CN107236678B - 一种复合菌剂转化土壤弱酸结合态镉的方法 - Google Patents

一种复合菌剂转化土壤弱酸结合态镉的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种复合菌剂转化土壤弱酸结合态镉的方法，由以下两个菌群混合后富集培养得到：（1）假丝酵母菌、单胞瓶霉菌、圆红东孢酵母菌、隐球菌组成菌群1；（2）嗜酸氧化亚铁硫杆菌、嗜中高温嗜酸古菌、嗜热硫氧化硫杆菌、嗜铁钩端螺旋菌、氧化硫硫杆菌组成菌群2。培养好后，将得到的菌剂导入有镉污染的土壤中，经过一定时间的翻搅，使其充分反应，可以高效转化土壤弱酸态镉。

Description

一种复合菌剂转化土壤弱酸结合态镉的方法
技术领域
本发明涉及处理重金属镉的微生物学方法，是利用绿色化的生物技术，尤其利用一种复合菌剂高效转化土壤弱酸结合态镉的方法。
背景技术
近年来，土壤重金属修复越来越偏向于生物修复，其中植物修复比较普遍，但高富集植物的驯化培养以及生长周期长等因素限制了植物修复的发展，而生物浸出以其经济高效的优势凸显出来。生物浸出技术早已广泛应用于冶金领域当中，但是由于土壤体系比较复杂，重金属存在形式多样，生物浸出技术在土壤重金属治理方面还涉足未深，大多仅限于实验室的摇瓶浸出，这在实际应用中是难以实现的。
土壤污染修复根据方法可分为三类：物理化学治理法、化学治理法、生物治理法。传统的物化治理法和化学治理法面临的主要问题是成本高，实施复杂，周期长，并且容易产生二次污染。如客土和换土法是典型的物理治理法，客土是指在污染的土壤上加入未污染的土，而换土是指用为污染的土替代污染土壤，这两种措施都不能从本质上减少重金属含量且只限于小规模使用。而典型的化学治理法如沉淀吸附法则是将重金属固定化，固定化技术面临的最大的问题就是土壤中总的金属含量并未减少，随着时间推移，已经被固定的重金属可能再次被植物利用。生物治理法包括植物修复法，动物修复法以及微生物修复法。植物修复法虽然不会破坏土壤理化性质，但植物培养周期长，超量积累重金属往往会导致植物生长缓慢。鉴于传统方法的局限性，具有成本低、效率高、对环境影响较小的的微生物修复法应运而生。
发明内容
本发明的目的是提出一种复合菌剂高效转化土壤弱酸结合态镉的方法。该方法利用绿色化的生物高效转化土壤弱酸结合态镉的技术，对环境造成零污染，浸出液中杂质少，投资运行成本均比常规方法低。
一种复合菌剂高效转化土壤弱酸结合态镉的方法：将所述的复合菌剂投入镉污染土壤中，充分翻搅，混匀；静置，待土壤沉淀，排掉上清液；
所述的复合菌剂由以下两个菌群混合后富集培养得到：
71.5％假丝酵母菌(Candida)、13.5％单胞瓶霉菌(Phialemonium)、10％圆红东孢酵母菌(Rhodosporidium toruloides)、5％ 隐 球 菌 ( Cryptococcus )的数量比例组成菌群 1 ；嗜酸氧化亚铁硫杆菌(A .ferrooxidans)、嗜中高温嗜酸古菌(F.thermophilum)、嗜热硫氧化硫杆菌(S.thermosulfidooxidnas)、嗜铁钩端螺旋菌(L.ferriphilum)、氧化硫硫杆菌(A.thiooxidans)5个菌种按1:1:1:1:1的数量比例组成菌群2；假丝酵母菌(Candida)由近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、热带假丝酵母 (Candida tropicalis)以及粗壮假丝酵母(Candida valida)组成，三种菌的数量比例为5:2:3；隐球菌(Cryptococcus)由罗伦特隐球菌(Cryptococcus laurentii)、维多利亚隐球酵母菌(Cryptococcus victoriae)和新型隐球菌(Filobasidiella bacillispora)组成，三种菌的数量比例为3:2:2。
所述的复合菌剂高效转化土壤弱酸结合态镉的方法，具体包括以下步骤：
①按照40L/亩-60L/亩的比例施加微生物制剂到镉污染土壤；
②用农用翻耕机翻地1小时以上，沉降至少4小时后排水至回收池；
③每1-2天重复步骤①②一次，微生物制剂用镉已被回收处理的微生物制剂；如此反复处理至少3次。
所述的菌剂中的各种菌在混合之前在含有镉的培养基中进行驯化；驯化的具体步骤及条件如下：将菌置于100mL灭菌的含有0.5％-1.5％9K培养基、4‰-12‰葡萄糖、4‰-9‰硫粉以及CdSO4的培养基中，在转速为150-200rpm温度为22-27℃条件下驯化至少30代，驯化时CdSO4的浓度梯度为0.5mmol/L，培养基中CdSO4含量从0.5增加到15.0mmol/L。
作为进一步的改进，将菌群1、菌群2接种到富集培养基中，曝气培养后，经过8—12次转接培养后获得微生物菌剂。
作为进一步的改进，将菌浓均为2.0×107-3.5×107个/mL的菌群1、菌群2和水按照3:2:5的体积比例混合，初始接种量为2％-5％接种到富集培养基中，曝气培养后，将所培养的富集物以8％—15％的体积比例转接到新鲜的培养基中，继续曝气培养，经过8—12次转接培养后获得微生物菌剂。
富集培养基组成如下：7％-11％9K培养基+4‰-9‰酵母粉+4‰-12‰葡萄糖+4‰-9‰硫粉＋0.3‰-0.8‰磁黄铁矿，将体系定容到50L；
所述的9K培养基成分如下：蒸馏水1000mL，(NH4)2SO4 (0.3g/L)，K2HPO4 (0.05g/L)，KCl (0.01g/L)，Ca(NO3)2 (0.001g/L)，MgSO4·7H2O (0.05g/L)；
培养基不做高压灭菌处理，直接将各组成成分加入曝气柱中。
作为进一步的改进，曝气培养条件为：初始pH2.5—3.0，温度20—30℃，曝气量DO2条件下富集培养1—3天。培养后富集物菌浓达5.0×108个/mL-8.0×108个/mL，pH降至1.3-1.5。
近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)以及粗壮假丝酵母(Candida valida) 、罗伦特隐球菌(Cryptococcus laurentii)可在中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)购买，编号分别为31861、1316、32439、32267；维多利亚隐球酵母菌(Cryptococcus victoriae)和新型隐球菌(Filobasidiella bacillispora)、嗜酸氧化亚铁硫杆菌(A .ferrooxidans)、嗜中高温嗜酸古菌(F.thermophilum)、嗜热硫氧化硫杆菌(S.thermosulfidooxidnas)、嗜铁钩端螺旋菌(L.ferriphilum)、氧化硫硫杆菌(A.thiooxidans)、单胞瓶霉菌(Phialemonium)、圆红东孢酵母菌(Rhodosporidium toruloides)可从北京莱耀生物科技有限公司购买。
本发明采用的菌群1通过将镉污染土壤中具有镉转化功能的微生物富集培养起来，最终通过测序获得主要微生物的种类和数量比例，然后据此复配得到菌群1，再与菌群2混合进行曝气培养，生成微生物菌剂。该菌剂能将镉从土壤中高效转化为土壤弱酸结合态镉 ,实现了在绿色化无污染条件下转化为弱酸结合态镉。在转化过程中,不需要添加其他物质,故减少了生产成本。该生物法绿色环保,工艺简单,易于推广。
本发明制备的复合微生物菌剂生长速度快，产酸能力强，接种培养第三天pH值降到1.5，菌浓达到5x108个/mL以上。
具体实施方式
本发明有下列实施例进一步说明,但不受这些实施例的限制。
实施例1：
实施例1：耐镉微生物的采集、培养和驯化
由71.5％假丝酵母菌(Candida)、13.5％单胞瓶霉菌(Phialemonium)、10％圆红东孢酵母菌(Rhodosporidium toruloides)、5％隐球菌(Cryptococcus)组成菌群1；假丝酵母菌(Candida)由近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)以及粗壮假丝酵母(Candida valida)组成，三种菌的数量比例为5:2:3；隐球菌(Cryptococcus)由罗伦特隐球菌(Cryptococcus laurentii)、维多利亚隐球酵母菌(Cryptococcus victoriae)和新型隐球菌(Filobasidiella bacillispora) 组成，三种菌的数量比例为3:2:2；
混合之前各菌分别在含镉培养基中进行驯化，驯化的具体步骤及条件如下：将菌置于100mL灭菌的含有10％9K、8‰葡萄糖、4‰硫粉及浓度梯度为0.5mmol/L、1.0mmol/L 、1.5mmol/L 、2.0mmol/L 、…、14.5mmol/L 、15.0mmol/L CdSO4的培养基中，在转速为180rpm温度为25℃条件下驯化30代。
然后将嗜酸氧化亚铁硫杆菌（A.ferrooxidans,A.f）、嗜中高温嗜酸古菌（F.thermophilum）、嗜热硫氧化硫杆菌（S.thermosulfidooxidnas）、嗜铁钩端螺旋菌（L.ferriphilum）、氧化硫硫杆菌（A.thiooxidans，A.t）5个菌种按1:1:1:1:1的比例组成菌群2；混合之前各菌分别在含镉培养基中进行驯化。驯化的具体步骤及条件如下：将菌置于100mL灭菌的含有10％9K、8‰葡萄糖、4‰硫粉及浓度梯度为0.5mmol/L、1.0mmol/L 、1.5mmol/L 、2.0mmol/L 、…、14.5mmol/L 、15.0mmol/L CdSO4的培养基中，在转速为180rpm温度为25℃条件下驯化30代。
富集培养基的配制：10％9K培养基+4‰酵母粉+8‰葡萄糖+4‰硫粉＋0.8‰磁黄铁矿，将体系定容到50L。9K培养基成分如下：蒸馏水1000mL，(NH4)2SO43g/L，K2HPO40.5g/L，KCl0.1g/L，Ca(NO3)20.01g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L。由于此富集培养基体系为50L，属于大体系，故培养基不做高压灭菌处理，直接将各组成成分加入曝气柱中。
将菌浓均为3.0×107个/mL菌群1、菌群2和自来水按照3:2:5的体积比例混合，再按照2％-5％接种到富集培养基中，在30℃，曝气量为DO2的条件下培养3天，pH降到1.5，菌浓为2×108个/mL。
将第一次富集的微生物以10%的浓度接种于培养基中，调节pH2.8，在相同条件下培养。重复传代8次后得到生长周期短，活性好的菌群。pH值在最后一次传代培养的第三天降到1.5，菌浓达到5x108个/mL。
实施例2：
本实施例在实验土壤里进行实地效果验证，情况如下，取湖南省长沙市北山镇环境治理VIP实验示范区污染农田土壤，对土壤内的Cd含量进行3次测量后取平均值为2.31ppm，应用本发明微生物制剂的具体步骤如下：①在被污染的土壤表面积按照40L/亩-60L/亩的比例均匀施加微生物制剂。②用农用翻耕机翻地1小时，沉降过夜后排水至回收池，测定土壤中的镉含量。③每1-2天重复步骤①②一次，微生物制剂可用回收处理过的，即溶液中的镉已被回收处理微生物制剂。如此反复处理3次，即可将被重金属污染的土壤修复成相对良性的土壤。经检测：处理后的土壤Cd（镉）含量为0.11pmm，国家标准为Cd（镉）含量不大于0.20ppm。
本发明适用于富水、温润地域或洼地,尤其适用于水稻种植区域。
对比例1：
将本发明菌群1中的各种菌按照实施例1中相同方法进行驯化，然后按照实施例1相同的方法进行富集培养，最后得到的菌剂按照实施例1相同的方法进行土壤镉的处理，发现镉的去除率仅为12.8%。
对比例2：
将本发明菌群2中的各种菌按照实施例1中相同方法进行驯化，然后按照实施例1相同的方法进行富集培养，最后得到的菌剂按照实施例1相同的方法进行土壤镉的处理，发现镉的去除率仅为33.4%。
对所公开的实施例的上述说明,仅为了使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种复合菌剂转化土壤弱酸结合态镉的方法，其特征在于：将所述的复合菌剂投入镉污染土壤中，充分翻搅，混匀；静置，待土壤沉淀，排掉上清液；所述的复合菌剂由菌群1和2混合后富集培养得到：71.5％假丝酵母菌(Candida)、13.5％单胞瓶霉菌(Phialemonium)、10％圆红东孢酵母菌(Rhodosporidium toruloides)、5％ 隐 球 菌 ( Cryptococcus )的数量比例组成菌群 1 ；嗜酸氧化亚铁硫杆菌(A .ferrooxidans)、嗜中高温嗜酸古菌(F.thermophilum)、嗜热硫氧化硫杆菌(S.thermosulfidooxidnas)、嗜铁钩端螺旋菌(L.ferriphilum)、氧化硫硫杆菌(A.thiooxidans)5个菌种按1:1:1:1:1的数量比例组成菌群2；假丝酵母菌(Candida)由近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)以及粗壮假丝酵母(Candida valida)组成，三种菌的数量比例为5:2:3；隐球菌(Cryptococcus)由罗伦特隐球菌(Cryptococcus laurentii)、维多利亚隐球酵母菌(Cryptococcus victoriae)和新型隐球菌(Filobasidiella bacillispora)组成，三种菌的数量比例为3:2:2。
2.根据权利要求1所述的复合菌剂转化土壤弱酸结合态镉的方法，其特征在于，包括以下步骤：①按照40L/亩‐60L/亩的比例施加微生物制剂到镉污染土壤；②用农用翻耕机翻地1小时以上，沉降至少4小时后排水至回收池；③每1‐2天重复步骤①②一次，微生物制剂用镉已被回收处理的微生物制剂；如此反复处理至少3次。
3.根据权利要求1或2所述的复合菌剂转化土壤弱酸结合态镉的方法，其特征在于，菌群中的各种菌在混合之前在含有镉的培养基中进行驯化；驯化的具体步骤及条件如下：将菌置于100mL灭菌的含有0.5％-1.5％9K培养基、4‰-12‰葡萄糖、4‰-9‰硫粉以及 CdSO4的培养基中，在转速为150-200rpm温度为22-27℃条件下驯化至少30代，驯化时CdSO4 的浓度梯度为0.5mmol/L，培养基中CdSO4含量从0.5增加到15.0mmol/L。
4.根据权利要求1或2所述的复合菌剂转化土壤弱酸结合态镉的方法，其特征在于，将菌群1、菌群2接种到富集培养基中，曝气培养后，经过8—12次转接培养后获得微生物菌剂。
5.根据权利要求1或2所述的复合菌剂转化土壤弱酸结合态镉的方法，其特征在于，将菌浓均为2.0×107-3.5×107个/mL的菌群1、菌群2和水按照体积比例3:2:5混合，初始接种量为2％-5％接种到富集培养基中，曝气培养后，将所培养的富集物以 8％-15％的体积比例转接到新鲜的培养基中，继续曝气培养，经过8-12次转接培养后获得微生物菌剂。
6.根据权利要求1或2所述的复合菌剂转化土壤弱酸结合态镉的方法，其特征在于，富集培养基组成如下：7％-11％9K培养基+4‰-9‰酵母粉+4‰-12‰葡萄糖+4‰-9‰硫粉+0.3‰-0.8‰磁黄铁矿，将体系定容到50L；所述的9K培养基成分如下：蒸馏水1000mL，(NH4)2SO4 0.3g/L，K2HPO4 0.05g/L，KCl 0.01g/L，Ca(NO3)2 0.001g/L，MgSO4·7H2O 0.05g/L；培养基不做高压灭菌处理，直接将各组成成分加入曝气柱中。
7.根据权利要求1或2所述的复合菌剂转化土壤弱酸结合态镉的方法，其特征在于，曝气培养条件为：初始pH2.5-3.0，温度20-30℃，曝气量DO2条件下富集培养1-3天。
8.根据权利要求1或2所述的复合菌剂转化土壤弱酸结合态镉的方法，其特征在于，培养后富集物菌浓达5.0×108个/mL-8.0×108个/mL，pH降至1.3-1.5。
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