CN107281162A - 一种稳定包埋花色苷的改性环糊精/羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种稳定包埋花色苷的改性环糊精/羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：S1.制备改性环糊精：将β‑环糊精溶于溶液中，加入碱溶液和环氧氯丙烷反应，得到改性环糊精；S2.制备羧甲基壳聚糖纳米颗粒：将1～5mg/mL的羧甲基壳聚糖水溶液，调节pH至中性，加入花色苷溶液和S1中改性环糊精，搅拌调节pH至中性后，再加入氯化钙溶液发生交联反应，得到稳定包埋花色苷的改性环糊精/羧甲基壳聚糖纳米颗粒。本发明提供的纳米颗粒能够实现对光和热均良好稳定作用，且反应温和，粒径小可控，更有利于人体吸收，对花色苷尤其是矢车菊素‑3‑O‑葡萄糖苷的吸收提供了一条生物利用度高的方法，具有较大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及提高花色苷稳定性的天然高分子材料制备技术领域，更具体地，涉及一种稳定包埋花色苷的改性环糊精/羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备方法。
背景技术
花色苷作为一种天然的植物色素，其可作为食品着色剂和添加剂，且具有良好的生理功能，但是，由于花色苷的稳定性差，使其利用度下降。花色苷的稳定性主要受到自身结构以及外界环境两方面的影响。目前，提高花色苷的稳定性的方法主要包括有辅色作用、结构修饰、微胶囊化等。提高花色苷的稳定性，对于提高其利用度、扩大应用范围、高效开发富含花色苷的农产品有着重要的意义。
微胶囊技术对提高花色苷的稳定性有着重要的作用，该技术经济可行，但是制备出的粒子大小一般为几微米至几毫米不等，形状多样，不利于体内吸收，而且多采用喷雾干燥的方法进行，制备过程温度较高，容易造成花色苷的损失。
纳米技术的发展，填补了微胶囊技术的缺陷。与微胶囊技术相比，纳米技术制备过程反应温和，粒子粒径小且可控，更有利于人体吸收。
矢车菊素-3-O-葡萄糖苷作为花色苷家族成员中的一种，其具有良好的药用价值，例如其具有的抗氧化、抗肿瘤、保护神经系统、恢复短暂性视力减弱等多种医疗保健作用，但其稳定性不佳，因此需要一种载体进行良好的负载使其效果得到充分的发挥。
发明内容
本发明根据现有技术中的不足，提供了一种稳定包埋花色苷的改性环糊精/羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种稳定包埋花色苷的改性环糊精/羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
S1.制备改性环糊精：将β-环糊精溶于溶液中，加入碱溶液和环氧氯丙烷反应，得到改性环糊精；
S2.制备羧甲基壳聚糖纳米颗粒：将1～5mg/mL的羧甲基壳聚糖水溶液，调节pH至中性，加入花色苷溶液、S1中改性环糊精，搅拌调节pH至中性后，再加入氯化钙溶液发生交联反应，得到稳定包埋花色苷的改性环糊精/羧甲基壳聚糖纳米颗粒；
S2中氯化钙溶液的浓度为1～5mg/mL；S2中改性环糊精与羧甲基壳聚糖水溶液的质量比为(1～5)：1；花色苷溶液的浓度为1～5mg/mL。
优选地，S2中花色苷溶液中花色苷为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷。
优选地，S2中氯化钙溶液的浓度为1mg/mL。
优选地，S2中氯化钙溶液与羧甲基壳聚糖水溶液的体积比为5：(1～3)。
优选地，S2中交联反应的时间为30～120min。
优选地，S2中改性环糊精与羧甲基壳聚糖水溶液的质量体积比为1：1。
优选地，花色苷溶液与羧甲基壳聚糖水溶液的体积比为1：(5～10)。
优选地，S1中用0.1％的冰醋酸调节羧甲基壳聚糖溶液至中性。
优选地，S1中β-环糊精与环氧氯丙烷的质量体积比为1：(1～3)。
优选地，S1中碱溶液为1M的NaOH水溶液。
与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：
本发明提供了一种以天然原料制备稳定包埋花色苷的纳米颗粒，上述纳米颗粒能够实现对光和热均良好稳定作用，保证了花色苷的效果，且反应温和，粒径粒径小可控，更有利于人体吸收，对花色苷尤其是矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的吸收提供了一条生物利用度高的方法，具有较大的应用前景。
附图说明
图1为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的标准曲线图。
图2为包埋花色苷(矢车菊素-3-O-葡萄糖苷)纳米颗粒的透射电镜图：(a)花色苷-羧甲基壳聚糖纳米颗粒；(b)花色苷-改性环糊精/羧甲基壳聚糖纳米颗粒。
图3分别为CMC NPs：羧甲基壳聚糖纳米颗粒(a)，C3G loaded CMC NPs：花色苷(矢车菊素-3-O-葡萄糖苷)-羧甲基壳聚糖纳米颗粒(b)，β-CD-EP/CMC NPs：改性环糊精/羧甲基壳聚糖纳米颗粒(c)和C3G loadedβ-CD-EP/CMC NPs：花色苷-改性环糊精/羧甲基壳聚糖纳米颗粒(d)的FT-IR光谱图。
图4为纳米颗粒在不同温度下处理后的花色苷含量变化图(a:40℃；b:60℃；c:80℃)。
图5为纳米颗粒在自然光下的剩余率。
图6为纳米颗粒存放时间与-ln(R％)关系图。
图7为CMC与CaCl2的质量比对纳米颗粒粒径和PDI的影响图。
图8为CaCl2浓度对纳米颗粒粒径和PDI的影响图。
图9为搅拌时间对纳米粒径和PDI的影响图。
图10为β-CD-EP对纳米颗粒粒径的影响图。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图进一步说明本发明，其实施例在附图中图示并在后面加以说明，给出了部分详细的实施方式和具体的操作过程。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1：稳定包埋花色苷的改性环糊精/羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备
(1)将1.5g的β-环糊精(β-CD)溶于5mL的无水二甲基亚砜和5mL的异丙醇混合液中，加入12.5mL的1M的NaOH水溶液，接着加入2mL的环氧氯丙烷。室温下，于氮气中搅拌48h。用盐酸调节反应溶液的pH值至7.0，用过量的丙酮沉淀反应混合物。丙酮沉淀的反应混合物用少量的去离子水溶解，转移至透析袋(MWCO，1000Da)中，以去离子水为透析介质在室温下进行透析纯化。透析结束后，收集透析袋中的样品进行冷冻干燥，得到纯化的改性环糊精(β-CD-EP)。
(2)花色苷负载改性环糊精羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备
用去离子水制备1mg/mL的羧甲基壳聚糖溶液，用0.1％的冰醋酸调节羧甲基壳聚糖溶液至中性。用去离子水制备1mg/mL花色苷(矢车菊素-3-O-葡萄糖苷)溶液0.5mL，取5mL羧甲基壳聚糖溶液，加入5g的改性环糊精(羧甲基壳聚糖溶液与改性环糊精的体积质量比为1:1)，800rpm磁力搅拌下，向5mL的混合液滴加2mL CaCl2溶液(1mg/mL)发生交联反应，继续搅拌30min，制得纳米溶液。
同时采用不加入改性环糊精的纳米颗粒进行对比，其中羧甲基壳聚糖纳米颗粒溶液的制备为：
用去离子水制备1mg/mL的羧甲基壳聚糖溶液，用0.1％的冰醋酸调节羧甲基壳聚糖溶液的pH至中性，800rpm磁力搅拌下，向5mL的羧甲基壳聚糖滴加2mL CaCl2溶液(1mg/mL)，继续搅拌30min，制得纳米溶液。
实施例2：步骤(1)同实施例1，不同的是步骤(2)中羧甲基壳聚糖溶液与CaCl2溶液的体积比为5:1。
实施例3：步骤(1)同实施例1，不同的是步骤(2)中羧甲基壳聚糖溶液与CaCl2溶液的体积比为5:3。
实施例4：步骤(1)同实施例1，不同的是步骤(2)中CaCl2溶液的浓度为2mg/mL。
实施例5：步骤(1)同实施例1，不同的是步骤(2)中CaCl2溶液的浓度为4mg/mL。
实施例6：步骤(1)同实施例1，不同的是步骤(2)中发生交联反应，继续搅拌60min。
实施例7：步骤(1)同实施例1，不同的是步骤(2)中发生交联反应，继续搅拌120min。
实施例8：步骤(1)同实施例1，改性环糊精与羧甲基壳聚糖溶液的质量体积比为2:1。
实施例9：步骤(1)同实施例1，改性环糊精与羧甲基壳聚糖溶液的质量体积比为4:1。
实施例10
(1)花色苷标准曲线的绘制
以甲酸，水和甲醇(3:47:50,v:v:v)溶液配制浓度为0.1、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的花色苷。黑暗处平衡1h后，用0.22μm膜过滤后进行HPLC-DAD检测，并绘制标准曲线。
色谱条件：应用Waters-DAD系统，色谱柱为Venusil ASB-C18(250×4.6mm；i.d.,5μm)，进样量20μL，同时在280和520nm下测定。柱温30℃。流动相A为含5％甲酸的水溶液，流动相B为甲酸，水和甲醇(5:45:50,v:v:v)。采用梯度洗脱，洗脱程序为：40％B等梯度洗脱，保持3min，流速0.4mL/min；然后线性梯度洗脱，在24min内B相由40％增大到60％，流速0.4mL/min；随后5min内B相由60％梯度增大到100％，流速为0.8mL/min，最后回到原始浓度40％B，平衡基线8min，总时间为40min。
图1是通过高效液相色谱法得到的矢车菊素-3-葡萄糖苷(C3G)标准曲线，当C3G的浓度在0.0-1.0mg/mL范围时，工作曲线显现出良好的线性关系，其标准曲线如下(公式4.1)所示：
y＝4×107x-459713 (公式4.1)
其中，y为最大吸收波长处测得的相应面积，x为C3G浓度(mg/mL)，R2＝0.9996。
样品测定：取1mL花色苷样品用0.22μm膜过滤后使用HPLC-DAD系统测定。
(2)花色苷负载纳米颗粒透射电镜分析
注:以下花色苷均为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷。
将花色苷负载纳米颗粒溶液稀释后滴在铜网膜上，用2％(w/v)的磷钨酸染色，室温干燥后，放置在透射电子显微镜(TEM)对其形态进行观察。
图2是花色苷负载羧甲基壳聚糖纳米颗粒(图a)和花色苷负载改性环糊精/羧甲基壳聚糖纳米颗粒(即实施例1中稳定包埋花色苷的改性环糊精/羧甲基壳聚糖纳米颗粒)(图b)的透射电镜图。由图可以看出，花色苷-羧甲基壳聚糖纳米颗粒和花色苷-改性环糊精/羧甲基壳聚糖纳米颗粒形态均为球形，表面光滑，比较完整，均一分散，而且无明显粘连现象。且粒径均在50nm左右。
(4)花色苷负载纳米颗粒红外分析
采用溴化钾压片法后进行红外光谱扫描。
图3显示的是羧甲基壳聚糖纳米颗粒(曲线a)，花色苷-羧甲基壳聚糖纳米颗粒(曲线b)，改性环糊精/羧甲基壳聚糖纳米颗粒(曲线c)，花色苷-改性环糊精/羧甲基壳聚糖纳米颗粒(曲线d)的红外光谱图。
在3400cm-1处的宽的是胺基和羟基的吸收峰。纳米颗粒包埋花色苷后，此位置的吸收峰向高波数移动，这表明了纳米颗粒包埋花色苷的过程主要是花色苷的-OH和纳米颗粒的-OH和-NH2产生了氢键作用。
(5)花色苷负载纳米颗粒包封率和负载率的研究
取7mL花色苷纳米溶液高速低温离心(120000rpm；30min；4℃)，取上清液体，转移至10mL容量瓶，加入0.5mL甲酸，定容。用HPLC测定上清液中花色苷的含量，按照以下负载率和包埋率公式计算花色苷纳米的包封率和负载率。具体见表1所示。
式中：m1为花色苷投入量，m2为上清液中花色苷的量，m为花色苷纳米颗粒的重量。
由表1可知，β-CD-EP/CMC NPs型花色苷纳米颗粒的包封率和负载率比CMC NPs型花色苷纳米颗粒高。花色苷的B环能够进入到β-环糊精的内腔形成包合物，β-CD-EP保留了β-CD的空腔结构，能够与花色苷产生包合作用，从而一定程度上提高了纳米颗粒的包封率。
表1花色苷纳米颗粒的包封率和负载率
(6)花色苷纳米颗粒的稳定性试验：
6.1花色苷纳米的热稳定性
将花色苷纳米溶液的pH调至中性，置于40、60、80℃的水浴锅中，每隔1h取样，HPLC测定花色苷浓度，计算花色苷剩余率。对照组为等量未经过纳米包埋的中性花色苷溶液进行相同操作。
(1)花色苷纳米颗粒的热稳定性
图4是花色苷和纳米花色苷在不同的温度(40、60、80℃)下，不同时间点的剩余率。
由图4可知，C3G的稳定性受温度的影响比较大，温度越高，降解得越快。在中性条件下，C3G经过40、60、80℃处理3h后，平均百分含量分别降至85.03％、69.85％、22.87％；花色苷-羧甲基壳聚糖纳米颗粒经过40、60、80℃处理3h后，平均百分含量分别降至90.60％、71.52％、36.14％；花色苷-改性环糊精/羧甲基壳聚糖纳米颗粒经过40、60、80℃处理3h后，平均百分含量分别降至90.90％、73.69％、42.29％。
加热处理1h内，花色苷的降解最快。经过40℃处理，C3G、花色苷-羧甲基壳聚糖纳米颗粒(C3G loaded CMC NPs)、花色苷-改性环糊精/羧甲基壳聚糖纳米颗粒(C3G loadedβ-CD-EP/CMC NPs)的平均百分含量在1h后分别降解至97.26％、97.37％、97.05％；经过60℃处理，C3G、花色苷-羧甲基壳聚糖纳米颗粒、花色苷-改性环糊精/羧甲基壳聚糖纳米颗粒的平均百分含量在1h后分别降解至80.87％、85.86％、88.19％；经过80℃处理，C3G、花色苷-羧甲基壳聚糖纳米颗粒、花色苷-改性环糊精/羧甲基壳聚糖纳米颗粒的平均百分含量在1h后分别降解至56.95％、68.63％、73.83％。
由此可见，纳米颗粒比未经纳米包埋的花色具有更高的热稳定性，这是因为纳米结构能够提高花色苷的热稳定性。而且β-CD-EP/CMC NPs包埋的花色苷的稳定性高于CMCNPs包埋的花色苷，这是因为花色苷的B环能够进入到β-环糊精的内腔形成包合物，β-CD-EP保留了β-CD的空腔结构，能够与花色苷产生包合作用，从而一定程度上提高花色苷的热稳定。
6.2花色苷的光稳定性
将花色苷纳米溶液的pH调至中性，置于自然光的条件下储存，每隔1天取样，HPLC测定花色苷浓度，计算花色苷剩余率。对照组为未经过纳米包埋的花色苷溶液进行相同操作。
(2)光稳定性
图5是在自然光下不同储存时间点的剩余率。
由5可知，花色苷的稳定性受光的影响比较大。随着自然光照射时间的延长，花色苷的含量越低。在中性条件、自然光下存放至第六天时，C3G、C3G loaded CMC NPs花色苷-羧甲基壳聚糖纳米颗粒、C3G loadedβ-CD-EP/CMC NPs花色苷-改性环糊精/羧甲基壳聚糖纳米颗粒的平均百分含量分别降至15.94％、30.93％、46.46％。存放1天后，花色苷降解最快，C3G、C3G loaded CMC NPs、C3G loadedβ-CD-EP/CMC NPs的平均百分含量分别降至65.29％、77.12％、83.18％。
图6是花色苷和花色苷纳米颗粒存放时间T与-ln(R％)关系图。以花色苷剩余百分含量对数的负值-ln(R％)(R％为花色苷和花色苷纳米的剩余百分含量)对存放时间作图，经计算可得回归方程和相关系数，可知回归方程和相关系数，可是-ln(R％)与T成线性关系，C3G、C3G loaded CMC NPs、C3G loadedβ-CD-EP/CMC NPs三组的决定系数R2分别是0.9806、0.8622、0.9644。花色苷纳米的决定系数R2比花色苷低，可能是由于纳米结构一定程度上避免了自然光对花色苷的影响所致。花色苷和纳米花色苷的反应级数(n)为1，所以花色苷和花色苷纳米的降解符合一级反应模型，这一结论和天然色素降解一般为一级反应一致。
花色苷纳米颗粒比未经纳米包埋的花色具有更高的光稳定性，这是因为纳米结构能够提高花色苷的稳定性。而且β-CD-EP/CMC NPs包埋的花色苷的稳定性高于CMC NPs包埋的花色苷，这是因为花色苷的B环能够进入到β-环糊精的内腔形成包合物，β-CD-EP保留了β-CD的空腔结构，能够与花色苷产生包合作用，从而一定程度上阻隔了光对花色苷的损失，提高花色苷的光稳定性。由此可见，改性环糊精/羧甲基壳聚糖负载体系对花色苷有光联合保护作用。
图7是实施例1～3的平均粒径和PDI图。由所测的数据可看出，随着CMC溶液与CaCl2的体积质量比的减小，CMC NPs的粒径呈现先减小后增大的现象。当CMC溶液与CaCl2的体积质量比为5:1时，纳米粒径较大，可能是因为CaCl2的质量较低，未能充分与CMC的-COO-作用，因此形成的粒子松散，且分散性较差；当CMC溶液与CaCl2的体积质量比为5:2时，CMC与CaCl2交联比例恰当，使得纳米颗粒呈现紧密状态，粒径较小；当CMC与CaCl2的溶液质量比为5:3时，纳米颗粒的粒径相应增大，这是因为CMC质量增大后，纳米颗粒发生的接触吸附机会增大，容易使得粒子发生聚集，另外，有可能是因为CMC的不断加入，包覆了之前已经形成的纳米颗粒或者团聚的纳米粒团，导致溶液体系的粒径分散不均匀，因而PDI也相应增加。
在水溶液中，羧甲基壳聚糖带负电荷，而钙离子带正电，羧甲基壳聚糖与钙离子的质量比的变化会引起纳米颗粒的表面电荷的变化，可能会导致纳米颗粒之间相互吸引和团聚。
CaCl2浓度对纳米颗粒的形成影响很大。图8是实施例1、4和5的平均粒径和PDI图。由结果可知，随着CaCl2浓度的增大，粒径和PDI都逐渐增大。这是因为大量的CMC分子链与CaCl2交联在一起，更多的分子间氢键形成，使得粒径显著地增加，纳米颗粒容易聚集在一起，分散性降低。
恰当的搅拌反应时间便可使纳米颗粒反应充分，形成的纳米颗粒大小均一，呈现良好的分散状态。图9是纳米颗粒发生交联反应时间为30min、60min、120min的平均粒径和PDI图。由所测的数据可看出，随着搅拌时间的增加，纳米颗粒的粒径并没有发生很大的改变，都保持在119nm左右，但是其PDI呈现增大的趋势，这是因为在一定的搅拌转速下，溶液中纳米颗粒在剪切力的作用下，分散均匀，在30min的时候已经反应完全，形成大小均一的粒子。当搅拌时间延长到120min时，鉴于搅拌时间的增加，在剪切力不断作用下，溶质的分子运动会增强，液滴碰撞机会增多，机械搅拌时间过长会对纳米颗粒造成破损，以上因素都有可能导致纳米颗粒碎片的产生，而使PDI增大。
图10是β-CD-EP与CMC溶液的质量体积比为0:1、1:1、2:1、4:1的平均粒径和PDI图。由所测的数据可看出，在CMC与CaCl2质量体积比相同的情况下，随着β-CD-EP浓度的增大，纳米颗粒的粒径整体呈先增大后减小的趋势。低浓度的β-CD-EP能够促进自身合并进入羧甲基壳聚糖，从而形成较大粒径的颗粒，而高浓度β-CD-EP，因其与CMC之间产生更多的氢键等分子间作用力，从而形成较小粒径纳米颗粒。当β-CD-EP与CMC溶液的质量体积比为1:1时，比没有添加β-CD-EP的纳米颗粒的粒径大，但其PDI变小，因此形成的纳米颗粒的分布和分散度更高。
Claims (10)
1.一种稳定包埋花色苷的改性环糊精/羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.制备改性环糊精：将β-环糊精溶于溶液中，加入碱溶液和环氧氯丙烷反应，得到改性环糊精；
S2.制备羧甲基壳聚糖纳米颗粒：将1～5mg/mL的羧甲基壳聚糖水溶液，调节pH至中性，加入花色苷溶液、S1中改性环糊精，搅拌调节pH至中性后，再加入氯化钙溶液发生交联反应，得到稳定包埋花色苷的改性环糊精/羧甲基壳聚糖纳米颗粒；
S2中氯化钙溶液的浓度为1～5mg/mL；S2中改性环糊精与羧甲基壳聚糖水溶液的质量体积比为(1～5)：1；花色苷溶液的浓度为1～5mg/mL。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S2中花色苷溶液中花色苷为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S2中氯化钙溶液的浓度为1mg/mL。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S2中氯化钙溶液与羧甲基壳聚糖水溶液的体积比为5：(1～3)。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S2中交联反应的时间为30～120min。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S2中改性环糊精与羧甲基壳聚糖水溶液的质量体积比为1：1。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，花色苷溶液与羧甲基壳聚糖水溶液的体积比为1：(5～10)。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S1中用0.1％的冰醋酸调节羧甲基壳聚糖溶液至中性。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S1中β-环糊精与环氧氯丙烷的质量体积比为1：(1～3)。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S1中碱溶液为1M的NaOH水溶液。
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