CN107267654B

CN107267654B - 一种spd生物标志物及其在制备诊断试剂中的应用

Info

Publication number: CN107267654B
Application number: CN201710694838.9A
Authority: CN
Inventors: 杜野; 唐建新; 马倩; 古艳丽; 杜新雅; 薛兴奎; 谢春
Original assignee: Shenzhen Longhua Peoples Hospital
Current assignee: Shenzhen Longhua Peoples Hospital
Priority date: 2017-08-15
Filing date: 2017-08-15
Publication date: 2019-11-26
Anticipated expiration: 2037-08-15
Also published as: CN107267654A

Abstract

本发明涉及一种SPD生物标志物，其为人TTC30B基因第1124位的核苷酸T，或人TTC30B基因所表达蛋白第375位的缬氨酸；还涉及上述SPD生物标志物在制备SPD诊断剂中的应用；还涉及一种SPD诊断剂，其为检测人TTC30B基因第1124位核苷酸或人TTC30B基因所表达蛋白第375位氨基酸的试剂。通过使用上述SPD生物标志物以及以其为基础研发的试剂或试剂盒，可在简单快速并且准确地诊断受检对象是否患有SPD，尤其适合产前筛查。此外，本发明的试剂或试剂盒还可用于检测健康的成年对象，用于评估受检者是否携带致病突变却由于外显不全而未表现SPD症状。

Description

一种SPD生物标志物及其在制备诊断试剂中的应用

技术领域

本发明涉及遗传病诊断领域，更特别地，涉及一种SPD生物标志物及其在制备诊断试剂中的应用。

背景技术

家族性并指(趾)畸形(Syndactyly，SD)是常见的出生缺陷之一，为不完全显性的常染色体显性遗传性疾病。其主要临床表现为相邻指(趾)间骨性或软组织融合，严重影响患者生活质量。并指(趾)多指(趾)畸形(Synpolydactyly，SPD)是SD最常见的类型之一，其临床表现最为复杂。SPD患者主要表现为手部3/4指并指和(或)足部4/5趾并趾，由于高达86％-97％的不完全外显率，不同家族间甚至同一个家族的不同患者间，畸形严重程度和次要临床特征往往不同。因此，复杂的临床表现和高不完全外显率，给SPD的临床诊断和分类带来了很大的困难。

SPD为单基因遗传病，依据致病基因不同，可分为三个亚型：SPD1由染色体2q31的HOXD13(Homeobox D13)基因突变引起，是目前报道家系最多且临床表现最为复杂的亚型；SPD2目前仅有一个家系报道，由位于染色体22q13.31的FBLN1(Fibulin-1)截短突变导致；SPD3的致病基因已被定位在染色体14q11.2-q12之间，确切致病基因仍有待进一步鉴定。除此以外，还有SPD家系的致病基因未被发现。

发明内容

发明人对一个极具代表性中国汉族SPD大家系进行研究，该SPD家系是我国目前发现的几个家系中最大、现存人数最多的家系之一，可追溯至6代共94人，其中患者27人(男性16人，女性11人)，现存患者22人(男性13人，女性9人)。在对该家族的研究过程中，发明人鉴定了一个位于人TTC30B基因的突变，该突变在该家系的所有具有SPD症状的成员中都检测到，并且在所有不表现SPD症状的成员中都未检测到。

基于以上发现，本发明提供了一种SPD生物标志物，其为人TTC30B基因第1124位的核苷酸T，或人TTC30B基因所表达蛋白第375位的缬氨酸。

本发明还提供了上述SPD生物标志物在制备SPD诊断剂中的应用。

本发明还提供了一种SPD诊断剂，其为检测人TTC30B基因第1124位核苷酸或人TTC30B基因所表达蛋白第375位氨基酸的试剂。

在一个实施方案中，所述SPD诊断剂为用于检测人TTC30B基因第1124位核苷酸的测序引物或探针。

在一个具体实施方案，所述测序引物根据人TTC30B基因序列或人TTC30B基因两侧的序列设计。

本发明还提供了一种SPD诊断试剂盒，其包含上述SPD诊断剂。

在一个优选实施方案中，所述SPD诊断试剂盒包含用于检测人TTC30B基因第1124位核苷酸的测序引物，并且还包含用于测序的其他试剂。

通过使用上述SPD生物标志物以及以其为基础研发的试剂或试剂盒，可在简单快速并且准确地诊断受检对象是否患有SPD，尤其适合产前筛查。此外，本发明的试剂或试剂盒还可用于检测健康的成年对象，用于评估受检者是否携带致病突变却由于外显不全而未表现SPD症状。

附图说明

图1为本发明所研究的SPD家系的家系图谱；

图2为对SPD患者(IV2、IV3、V7、V8、VI10、IV13和V23)和健康者(IV12、VI14和V22)的TTC30B基因第1124位的核苷酸检测的测序谱图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.外显子组测序

发明人针对中国汉族的一个SPD家系进行研究，该家系可追溯至6代、94人，其中患者27人(男性16人，女性11人)，现存患者22人(男性13人，女性9人)。家系图谱如图1所示，可看出，该疾病为单基因常染色体显性遗传。

与SPD1家系的临床特征相似，不同患者间临床表现差异较大，同时个别患者伴有不同程度的次要特征，如手指变短(IV23)，手指弯曲(VI23)等，且不同患者间疾病的严重程度明显不同。先证者(V23)表现为典型的3/4指并指并发足多趾。

从该家系选出3个病人(IV2、IV3、IV13和V23)和3个健康人(IV12和V22)，进行外显子组测序，通过生物信息学方法鉴定可能的致病突变。每个人的外显子组全长51391525bp，6个样品分别测了约50倍和100倍的深度，覆盖外显子组目标区域的95％以上。将测得的序列和参考序列通过生物信息学方法比较，鉴定不同的点突变和InDel(插入缺失)突变，综合分析了不同突变位点在基因组的位置。

2.有害突变位点的鉴定

测序并分析后，发现患者相对于健康者的外显子中发生了434个单核苷酸多态性(SNP)，其中38个SNP为病例中特有的突变，病例特有的38个突变中，有3个为非同义突变，其中有一个被预测为有害突变。

该有害突变位点位于基因组第2号染色体，178416368位，TTC30B基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所表达的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)的第1124位，由C突变成T，导致该蛋白第375位氨基酸由A突变成V。通过搜索目前常用的突变位点信息数据库，发现，该位点在千例基因组数据库、Hapmap计划数据库中都未被发现，而在dbSNP和ExAC数据库，位点的频率都是极低的，基本可以说明在正常人群体不携带这个致病突变。该突变的分析信息如表1所示。

表1预测为有害的突变的分析信息

3.致病突变的验证

3.1 PCR-Sanger测序

利用PCR-Sanger测序方法，对突变为点在家系大部分病人和健康人中进行验证，结果发现，病人中都为杂合突变，健康人中为纯合的参考序列。设计的测序引物序列如下：

TTC30B-for：5’-AACTTCCACACATCATGGTCG-3’(SEQ ID NO:3)

TTC31B-rev：5’-ACTTCTTGGACGCTGTGATCAC-3’(SEQ ID NO:4)

这两条引物均可检测到靶位点。

3.2 SNaPshot检测

SNaPshot技术又称为小测序技术，是由美国应用生物公司(ABI)开发的主要针对中等通量(<20)的SNP分型项目的分型技术。其原理跟一代测序类似：在一个含有测序酶，四种荧光标记的ddNTP(注意：这里只有ddNTP，并没有测序反应中的dNTP)，紧挨多态位点5’端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止。经ABI测序仪跑胶后，根据峰的颜色可知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型，针对不同的SNP位点设计不同长度的延伸引物来做到多个SNP在一个反应体系中进行分型。在本例中，我们设计的检测引物为：5’-CCAGACAGCTCCTGAAGAGG-3’(SEQ ID NO:5)。

3.3 TaqMan探针检测

应用一对双标记Taqman探针，分别针对双等位SNP的不同基因型，只有完全匹配的探针扩增出各自对应的基因型；用两种荧光染料Fam，Hex(Vic)分别标记这两种探针，就可以在一次PCR反应中完成对单个SNP位点的基因型判定。在本例中，我们设计的检测探针对为：

TTC30B-TaqMan-ref：5’-TCCTGAAGAGGCTTTCATTAA-3’(SEQ ID NO:6)

TTC30B-TaqMan-mut：5’-TCCTGAAGAGGTTTTCATTAA-3’(SEQ ID NO:7)。

对SPD患者(IV2、IV3、V7、V8、VI10、IV13和V23)和健康者(IV12、VI14和V22)进行测序验证。结果如图2所示，受检的所有SPD患者均检出该位点的C到T的突变，为C/T杂合体，而健康者则均为纯合的C。

以上虽然都是针对核酸序列进行检测，并且还给出了具体的测序引物，但是这些具体的技术特征均为举例说明的作用，并非用以限制本发明。本领域技术人员应当知道，当鉴定了该生物标志物后，可运用任何本领域已知技术来检测该生物标志物。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 深圳市龙华区人民医院

<120> 一种SPD生物标志物及其在制备诊断试剂中的应用

<130> 1

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1998

<212> DNA

<213> 人

<400> 1

atggctggcc tgagcggcgc gcagatcccc gacggggagt tcaccgcggt cgtgtaccgc 60

ctcatccgca atgcacgcta cgccgaggcg gtgcagctgc tgggcggaga actgcagcgg 120

agccctagga gccgcgccgg cctgtcgctg ctaggctact gctactaccg cctgcaggag 180

ttcgcgctgg cggccgagtg ctatgagcag ctgggccagc tgcacccgga actggagcag 240

taccgcctgt accaggccca ggccctatac aaggcctgcc tttatgcgga ggccacccgg 300

gtcgccttcc ttctcctgga taaccccgcc taccacagcc gggtcctcca cctgcaagct 360

gctatcaagt acagcgaggg cgatctgcca gggtccagga gcctggtaga gcagctgccg 420

agtagggaag ggggagagga aagtgggggc gagaatgaga ccgatggcca gatcaacctg 480

ggttgtttgc tctacaagga gggacagtat gaagctgcat gctccaagtt ttttgccgcc 540

ctgcaggcct cgggctacca gcctgacctt tcctacaacc tggctttggc ctattacagc 600

agccgacagt atgcttcagc actgaagcat atcgctgaga ttattgagcg tggcatccgc 660

cagcaccctg agctaggtgt gggcatgacc actgagggca ttgatgttcg cagtgttggc 720

aacaccttag tcctccatca gactgctctg gtggaagcct tcaaccttaa ggcagctata 780

gaataccaac tgagaaacta tgaggcagct caagaagccc tcactgacat gccacccagg 840

gcagaggaag agttggaccc tgtgacccta cacaaccagg cactaatgaa catggatgcc 900

aggcctacag aagggtttga aaagctacag tttttgctcc aacagaatcc ctttcctcca 960

gagacttttg gcaacctgtt gctgctctac tgtaaatatg agtattttga cctggcagca 1020

gatgtcctgg cagaaaatgc ccatttgatt tataagttcc tcacacccta tctctatgac 1080

ttcttggacg ctgtgatcac ttgccagaca gctcctgaag aggctttcat taagcttgat 1140

gggctagcag ggatgctgac tgaggtcctc cggaaactta ccatacaagt acaggaagca 1200

agacacaata gagatgatga agctatcaaa aaggcagtga atgaatatga tgaaaccatg 1260

gagaaataca ttcctgtgtt gatggctcag gcaaaaatct actggaatct tgaaaattat 1320

ccaatggtgg aaaagatctt ccgcaaatct gtggaattct gtaacgacca tgatgtgtgg 1380

aagttgaatg tggctcatgt tctgttcatg caggaaaaca aatacaaaga agccattggt 1440

ttctatgaac ccatagtcaa gaagcattat gataacatcc tgaatgtcag tgctattgta 1500

ctggctaatc tctgtgtttc ctatattatg acaagtcaaa atgaagaagc agaggagttg 1560

atgaggaaga ttgaaaagga ggaagagcag ctctcttatg atgacccaga taagaaaatg 1620

taccatctct gcattgtgaa tttggtgata ggaactcttt attgtgccaa aggaaattat 1680

gactttggta tttctcgagt tatcaaaagc ttggaacctt acaacaaaaa gctgggaaca 1740

gacacctggt attatgccaa aagatgcttc ctgtccttgt tagaaaacat gtcaaaacac 1800

acaatcatgc ttcgtgatag tgttattcaa gaatgtgtcc agtttctaga acactgtgaa 1860

cttcatggca gaaacatacc tgctgttatt gaacaacccc tggaagaaga aagaatgcat 1920

gttggaaaga atacagtcac atatgagtct aggcagttaa aagctttgat ttatgagatt 1980

ataggatgga atatatag 1998

<210> 2

<211> 665

<212> PRT

<213> 人

<400> 2

Met Ala Gly Leu Ser Gly Ala Gln Ile Pro Asp Gly Glu Phe Thr Ala

1 5 10 15

Val Val Tyr Arg Leu Ile Arg Asn Ala Arg Tyr Ala Glu Ala Val Gln

20 25 30

Leu Leu Gly Gly Glu Leu Gln Arg Ser Pro Arg Ser Arg Ala Gly Leu

35 40 45

Ser Leu Leu Gly Tyr Cys Tyr Tyr Arg Leu Gln Glu Phe Ala Leu Ala

50 55 60

Ala Glu Cys Tyr Glu Gln Leu Gly Gln Leu His Pro Glu Leu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Arg Leu Tyr Gln Ala Gln Ala Leu Tyr Lys Ala Cys Leu Tyr Ala

85 90 95

Glu Ala Thr Arg Val Ala Phe Leu Leu Leu Asp Asn Pro Ala Tyr His

100 105 110

Ser Arg Val Leu Arg Leu Gln Ala Ala Ile Lys Tyr Ser Glu Gly Asp

115 120 125

Leu Pro Gly Ser Arg Ser Leu Val Glu Gln Leu Pro Ser Arg Glu Gly

130 135 140

Gly Glu Glu Ser Gly Gly Glu Asn Glu Thr Asp Gly Gln Ile Asn Leu

145 150 155 160

Gly Cys Leu Leu Tyr Lys Glu Gly Gln Tyr Glu Ala Ala Cys Ser Lys

165 170 175

Phe Phe Ala Ala Leu Gln Ala Ser Gly Tyr Gln Pro Asp Leu Ser Tyr

180 185 190

Asn Leu Ala Leu Ala Tyr Tyr Ser Ser Arg Gln Tyr Ala Ser Ala Leu

195 200 205

Lys His Ile Ala Glu Ile Ile Glu Arg Gly Ile Arg Gln His Pro Glu

210 215 220

Leu Gly Val Gly Met Thr Thr Glu Gly Ile Asp Val Arg Ser Val Gly

225 230 235 240

Asn Thr Leu Val Leu His Gln Thr Ala Leu Val Glu Ala Phe Asn Leu

245 250 255

Lys Ala Ala Ile Glu Tyr Gln Leu Arg Asn Tyr Glu Ala Ala Gln Glu

260 265 270

Ala Leu Thr Asp Met Pro Pro Arg Ala Glu Glu Glu Leu Asp Pro Val

275 280 285

Thr Leu His Asn Gln Ala Leu Met Asn Met Asp Ala Arg Pro Thr Glu

290 295 300

Gly Phe Glu Lys Leu Gln Phe Leu Leu Gln Gln Asn Pro Phe Pro Pro

305 310 315 320

Glu Thr Phe Gly Asn Leu Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Tyr Glu Tyr Phe

325 330 335

Asp Leu Ala Ala Asp Val Leu Ala Glu Asn Ala His Leu Ile Tyr Lys

340 345 350

Phe Leu Thr Pro Tyr Leu Tyr Asp Phe Leu Asp Ala Val Ile Thr Cys

355 360 365

Gln Thr Ala Pro Glu Glu Ala Phe Ile Lys Leu Asp Gly Leu Ala Gly

370 375 380

Met Leu Thr Glu Val Leu Arg Lys Leu Thr Ile Gln Val Gln Glu Ala

385 390 395 400

Arg His Asn Arg Asp Asp Glu Ala Ile Lys Lys Ala Val Asn Glu Tyr

405 410 415

Asp Glu Thr Met Glu Lys Tyr Ile Pro Val Leu Met Ala Gln Ala Lys

420 425 430

Ile Tyr Trp Asn Leu Glu Asn Tyr Pro Met Val Glu Lys Ile Phe Arg

435 440 445

Lys Ser Val Glu Phe Cys Asn Asp His Asp Val Trp Lys Leu Asn Val

450 455 460

Ala His Val Leu Phe Met Gln Glu Asn Lys Tyr Lys Glu Ala Ile Gly

465 470 475 480

Phe Tyr Glu Pro Ile Val Lys Lys His Tyr Asp Asn Ile Leu Asn Val

485 490 495

Ser Ala Ile Val Leu Ala Asn Leu Cys Val Ser Tyr Ile Met Thr Ser

500 505 510

Gln Asn Glu Glu Ala Glu Glu Leu Met Arg Lys Ile Glu Lys Glu Glu

515 520 525

Glu Gln Leu Ser Tyr Asp Asp Pro Asp Lys Lys Met Tyr His Leu Cys

530 535 540

Ile Val Asn Leu Val Ile Gly Thr Leu Tyr Cys Ala Lys Gly Asn Tyr

545 550 555 560

Asp Phe Gly Ile Ser Arg Val Ile Lys Ser Leu Glu Pro Tyr Asn Lys

565 570 575

Lys Leu Gly Thr Asp Thr Trp Tyr Tyr Ala Lys Arg Cys Phe Leu Ser

580 585 590

Leu Leu Glu Asn Met Ser Lys His Thr Ile Met Leu Arg Asp Ser Val

595 600 605

Ile Gln Glu Cys Val Gln Phe Leu Glu His Cys Glu Leu His Gly Arg

610 615 620

Asn Ile Pro Ala Val Ile Glu Gln Pro Leu Glu Glu Glu Arg Met His

625 630 635 640

Val Gly Lys Asn Thr Val Thr Tyr Glu Ser Arg Gln Leu Lys Ala Leu

645 650 655

Ile Tyr Glu Ile Ile Gly Trp Asn Ile

660 665

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aacttccaca catcatggtc g 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acttcttgga cgctgtgatc ac 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccagacagct cctgaagagg 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcctgaagag gctttcatta a 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tcctgaagag gttttcatta a 21

Claims

1.一种并指(趾)多指(趾)畸形生物标志物在制备并指(趾)多指(趾)畸形诊断剂中的应用，所述并指(趾)多指(趾)畸形生物标志物为人TTC30B基因第1124位的核苷酸T，或人TTC30B基因所表达蛋白第375位的缬氨酸。