CN107320484B - mir-452-3p在制备治疗肝癌的药物组合物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，涉及mir‑452‑3p在制备治疗肝癌的药物组合物中的用途。此外，本发明还涉及用于治疗肝癌的药物组合物、检测mir‑452‑3p的特异性扩增引物和检测mir‑452‑3p的试剂盒。本发明的mir‑452‑3p对肝癌细胞的抑制效果显著，为肝癌的治疗提供了新的途径。

Description

mir-452-3p在制备治疗肝癌的药物组合物中的用途
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及mir-452-3p在制备治疗肝癌的药物组合物中的用途。
背景技术
肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其中肝细胞性肝癌是肝癌最主要的类型，在我国占原发性肝癌的90％。肝细胞性肝癌的发病率和死亡率均很高，肝癌的高转移性是其致死率的重要原因。因而，抑制肝癌的转移、增殖和侵袭是肝癌治疗的重要途径。
miRNA是一类内源性的、不参与蛋白质编码的小RNA分子，其长度大约有18-25个核苷酸。miRNA前体，经酶切割为成熟miRNA。后者与相关蛋白一起组成RNA-诱导沉默复合体(RISC)，调控其靶基因的表达。miRNA调控靶基因的方式有两种：与靶基因mRNA的3’UTR结合导致其降解；与靶基因mRNA 3’UTR结合抑制其翻译。在植物中比较普遍的沉默机制中，miRNA和靶基因mRNA几乎完全配对时，诱导其降解。然而大多数哺乳动物是通过不完全的配对结合，从而在转录后水平抑制基因翻译。除此之外，miRNA还可通过促进靶mRNA polyA尾的去除，mRNA快速脱腺苷酸化促进了其被3’核酸外切酶水解。人类的miRNA由2％的基因编码，却能调控人体约30％的基因。多种miRNA已被报道在肿瘤发生中参与调节相关基因的表达。非编码miRNA在调控EMT的细胞信号通路中具有重要作用。例如miR-200和miR-205抑制ZEB1和ZEB2，后者调控E-cadherin的表达，由此维持上皮细胞的表型。
鉴于miRNA在癌症发生发展的重要作用，已有多位研究者对肝癌与miRNA的关系做了深入研究，发现了部分与肝癌相关的miRNA，这些miRNA的表达在转移性肝癌中下调明显。然而目前的工作仅是冰山一角。
发明内容
经过对肝癌发病机理的多年研究，本发明人发现mir-452-3p在肝癌细胞中下调明显，并且对于肝癌细胞的增殖和侵袭有抑制作用。基于此，本申请的目的是提供一种新的治疗肝癌的方式。
由此，本发明的第一个目的是提供mir-452-3p在制备治疗肝癌的药物组合物中的用途。
优选地，所述mir-452-3p的序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述治疗是通过抑制肝癌细胞的增殖与侵袭实现的。
优选地，所述肝癌为原发性肝癌。
本发明的第二个目的是提供一种用于治疗肝癌的药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的mir-452-3p及其药学上可以接受的辅料。
优选地，所述mir-452-3p的序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的第三个目的是提供检测mir-452-3p的特异性扩增引物，所述特异性扩增引物包括上游引物和下游引物。
优选地，所述上游引物的序列如SEQ ID NO:2所示；所述下游引物的序列如SEQ IDNO:3所示。
本发明的第四个目的是提供检测mir-452-3p的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的检测mir-452-3p的特异性扩增引物。
本发明人通过大量实验发现，mir-452-3p能够抑制肝癌细胞的增殖与侵袭，从而使肝癌细胞凋亡。特别地，可以使肝癌细胞系HepG2凋亡63.6％，使SMMC7221凋亡53.1％，说明mir-452-3p或其类似物能够用于制备治疗肝癌的药物组合物，也可以构建它的表达载体，用于基因治疗。本发明的mir-452-3p对肝癌细胞的抑制效果显著，为肝癌的治疗提供了新的途径。
具体实施方式
通过下面给出的具体实施例，可以进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。
本发明人对大量原发性肝癌病例的基因表达进行分析，发现miR-452-3p在大部分研究的肝癌病例细胞中下调。因此，本发明人展开进一步的研究，探索mir-452-3p与肝癌之间的相关性。
在本发明中，mir-452-3p的序列为：cucaucugcaaagaaguaagug(SEQ ID NO:1)。
本发明进一步提供mir-452-3p的特异性扩增引物，其包括上游引物和下游引物。其中，所述上游引物的序列为：ctccagctgggctcatgc(SEQ ID NO:2)，所述下游引物的序列为：tggtgtcgtggagtcg(SEQ ID NO:3)。
本发明中，所述药物组合物中的治疗有效量是本领域技术人员可以根据制药领域的要求和治疗效果来判断和确定的。
本发明中所述的表达载体为miRNA表达载体，本领域技术人员根据miRNA的茎序列可以设计出合适的表达载体。
本发明中使用的细胞系HepG2、SMMC7721和L-02，购自中国科学院上海细胞生物研究所，引进后在本实验室长期培养。以RPMI1640+10％FBS，37℃、5％CO2、95％空气、饱和湿度条件下进行培养。
以下实施例中，如没有特殊说明，所使用的试剂和仪器都是本领域常规试剂和仪器，可以通过商购途径获得；所使用的方法为本领域常规方法，本领域技术人员根据实验目的可以毫无疑问地知道如何实施该方法。
实施例1：肝癌细胞中mir-452-3p表达量的验
1、收集病例
收集2015年1月至2016年12月间，在第四军医大学西京医院行原发性肝癌切除手术的90例患者切除标本及癌旁组织作为肝癌组织标本和癌旁对照。所有患者术前未接受过放化疗等抗肿瘤治疗。标本取材后立即放入4％甲醛溶液中进行组织固定。所有组织标本的病理学特征均经病理检查确认。
2、总RNA提取
利用TRIzol(Invitrogen)试剂说明提取组织的总RNA，步骤如下：
(1)组织研磨后或细胞收集后用PBS洗2次，按1×107细胞加入1mL细胞总RNA抽提试剂Trizol，充分匀浆；
(2)加入0.2mL氯仿混匀，室温静置3分钟后，4℃、12,000g离心15分钟；吸取上层水相置于新管中，加入0.5ml异丙醇，室温静置10分钟后，4℃、12000g离心20分钟；
(3)弃上清，沉淀以75％乙醇洗涤，4℃、7500g离心5分钟后，空气干燥；溶解于40μLDEPC处理的水溶液，进行浓度和纯度测定后保存于-80℃用于反转录。
3、microRNA逆转录
(1)取2μg组织总RNA，在室温解冻，解冻后迅速置于冰上。按照表1配制混合液。
表1：microRNA逆转录体系
试剂名称 量
5×反应缓冲液 5μL
总RNA 2μg
RTase混合物 1μL
2.5U/μL聚合酶 1μL
无RNA酶水 补充到25μL
37℃下，反应60min。
(2)85℃，5min后放于冰上，得到的microRNA cDNA可用于后续实验，或置于-20℃保存。
4、检测microRNA表达
以上述逆转录反应得到的cDNA为模板，每份组织的模板设置三个复孔，在冰上操作，反应体系配制如表2。
表2：PCR反应体系
试剂 量
模板Cdna 1μg
上游引物(2μm) 2μL
下游引物(2μm) 2μL
dNTP(10μm) 8μL
DNA聚合酶 1μL
缓冲液(10×) 2μL
dd水 补足20μL
反应条件：95℃，5min；94℃，30s；52℃，30s；72℃，30s；30个循环。
结果表明，在90对样品中，有86对的肝癌组织中mir-452-3p的表达量低于癌旁对照组织的表达量，其中最大的降低量为68.5％，最小的降低量为9.7％。其它4对中，mir-452-3p的表达量没有差异。由此可见，mir-452-3p的表达与肝癌的发生有联系。
实施例2：肝癌细胞SMMC7721和HepG2中mir-452-3p的表达量分析
培养肝癌细胞SMMC7721和HepG2以及正常人肝细胞L-02至对数期，分别经脱离基质附着培养24h，得到脱离附着的细胞。通过实施例1的方法检测细胞中miR-424-5p的表达。检测结果显示，与正常人肝细胞L-02相比，mir-452-3p在肝癌细胞SMMC7721和HepG2中的表达量分别为L-02细胞中的43.2％和38.9％，进一步证实mir-452-3p在人肝癌细胞中下调表达。
实施例3：肝癌细胞转染mir-452-3p
1、microRNA的合成：
分别合成mir-452-3p：
CUCAUCUGCAAAGAAGUAAGUGAA(SEQ ID NO：4)
UUCACUUACUUCUUUGCAGAUGAG(SEQ ID NO：5)；
阴性对照：
UUCUCCGAACGUGUCACGU(SEQ ID NO：6)
ACGUGACACGUUCGGAGAA(SEQ ID NO：7)。
2、细胞株的选择：
选择SMMC7221和HepG2细胞系作为实验细胞系。
3、细胞的转染：
(1)转染前一天，胰酶消化预转染的细胞，调整细胞浓度为2×105个/孔接种于6孔培养板中，置于37℃，5％CO2培养箱培养。
(2)16-20h后，细胞密度达到80％，将板内完全培养基换成opti-MEM培养液。
(3)取5μL的miR-452-3p或阴性对照稀释于250μL opti-MEM培养基中。
(4)取10μL Lipofectamine2000脂质体稀释于250μL opti-MEM培养基中。
(5)将稀释好的脂质体与miR-452-3p或阴性对照混合，室温孵育25min。
(6)将(5)的混合液按每孔500μL/孔加到6孔板中，轻轻摇动混匀。
(7)37℃，5％CO2培养箱中培养6h后，更换为完全培养基继续培养24h。
4、转染后分析
转染24h后消化细胞，置poly-HEMA培养板中继续培养24h。收集细胞，用移液器轻轻吹开细胞团成单个细胞，1000rpm 4℃离心5min，预冷PBS冲洗3遍，进行AnnexinV-FITC染色，上机后检测凋亡细胞。结果显示，HepG2细胞中，与转染阴性对照相比，转染mir-452-3p的细胞凋亡了63.6％；SMMC7221细胞中，与转染阴性对照相比，转染mir-452-3p的细胞凋亡了53.1％。
Figure BDA0001316233490000061
Figure BDA0001316233490000071
Figure BDA0001316233490000081
序列表
<110> 中国人民解放军第四军医大学第一附属医院
<120> mir-452-3p在制备治疗肝癌的药物组合物中的用途
<130> W171138-OI
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人
<400> 1
cucaucugca aagaaguaag ug 22
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctccagctgg gctcatgc 18
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tggtgtcgtg gagtcg 16
<210> 4
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 4
cucaucugca aagaaguaag ugaa 24
<210> 5
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 5
uucacuuacu ucuuugcaga ugag 24
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 6
uucuccgaac gugucacgu 19
<210> 7
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 7
acgugacacg uucggagaa 19

Claims (1)

1.序列SEQ ID NO:4在制备治疗与SMMC7221细胞有关的肝癌的药物组合物中的用途。
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