CN107312070A - 一种18f标记的pet多肽探针及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种18F标记的PET多肽探针及其制备方法，其结构式如下：本发明利用18F标记D4，采用18F为放射性核素，利用[18F]AlF‑NODA的方法标记D4多肽，标记后的[18F]AlF‑NODA‑D4探针具有两大优势，首先标记步骤简单，又较高的标记产率，为临床应用打下基础，其次获得的[18F]AlF‑NODA‑D4可以活体定量诊断EGFR表达情况，以预测EGFR靶向治疗药物的疗效，为临床治疗提供参考。

Description

一种18F标记的PET多肽探针及其制备方法
技术领域
本发明属于放射性标记化合物技术领域，具体涉及一种18F标记的PET多肽探针及其制备方法。
背景技术
肺癌在癌症中发病率最高，目前已成为全世界造成癌症死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)约占所有肺癌的80％。75％的患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低。化疗目前仍然是晚期NSCLC应用最广泛的治疗方法，但化疗特异性差，毒、副反应大，限制剂量又会导致疗效不佳，而且有报道化疗药物之间的抵抗作用可能会导致肿瘤的复发。随着化疗的疗效已达到一个平台期，人们迫切需要新型的治疗方法以求降低癌症死亡率。
EGFR属于表皮生长因子家族(erbB家族)EGFR是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，具有酪氨酸激酶活性，是原癌基因C2erb21(HER21)的表达产物，它由1186个氨基酸残基组成，分子量为70000M，分为胞外区、跨膜区、胞内区和羧基末端四个部分。胞外区是配体结合区，胞质区含有典型的ATP结合位和保守的酪氨酸激酶区。研究人员发现在乳腺癌、肺癌、头颈鳞癌等多种人类恶性肿瘤中均发现EGFR过表达或突变现象，而且研究结果表明EGFR的表达水平和突变状态与多种肿瘤的预后相关。所以以EGFR为靶点的分子靶向药物研究广泛，发展迅速。
目前虽然有靶向EGFR的治疗药物，但是却没有可以准确、全面预测这些药物疗效的临床评价指标。目前临床上检测EGFR表达的标准化方法为免疫组化法，但免疫组化法受检测者主观影响大、不能准确定量、不能反映肿瘤整体表达水平。另外，也有通过荧光原位杂交(FISH)技术进行EGFR表达水平的检测。但这些检测得出的EGFR阳性结果却并不能很好的预测药物的治疗效果，一个可能的原因即体外检测不能完整的反映整个肿瘤EGFR的表达水平。另外，EGFR的突变也是影响EGFR靶向药物疗效的一个因素。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种18F标记的PET多肽探针。
本发明的另一目的在于提供上述18F标记的PET多肽探针的制备方法
本发明的技术方案如下：
一种18F标记的PET多肽探针，其结构式如下：
一种上述PET多肽探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备NODA-D4：将多肽D4溶于1mLDMF(二甲基甲酰胺)中，加入1，4-二乙酸-1，4，7-三氮杂环壬烷-7-乙酸-N-羟基琥柏酰亚胺酯(NOTA-NHS ester，购买于CheMatech公司)，然后加入DIEA(N，N-二异丙基乙胺)将pH调节到8.0～8.5，室温搅拌过夜，经HPLC分离纯化，收集目标产物的馏分，合并后冻干，得NOTA-D4。
(2)制备925～1850MBq(25～150mCi)的18F生理盐水溶液；
(3)制备[18F]AlF-NODA-D4：向反应容器中加入3～10μL 2nmol/L的AlCl3，10～30μL 0.1mol/L pH＝4.0的醋酸钠缓冲液，然后加入100～300μL 925～1850MBq(25～150mCi)的18F-的生理盐水溶液混合2～3min，再加入100～600μL 1mg/mL的NOTA-D4的去离子水溶液，摇匀后在80～110℃反应10～30min，冷却至常温，用HPLC测定其标记率；
(4)纯化所制得的[18F]AlF-NODA-D4，即得所述18F标记的PET多肽探针。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(2)为：在回旋加速器上用核反应18O(p，n)18F制得[18F]F-，然后富集在Sep-Park light QMA柱上，用去离子水淋洗以除去吸附在QMA柱上的金属杂质离子，用0.2～1mL生理盐水洗脱得到925～1850MBq(25～150mCi)的18F生理盐水溶液。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(4)为：将步骤(3)所得的物料缓慢注入事先活化过的Sep-Pak C18柱，再用10～20mL蒸馏水淋洗除去水溶性杂质，吹干后用200～600μL的乙醇淋洗，淋洗液用生理盐水稀释至乙醇含量小于10％，用HPLC测定其保留时间和放化纯，观察其外观性状是否为无色澄清透明液体。
进一步优选的，所述步骤(1)的HPLC分离纯化中的第一流动相为0.1％三氟乙酸水溶液，第二流动相为0.1％三氟乙酸乙腈，梯度洗脱条件，0～10min，95％的第一流动相；10～25min，95～35％的第一流动相；25～40min，35％的第一流动相；流动相的流速为1mL/min，检测波长为220nm。
本发明的有益效果：
1、本发明中的D4(Leu-Ala-Arg-Leu-Leu-Thr)是通过计算机虚拟筛选得到，其结合位点是EGFR中结构域I(domin I)的一个表面口袋(pocket)，距离EGFR活性位点距离比较要，结合后不会激活EGFR下游信号通路[Novel peptide ligand directs liposomestoward EGF-R high-expressing cancer cells in vitro and in vivo.FASEB J，2009.23(5)：p.1396-404]；本发明利用18F标记D4，采用18F为放射性核素，利用[18F]AlF-NODA的方法标记D4多肽，标记后的[18F]AlF-NODA-D4探针具有两大优势，首先标记步骤简单，又较高的标记产率，为临床应用打下基础，其次获得的[18F]AlF-NODA-D4可以活体定量诊断EGFR表达情况，以预测EGFR靶向治疗药物的疗效，为临床治疗提供参考。
2、本发明的PET多肽探针具有非常优异的药动学性质，对肺癌肿瘤的摄取高，具有很高的靶/非靶比。
3、本发明的PET多肽探针采用Al-18F的标记方法对其进行标记，标记方法简单，易于实现自动化合成，标记产率高，不需要HPLC纯化，这对半衰期较短的放射性核素来说非常重要，更加有利于放射性标记化合物的商业应用于临床推广。
附图说明
图1为本发明实施例1中[18F]AlF-NODA-D4利用HPLC测定其放化纯度的结果图。
图2为本发明实施例1中[18F]AlF-NODA-D4在荷瘤小鼠(A549)中microPET显像冠状面断层图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
(1)制备NODA-D4
将10mg多肽D4(定制于美国多肽公司)溶于1mLDMF(二甲基甲酰胺)中，加入15mg1，4-二乙酸-1，4，7-三氮杂环壬烷-7-乙酸-N-羟基琥柏酰亚胺酯(NOTA-NHS ester，购买于CheMatech公司)，然后加入DIEA(N，N-二异丙基乙胺)将pH调节到8.0-8.5，室温搅拌过夜，经HPLC分离纯化，收集目标产物的馏分，合并后冻干，得目标产物NODA-D4，经过质谱分析确认。
上述HPLC分离，第一流动相为0.1％三氟乙酸水溶液，第二流动相为为0.1％三氟乙酸乙腈，梯度洗脱条件，0～10min，95％第一流动相；10～25min，95～35％第一流动相；25～40min，35％第一流动相；流动相的流速为1mL/min，检测波长为220nm.。
MS，m/z：971.7([M+H]+)
(2)制备18F生理盐水溶液：在回旋加速器上用核反应18O(p，n)18F制得[18F]F-，然后富集在Sep-Park light QMA柱上，用5mL去离子水淋洗以除去吸附在QMA柱上的金属杂质离子，用0.2～1mL生理盐水洗脱得到925～1850MBq(25～150mCi)的18F生理盐水溶液。
(3)制备[18F]AlF-NODA-D4：向1.5mL的EP管中加入10μL 2nmol/L的AlCl3，300μL0.1mol/LpH＝4.0的醋酸钠缓冲液，然后加入100μL 925～1850MBq(25～150mCi)18F-的生理盐水溶液混合物3min，再加入1000μL 1mg/mL的NODA-D4的去离子水溶液。混合物摇匀后在80～110℃反应10～30min，冷却至常温，用HPLC测定其标记率。
(4)纯化所制得的[18F]AlF-NODA-D4，即得所述Al-18F标记D4：将以上反应液缓慢注入事先活化过的Sep-Pak C18柱，再用20mL蒸馏水淋洗除去水溶性杂质，吹干后用700μL的乙醇淋洗，淋洗液用生理盐水稀释至乙醇含量小于10％，用HPLC测定其保留时间和放化纯，观察其外观性状是否为无色澄清透明液体。经衰变校正的放化产率约10～40％，放化纯度为98.6％(如图1所示)。
上述步骤(3)和(4)的HPLC中，第一流动相为0.1％三氟乙酸水溶液，第二流动相为0.1％三氟乙酸乙腈，梯度洗脱条件，0～10min，95％第一流动相；10～25min，95～35％第一流动相；25～40min，35％第一流动相；流动相的流速为1mL/min，检测波长为220nm.。
(5)荷A549肿瘤裸鼠MicroPET显像：A549荷瘤裸鼠麻醉状态下经尾静脉分别注射0.1ml[18F]AlF-NODA-D4(7.4MBq)并于注射后30min进行静态microPET/CT断层扫描(Siemens Inveon)，图像采集后通过三维有序子集最大期望值法(ordered subsetexpectation maximization with three-dimensional resolution recovery，OSEM3D)进行空间重构。在衰变校正的冠状面显像图中，用ASI Pro 5.2.4.0软件圈出肿瘤、正常组织和器官的感兴趣区域(region of interest，ROI)，计算肿瘤模型中肿瘤/非肿瘤(T/NT)的放射性比值，肿瘤/肌肉可达到9.2(如图2所示)。
(6)荷A549肿瘤裸鼠生物分布：0.37MBq[18F]AlF-NOTA-D4经尾静脉注射到荷A549肿瘤裸鼠体内，分别在30min、60min、120min后，处死后取心、肝、脾、肺、肾、骨骼、肌肉、血、肿瘤、肠，称取质量，并利用γ-计数器测定放射性计数，计算％ID/g。结果如表1所示，肿瘤对[18F]AlF-NOTA-D4的摄取在30min时可达到0.52±0.14％ID/g，其摄取值随时间延长而逐渐降低，摄取较高的脏器为肝脏、肾脏和小肠，除此之外，肿瘤摄取值最高，可以作为活体定量诊断EGFR表达情况的指标。
表1
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (5)

1.一种18F标记的PET多肽探针，其特征在于：其结构式如下：
2.一种权利要求1所述的PET多肽探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)制备NODA-D4：将多肽D4溶于1mL DMF中，加入1，4-二乙酸-1，4，7-三氮杂环壬烷-7-乙酸-N-羟基琥柏酰亚胺酯，然后加入DIEA将pH调节到8.0～8.5，室温搅拌过夜，经HPLC分离纯化，收集目标产物的馏分，合并后冻干，得NOTA-D4。
(2)制备925～1850MBq(25～150mCi)的18F生理盐水溶液；
(3)制备[18F]AlF-NODA-D4：向反应容器中加入3～10μL 2nmol/L的AlCl3，10～30μL0.1mol/L pH＝4.0的醋酸钠缓冲液，然后加入100～300μL 925～1850MBq(25～150mCi)的18F-的生理盐水溶液混合2～3min，再加入100～600μL 1mg/mL的NOTA-D4的去离子水溶液，摇匀后在80～110℃反应10～30min，冷却至常温，用HPLC测定其标记率；
(4)纯化所制得的[18F]AlF-NODA-D4，即得所述18F标记的PET多肽探针。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)为：在回旋加速器上用核反应18O(p，n)18F制得[18F]F-，然后富集在Sep-Park light QMA柱上，用去离子水淋洗以除去吸附在QMA柱上的金属杂质离子，用0.2～1mL生理盐水洗脱得到925～1850MBq(25～150mCi)的18F生理盐水溶液。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)为：将步骤(3)所得的物料缓慢注入事先活化过的Sep-Pak C18柱，再用10～20mL蒸馏水淋洗除去水溶性杂质，吹干后用200～600μL的乙醇淋洗，淋洗液用生理盐水稀释至乙醇含量小于10％，用HPLC测定其保留时间和放化纯，观察其外观性状是否为无色澄清透明液体。
5.如权利要求2至4中任一权利要求所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)的HPLC分离纯化中的第一流动相为0.1％三氟乙酸水溶液，第二流动相为0.1％三氟乙酸乙腈，梯度洗脱条件，0～10min，95％的第一流动相；10～25min，95～35％的第一流动相；25～40min，35％的第一流动相；流动相的流速为1mL/min，检测波长为220nm。
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