CN107287175B - 一种用于木糖生产的复合酶制剂及其应用 - Google Patents
一种用于木糖生产的复合酶制剂及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于木糖生产的复合酶制剂，包含木聚糖酶，阿魏酸酯酶和阿拉伯糖转苷酶。本发明的复合酶制剂能够以粘胶纤维生产的压榨液为原料制备以木糖为主要成分的低聚木糖溶液，通过碳酸钠与复合酶制剂中的木聚糖酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯糖转苷酶以及脂肪醇聚氧乙烯醚产生的协同作用，大大提高木糖的转化率，取得了意料不到的技术效果，市场前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于酶制剂应用技术领域，具体涉及一种用于木糖生产的复合酶制剂及其应用。
背景技术
低聚木糖又称为木寡糖，由2-7个D-木糖以1,4-木糖普键结合而成的短链聚合物，作为一种功能性聚合糖，现已广泛运用于医疗、健康、畜牧业等领域，具有可观的市场前景。
生产低聚木糖主要途径为木聚糖的水解法降解。该水解过程强调三个方面：化学反应机理，反应条件和传质。主要包括自水解、酶法水解、酸法水解、酶法酸法相结合四种方法。
在自动水解过程中，木质纤维素材料在含水介质中加热，得到水中的水合氢离子，对木聚糖主链产生作用，进而使得木聚糖解聚，另外自水解常涉及对半纤维素的热解反应生产乙酸来进行木聚糖的乙酰化。通过对木质纤维素的自水解反应会产生各种副产物，例如木质素、单糖、糠醛等，因此需要进一步纯化。
酸法水解主要通过酸中的H+对半纤维素糖键产生作用，进而完成对纤维素的降解。一般来说，无机酸的水解效果优于有机酸。在酸解过程中，离解的水在高温下生成质子，本体溶液中増加了酸解离和扩散作用，这些质子随后催化乙酰基从半纤维素上的分离，并进一步增加酸度。
作为一种生物催化方法，酶水解是将存在于木质纤维素生物质中的半纤维素以环境友好的方式转化为增值产品的一个强大工具。由于半纤维素结构的复杂性，为了打断各种侧链基的链接键，可使用多种酶协同酶解的方法。而对于不同种类的增值产品，需要选择不同种类的酶以及相应的反应条件。对于产率及产品性质的主要影响因素有：酶种类；酶解条件(酶解温度、酶解时间、揽拌速率、酶解液pH)；辅助酶的作用等等。高效的酶法制备工艺，是目前低聚木糖生产行业的研究热点之一。
本发明的申请人之前公开了CN 106754828A一种用于桉木制备低聚木糖的复合酶，包括木聚糖酶和纤维素酶；上述的复合酶还包含有甘露聚糖酶。该发明的复合酶可广泛应用于低聚木糖的生产，能有效提高桉木半纤维素转化低聚木糖的效率，而且复合酶中的纤维素酶和甘露聚糖酶能明显促进木聚糖酶对半纤维素的降解作用，三种酶协同作用，能使木二糖、木三糖和木四糖的总转化率提高12.5％，并且木四糖的转化率也提高了50％，但是利用该发明的复合酶制剂制备木糖的转化率极低。
由于，低聚木糖的性质和用途与单木糖差异较大，在大多数应用领域是不能代替单木糖的。现有文献报道，均为生产以木二糖和木三糖为主的低聚木糖的方法和酶制剂，而鲜于关注单木糖的生产，因此，提供一种高效的木糖生产制备的酶制剂，是木糖生产行业亟待解决的问题。
发明内容
本发明为解决现有技术问题，提供了一种用于木糖生产的复合酶制剂，该复合酶制剂能够有效提高木糖的转化效率，效果显著。，
本发明提供了一种用于木糖生产的复合酶制剂，包含木聚糖酶、阿魏酸酯酶和阿拉伯糖转苷酶。
进一步，所述复合酶制剂还包括表面活性剂。
优选的，所述表面活性剂为脂肪醇聚氧乙烯醚。
进一步，所述复合酶制剂中还包含碳酸钠。
优选的，所述复合酶制剂中木聚糖酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯糖转苷酶、表面活性剂和碳酸钠的重量比为3：0.5-1：0.2-0.5：0.01-0.06：0.1-0.8。
优选的，所述复合酶制剂中木聚糖酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯糖转苷酶、表面活性剂和碳酸钠的重量比为3：1：0.5：0.04-0.06：0.3-0.6。
优选的，所述复合酶制剂中木聚糖酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯糖转苷酶、表面活性剂和碳酸钠的重量比为3：1：0.5：0.05：0.5；所述复合酶制剂中木聚糖酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯糖转苷酶的酶活分别为10000U/g、500U/g、100U/g。
进一步，本发明的所述复合酶制剂在生产木糖中的应用。
进一步，根据所述复合酶制剂生产木糖的方法，包括如下步骤：
1)将粘胶纤维生产的压榨液经过膜脱碱浓缩，得到半纤维素溶液，取浓度为12％的稀硫酸与半纤维素溶液等体积混合，100℃高温处理90min，用碳酸钙调PH至中性；
2)用浓硫酸调节半纤维素溶液的pH至5.5，按50-60g/Kg木聚糖的比例加入所述复合酶制剂，50-60℃作用12-24h；
3)酶解反应结束后，升温至80℃以上，保温15min，灭活复合酶；
4)将酶解后的溶液通过板框进行固液分离，得到的澄清溶液，即为低聚木糖溶液。
进一步，根据所述复合酶制剂生产木糖的方法，包括如下步骤：
1)将粘胶纤维生产的压榨液经过膜脱碱浓缩，得到半纤维素溶液，取浓度为12％的稀硫酸与半纤维素溶液等体积混合，100℃高温处理90min，用碳酸钙调PH至中性；
2)用浓硫酸调节半纤维素溶液的pH至5.5，按55g/Kg木聚糖的比例加入所述复合酶制剂，60℃作用12h；
3)酶解反应结束后，升温至80℃以上，保温15min，灭活复合酶；
4)将酶解后的溶液通过板框进行固液分离，得到的澄清溶液，即为低聚木糖溶液。
与现有技术相比，本发明方法具有如下优点：
(1)利用本发明所述复合酶制剂处理粘胶纤维压榨液制备得到的低聚木糖溶液中，木糖的含量得到显著提高，木糖的转化率高达94.1％。
(2)本发明的复合酶制剂中碳酸钠的添加对木糖的转化率影响非常显著，随着复合酶制剂中碳酸钠添加量的增加，利用该复合酶制剂制备得到的低聚木糖溶液中木糖的转化率缓慢提高，但当碳酸钠在复合酶中的添加量达到0.3-0.5Kg时，木糖的转化率得到大幅提升，高达90.9％-94.1％；但当碳酸钠在复合酶中的添加量超过0.5Kg时，木糖的转化率又开始缓慢下降。
(3)本发明的复合酶制剂中表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚的添加对木糖的转化率影响也十分显著。随着复合酶制剂中脂肪醇聚氧乙烯醚添加量的增加，木糖的转化率缓慢提高，但当脂肪醇聚氧乙烯醚在复合酶中的添加量达到0.05Kg时，木糖的转化率得到大幅提升，高达94.1％；但当脂肪醇聚氧乙烯醚在复合酶中的添加量超过0.06Kg时，木糖的转化率又开始缓慢下降。
(4)在本发明中，碳酸钠可以与复合酶制剂中的木聚糖酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯糖转苷酶以及表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚产生协同作用，促进木糖的转化，尤其是当碳酸钠在复合酶中的添加量为0.3-0.5Kg时，表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚的添加量0.05Kg时，协同促进作用最强，能大幅提升木糖的转化率，取得了意料不到的技术效果。
综合上述，本发明的复合酶制剂能够以粘胶纤维生产的压榨液为原料制备以木糖为主要成分的低聚木糖溶液，通过碳酸钠与复合酶制剂中的木聚糖酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯糖转苷酶以及脂肪醇聚氧乙烯醚产生的协同作用，大大提高木糖的转化率，取得了意料不到的技术效果，市场前景广阔。
具体实施方式
在粘胶纤维生产过程中，主要通过碱法溶解原料纸浆，具体就是利用氢氧化钠溶液将纸浆中的半纤维素溶解出来。碱溶解后，将原料进行压榨，获得的溶液即为本发明实施例中所述的粘胶纤维压榨液，其主要成分为半纤维素和氢氧化钠。
本发明实施例中采用高压液相色谱法测定木糖含量，测定方法具体为：
1原理
高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相)内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。
2实验试剂
本标准中所有试剂，在没有标准其他要求时，均指色谱级试剂和去离子水。
2.1 50mg/L EDTA钙溶液
准确称取0.1g EDTA钙与2000ml容量瓶中，用去离子水定容至刻度，过0.22um水系膜，装入专用的试剂瓶中,超声脱气5min。
2.2去离子水：杭州产地娃哈哈纯净水
2.3木糖标准溶液
分别准确称取0.1g的木糖于10ml容量瓶中，用去离子水定容到刻度，木糖、果糖含量分别为10g/L。
2.4 10％甲醇溶液
取1份甲醇+9份去离子水
3测定步骤
3.1标准曲线的制备
取木糖标准溶液(2.3)按下表稀释，为待测标准溶液：
| 混合标准溶液(ml) | 去离子水(ml) | 总体积(ml) |
| 0.1 | 0.9 | 1 |
| 0.3 | 0.7 | 1 |
| 0.5 | 0.5 | 1 |
| 0.7 | 0.3 | 1 |
| 1.0 | 0 | 1 |
3.2实验条件
高效液相色谱仪：waters 2695
检测器：waters2414示差检测器
流速：0.3ml/min
检测器温度：35℃
色谱柱：Waters suger-pkaⅠ
保护柱：Waters suger-pkaⅠ保护柱
柱温：90℃
进样温度：25℃
进样量：10ul
流动相：50mg/L EDTA钙溶液(4.1)
4样品处理
称取一定量的样品加入100ml容量瓶中，用纯净水定容，3000转离心5分钟，取上清，过滤后放到设备上测定。
5实验结果与计算
5.1标准曲线的制作
以木糖系列浓度为横坐标，色谱峰面积响应值为纵坐标，列出木糖直线回归方程：
Y木＝ac木+b Y为木糖峰面积，a、b为标准方程系数，c木为木糖浓度；
5.2样品含量计算
P木＝C木*n，P木为样品中木糖含量，C木为由标准曲线计算出来的木糖浓度，n为稀释倍数
本实施例中所述的木聚糖酶，阿魏酸酯酶，阿拉伯糖转苷酶均可采购自潍坊康地恩生物科技有限公司，其酶活分别为10000U/g，500U/g，100U/g；所述表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚和碳酸钠可购自国药集团。
实施例1
一种用于木糖生产的专用复合酶，包含木聚糖酶3Kg，阿魏酸酯酶0.5Kg，阿拉伯糖转苷酶0.2Kg，脂肪醇聚氧乙烯醚0.02Kg，碳酸钠0.8Kg。
按比例称取上述各组分，混合均匀，即得本发明所述专用复合酶。
实施例2
一种用于木糖生产的专用复合酶，包含木聚糖酶3Kg，阿魏酸酯酶1Kg，阿拉伯糖转苷酶0.5Kg，脂肪醇聚氧乙烯醚0.05Kg，碳酸钠0.5Kg。
制备方法同实施例1.
实施例3
一种用于木糖生产的专用复合酶，包含木聚糖酶3Kg，阿魏酸酯酶0.8Kg，阿拉伯糖转苷酶0.4Kg，脂肪醇聚氧乙烯醚0.01Kg，碳酸钠0.6Kg。
制备方法同实施例1.
实施例4复合酶制剂在以粘胶纤维压榨液为原料生产木糖中的应用
1、将粘胶纤维生产的压榨液经过膜脱碱浓缩，得到低碱高浓度的半纤维素溶液；
取20毫升的半纤维素溶液，与20毫升浓度为12％的稀硫酸混合，100℃高温处理90min，用碳酸钙调节pH至中性，用高压液相色谱测定里面木聚糖的总含量，结果表明获得的半纤维素溶液中木聚糖含量为50g/L；
2、用浓硫酸调节半纤维素溶液pH至5.5；
3、按50-60g/Kg木聚糖的比例加入本发明实施例1-3任意所述复合酶，50-60℃作用12-24h；
4、酶解反应结束后，升温至80℃以上，保温15min，灭活复合酶；
5、将酶解后的溶液通过板框进行固液分离，得到的澄清溶液，即为低聚木糖溶液。
利用高压液相色谱测定上述获得的低聚木糖溶液中的木糖的含量，并计算木糖的转化率，具体结果见表1。
木糖转化率＝木糖含量/总木聚糖含量×100％。
表1本发明所述复合酶对木糖转化率的影响
| 复合酶 | 添加量 | 酶解条件 | 木糖含量 | 木糖转化率 |
| 实施例1 | 60g/Kg木聚糖 | 50℃酶解24h | 46.1g/l | 92.2％ |
| 实施例2 | 55g/Kg木聚糖 | 60℃酶解12h | 47.1g/l | 94.1％ |
| 实施例3 | 50g/Kg木聚糖 | 55℃酶解20h | 46.0g/l | 92.0％ |
从表1的结果可以看出，利用本发明提供的复合酶处理粘胶纤维压榨液制备得到的木糖溶液中木糖的含量得到显著提高，木糖的转化率高达94.1％，取得了意料不到的效果。
实施例5碳酸钠的添加量对于木糖转化率的影响
1、实验设计
取实施例4步骤1制得的木聚糖含量为50g/L的半纤维素溶液；调节半纤维素溶液的pH为5.5，按55g/Kg木聚糖的比例分别加入下述复合酶样品，60℃作用12h；；酶解反应结束后，升温至80℃，保温15min，灭活复合酶；将酶解后的溶液通过板框进行固液分离，得到的澄清溶液，即为低聚木糖溶液。
复合酶酶制剂样品配方：
样品1：木聚糖酶3Kg，阿魏酸酯酶1Kg，阿拉伯糖转苷酶0.5Kg，脂肪醇聚氧乙烯醚0.05Kg，碳酸钠0Kg。
样品2：木聚糖酶3Kg，阿魏酸酯酶1Kg，阿拉伯糖转苷酶0.5Kg，脂肪醇聚氧乙烯醚0.05Kg，碳酸钠0.1Kg。
样品3：木聚糖酶3Kg，阿魏酸酯酶1Kg，阿拉伯糖转苷酶0.5Kg，脂肪醇聚氧乙烯醚0.05Kg，碳酸钠0.2Kg。
样品4：木聚糖酶3Kg，阿魏酸酯酶1Kg，阿拉伯糖转苷酶0.5Kg，脂肪醇聚氧乙烯醚0.05Kg，碳酸钠0.3Kg。
样品5：木聚糖酶3Kg，阿魏酸酯酶1Kg，阿拉伯糖转苷酶0.5Kg，脂肪醇聚氧乙烯醚0.05Kg，碳酸钠0.4Kg。
样品6：木聚糖酶3Kg，阿魏酸酯酶1Kg，阿拉伯糖转苷酶0.5Kg，脂肪醇聚氧乙烯醚0.05Kg，碳酸钠0.5Kg。
样品7：木聚糖酶3Kg，阿魏酸酯酶1Kg，阿拉伯糖转苷酶0.5Kg，脂肪醇聚氧乙烯醚0.05Kg，碳酸钠0.6Kg。
样品8：木聚糖酶3Kg，阿魏酸酯酶1Kg，阿拉伯糖转苷酶0.5Kg，脂肪醇聚氧乙烯醚0.05Kg，碳酸钠0.7Kg。
样品9：木聚糖酶3Kg，阿魏酸酯酶1Kg，阿拉伯糖转苷酶0.5Kg，脂肪醇聚氧乙烯醚0.05Kg，碳酸钠0.8Kg。
2、结果分析
分别测定利用上述复合酶样品制得的低聚木糖溶液中木糖的含量(g/l)，计算木糖的转化率。具体结果见表2。
表2碳酸钠的添加量对于木糖转化率的影响
| 复合酶 | 碳酸钠添加量 | 木糖含量 | 木糖转化率 |
| 样品1 | 0 | 12.6g/l | 25.2％ |
| 样品2 | 0.1Kg | 21.2g/l | 42.4％ |
| 样品3 | 0.2Kg | 29.6g/l | 59.1％ |
| 样品4 | 0.3Kg | 45.5g/l | 90.9％ |
| 样品5 | 0.4Kg | 46.1g/l | 92.2％ |
| 样品6 | 0.5Kg | 47.1g/l | 94.1％ |
| 样品7 | 0.6Kg | 46.0g/l | 92.0％ |
| 样品8 | 0.7Kg | 42.2g/l | 84.4％ |
| 样品9 | 0.8Kg | 42.0g/l | 84.0％ |
从表2的结果可以看出，复合酶制剂中碳酸钠的添加对木糖的转化率影响非常显著。随着复合酶制剂中碳酸钠添加量的增加，利用该复合酶制剂制备得到的低聚木糖溶液中木糖的转化率缓慢提高，但当碳酸钠在复合酶中的添加量达到0.3-0.5Kg时，木糖的转化率得到大幅提升，高达90.9％-94.1％；但当碳酸钠在复合酶中的添加量超过0.5Kg时，木糖的转化率又开始缓慢下降。从而说明，碳酸钠可以与所述复合酶中的木聚糖酶，阿魏酸酯酶，阿拉伯糖转苷酶以及表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚产生协同作用，促进木糖的转化，尤其是当碳酸钠在复合酶中的添加量为0.3-0.5Kg时，协同促进作用最强，能大幅提升木糖的转化率，取得了意料不到的技术效果。
实施例6表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚的添加量对于木糖转化率的影响
1、实验设计
取实施例4步骤1制得的木聚糖含量为50g/L的半纤维素溶液；调节半纤维素溶液的pH为5.5，按55g/Kg木聚糖的比例分别加入下述复合酶样品，60℃作用12h；；酶解反应结束后，升温至80℃，保温15min，灭活复合酶；将酶解后的溶液通过板框进行固液分离，得到的澄清溶液，即为低聚木糖溶液。
复合酶酶制剂样品配方：
样品1：木聚糖酶3Kg，阿魏酸酯酶1Kg，阿拉伯糖转苷酶0.5Kg，脂肪醇聚氧乙烯醚0Kg，碳酸钠0.5Kg。
样品2：木聚糖酶3Kg，阿魏酸酯酶1Kg，阿拉伯糖转苷酶0.5Kg，脂肪醇聚氧乙烯醚0.01Kg，碳酸钠0.5Kg。
样品3：木聚糖酶3Kg，阿魏酸酯酶1Kg，阿拉伯糖转苷酶0.5Kg，脂肪醇聚氧乙烯醚0.02Kg，碳酸钠0.5Kg。
样品4：木聚糖酶3Kg，阿魏酸酯酶1Kg，阿拉伯糖转苷酶0.5Kg，脂肪醇聚氧乙烯醚0.03Kg，碳酸钠0.5Kg。
样品5：木聚糖酶3Kg，阿魏酸酯酶1Kg，阿拉伯糖转苷酶0.5Kg，脂肪醇聚氧乙烯醚0.04Kg，碳酸钠0.5Kg。
样品6：木聚糖酶3Kg，阿魏酸酯酶1Kg，阿拉伯糖转苷酶0.5Kg，脂肪醇聚氧乙烯醚0.05Kg，碳酸钠0.5Kg。
样品7：木聚糖酶3Kg，阿魏酸酯酶1Kg，阿拉伯糖转苷酶0.5Kg，脂肪醇聚氧乙烯醚0.06Kg，碳酸钠0.5Kg。
样品8：木聚糖酶3Kg，阿魏酸酯酶1Kg，阿拉伯糖转苷酶0.5Kg，脂肪醇聚氧乙烯醚0.07Kg，碳酸钠0.5Kg。
2、结果分析
分别测定利用上述复合酶样品制得的低聚木糖溶液中木糖的含量(g/l)，计算木糖的转化率。具体结果见表3。
表3脂肪醇聚氧乙烯醚的添加量对于木糖转化率的影响
从表3的结果可以看出，复合酶制剂中表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚的添加对木糖的转化率影响非常显著。随着复合酶制剂中脂肪醇聚氧乙烯醚添加量的增加，木糖的转化率缓慢提高，但当脂肪醇聚氧乙烯醚在复合酶中的添加量达到0.05Kg时，木糖的转化率得到大幅提升，高达94.1％；但当脂肪醇聚氧乙烯醚在复合酶中的添加量超过0.06Kg时，木糖的转化率又开始缓慢下降。从而说明，脂肪醇聚氧乙烯醚可以与所述复合酶中的木聚糖酶，阿魏酸酯酶，阿拉伯糖转苷酶以及碳酸钠产生协同作用，促进木糖的转化，尤其是当脂肪醇聚氧乙烯醚在复合酶中的添加量为0.04-0.06Kg时，协同促进作用最强，能大幅提升木糖的转化率，取得了意料不到的技术效果。
以上所述仅为发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种复合酶制剂在木糖生产的应用，其特征在于，所述的复合酶制剂的组成为木聚糖酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯糖转苷酶、表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚和碳酸钠；其中木聚糖酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯糖转苷酶、表面活性剂和碳酸钠的重量比为3：1：0.5：0.04-0.06：0.3-0.6；
所述的复合酶制剂生产木糖的方法，具体步骤如下：
1)将粘胶纤维生产的压榨液经过膜脱碱浓缩，得到半纤维素溶液，取浓度为12％的稀硫酸与半纤维素溶液等体积混合，100℃高温处理90min，用碳酸钙调PH至中性；
2)用浓硫酸调节半纤维素溶液的pH至5.5，按50-60g/Kg木聚糖的比例加入所述复合酶制剂，50-60℃作用12-24h；
3)酶解反应结束后，升温至80℃以上，保温15min，灭活复合酶；
4)将酶解后的溶液通过板框进行固液分离，得到低聚木糖溶液。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的复合酶制剂中木聚糖酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯糖转苷酶、表面活性剂和碳酸钠的重量比为3：1：0.5：0.05：0.5；所述复合酶制剂中木聚糖酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯糖转苷酶的酶活分别为10000U/g、500U/g、100U/g。
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