途或各种治疗方法适用于需要预防或治疗与克雷伯氏肺炎菌感染有关的疾病状况的主体。所述主体可以是存在克雷伯氏肺炎菌感染风险的患者或患有此类疾病包括早期或晚期疾病的患者。词语“患者”包括接受预防或治疗处理的人类和其它哺乳动物主体。因此，词语“处理”包括预防和治疗处理。
对主体例如进行处理，以预防或治疗克雷伯氏肺炎菌疾病。特别是，对处于感染风险或正发展出此类疾病或疾病复发的主体，或患有此类感染与/或与此类感染有关疾病的主体进行处理。
特别是，词语“预防”指的是包括防止发病的防止措施或降低发病风险的预防措施。
特别是，所述处理可以通过干扰作为该状况致病因子的克雷伯氏肺炎菌的发病机理实现的。
本文所使用的词语“基本上纯”或“纯化”应指的是包含至少50％(w/w)，优选至少60％、70％、80％、90％或95％化合物(如核酸分子或抗体)的制备物。纯度采用适合所述化合物的方法测定(例如，色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、HPLC分析等)。
本发明谈到化合物例如本发明的抗体时使用的词语“治疗有效量”与词语“有效量”或“足够量”可以互换，它们是施用于主体时足够产生有益结果或要求结果(包括临床结果)的量或活性，因此，有效量或其同义词取决于其应用的背境。
有效量指的是足以治疗、防止或抑制这样的疾病或紊乱的化合物的量。在疾病语境中，此处所描述的抗体的治疗有效量特别用于治疗、调节、减弱、逆转或影响疾病或状况，从抑制克雷伯氏肺炎菌发病机理(例如，粘附和定殖在粘膜表面，在无菌体部位内不受控的复制，及细菌产物对宿主细胞的毒性)中受益。
与这样的有效量对应的化合物的量将根据各种因素而变化，如给定的药物或化合物、药物配方、给药途径、疾病或状况类型、接受治疗的主体或宿主身份等，但是，这些都是本领域的技术人员可以常规确定的。
此处所描述抗体的治疗有效量，如提供给需要治疗的人类患者的有效量，可以特别是0.5-50mg/kg，优选是5-40mg/kg，甚至更优选是不超过20mg/kg，不超过10mg/kg，不超过5mg/kg，尽管例如治疗急性疾病状况时，可能需要较高的剂量。如果采用高效力抗体，剂量可以大幅降低。在这种情况下，有效量可以是0.005-5mg/kg，优选0.05-1mg/kg。
此外，采用治疗有效量的本发明抗体治疗或预防主体的方案可由单次给药组成或包含一系列给药。例如，抗体的给予可以至少每年一次，至少半年一次或至少一个月一次。但是，在另一个实施例中，对于给定治疗，对主体给予抗体从大约每周一次至大约每天一次。治疗期长短取决于各种因素，例如，疾病的严重程度，是急性还是慢性疾病，患者的年龄、抗体形式的浓度和活性。还应该理解的是，在特定治疗或预防方案期间，用于治疗或预防的有效剂量可以增加或减少。采用本领域已知的标准诊断试验，剂量的变化可导致和变得显而易见。在某些情况下，可能需要慢性给药。
对gal-III具有高度特异性的单克隆抗体(mAb)有巨大的潜力作为鉴定MDR克雷伯氏肺炎菌，特别是属于ST258谱系的MDR菌株的诊断试剂。此外，特别是在人源化以后，这些mAb适合用于预防(例如，用于高风险群体)和治疗ST258-gal-III菌株引发的克雷伯氏肺炎菌感染。
人们曾经认为，gal-III和gal-I糖类结构非常类似，并且不是不同的抗原。MDR克雷伯氏肺炎菌-ST258菌株O-抗原合成的遗传背景尚未完全解释清楚。与rfb(wb)簇相邻的特定基因(编码糖基转移酶，gtr)构成gal-III O-型菌株的基于PCR的鉴定的基础，这一点让人吃惊。
有证据表明编码O-抗原因子半乳聚糖-I的rfb基因簇内存在异质性。变体之间观察到的大小区别源于存在或不存在携带gtr(糖基转移酶)-样基因的～3-kb片段。建立了PCR反应来区分这些变体，结果表明，全部O1和O2克雷伯氏菌临床分离株中50％以上及所有ST258菌株的80％以上携带gtr-样位点。
本发明的抗体能够与gal-III抗原特异性结合是非常让人吃惊的。结果表明，采用gtr+O2菌株给小鼠免疫，诱发抗半乳聚糖抗体，所述抗体仅识别被gtr位点(即半乳聚糖-III抗原)修饰的半乳聚糖-I分子。虽然这种修饰的性质被鉴定为具有与血清型O2(2a、2f、2g)的重复单元相同的之前描述的支链半乳聚糖结构，但是，并没有发现这些结构在抗原上有什么不同。本发明第一次提供对标准杂交瘤技术产生的半乳聚糖-III具有特异性的mAb。观察了这种mAb与活O2gtr+克雷伯氏菌分离株(包括ST258菌株)表面结合的能力。让人吃惊的是，半乳聚糖-III特异性mAb对菌血症和内毒素血症鼠类模型表现出保护功效。保护作用的假定模型是内毒素的中和，这一点通过体外功能实验得到了证实。
为了开发防止和治疗MDR克雷伯氏菌株引发的感染的治疗性单克隆抗体，合适的特异性mAb分子靶标是LPS O-抗原，所述抗原在克雷伯氏菌中表现出有限的异质性。由于未被体积大的荚膜多糖完全遮蔽，因此，这样的O-侧链被视为免疫相关。
一旦鉴定出具有要求的结合性质的抗体，可以采用本领域熟悉的方法，包括，例如，杂交瘤技术或重组DNA技术产生这样的抗体，包括抗体片段。
例如，可以采用熟知的重组表达载体，例如，包括编码抗体序列的核苷酸序列的本发明的质粒或表达盒，通过分离编码要求的抗体链的DNA和利用用于表达的编码序列转染重组宿主细胞，可产生重组单克隆抗体。重组宿主细胞可以是原核细胞和真核细胞，如前文所描述的那些细胞。
根据一个特定方面，核苷酸序列可用于基因操作，以对抗体进行人源化或改善抗体的亲和力，或抗体的其它特点。例如，恒定区可以经改造以使其与人类恒定区更类似，从而如果抗体在临床试验中使用和治疗人类时，可以避免免疫应答。基因操作抗体序列，以获得对gal-III靶标的较大亲和力及抗克雷伯氏肺炎菌特别是MDR克隆ST258的较大功效，是符合要求的。显然，对于本领域的技术人员来说，可以对抗体进行一种或多种多核苷酸改变，却仍然保持其对靶标gal-III抗原的结合能力。
采用各种方法产生抗体分子通常是人们熟悉的。例如，美国专利6331415(Cabillyet al.)描述了一种重组产生抗体的方法，其中重链和轻链从单一载体或从单一细胞中两个独立的载体同时表达。Wibbenmeyer et al.,(1999,Biochim Biophys Acta 1430(2):191-202)和Lee and Kwak(2003,J.Biotechnology 101:189-198)描述了采用在独立的宿主细胞培养物中表达的质粒，从独立产生的重链和轻链产生单克隆抗体。与抗体产生有关的其它各种方法在，例如，Harlow,et al.,ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1988)中提供。
如果要求的话，可对本发明的抗体，例如，图1或图2的任一个抗体进行测序，然后，多核苷酸序列可以克隆到用于表达或传播的载体中。编码抗体的序列可以保持在宿主细胞中的载体内，然后，宿主细胞可以扩大和冷冻供将来之用。细胞培养中重组单克隆抗体的产生可以采用本领域熟悉的方法通过B细胞抗体基因克隆进行。
另一方面，本发明提供一种分离核酸，所述分离核酸包括编码用于产生本发明重组抗体的序列。
编码抗体的核酸可以具有任何合适的特性和包括任何合适的特征或其组合。因此，例如，编码抗体的核酸可以是DNA、RNA或它们的混合物的形式，可以包括非天然碱基、修饰骨架，例如，促进核酸稳定性的硫代磷酸酯骨架，或它们两者。核酸有利地可掺入到本发明的表达盒、载体或质粒内，所述表达盒、载体或质粒包含促进靶宿主细胞中所需表达、复制与/或选择的特征。这样的特征的实例包括复制起始点组件、选择基因组件、启动子组件、增强子元件组件、聚腺苷酸化序列组件、终止组件等，其中许多合适的实例是人们熟悉的。
本发明进一步提供包含本发明所描述一种或多种核苷酸序列的重组DNA构建体。这些重组构建体与载体(例如，质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体)一起使用，在载体内插入编码任何所公开的抗体的DNA分子。
可以使用通过培养细胞系产生抗体分子的任何方法，例如，培养重组真核(哺乳动物或昆虫)或原核(细菌)宿主细胞，产生单克隆抗体。制备单克隆抗体的合适方法的实例包括Kohler et al.(1975,Nature 256:495-497)描述的杂交瘤方法和人B-细胞杂交瘤方法(Kozbor,1984,J.Immunol.133:3001；和Brodeur et al.,1987Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications,(Marcel Dekker,Inc.,New York)，pp.51-63)。
本发明的抗体可以采用杂交瘤方法鉴定或获得。在这种方法中，小鼠或其它合适的宿主动物，如仓鼠，经免疫诱发淋巴细胞，产生或能够产生与免疫用蛋白质特异性结合的抗体。或者，淋巴细胞可以体外免疫。然后，采用合适的融合剂(如聚乙二醇)，将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
对杂交瘤在其中生长的培养基进行试验，测试抗该抗原的单克隆抗体的产生。优选通过免疫沉淀法或通过体外结合试验如放射免疫法(RIA)或酶联免疫吸附剂法(ELISA)对杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性进行测定。
然后，mAb可以从杂交瘤上清液提纯，进一步测试其对gal-III抗原的特异性结合，及可能的其相对gal-I抗原优先结合gal-III抗原的结合亲和力差异，和抗体的改造，例如，用于不同诊断或治疗用途。
在某些情况下，gal-III特异性抗体通过针对单一gal-III抗原进行筛选而得到。为了增加分离差异结合克隆的可能性，人们会通过对不同的抗原开展逐步筛选而施加多重选择压力。特殊的mAb选择策略以交替的方式采用gal-III组分和gal-I组分或其它克雷伯氏肺炎菌抗原。
鉴定具有要求的选择性结合性质的抗体的筛选方法可以采用展示抗体序列或其抗原结合序列的文库(例如使用噬菌体、细菌、酵母或哺乳动物细胞；或将核酸信息翻译为各(多)肽的体外展示系统)，通过展示技术实现。反应性可以根据ELISA、蛋白质印迹法或流式细胞术表面染色法，例如，采用标准试验进行评价。
例如，分离的抗原可用于从抗体文库，例如，酵母展示的抗体文库选择抗体。
例如，本发明特别提供gal-III特异性抗体，所述抗体通过鉴定具有与gal-III抗原结合特异性的抗体的过程得到，例如，通过特异性发现选择方案得到。因此，根据与靶标的反应性，可选择包含与gal-III靶标具有反应性的抗体的抗体文库。
此外，本发明提供药物组合物，其包含本发明所描述的抗体及药学上可接受的载体或赋形剂。这些药物组合物可以按照本发明以推注或输注或持续输注的方式给药。适合辅助这种给药手段的药物载体是本领域熟悉的。
药学上可接受的载体通常包括与本发明提供的抗体或相关组合物或组合生理上相容的任何和所有合适的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的其它实例包括无菌水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它们的任何组合。
一方面，抗体可与适合要求的给药途径的一种或多种载体组合，抗体可以，例如，与以下的任一种混合：乳糖、蔗糖、淀粉、链烷酸的纤维素酯、硬脂酸、滑石粉、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、阿拉伯树胶、明胶、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidine)、聚乙烯醇和任选进一步片剂化或胶囊化用于传统给药。或者，抗体可以溶于盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、羧基甲基纤维素胶体溶液、乙醇、玉米油、花生油、棉籽油、麻油、黄蓍胶与/或各种缓冲溶液。其它载体、佐剂和给药方式是药学领域熟知的。载体可以仅包括控释材料或时间延迟材料(如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯)或与蜡，或本领域熟悉的其它材料一起使用。
其它药学上可接受的载体是本领域熟悉的，在例如，REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES中进行了描述。液体制剂(formulation)可以是溶液、乳液或悬浮液，可以包括赋形剂，如悬浮剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂和螯合剂。
本发明还提供药物组合物，其中配制有本发明的抗体及一种或多种治疗活性剂。将具有要求纯度的所述免疫球蛋白与任选药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，制备本发明抗体的稳定制剂，以冻干制剂或水溶液的形式贮存。体内给药用的制剂特别是无菌的，优选是无菌水溶液形式。通过无菌过滤膜过滤或其它方法，很容易实现这一点。本发明公开的抗体和其它治疗活性剂还可以配制为免疫脂质体，与/或装在微胶囊中。
包含本发明抗体的药物组合物的给药可以采用各种方式，包括口服、皮下、静脉、鼻内、耳内(intraotically)、经皮、粘膜、局部给药，例如，凝胶、药膏、洗液、乳膏等，腹膜内、肌肉内、肺内给药，例如，采用可吸入技术或肺部递送系统，阴道、肠胃外、直肠或眼内给药。
肠胃外给药所用示例性制剂包括适合皮下、肌肉内或静脉注射的那些，例如，无菌溶液、乳液或悬浮液。
在一个实施例中，本发明的抗体是给主体施用的唯一的治疗活性剂，例如，作为疾病改善或防止的单一疗法。
在另一个实施例中，本发明的抗体在混杂物中与其它抗体组合，例如，组合在各组分的混合物或试剂盒中，以靶向克雷伯氏肺炎菌，特别是属于ST258系的MDR菌株，从而该混杂物包含不止一种向主体施用的治疗活性剂，例如，作为疾病改善或防止的联合疗法。
此外，本发明的抗体可与一种或多种其它治疗或预防剂组合给药，包括但不限于标准处理，例如，抗生素、炎症的甾体和非甾体抑制剂，与/或其它基于抗体的疗法，如采用抗菌剂或消炎剂。
组合疗法特别地采用标准方案，例如，用于治疗克雷伯氏肺炎菌特别是MDR克隆ST258感染。这可能包括抗生素，例如，替加环素、粘菌素、多粘菌素B和β内酰胺类抗生素与非β-内酰胺类抑制剂组合。
在组合疗法中，抗体以混合物的形式施用，或与一种或多种其它治疗方案同时施用，例如，在同时治疗之前、同时或之后施用。
本发明抗体或各药物制备物的生物学特性可以在活体外以细胞、组织和整个有机体实验进行表征。正如本领域熟悉的那样，为了测量药物治疗疾病或疾病模型的效力，或测量药物的药代动力学、药效动力学、毒性和其它特性，通常在动物体内对药物进行测试，这些动物包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、狗、猫、猪和猴子。动物可称为疾病模型。治疗剂通常在小鼠中测试，包括但不限于裸鼠、SCID小鼠、异种移植小鼠和转基因小鼠(包括敲入和敲除)。这种实验可以提供确定抗体作为治疗或预防潜力的有意义的数据，包括合适的半衰期、效应子功能、(交叉-)中和活性与/或主动或被动免疫疗法时的免疫应答。测试可采用任何有机体，优选哺乳动物。例如，由于与人类的遗传相似性，灵长类动物、猴子可以是合适的治疗模型，因此，可用于测试主题试剂或组合物的功效、毒性、药代动力学、药效动力学、半衰期或其它特性。作为药物要获得批准，最终需要在人体内进行测试，因此，当然需要设计这些实验。因此，本发明的抗体和各药物组合物可以在人体内测试，以确定其治疗功效或预防功效、毒性、免疫原性、药代动力学与/或其它临床特性。
下述定义的主题视为本发明的实施例：
1.一种特异性识别克雷伯氏肺炎菌脂多糖(LPS)O-抗原结构的半乳聚糖-III表位的分离抗体，所述表位包括在半乳聚糖-III重复单元内，其中所述半乳聚糖-III重复单元是式(I)的支链半乳糖均聚物。
Figure BDA0001373016120000401
2.根据定义1所述的抗体，相对半乳聚糖-I表位，所述抗体优先与半乳聚糖-III表位结合，或不与半乳聚糖-I表位交叉反应，其中半乳聚糖-I表位包括在克雷伯氏肺炎菌LPSO2a-抗原结构的半乳聚糖-I重复单元中，以及其中半乳聚糖-I重复单元是式(II)的线性半乳糖均聚物
[→3)-β-D-Galf-(1→3)-α-D-Galp-(1→] 式(II)。
3.根据定义1或2所述的抗体，其中所述半乳聚糖-III表位是耐多药(MDR)克雷伯氏肺炎菌的表位，特别是MDR克隆ST258的表位。
4.根据定义1至3任一项所述的抗体，所述抗体与半乳聚糖-III表位结合的亲和力Kd小于10-7M，优选小于10-8M，甚至更优选小于10-9M。
5.根据定义1至4任一项所述的抗体，所述抗体中和表达半乳聚糖-III表位的克雷伯氏肺炎菌菌株的内毒素。
6.根据定义1至5任一项所述的抗体，所述抗体中和表达半乳聚糖-III表位的克雷伯氏肺炎菌菌株的内毒素，其中中和效力至少与参考抗体的效力相同，所述抗体包含：
a)由氨基酸序列SEQ ID 10组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 11组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 12组成的CDR3；和
d)由氨基酸序列SEQ ID 19组成的CDR4；和
e)由氨基酸序列SEQ ID 17组成的CDR5；和
f)由氨基酸序列SEQ ID 18组成的CDR6，
采用Kabat命名法命名。
7.根据定义5或6所述的抗体，其中所述菌株的特征在于rfbgal-I基因座包含gtr基因。
8.根据定义5至7任一项所述的抗体，所述抗体识别MDR克雷伯氏肺炎菌克隆ST258。
9.根据定义1至8任一项所述的抗体，所述抗体是全长单克隆抗体、其抗体片段或融合蛋白，所述抗体片段包含带所述结合位点的至少一个抗体域，所述融合蛋白包含带所述结合位点的至少一个抗体域，特别是，其中所述抗体是包含随机化或人工氨基酸序列的非天然抗体。
10.根据定义1至9任一项所述的抗体，所述抗体是人、人源化、嵌合或鼠源抗体。
11.根据定义1至10任一项所述的抗体，所述抗体是单克隆抗体。
12.根据定义1至11任一项所述的抗体，所述抗体包含至少一抗体重链可变区(VH)，其特征在于表1所列按照Kabat命名体系命名的CDR1至CDR3序列中的任一个序列，或其功能活性CDR变体。
13.根据定义12所述的抗体，其是
A)
选自由i)至iv)组员组成的组，其中
i)
是一种抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 1组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 2组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 3组成的CDR3；
ii)
是一种抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 4组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 5组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 6组成的CDR3；
iii)
是一种抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 7组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 8组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 9组成的CDR3；
iv)
是一种抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 10组成的CDR1；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 11组成的CDR2；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 12组成的CDR3；
或
B)一种抗体，所述抗体是A中任一组员亲代抗体的功能活性变体，其包含所述亲代抗体的CDR1、CDR2或CDR3中任一个的至少一个功能活性CDR变体。
14.根据定义12或13所述的抗体，包含选自图2所描述任一VH序列的VH氨基酸序列。
15.根据定义12至14任一项所述的抗体，所述抗体进一步包含一抗体轻链可变区(VL)，其包含表1所列按照Kabat命名体系命名的CDR4至CDR6序列中的任一个序列，或其功能活性CDR变体。
16.根据定义15所述的抗体，其是
A)
选自由i)至iv)组员组成的组，其中
i)
是一种抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 13组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 14组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 15组成的CDR6；
ii)
是一种抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 16组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 17组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 18组成的CDR6；
iii)
是一种抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 19组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 20组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 18组成的CDR6；
iv)
是一种抗体，包括：
a)由氨基酸序列SEQ ID 19组成的CDR4；和
b)由氨基酸序列SEQ ID 17组成的CDR5；和
c)由氨基酸序列SEQ ID 18组成的CDR6；
或
B)一种抗体，所述抗体是A中任一组员亲代抗体的功能活性变体，其包含亲代抗体CDR4、CDR5或CDR6中任一个的至少一个功能活性CDR变体。
17.根据定义16所述的抗体，包括选自图2所描述的任一VL序列的VL氨基酸序列。
18.根据定义12至17任一项所述的抗体，所述抗体包括
a)表1所列任何抗体的CDR1-CDR6序列；或
b)图2所描述任何抗体的VH和VL序列；或
c)以a)-c)序列为特征的亲代抗体的功能活性变体，
优选其中
i.所述功能活性变体包含亲代抗体CDR1-CDR6中任一个的至少一个功能活性CDR变体；与/或
ii.所述功能活性变体在VH和VL序列中的任一序列的构架区内包含至少一个点突变；
及进一步其中
iii.所述功能活性变体具有结合与亲代抗体相同表位的特异性；与/或
iv.所述功能活性变体是亲代抗体的人、人源化、嵌合或鼠源与/或亲和力成熟变体。
19.根据定义1至18任一项所述的抗体，包含表1所列任一CDR序列的功能活性CDR变体，其中所述功能活性CDR变体包含以下中的至少一项：
a)亲代CDR序列中有1、2或3个点突变；与/或
b)亲代CDR序列的四个C-端或四个N-端，或四个中心氨基酸位置中的任一个有1或2个点突变；与/或
c)与亲代CDR序列具有至少60％序列一致性；
优选其中所述功能活性CDR变体在由4或5个以下氨基酸组成的任何CDR序列中包含1或2个点突变。
20.根据定义1至19任一项所述的抗体，用于治疗存在克雷伯氏肺炎菌感染或定殖风险或患有克雷伯氏肺炎菌感染或定殖的主体，包括给予所述主体有效量的抗体，以限制主体的感染或减轻所述感染引起的疾病状况，优选用于治疗或预防任何原发性菌血症和继发性菌血症、肺炎、尿路感染、肝脓肿、腹膜炎或脑膜炎。
21.包含定义1至19任一项所述抗体的药物制备物，优选包含肠胃外或粘膜制剂，任选包含药学上可接受的载体或赋形剂。
22.定义1至19任一项所述抗体的用途，用于诊断主体中克雷伯氏肺炎菌感染或定殖，或相关疾病，如原发性和继发性菌血症、肺炎、尿路感染、肝脓肿、腹膜炎或脑膜炎。
23.根据定义22所述的用途，其中所述主体是免疫受损或免疫抑制患者，或其接触人。
24.定义1至19任一项所述抗体的诊断制备物，在组合物或多组件试剂盒中包含抗体和其它诊断剂，包括以下组分：
a)抗体；与
b)其它诊断剂；
c)及任选固相，以固定所述抗体和诊断剂中的至少一种。
25.根据定义24所述的诊断制备物，其中所述其它诊断剂是与所述抗体和/或抗体与其抗原结合的反应产物特异性反应的诊断标记或试剂。
26.诊断克雷伯氏肺炎菌菌株引发的主体克雷伯氏肺炎菌感染或定殖的方法，包括：
a)提供定义1至19任一项所述的抗体，及
b)检测所述抗体是否与待测主体生物样品中的半乳聚糖-III表位特异性免疫反应，从而诊断克雷伯氏肺炎菌感染或定殖。
27.根据定义26所述的方法，其中所述生物样品是体液或组织样品，优选样品选自血样、粪便样品、皮肤样品、尿样、脑脊液和呼吸道标本，如气管内吸取物、胸膜液、肺部tap、鼻拭子或痰，或来源于上述任何样品的克雷伯氏肺炎菌分离物。
28.编码定义1至19任一项所述抗体的分离核酸。
29.一种表达盒或质粒，包含编码序列以表达蛋白质构造(proteinaceousconstruct)或蛋白质，其包含定义1至19任一项所述抗体的VH与/或VL。
30.包含定义29所述表达盒或质粒的宿主细胞。
31.产生定义1至19任一项所述抗体的方法，其中在产生所述抗体的条件下培养或维持定义30所述的宿主细胞。
32.一种鉴定候选抗体的方法，包括：
a)提供包含抗体或抗体产生细胞的样品；及
b)评价样品中的抗体或样品产生的抗体与定义1定义的半乳聚糖-III表位的结合，其中抗体和表位之间呈阳性反应将抗体鉴定为候选抗体。
33.一种鉴定候选抗体的方法，包括：
a)提供包含抗体或抗体产生细胞的样品；及
b)评价样品中的抗体或样品产生的抗体与定义1定义的半乳聚糖-III表位的结合，其中相对半乳聚糖-I表位，抗体和半乳聚糖-III表位之间呈特异性阳性反应将抗体鉴定为候选抗体。
34.一种产生定义1至19任一项所述抗体的方法，包括
a)提供根据定义32或33鉴定的候选抗体；及
b)产生单克隆抗体，或候选抗体的人源化或人形式，或其与候选抗体具有相同表位结合特异性的衍生物。
本发明通过下述实例进一步说明，但并不限于这些实例。
实例
实例1：新型半乳聚糖结构的遗传背景鉴定：
由于半乳聚糖-I特异性rfb(亦称为wb)簇的原始说明(3)，已经可以得到几种全基因组序列。由于rfb簇总是在两个保守基因(uge和hisl)之间整合，因此可以确定rfb基因座的准确大小。计算机模拟分析表明了rfb操纵子的两种替代长度(图4A)。这些序列的详细分析(图4B)表明在rfb簇内存在Clarke等人(3)未鉴定的其它基因。
甚至，较短的全长rfb操纵子比Clarke等人描述的要长大约2kb，并包含标为假定糖基转移酶家族蛋白质的其它基因。该基因在长rfb操纵子和短rfb操纵子之间表现出差的同源性。鉴于缺少该基因的克隆簇恢复了半乳聚糖-I合成(5)，这种基因对半乳聚糖-I的表达似乎是可有可无的。
在rfb基因座的较长形式中，有额外的3kb区，其包含在相反的DNA链上组织在一个操纵子内的3个基因。这些基因与肠杆菌各成员中移动遗传元件通常携带的糖基转移酶家族具有高度的序列相似性。这种类型的横向获得的糖基转移酶被认为在血清型-转化(6)中起作用或增加菌株内和菌株间的表型多样性。有趣的是，在产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)中，在未与rfb簇连接的染色体位点发现了相同的gtr簇(该发现未公布)。因此，通过产酸克雷伯氏菌的横向基因转移，某些克雷伯氏肺炎菌菌株得到这种簇是可能的。
从携带较长rfb基因座(即包含gtr基因)的O2菌株提纯的O-抗原亚基的结构表明拥有与半乳聚糖-I-结构不同的支链三-半乳糖重复单元(图5)。这种结构之前被Kelly等人(5)鉴定为O2的血清亚型，称为O2(2a，2f，2g)。染色体上携带与空载体或载体内克隆的gtr基因反式互补的短操纵子的O2菌株的结构分析证明，1-4连接处支链半乳糖的增加由gtr基因编码(参见下文实例3)。
与之前公开的文献(5)相反的是，生物化学分析表明，半乳聚糖-I重复单元的这种修饰并不完全符合化学计量，虽然这些单元的绝大多数是半乳聚糖-III。但是，这种修饰的化学计量可能是菌株依赖的，并且受表达调控的影响，因此，需要进一步研究。
实例2：半乳聚糖-III的流行病学
为了检测克雷伯氏肺炎菌临床分离物中rfb簇内的gtr-样基因，设计退火到保守wbbO和hisl基因(参见图4B)的引物(下表2)。
表2：用于检测gtr+和gtr-菌株的引物
Figure BDA0001373016120000461
采用上面描述的引物，测定克雷伯氏肺炎菌的O1、O2和O2ac原型菌株是否存在gtr-样基因。按照生产商的说明，采用
Figure BDA0001373016120000462
基因组DNA提纯试剂盒(Promega)从菌株提纯基因组DNA。采用
Figure BDA0001373016120000463
High-Fidelity PCR Master Mix(Thermo)，20pmol正向引物和反向引物及0.2μl纯化gDNA的20μl混合物，建立PCR反应。采用下述程序，在TProfessionalTRIO热循环仪(Biometra)中运行PCR：
Figure BDA0001373016120000471
将反应混合物加载到1％琼脂糖凝胶上，通过GelRedTM(Biotium)可视化，并采用ImageQuantTM LAS 4000(GE Healthcare)捕捉图像(图6)。
PCR证实，在O1和O2菌株中可以检测到gtr+和gtr-分离物。为了说明临床分离物中gtr+和gtr-分离物的频率，从不同地理来源筛选45个O1和47个O2临床分离物。在O1分离物中，分离出分离的27个(60％)gtr-和18个(40％)gtr+分离物，在O2菌株中，鉴定出15个(32％)gtr-和32个(68％)gtr+菌株。
有趣的是，我们发现，属于产耐多药KPC(克雷伯氏肺炎菌碳青霉烯酶)地方性克隆ST258的大多数菌株携带编码半乳聚糖-III的操纵子(即包含gtr基因的长rfbgal-I基因座)。采用PCR对27个ST258分离物进行了分析，并采用计算机模拟对数据库中的另外224个基因组序列进行了分析。这些菌株中共有210个(83.6％)菌株携带了包含gtr基因的完整rfb操纵子(即预期表达半乳聚糖-III抗原)。但是，其余菌株中的许多菌株的基因组包含至少部分gtr基因，由于删除或转座子插入，预期不会表达完整的半乳聚糖-III。
由于最近对半乳聚糖-II合成的遗传背景进行了描述(4)，仅采用基因组序列分析就可以区分O1和O2菌株。但是，没有任何ST258分离物携带了这些O1特异性决定子。此外，可得的ST258分离物中没有一个与半乳聚糖-II特异性mAb反应，证实这些分离物是O2血清组的。
这些数据表明，克隆谱系ST258与半乳聚糖-lll O-抗原的表达强烈相关，并且显然，在大多数ST258菌株中，半乳聚糖-III是唯一的O-侧链决定子(即半乳聚糖-III抗原未被半乳聚糖-II加帽)。这一点使半乳聚糖-III成为一种很有吸引力的抗体靶标用于基于免疫的诊断与/或治疗。
实例3：产生对半乳糖-III具有特异性的单克隆抗体
采用标准杂交瘤方法，使用gtr+O2(即表达gal-III)菌株免疫的小鼠，产生鼠源单克隆mAb。选择对半乳聚糖-III抗原表现出特异性的4个mAb。为了研究这些mAb的结合是否受gtr-介导的半乳聚糖-I分子修饰的影响，采用免疫印迹法对从gtr-及gtr+O1和O2菌株提纯的一组LPS分子进行了研究。将抗体稀释到1μg/ml浓度，抗-小鼠IgG二抗按1:20,000稀释。
全部4个mAb都显示出相同的结合模式。一个代表性mAb(9H9-H7)得到的结果在图7中示出。除一个菌株(Kp67，泳道8)之外，从gtr+菌株得到的所有O-抗原都强烈染色，而没有任何gtr-LPS分子被这种mAb识别(也没有被其它3个识别)。虽然发现菌株Kp67对gtr-基因座呈PCR阳性，但是，它似乎对假定gtr-介导的修饰在表型上呈阴性。矛盾的原因最可能来源于rfb操纵子内的突变，正如银染凝胶上粗糙LPS表型表明的那样(即缺失任何可检测的O-抗原)(数据未示出)。
为了进一步证实这些mAb的特异性，在一组等基因衍生物上对免疫反应性进行了研究(图8)。正如预期的那样，从O2gtr-菌株提取的LPS未观察到结合(图8泳道2)。采用携带gtr基因的质粒补充后，检测到强烈的结合(图8中泳道5和泳道6)。
实例4：生物层干涉(BLI)测量
采用生物层干涉法(BLI)，对抗体的结合特点开展研究。将生物素化D-半乳聚糖III多糖抗原(纯化自O2gtr+克雷伯氏肺炎菌菌株)固定在链霉亲和素传感器上(ForteBio,Pall LifeSciences)，并在含1％牛血清白蛋白(BSA)和0.05％Tween-20的DPBS中对嵌合mAb(10μg/mL)与预载传感器结合的情况监测10分钟，然后在同一缓冲溶液中解离(1小时)，测定抗体的结合情况。采用Data Analysis 7软件(ForteBio,Pall Life Sciences)，确定Kd、kon和Koff。响应值低于0.05nm被视为阴性。
Kd、kon和Koff总结在表3中。所有mAb都表现出对纯化抗原具有强烈的结合性(Kd0.1nM-10nM)，kon值类似(最低和最高kon相差仅3倍)。与此相反，mAb 5A4和9H9的koff值比2D8和8E3低2个数量级。这些mAb中没有一个观察到与阴性对照抗原存在结合。
表3：嵌合D-半乳聚糖III特异性mAb的Kd、Kon和Koff值
mAb K<sub>d</sub> k<sub>on</sub> k<sub>off</sub>
2D8 1.12E-08 6.85E+04 7.66E-04
5A4 1.06E-10 9.19E+04 9.75E-06
9H9 3.40E-10 3.54E+04 1.20E-05
8E3 1.32E-08 6.29E+04 8.30E-04
实例5：活克雷伯氏菌细胞的表面染色
采用流式细胞术，在拥有不同O-型的克雷伯氏菌的几种临床分离物上，测试一种代表性mAb(9H9-H7)的表面染色情况(表4)。
将过夜培养的细菌稀释，并培养到对数中期(OD600＝0.5)，用PBS洗涤，用于表面染色。将2x106细菌重新悬浮在含0.5％BSA+0.0.1％叠氮化钠的PBS中，并在冰上采用浓度40μg/mL的mAb 9H9-H7染色30分钟。将样品在含BSA和叠氮化钠的PBS缓冲溶液中洗涤2次，重新悬浮在含4μg/mL AlexaFluor 488-缀合的山羊抗小鼠IgG二抗的PBS中，在冰上孵育30分钟。洗涤后，将样品重新悬浮在含5nM SYTO-62染料的PBS中，在冰上孵育10分钟，然后在i-Cyt Eclipse流式细胞仪上开展分析。
流式试验结果(表4)证明，根据临床gtr+和gtr-菌株得到的结果，研究的mAb对半乳聚糖-III(即gtr阳性菌株)具有特异性。
表4：具有不同gtr状态的O1和O2菌株的半乳聚糖-III特异性mAb的表面染色。数值代表荧光强度(FL-1)/1000
Figure BDA0001373016120000491
此外，采用上述流式细胞术还测定了与一批ST258菌株的结合情况(表5)。在研究的菌株中，8/11被全部四种mAb强烈染色，一个菌株被证明是粗糙型，另两个菌株表现出非分型-LPS结构(数据未示出)。这些菌株中没有任何菌株与半乳聚糖-II特异性mAb反应(参见上文)。
表5：ST258分离物的半乳聚糖-III特异性mAb的表面染色。数值代表荧光强度(FL-1)。
Figure BDA0001373016120000492
实例6：不同半乳聚糖-III特异性mAb的功效对比
产生嵌合mAb，其中小鼠可变区(重链和轻链分别是VH和VL)在基因上与人lgG1和κ恒定区融合。开展体外和体内不同功能试验之后(参见下文)，将最佳嵌合mAb人源化。通过将重链和轻链的CDR序列从小鼠构架区接枝到相应(计算机模拟预测的)人构架中，实现人源化。因此，在这些人源化mAb中，唯一的小鼠源序列是CDR区，mAb的其余部分包括人序列。
此外，人源化轻链与不同人源化重链配对(轻链替换，参见图9)。有趣的是，包括5A4衍生的人源化轻链的mAb似乎显示出明显较高的功效，表明这些特别的轻链CDR区可能有助于某些mAb的卓越功效。正如流式细胞术评价的那样，特定细菌的表面染色证明了人源化mAb的结合(图9)。
实例7：gal-III特异性mAb的体内保护功效
将每组5只小鼠腹腔注射嵌合(图10A)或人源化(图10B)半乳聚糖-III特异性mAb或作为对照的同型匹配的不相关mAb进行被动免疫。24小时后，腹腔注射20mg GaIN使小鼠对内毒素敏感，同时用致死剂量的克雷伯氏肺炎菌菌株#79攻击。每天监测死亡率。
测试的所有嵌合mAb在剂量低达1μg/小鼠(图10A)(对应剂量大约50μg/kg)时表现出明显的保护作用。mAb 5A4表现出优越的保护功效，这与其较高亲和力(实例4)及体外LPS中和效力(下面实例8)良好相关。
在同一模型中，测定就内毒素中和潜力(参见下面的实例8)而言最有效的人源化mAb。由于所有的人源化mAb都携带来源于5A4的轻链CDR，保护功效以嵌合mAb 5A4为基准。如图10B所示，大多数人源化mAb都保留了优越的保护功效。鉴于这些人源化mAb包含不同的重链CDR(但共享轻链CDR)，可以得出的结论是：轻链区明显有助于强保护功效。
实例8：体外内毒素中和试验
鉴于克雷伯氏肺炎菌O2菌株的血清敏感性高，我们已经提出，内毒素中和，而非杀菌活性，可能是以上描述的保护作用(实例7)的主要模式。为了证明半乳聚糖-III特异性mAb的这种实验上的内毒素中和效力，开展了体外研究。
按照生产商说明，采用商业报告细胞系(HEK-BlueTM TLR4,Invivogen)检测纯化LPS触发的Toll-样受体4(TLR-4)信号传导。将35μl mAb(在HEK BlueTM培养基中稀释)与25μl新鲜解冻的纯化LPS混合。源自菌株PCM-27的O2gtr+LPS(O2gtr+:K27Polish Collectionof Microbes,Poland)；在HEK BlueTM培养基中制备0.4ng/ml浓度的储备溶液。将混合物转移到透明96-孔半区板内，并在室温孵育30分钟。加入50μl HEK-BlueTM细胞悬浮液(～50000细胞/孔)。用铝箔将板包好，并在37℃在5％CO2条件下孵育过夜(16-18小时)。第二天，在630nm测量光密度，计算相对于模拟的报告蛋白水平(分泌型胚胎碱性磷酸酶–SEAP)。计算相对于无抗体对照的SEAP诱导的百分抑制率，并在不同浓度mAb处进行绘制。采用GraphPadPrism 5.0，采用log(抑制剂)vs.响应–可变斜率非线性回归分析，计算50％抑制浓度(IC50)。阳性对照采用多粘菌素B(PMB-Sulfate,FLUKA Cat.#81334)，与测试mAb类似。阴性对照采用不相关mAb。
将1μg/ml mAb剂量的人源化mAb的中和效力与其亲代(相对于重链，因为人源化轻链被替换)嵌合mAb对比(图11)。在此剂量，嵌合mAb 5A4表现出优于其它嵌合mAb的中和效力，这与BLI测定的亲和力良好相关(实例4)。有趣的是，当与5A4衍生的人源化轻链配对时，每个重链谱系的某些人源化衍生物表现出与嵌合5A4相当的良好的中和。这种观察再次表明，5A4轻链CDR序列可赋予改善的中和效力，因此，提供上面描述的体内保护(实例7)。
为了进一步支持这种发现，在同一体外中和试验中滴定每个谱系的最佳人源化mAb及其亲代嵌合mAb。如图12所描述，所有携带来源于5A4的轻链CDR的mAb，都表现出优于多粘菌素B(小分子抗生素，具有已知的内毒素结合特点)的中和效力，而其余mAb仅在较高剂量时表现出中和。
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Claims (22)

1.一种特异性识别克雷伯氏肺炎菌脂多糖LPS O-抗原结构的半乳聚糖-III表位的分离抗体，其中所述半乳聚糖-III表位包括在半乳聚糖-III重复单元内，其中所述半乳聚糖-III重复单元是式(I)的支链半乳糖均聚物
Figure FDA0003266649730000011
其中所述抗体不与半乳聚糖-I表位交叉反应，其中半乳聚糖-I表位包括在克雷伯氏肺炎菌LPS O2a-抗原结构的半乳聚糖-I重复单元中，以及其中所述半乳聚糖-I重复单元是式(II)的线性半乳糖均聚物
[→3)-β-D-Galf-(1→3)-α-D-Galp-(1→]
式(II)，
其中，所述抗体选自以下抗体所组成的组：
i)抗体，包括：
a.SEQ ID NO.:1的CDR1序列；及
b.SEQ ID NO.:2的CDR2序列；及
c.SEQ ID NO.:3的CDR3序列；及
d.SEQ ID NO.:13的CDR4序列；及
e.SEQ ID NO.:14的CDR5序列；及
f.SEQ ID NO.:15的CDR6序列；
ii)抗体，包括：
a.SEQ ID NO.:4的CDR1序列；及
b.SEQ ID NO.:5的CDR2序列；及
c.SEQ ID NO.:6的CDR3序列；及
d.SEQ ID NO.:16的CDR4序列；及
e.SEQ ID NO.:17的CDR5序列；及
f.SEQ ID NO.:18的CDR6序列；
iii)抗体，包括：
a.SEQ ID NO.:7的CDR1序列；及
b.SEQ ID NO.:8的CDR2序列；及
c.SEQ ID NO.:9的CDR3序列；及
d.SEQ ID NO.:19的CDR4序列；及
e.SEQ ID NO.:20的CDR5序列；及
f.SEQ ID NO.:18的CDR6序列；
iv)抗体，包括：
a.SEQ ID NO.:10的CDR1序列；及
b.SEQ ID NO.:11的CDR2序列；及
c.SEQ ID NO.:12的CDR3序列；及
d.SEQ ID NO.:19的CDR4序列；及
e.SEQ ID NO.:17的CDR5序列；及
f.SEQ ID NO.:18的CDR6序列；
v)抗体，包括：
a.SEQ ID NO.:4的CDR1序列；及
b.SEQ ID NO.:5的CDR2序列；及
c.SEQ ID NO.:6的CDR3序列；及
d.SEQ ID NO.:19的CDR4序列；及
e.SEQ ID NO.:20的CDR5序列；及
f.SEQ ID NO.:18的CDR6序列；
vi)抗体，包括：
a.SEQ ID NO.:10的CDR1序列；及
b.SEQ ID NO.:11的CDR2序列；及
c.SEQ ID NO.:12的CDR3序列；及
d.SEQ ID NO.:19的CDR4序列；及
e.SEQ ID NO.:20的CDR5序列；及
f.SEQ ID NO.:18的CDR6序列。
2.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体中和表达半乳聚糖-III表位的克雷伯氏肺炎菌的内毒素，并且所述抗体与半乳聚糖-III表位结合的亲和力Kd小于10-7M。
3.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体是全长单克隆抗体、其抗体片段或融合蛋白，所述抗体片段包含带结合位点的至少一个抗体区，所述融合蛋白包含带结合位点的至少一个抗体域。
4.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体包含选自VH序列SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31、33、35和37中任一个的VH氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体包含选自VL序列SEQ ID NO:22、24、26、28、30、32、34、36和38中任一个的VL氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体是以下抗体中的任一种：
a)包括VH序列SEQ ID NO:21和VL序列SEQ ID NO:22的抗体；或
b)包括VH序列SEQ ID NO:23和VL序列SEQ ID NO:24的抗体；或
c)包括VH序列SEQ ID NO:25和VL序列SEQ ID NO:26的抗体；或
d)包括VH序列SEQ ID NO:27和VL序列SEQ ID NO:28的抗体；或
e)包括VH序列SEQ ID NO:29和VL序列SEQ ID NO:30的抗体；或
f)包括VH序列SEQ ID NO:31和VL序列SEQ ID NO:32的抗体；或
g)包括VH序列SEQ ID NO:33和VL序列SEQ ID NO:34的抗体；或
h)包括VH序列SEQ ID NO:35和VL序列SEQ ID NO:36的抗体；或
i)包括VH序列SEQ ID NO:37和VL序列SEQ ID NO:38的抗体。
7.根据权利要求2所述的抗体，其中所述抗体与半乳聚糖-III表位结合的亲和力Kd小于10-8M。
8.根据权利要求2所述的抗体，其中所述抗体与半乳聚糖-III表位结合的亲和力Kd小于10-9M。
9.根据权利要求3所述的抗体，其中所述抗体是包含随机化或人工氨基酸序列的非天然抗体。
10.一种包含权利要求1至9中任一项所述抗体的药物制剂。
11.根据权利要求10所述的药物制剂，进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。
12.根据权利要求10所述的药物制剂，其中所述药物制剂是肠胃外或粘膜制剂。
13.权利要求1至9中任一项所述抗体的在制备诊断试剂中的用途，其中所述诊断试剂用于诊断主体的克雷伯氏肺炎菌感染或定殖，或选自原发性和继发性菌血症、肺炎、尿路感染、肝脓肿、腹膜炎或脑膜炎中的相关疾病。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述主体是免疫受损或免疫抑制的患者，或其接触人。
15.一种权利要求1至9中任一项所述抗体的诊断制剂，包括在组合物或多成分的试剂盒中的抗体和其它诊断剂，所述诊断制剂包含以下各组分：
a)所述抗体；与
b)其它诊断剂；
c)及任选固相，以固定所述抗体和诊断剂中的至少一种。
16.根据权利要求15所述的诊断制剂，其中所述其它诊断剂是与所述抗体和/或抗体结合其抗原的反应产物特异性反应的诊断标记或试剂。
17.一种编码权利要求1至9中任一项所述抗体的分离核酸。
18.一种表达盒或质粒，包含表达含权利要求1至9中任一项所述抗体的VH与/或VL的蛋白质的编码序列。
19.一种包含权利要求18所述表达盒或质粒的宿主细胞。
20.一种产生权利要求1至9中任一项所述抗体的方法，其中在产生所述抗体的条件下，培养或维持权利要求19所述的宿主细胞。
21.一种鉴定候选抗体的方法，包括：
a)提供包含抗体或抗体产生细胞的样品；及
b)评价样品中的抗体或样品产生的抗体与权利要求1定义的半乳聚糖-III表位的结合，其中抗体和表位之间呈阳性反应将该抗体鉴定为候选抗体。
22.一种鉴定候选抗体的方法，包括：
a)提供包含抗体或抗体产生细胞的样品；及
b)评价样品中的抗体或样品产生的抗体，与权利要求1定义的半乳聚糖-III表位的结合，其中相对半乳聚糖-I表位，抗体和半乳聚糖-III表位之间呈特异性阳性反应将该抗体鉴定为候选抗体。
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