CN107299073B - 木醋杆菌基因重组菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株木醋杆菌基因重组菌，在木醋杆菌中过表达纤维素合酶中的bcsD亚基，以此提高细菌纤维素的产量。本发明所述菌株的细菌纤维素产量最高可达4～6g/L，是原始菌株的两倍。本发明有利于提高细菌纤维素的产量，从而减轻细菌纤维素产量低对于其应用的限制。

Description

木醋杆菌基因重组菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株木醋杆菌基因重组菌及其构建方法与应用。

背景技术

细菌纤维素(BC)是由细菌新陈代谢的产物形成的不含木素、半纤维素以及其他抽提物的高结晶度的三维网状结构，这种结构使得BC有着一些特有的特点，如高纯度，高结晶度，高保水值、抗菌性、无毒性、生物相容性和生物降解性等，从而在多个领域有着广泛应用。然而在目前的实验生产中，木醋杆菌产细菌纤维素的产量却很低，因此需要提高细菌纤维素的产量。

木醋杆菌生产细菌纤维素的过程是在葡萄糖激酶的作用下葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸，葡萄糖磷酸变位酶将葡萄糖-6-磷酸转化为葡萄糖-1-磷酸，在UDPG焦磷酸化酶的作用下，葡萄糖-1-磷酸转化为尿苷二磷酸葡萄糖。最后纤维素合酶把尿苷二磷酸葡萄糖转化为细菌纤维素。在木醋杆菌产细菌纤维素的过程中，起限速作用的酶纤维素合酶，纤维素合酶包含多个亚基，其中最主要的亚基为bcsA、bcsB、bcsC、bcsD，bcsA、bcsB主要与细菌纤维素的合成相关。

发明内容

本发明要解决的技术问题是一株木醋杆菌基因重组菌，以提高细菌纤维素的产量。

本发明还要解决的技术问题是提供上述木醋杆菌基因重组菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述木醋杆菌基因重组菌在发酵产细菌纤维素中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一株木醋杆菌基因重组菌，在木醋杆菌中过表达纤维素合酶中的bcsD亚基。所述纤维素合酶的bcsD亚基与细菌纤维素的分泌密切相关，细菌纤维素产生菌种过表达该基因可以促进细菌纤维素的分泌。

其中，所述木醋杆菌为木醋杆菌ATCC700178。

其中，所述纤维素合酶中的bcsD亚基，其基因序列如SEQ ID NO:1所示。

上述木醋杆菌基因重组菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)将纤维素合酶中的bcsD亚基的基因序列克隆到表达质粒中，得到重组质粒；

(2)将步骤(1)中重组质粒转化木醋杆菌，既得到木醋杆菌基因重组菌。

其中，步骤(1)中，所述表达质粒为pSA-19。

其中，步骤(2)中，所述木醋杆菌木醋杆菌ATCC700178。

上述木醋杆菌基因重组菌在发酵产细菌纤维素中的应用。

有益效果：本发明公开了一种在木醋杆菌中过表达纤维素合酶中的bcsD亚基，以提到细菌纤维素产量的方法，研究表明，构建得到的重组菌的细菌纤维素的产量比出发菌高出了2～4g/L。本发明有利于提高细菌纤维素的产量，从而减轻细菌纤维素产量低对于其应用的限制。

附图说明

图1重组菌PCR结果验证。第一泳道为2000的marker的条带。

图2x-射线衍射图谱。

图3热重力分析曲线。

图4细菌纤维素的红外光谱图。

图5细菌纤维素的扫描电镜照片。

图6出发菌和重组菌发酵结果对比图。

图7出发菌和重组菌发酵结果对比图。

图8出发菌和重组菌发酵结果对比图。

图9出发菌和重组菌发酵结果对比图。

具体实施方式

本发明公开了两种菌株、其制备方法及应用，以及该菌株的发酵方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

实施例1、木醋杆菌纤维素合酶亚基bcsD基因的克隆。

首先对于木醋杆菌的纤维素合酶中与细菌纤维素分泌相关的亚基(bcsD)进行扩增及序列测定，经过扩增得到约470bp的DNA片段。具体过程如下：

首先，提取木醋杆菌ATCC700178的基因组。根据NCBI上提交的木醋杆菌纤维素合酶(如Komagataeibacter sucrofermentans DSM 15973bcsD、Komagataeibacter xylinusbcsD)的基因序列设计引物对bcsD-FA、bcsD-RC，以提取的木醋杆菌ATCC 700178的基因组为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为2×PCR buffer for KOD FX，25.0μl；dNTPs(2mM)10μl；bcsD-FA,bcsD-RC各1.5μl；KOD 1μl；模板1μl；用无菌水补充至50μl，然后将其分装成25μl/管。反应条件：94℃2min；98℃10sec；55℃30sec；68℃30sec；68℃10min；38个循环扩增得到的PCR产物通过凝胶回收试剂盒纯化。

上述所需引物如下：

bcsD-FA：tatgaccatgattacgaattctgacaactttgaacgcaaaaccggactttt

bcsD-RC：cttgcatgcctgcaggtcgactcaggtcgcggcgctgcggg

实施例2：重组质粒pSA19-bcsD的构建及验证。

根据NCBI上木醋杆菌内源性质粒序列合成质粒片段pAH4，将质粒pAH4(其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)和质粒pUC18用Hind III单酶切后重组，得到带氨苄抗性的重组质粒pSA19。用EcoRI和SalI双酶切pSA19质粒，凝胶回收。通过一步克隆将上述胶回收得到的目的片段连到pSA19质粒上，从而构建了以氨苄抗性为选择标记的载体pSA19-bcsD。然后对于psa19-bcsD载体进行验证，进行双酶切验证，验证结果电泳结果如图，结果与预期相符，将双酶切结果与预期相符的质粒送测序，测序得到的bcsD与Komagataeibactersucrofermentans DSM 15973的bcsD序列对比，两者序列一致，序列与预期相符，证明该载体构建成功。

实施例3：pSA19-bcsD载体转木醋杆菌ATCC700178转化子的构建及分子验证。

将1μg pSA19-bcsD载体转化木醋杆菌ATCC700178，转化过程采用电转化法。在含有氨苄抗性的选择培养基上对转化子进行筛选，最终得到一株遗传稳定的木醋杆菌pSA19-bcsD转化子。经PCR验证，证明上述转化子成功插入pSA19-bcsD质粒。

上述的电转化的具体方法如下：

感受态的制备：

(1)从平板上刮一环木醋杆菌种子于装有100ml种子液的500ml锥形瓶中，同时加入过膜除菌的纤维素酶使得每毫升培养基中的纤维素酶量为0.5U，30℃，150rpm，培养18h，使得菌液的OD值在0.6-0.8之间。

(2)将培养得到的菌液5000rpm，离心5min，弃上清收集菌体，再用5ml的EPB溶液(284mmol的蔗糖溶液和100mmol，Ph7.4的磷酸盐缓冲液分别灭菌后以1:19比例混合得到)洗涤两次。最后加3.3ml的EPB溶液重悬，分装，每管560μl。

木醋杆菌的转化：

将得到的质粒pSA19-bcsD 20μl(浓度约为30ng/μl)加入上述分装的感受态中，于冰上放置10min后，转入2mm电转杯中，加入电转仪中电转，电转条件为电压3000V，电阻200Ω，电容25μF。

复苏、涂板：

在电转化后的菌中加入1ml的含有纤维素酶的种子液，再在30℃，150rpm，复苏3h。复苏完成后，取100μl上述菌液涂布于含有75μg/ml的氨苄抗性的琼脂培养基，30℃，培养3-4天，挑选在琼脂培养基上长出的转化子。同时对于没有加入目的质粒的感受态按照同样的方法进行，按照相同的量涂布于相同的琼脂培养基上作为感受态生长情况检测及阴性对照。

上述的琼脂培养基(即选择培养基)：葡萄糖22g/l,酵母膏5g/l，蛋白胨5g/l,琼脂20g/l，氨苄抗生素75μg/ml。

将选择平板上长出的转化子进一步挑取到转化基本培养基平板上进行复筛，将复筛培养基上挑选得到的转化子进行菌落PCR验证，验证的引物对为yz-d-1、yz-d-2；

PCR结果的凝胶电泳图如图1所示。

yz-d-1：gagttagctcactcattaggcaccc；

yz-d-2：cgcgtcgatatcacgcgtcacgacataatc。

实施例4：将重组菌木醋杆菌ATCC700178-bcsD进行发酵验证。

将木醋杆菌转化子和出发菌株分别活化，接种到种子培养基中，30℃，100rpm(摇床)培养18-20h后，接种于100ml(500ml的三角瓶)发酵培养基中，同时在发酵培养基中加入1ml无水乙醇。接种的同时，取样测定初始糖浓度。于30℃静置培养6d后，用蒸馏水过夜冲洗纤维素膜以除去膜表面的培养基及杂质，再将纤维素膜浸泡在0.5M的氢氧化钠溶液中煮沸1h至乳白色半透明以除去附着的菌体，将处理后的纤维素膜在滤纸上沥干，称重(即纤维素湿重)，将沥干的纤维素膜在烘箱中于65℃烘至恒重，称重(即纤维素干重)以及残糖浓度，发酵结果如图6～9所示，图6～9中，0原始菌；d为过表达bcsD的木醋杆菌重组菌。

发酵培养基(g/l):葡萄糖22，酵母膏5，蛋白胨5，十二水磷酸氢二钠2.7，柠檬酸1.2，柠檬酸三钠20，无水硫酸镁5.7，硫酸铵2。

实施例5：重组菌株所产的细菌纤维素的性能分析。

1.x-衍射(XRD)分析

将过表达bcsD的重组菌株产生的细菌纤维素取一部分样品用于x-衍射，热重力分析，红外光谱及扫描电镜，结果如图2-5所示。由重组菌株所产的细菌纤维素的x-射线衍射图谱(图2)可看出，发酵产物经纯化后得到的衍射图在2θ＝22.5°和2θ＝16°以及2θ＝14°处各有一个明显的衍射峰，与纤维素Ⅰ型晶体峰值位置(2θ＝14°，16°，22°)完全吻合，所得的细菌纤维素成分为纤维素，且晶体结构属于纤维素Ⅰ型。

2.热重力分析

由重组菌株所产的细菌纤维素的热重力分析曲线(图3)可看出，细菌纤维素在0～100℃，纤维素质量几乎无变化，在150～300℃由于纤维素结构中的糖苷键的断裂、解聚，纤维素不断失重。从200℃开始迅速降低，且在250℃左右具有最大失重速率，之后在450℃处结束其反应失重。在600℃时，细菌纤维素质量出现突然的下降，当温度高于600℃后，纤维素质量进一步下降，这是由于该阶段中纤维素结构的残留物质发生进一步化学而变成分子量更低的挥发性物质。

3.红外光谱分析

从图3可以看到在3200cm^-1-3500cm^-1处的吸收峰宽且强，这归因于细菌纤维素分子间的氢键的伸缩振动，在2900cm^-1处显示的是CH₂-CH中的C-H伸缩振动的吸收峰，在1700cm^-1左右显示的是羟基O-H的弯曲振动的吸收峰；在1400-1500cm^-1范围出现的吸收峰则是由于亚甲基、次甲基的C-H弯曲振动所引起的；在1350cm^-1左右出现的吸收峰是由于O-H的面内振动所产生的；1000-1200cm^-1范围内则属于C-O伸缩振动吸收峰。这些特征峰可说明该细菌纤维素为纯纤维素。

4.扫描电镜

图5为细菌纤维素的扫描电镜照片，由图5可知，微纤维间相互交错形成纳米纤维网状结构，在8000倍下课看出薄膜是由许多纤维丝连接交织而成。这一结构特征使得细菌纤维素具有高结晶度、高持水性等优良性能。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 木醋杆菌基因重组菌及其构建方法与应用

<130> SG20170825

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 471

<212> DNA

<213> 木醋杆菌(Acetobacter xylophilus)

<400> 1

atgacaactt tgaacgcaaa accggacttt tcgcttttcc tgcaggcact gtcctgggag 60

atcgatgatc aggccgggat cgaggtcagg aatgacctgt tgcgcgaggt cggccggggt 120

atggctggtc gtttccagcc gccgctgtgc aacaccatcc accagctcca gatcgagctg 180

aacgccctgc tggccatgat caactggggc tacgtaaagc tggacctgct ggcggaagaa 240

caggccatgc gcatcgtgca tgaagacctg ccgcaggtgg gcagcgcggg cgaacccgcc 300

ggcacatggc ttgccccggt gctggaaggg ctttatggcc gctggatcac gtcgcagccc 360

ggcgccttcg gtgattatgt cgtgacgcgt gatatcgacg cggaagacct gaactcggtc 420

ccggcccaga cggtcatcct gtacatgcgc acccgcagcg ccgcgacctg a 471

<210> 2

<211> 4002

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagcttctgg cgggcggatt cctgttcagc ccgcttttgc gcctcgcgtg ttcccgcgcc 60

aatcgctcca ttatggcccg ctgccgtcct gcctctcctg ctccttccgc tcgatggcat 120

cccgacccac ctcgtcggcc agatcggcga accagtccat caggtcttcc gctgcctgct 180

gaaccttggc gatggcctgt tccgcgcttt cgatgatatg gcgcagggct ttcgcaatcc 240

cgttcttctc ggcggcatcc gcatttgccc tggcacggta ggttctgggt tcatactccc 300

gaccttcctg ctcggcctga tgcgcggcct tgcgttcgac cgccgtgctg tgcggcccga 360

gatggacgcc gggcacaacc tcgacaccct gccgctcata actccggtga tcgacgcggg 420

cggtctgtcc ggcccgctct agcagcctgt cgggttgggc attttgcggc tgataacgcc 480

aaggctgacc tggcttatgc tgcctgaagc cgcgccattc ttttacagtt gtatgcgaga 540

gcaacgagtg tccattcggt cgtgactttt gcaaggccac gcaggctgaa ttttctgaag 600

cccatgatgc ttttgataat tccaaagacc ggctccacgg tctgttttcg tcgtctgtaa 660

agatctccgg cttctgtagt ttccagcctg tccttcatgg caagccgcca gggttcggtt 720

atccggcgtg gctccctttc tgcgggccgg ggtcggaagt cgtaaggtct gcgggcacag 780

ggccgtccaa tggcgaccag cggatcaatg cccttttccc gcagtttccg gaccgcctgc 840

ccgctggcgt aaccggtatc ggcgagcact gtctttggga gaccgattgt gtcttccatc 900

gacagcaccg tgtcggcaaa ggacggcgca tccgctgatg tggcgacaac gtcggttgtc 960

acgatcaact ggctgccttc ggcgcacacc acggcctggg cattgtaagc ctgccggaac 1020

tcgtgggcgt ccgaacgccg catgaggcgg ctgtcgggat cggtcagact gatctgtcgg 1080

tcgggtggtg gttcatcact cgggcggttt gggcgcccgg ccgcgacgcc ctgttttcgc 1140

atcataagcg gctttcttct tctcgtaggc cggtcgcgcc gtttcagcct gcgccttcgc 1200

atcagcttcc agccgggcgc aggcttcgtc agcttctttc agcgtttccc gccgggcaag 1260

ctcttccggc aatgctgcgg atctctgtct gtgacgtccg catctccgcc tggtccatca 1320

gtttcgcgat atccacagcc agctgttcgc gcacgcctga tccggtcgta gcgcaccgaa 1380

cggtatttcg atgcgtcagc atcgattttc gtgccgtcga tcgacaccac gcccagacgc 1440

agcagacccg tctcgcgcgc cagaagcagg acctgcgcaa atgcagcttc aatggctgtc 1500

cggttcgtcc ggcggaaggt cgcaatcgta tcatgatccg gatgcaggtt cgccgccacg 1560

aatcgcaccc cgatgtcgcg atatgtcgcc cgctcgatcc ggcgtgagga aaacaacccg 1620

ttcgcatagc tgaagatcag aagggccagc atcaggcgcg gatgatactg cgccttgcct 1680

cccgtgcgca ctggcacgca gaacgcactc atcggaaccc gctcaacggc ggctacaatg 1740

aaatgcgcca tatcatcagc aggaagccac gacttcagat caggcggcag aagatacggc 1800

tgagaccggt caaacgggat gaagctgctc atcacaccac cttacaatcg cccccttcac 1860

agggtacccc aacccgacag gctgctagaa ccgccgtaga agcgtccgag gcattcgcag 1920

tgtcgaaacc ccgcctaatg atctggacgg ccctctgtgc cttcctgctg gtctctggcg 1980

ggtggttggc agcgttctgg gtaggcagac acgatggctg ggccgctggt caggtcgatg 2040

gcagacagga agccctcacc gccaatgccg ccgcgtcatg ggcgaatacc accagcggga 2100

agatggccaa gcaactggat gacctcggca accttcaacc tttggcgact tgcaacgtcc 2160

ccggattctc catccagaag ggggaaaagg gtgttcgctg gtgtgtggtt gctggaacag 2220

acgggcagtt ccacgggtgg gcgatgccct gacgaaccct tccctcttcc tgagcaattc 2280

ggaagatcaa tttcctctag cctaacacgt cgaaaacggg agttttccac caaaaaagag 2340

agacctacag agagattaaa tttctttctc tttcttaacc atagtcaacc cgcgcgagac 2400

tgcggaaaaa tgcttgtaat aggttacagg atatgtaacc cagaagttac aggggctgta 2460

acctattagc ccgttatcaa caggggtgcg agatgtcccg gattgtcaga ctgaccacca 2520

agcggcaaat ggccgaccag caggccgcag ctaccattgc cgaacaactg gaactcatca 2580

ctccggaaat gctggaaggc gctccgggag acctgaaact gttgctgtca cgggctatct 2640

acagcgcaca aaagcaatcg cgcccgaaca ccgaaggact ttggccggga gtttcaccat 2700

gattagccgc gaccagacga aacttgtgtg ggatgccatc cgcgcccttc cgccagaaga 2760

tcgcccccag caggtacgtc acgccttcga tctggccttg ctgtcactgc gacaggatac 2820

cggcgaaatc atgatgcgcc gtgatgaact tgccgaagaa atcggctgtt ctccgcagaa 2880

cgtcagccaa attatgggcg ttctcgagcg tatgggtgcc gtccgtcgaa cccgccaaaa 2940

ggtgccgggg atcagaggac cgggtgtggc aatatattac atcaacccgc atgtcggctg 3000

gaatggctct ctagatgctc gcaaggcaca ggctgaagaa atccatccgc cggtacagct 3060

tgagcttctg caagggggag ccaaatgagt tcccgtagaa gcagtagagc acagggcacc 3120

aatccaaaag ctctaggatt aaaccctaga gcacttggat taagtcctaa acaattagga 3180

attagccccc gtcagctcgg gattagccct aagcaactcg caaaaaagag gcaaatcatg 3240

accgacctat ccgacgaact ggccgccaaa cgggcggcaa tccgtgcagc ccgcgaatgc 3300

acagaaccgt cgctgtctgc ggcggaggct atcgccttgc tggaatccga tctggttatg 3360

gttcaggcag ctatcgacgc tctacacgcc gaggaacgcc gtgcaggttg agtggtcgaa 3420

gctggcccgt tctgatgcgg aagcaatcag agcctacctg ttggatcgaa acccatacgc 3480

agctaagcga attttactcc gtctgatcga tgcgacaaaa gacttggcaa tgttcccgag 3540

catcggtcgg atagggctgg acggcacccg cgaatgggtc gtcgcccagc cctacgttct 3600

gctctacgaa gtcaatgaaa tggccggaat cgttaaaatc ctgcgtgttt ggcacagcgc 3660

ccaagaccgc tgaatagcct ctaacgcctt cgccgggggc gggggtacac aggcactaga 3720

cctaatccca aaacccggtg tcaaattggc tattatccaa ggcgttgcaa aacaattctt 3780

aagtaatgaa atatttttat tgacaacata tgaaaaaaat cgtataaata atattatgcg 3840

gccatggtga aatttggtaa acacatataa tttggaatta tagatacatt taagagagta 3900

tttgagggtt caagttcctc tggccgcacc atataaatct caaaatactt agcgtcgcct 3960

tcctcccggc cctttacgtc cgcctgtgaa gccctcgtcg at 4002

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tatgaccatg attacgaatt ctgacaactt tgaacgcaaa accggacttt t 51

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cttgcatgcc tgcaggtcga ctcaggtcgc ggcgctgcgg g 41

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gagttagctc actcattagg caccc 25

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgcgtcgata tcacgcgtca cgacataatc 30

Claims (5)

1.一株木醋杆菌基因重组菌，其特征在于，在木醋杆菌中过表达纤维素合酶中的bcsD亚基；所述bcsD亚基的基因序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的木醋杆菌基因重组菌，其特征在于，所述木醋杆菌为木醋杆菌ATCC700178。

3.权利要求1～2任一所述的木醋杆菌基因重组菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将纤维素合酶中的bcsD亚基的基因序列克隆到表达质粒中，得到重组质粒；

(2)将步骤(1)中重组质粒转化木醋杆菌，即得到木醋杆菌基因重组菌。

4.根据权利要求3所述木醋杆菌基因重组菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述表达质粒为pSA-19。

5.权利要求1～2任一所述的木醋杆菌基因重组菌在发酵产细菌纤维素中的应用。

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