CN107233223A - 控制诱导黑色素靶向组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种控制诱导黑色素靶向组合物及其应用，该组合物包括苯基苯并咪唑磺酸、十一碳烯酰基苯丙氨酸、水解贝壳蛋白、甘草酸二钾和羟苯基丙酰胺苯甲酸。上述控制诱导黑色素靶向组合物采用苯基苯并咪唑磺酸防晒抵御紫外线，利用十一碳烯酰基苯丙氨酸抑制α‑MSH促黑素表达，利用水解贝壳蛋白抑制内皮激素BT‑1表达，利用羟苯基丙酰胺苯甲酸和甘草酸二钾共同抑制炎症因子。针对诱导黑色素形成的四个靶向全方位控制，从而达到降低皮肤色素沉着和产生色斑的几率。

Description

控制诱导黑色素靶向组合物及其应用

技术领域

本发明涉及化妆品技术领域，特别是涉及一种控制诱导黑色素靶向组合物及其应用。

背景技术

随着现代生活水平的提高，人们越来越注重外部形象。以美好的形象在各自活动和场合增加自信，同时在美好的外表下，追求皮肤的健康，以健康的皮肤和美好的形象展现人们对高端生活的追求。

东方女性历来推崇“肤如雪，凝如脂”的肌肤至高境界。人们已经不再满足于以粉等来掩饰面部瑕疵，而是更加追求自然的美白效果更加关注健康的美白方式。

黑色素的形成过程，存在于黑色素细胞组织中的酪氨酸在酪氨酸酶的作用下逐步转化为纯黑色素和褐黑素，进而黑色素细胞组织将黑色素转移至表皮基底层细胞中，随着细胞的新陈代谢而被带到角质层中，随着角质化细胞脱落。但当黑色过速增长或分布不均时，就会造成局部皮肤过黑及色素沉着。

世界上第一款美白产品于1897年正式问世于日本资生堂，其发展经历以下阶段：

第一阶段：“增白”阶段。主要以表面遮盖，物理性增白成分为主，简单强调产品令肌肤更加白的表观特性，如早期的增白粉蜜等。但其给皮肤带来诸多弊端，不仅对肌肤无实质性增白，促白作用，还会因长期使用造成毛孔或皮脂腺堵塞，影响排汗和新陈代谢，导致皮肤疾病(如局部炎症、痤疮等)的发生，其“增白”只是一种遮盖性暂时的增白。

第二阶段：“漂白”阶段。常通过天然矿物等物理磨剥成分或果酸等化学成分，磨剥或刺激表皮角质层细胞使其快速脱落，从而达到换肤漂白的目的，如磨砂膏或焕肤霜等。长期使用可至肌肤免疫力下降，是一种典型的治标不治本的美白方式。

第三阶段：“协同”美白阶段。通过添加多种美白成分，多方位干扰黑色的形成或加速其分解代谢，相对前者而言，第三代无论在原料选择和美白机理认知和应用方面都有了质的飞跃，能解决皮肤美白的基本问题，但它依然停留在外部干扰阻扰美白阶段。

传统针对皮肤美白大部分停留在抑制酪氨酸酶活性的阶段，并没有针对影响皮肤黑色素含量的因素进行综合靶向的全面控制，导致美白效果不佳。

发明内容

基于此，本发明的目的是提供一种控制诱导黑色素靶向的组合物。

具体的技术方案如下：

一种控制诱导黑色素靶向组合物，包括苯基苯并咪唑磺酸、十一碳烯酰基苯丙氨酸、水解贝壳蛋白、甘草酸二钾和羟苯基丙酰胺苯甲酸。

在其中一些实施例中，所述控制诱导黑色素靶向组合物包括如下质量份的组分：

在其中一些实施例中，所述控制诱导黑色素靶向组合物包括如下质量份的组分：

在其中一些实施例中，所述的控制诱导黑色素靶向组合物包括如下质量份的组分：

本发明的另一目的是提供上述控制诱导黑色素靶向组合物在化妆品中的应用。

在其中一些实施例中，所述化妆品选自化妆水、乳液、膏霜、精华液或彩妆。

本发明的另一目的是提供一种化妆品，包括上述控制诱导黑色素靶向组合物。

本发明的原理和优点如下：

1皮肤黑色素生成机制

1.1影响皮肤呈色的因素

人类的皮肤颜色首先是由人种决定的，还与遗传基因有关，同一种族的人，由于基因的个体差异，其皮肤的颜色也存在着一定的差别。同样是中国人，有的皮肤颜色较白，有的颜色较黑，两者差别很大。一般来说，婴儿皮肤的颜色是人的皮肤本色，具有基因的性质，随着年龄的增长，人体皮肤的颜色也会发生较大变化。这与皮肤老化以及外界环境的影响关系很大。皮肤老化和皮肤内外环境的影响，是导致皮肤发暗，色素沉着，产生色斑等因素。

人体皮肤的颜色主要由黑色素细胞合成黑色素的数量，类型以及在角质形成细胞周围分布的模式来决定的。黑色素细胞是人类的一个小细胞，它主要的功能是合成黑色素并形成和分布色素沉着。

1.2黑色素的合成机理

在正常状态下，人类皮肤的颜色取决于黑色素的含量和分布，而黑素细胞的结构功能和数量直接影响皮肤黑素的含量，是产生黑素的决定因素。

在皮肤表皮基底层存在黑色素细胞，黑素细胞属于腺细胞，具有呈树状突起，它起源于胚胎神经嵴，随胚胎发育移行至表皮基底层，并通过树状突起以1:36的比例与角质形成细胞构成一个表皮黑素单位。在表皮黑素单位中，黑素细胞与角质形成细胞之间相互影响，尤其是角质形成细胞可通过接触几分泌碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、内皮素(ET-1)、神经细胞生长因子(NGF)、白介素1(1L-1)、白介素6(1L-6)、肿瘤坏死因子(TNF)等对黑素细胞的形态，结构和功能产生明显影响。

黑素细胞树状突起实际为一管道，黑素细胞内所产生的黑素由此树枝状管道运输到角质形成细胞内，在角质形成细胞溶酶体内溶解，随着表皮细胞脱落而排出。

皮肤中的黑素能将日光中的有害光线过滤，消除紫外线引起的自由基，防止弹力纤维变形所导致皮肤老化，能保护DNA使其免受伤害因素引起的致突变效应，从而降低皮肤癌的发病几率。因此黑素对人体具有一定的生理保护功能，皮肤中约有400万个黑素细胞，通过致突斑与基底膜相连。在电镜下，黑素细胞核呈椭圆形，胞质清亮，有形成黑素的膜性细胞器即黑素小体。

皮肤黑素合成的主要四步骤为：

(1)黑色素细胞受到紫外线，神经因素，内分泌、炎症或激活黑色素细胞，启动酪氨酸摄取与分布，酪氨酸酶合成；

(2)黑色素小体形成，黑色素在小体中合成，黑素体储存黑素；

(3)黑色素通过细胞树突将黑素颗粒转运至角朊细胞；

(4)角朊细胞中的黑素颗粒随表皮细胞移动，伴随角质细胞脱落而排出。

黑色素的形成不仅是黑色素细胞的细胞内生化结果，同时与之相邻的角质细胞(每个黑色素细胞周围约有36个角质细胞)、成纤维细胞、吞噬细胞以及角质细胞产生的内皮素对黑色素形成也有较大影响。黑色素合成的其他影响因素还有多巴、疏基(GSH)、微量元素(铜离子，锌离子)、内分泌因素，神经因素(交感神经，副交感神经分泌的肾上腺激素和去甲肾上腺素)和维生素(维生素C、泛酸、叶酸和生物素等)。

2、美白机理

本发明是针对诱导启动酪氨酸提取与分布，络氨酸酶合成的内外诱导因素进行黑色素细胞外靶向控制。

2.1紫外线

长时间日晒会使皮肤变黑，这已经成为了人们生活常识。这是由于太阳光所含的紫外线造成的，其中紫外线UVA(320-400nm)段被称为晒黑段，是导致皮肤晒黑的主要波段。UVA与UVB两种紫外线都会伤害皮肤类脂DNA以及免疫系统，使皮肤老化加速，皮肤变黑发暗。

皮肤受紫外线照射后，其角质细胞会做出反应，并释放一种称为内皮素的物质。内皮素与黑色素细胞膜受体结合，会促进黑色素细胞增殖，合成更多黑色素，合成新的DNA，以对抗紫外线的照射。

本发明采用内皮素拮抗剂水解贝壳蛋白，它抢先与内皮素结合，从而阻止了内皮素与黑色素细胞膜结合，达到抑制黑色素生成的目的。它能抑制黑色素细胞的生成，针对黑色素的活化，从源头减少黑色素细胞增殖和促进黑色素产生。

防晒是防止皮肤变黑的重要举措，本发明采用水溶性的防晒剂成分苯基苯并咪唑磺酸与内皮素拮抗剂水解贝壳蛋白有机结合，相互增效，共同提高皮肤美白效果。

2.2神经因素影响

黑色素细胞位于表皮下部基底层，是产生黑色素的来源，而黑色素细胞直接与交感神经相连。人脑中产生两种激素影响着皮肤黑色素的代谢过程。一种激素被称为促黑素(MSH)，促黑素有3种不同结构，均属于肽类化合物，由脑下垂体中叶产生，它可以增加血清中铜离子的含量，有利于黑色素形成。另外一种影响黑色素形成的激素叫“黑色素细胞激素抑制因子”，它由丘脑分泌，与黑色素细胞激素产生对抗作用，抑制黑色素的形成，以上两种极速在体内达到平衡状态，从而将黑色素维持在一个正常水平。本发明采用十一碳烯酰基苯丙氨酸是一种类黑色素细胞激素抑制因子，从而降低黑色素合成几率。

2.3内分泌的影响

内分泌对皮肤内黑色素含量也有很大影响，雌激素，求偶素，甲状腺素会影响皮肤黑色素的的代谢，使黑色素增加，肾上腺皮质激素水平亢进会使黑色素减少，反之，肾上腺皮质激素减退时，会使黑色素增加，许多妇女在妊娠期间面部出现黄褐斑等色素沉着现象，也是与激素水平变化关系。

2.4炎症因素

皮肤因不同原因产生的炎症因子白介素1(1L-1)、白介素6(1L-6)、肿瘤坏死因子(TNF)等对黑素细胞的形态，结构和功能产生明显影响，促进黑色素表达，导致黑色素形成。

本发明采用羟苯基丙酰胺苯甲酸和甘草酸二钾，通过抑制炎症因子白介素1(1L-1)、白介素6(1L-6)、肿瘤坏死因子(TNF)，全方位消除皮肤发热，发红，瘙痒，水肿状态，降低因炎症导致黑色素细胞增殖以及黑色素的色素沉着。

3美白剂优选

本发明控制诱导黑色素靶向组合物主要针对皮肤黑素合成的第一步骤激活黑色素的诱导因素进行靶向控制，采用苯基苯并咪唑磺酸防晒抵御紫外线，利用十一碳烯酰基苯丙氨酸抑制α-MSH促黑素表达，利用水解贝壳蛋白抑制内皮激素BT-1表达，利用羟苯基丙酰胺苯甲酸和甘草酸二钾全方位消除炎症因子，抑制启动络氨酸摄取、分布以及络氨酸酶合成。

3.1苯基苯并咪唑磺酸

本发明采用水溶性的防晒剂成分苯基苯并咪唑磺酸，白色粉末，几乎无味。不溶于凡士林、橄榄油、棕榈酸异丙酯，溶于乙醇、异丙醇，部分溶于水。是高效的UVB吸收剂，最小UV吸光度(E％/1cm):302nm下920。能阻断紫外线对酪氨酸酶的激活。

3.2十一碳烯酰基苯丙氨酸(SEPIWHITE-MSH)

α-MSH由于紫外线照射刺激荷尔蒙导致黑色素生成，促黑细胞受体(MC1R)可被α-MSH激活，刺激真黑色素生成棕-黑色斑，形成黑色素层叠。

十一碳烯酰基苯丙氨酸是α-MSH促黑素的抑制对抗剂，抑制由α-MSH引发的各个步骤的黑色素生成过程，刺激“AGRP”型蛋白，在控制绑定MCR1受体中起到决定作用。

十一碳烯酰基苯丙氨酸(SEPIWHITE-MSH)在抑制α-MSH导致黑色素生成具有明显的靶向抑制性能，具体体现以下几方面：

(1)SEPI-MSH和α-MSH受体MC1R有极好的亲和性，亲和可达到96％，从而抑制了促黑激素α-MSH活性；

(2)腺苷酸环化酶指跨膜蛋白被MC1R活化，它从三磷酸腺苷(ATP)制造环单磷酸腺苷CAMP，十一碳烯酰基苯丙氨酸能够100％抑制腺苷酸环化酶；

(3)环单磷酸腺苷(camp)属二级信息传递，能够把外部信号转换为细胞内部信号，十一碳烯酰基苯丙氨酸减少黑色素细胞内环单磷酸腺苷数量34％；

(4)蛋白活化酶A，能被4个环单磷酸腺苷CAMP分子活化，它可以使酪氨酸酶磷酸化使其具有活性，十一碳烯酰基苯丙氨酸100％抑制活化蛋白酶；

(5)可以抑制酪氨酸酶活性83％。

十一碳烯酰基苯丙氨酸(SEPIWHITE-MSH)作用在整个由α-MSH引发的黑色素生成过程。

3.3水解贝壳蛋白

人体皮肤被紫外线(UVB)照射后，角质细胞释放出内皮素的量会明显增加，当内皮素的信息被黑色素细胞膜上的受体接收后，刺激黑色素细胞分化，增殖并激活酪氨酸酶的活性，从而黑色素急剧增加。内皮素是造成色斑的主要原因。

内皮素由日本的Imokawa等人发现，它会刺激黑素细胞增殖，分化，并且激活酪氨酸酶的活性，提高黑色素的合成。内皮素是一种内源性多肽类物质，由血管内皮细胞产生，包括ET-1，ET-2和ET-3三种多肽。

内皮素拮抗剂针对在角质细胞里的内皮素作用，有效抑制内皮素生成和传送，从而减少黑色素细胞的分裂增殖和抑制黑色素的产生。内皮素拮抗剂代表了当今美白技术的最新水平，不但保护皮肤免受UV射线的刺激还能有效淡化已产生的斑点和斑块。

本发明控制诱导黑色素靶向组合物采用内皮素拮抗剂水解贝壳蛋白(购自奥利，其中水解贝壳蛋白含量>85wt％，乳酸钙<15wt％，氮含量>10wt％)，它抢先与内皮素结合，从而阻止了内皮素与黑色素细胞膜结合，达到抑制黑色素生成的目的。它能抑制黑色素细胞的生成，针对黑色素的活化，从源头减少黑色素细胞增殖和促进黑色素产生。

在水解贝壳蛋白的存在下，内皮素不能与黑色素细胞上的受点联结。因此，不会再有额外的黑色素生成。能够快速去黑色素作用。由于酪氨酸酶存在于黑色素细胞内的黑色素内，因此酪氨酸酶抑制剂必须通过4层(角质层，表皮深层、黑色素细胞、黑色素膜)障碍才能起到抑制作用，而由于内皮素拮抗剂的靶点在黑色素细胞膜之外，因此，仅需要通过两层障碍即可发挥作用。采用水解贝壳蛋白作为内皮素拮抗剂，能够均匀黑色素分布。

3.4羟苯基丙酰胺苯甲酸(购自德之馨德敏舒)&甘草酸二钾

皮肤炎症的发生促进黑色素细胞增殖，产生色素沉着的因素，将炎症因子进行有效控制也是美白的途径之一，本发明采用羟苯基丙酰胺苯甲酸和甘草酸二钾，全方位给肌肤舒缓肌肤，降低炎症导致的皮肤色素沉着。

德之馨德敏舒产品性能：

组分	配比
		1,2-戊二醇	49.900
丁二醇	45.000
		羟苯基丙酰胺苯甲酸	5.000
抗坏血酸棕榈酸酯	0.100

炎症反应是细胞和血管对外界或损伤的应激反应，若得到有效控制，这种应激反应是有益的并具有保护作用；若无法得到有效控制，则会引起组织损伤。

皮肤内1L-1和PGE2水平升高的影响因素如下：肌肤干燥、心里压力，皮肤刺激，皮肤老化，慢性炎症，急性炎症，特应性炎症，均可以削弱皮肤屏障功能，引发色素沉着。

(1)羟苯基丙酰胺苯甲酸

从源头上调节感觉神经的链式反应，有效地减少皮肤发痒和红肿；减少自由基诱发的皮肤损害；皮肤研究表明NK-1受体是引发皮肤痒感的关键，羟苯基丙酰胺苯甲酸可作为NK-1受体协抗剂并调节皮肤的过度反应。

本发明采用的羟苯基丙酰胺苯甲酸对于物质P的刺激下肥大细胞组胺释放具有有效抑制作用。

(2)甘草酸二钾

甘草酸二钾是一种白色或白色粉末，易溶于水，溶于乙醇，不溶于油脂的三萜皂苷类化合物，其含有亲水性基团和亲油性基团，能降低水溶液的表面张力，保湿润发，软化皮肤，抗皱，防治色素沉积，消炎止痒广泛应用于医药和日用化工等行业。

甘草酸二钾具有抗敏，防晒，祛斑，皮肤修复等功效，采用甘草酸二钾能预防皮肤受刺激时敏感发炎，且对日照引起的炎症具有消炎镇静作用。

本发明控制诱导黑色素靶向组合物的有益效果如下：

(1)采用苯基苯并咪唑磺酸防晒抵御紫外线，利用十一碳烯酰基苯丙氨酸抑制α-MSH促黑素表达，利用水解贝壳蛋白抑制内皮激素BT-1表达，利用羟苯基丙酰胺苯甲酸&甘草酸二钾全方位消除炎症因子，本专利针对诱导黑色素形成的四个靶向全方位控制，从而达到降低皮肤色素沉着和产生色斑的几率。

(2)采用内皮素拮抗剂水解贝壳蛋白，它抢先与内皮素结合，从而阻止了内皮素与黑色素细胞膜结合，达到抑制黑色素生成的目的。它能抑制黑色素细胞的生成，针对黑色素的活化，从源头减少黑色素细胞增殖和黑色素产生。

(3)采用水溶性的防晒剂成分苯基苯并咪唑磺酸与内皮素拮抗剂水解贝壳蛋白有机结合，相互增效，共同提高皮肤美白效果。

(3)采用羟苯基丙酰胺苯甲酸对于物质P的刺激下肥大细胞组胺释放具有有效抑制作用；采用甘草酸二钾预防皮肤受刺激时敏感发炎，对日照引起的炎症具有消炎镇静作用。

(4)采用羟苯基丙酰胺苯甲酸和甘草酸二钾，通过抑制炎症因子白介素1(1L-1)、白介素6(1L-6)、肿瘤坏死因子(TNF)，全方位消除皮肤发热，发红，瘙痒，水肿状态，降低因炎症导致黑色素细胞增殖，黑色素的色素沉着。

附图说明

图1为实施例与对照样酪氨酸酶抑制率比较图；

图2为实施例与对照样黑色素含量比较图；

图3为实施例样与空白样对UV产生黑色素的抑制比较图；

图4为实施例样与空白样的培养基经UV照射后颜色比较图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本实施例在补水保湿基础配方基础上添加控制诱导黑色素靶向组合物：采用苯基苯并咪唑磺酸防晒抵御紫外线，利用十一碳烯酰基苯丙氨酸抑制α-MSH促黑素表达，利用水解贝壳蛋白抑制内皮激素BT-1表达，利用羟苯基丙酰胺苯甲酸和甘草酸二钾共同抑制炎症因子。针对诱导黑色素形成的四个靶向全方位控制，从而达到降低皮肤色素沉着和产生色斑的几率。

实施例与对照样配方(在补水保湿基础配方基础上添加)配比如下：

制备方法：

以实施例3为例，添加质量比1:1的卡波20(0.1-0.6质量份)和精氨酸，添加1质量份的PHL作为防腐剂，加水至100质量份，制备工艺如下：

(1)按照配方配比称取甘油，丙二醇，丁二醇，甜菜碱，尿囊素，海藻糖，透明质酸钠(寡聚)，加入工艺水加热至75-80℃，以250-300r/min,搅拌20min,直至溶解透明；

(2)按照配方配比称取SPIWITHE(a-MSH)苯丙氨基酸，精氨酸，温度控制为65-75℃，以300r/min，搅拌15min,直至所有添加物全部溶解；

(3)按照配比称取苯基苯并咪唑磺酸，水解贝壳蛋白，温度控制在50-60℃，以200r/min搅拌15min,直至全部溶解；

(4)按照配比称取羟苯基丙酰胺苯甲酸，甘草酸二钾、卡波20、精氨酸，PHL,温度控制45℃以下，以100r/min，搅拌15min,静置恢复到室温即可。

美白功效评测

(1)酪氨酸酶活性抑制效果测试

试剂：0.175mol/L PBS(pH 6.8),1.5mmol/L酪氨酸,2000unit/mL酪氨酸酶；

实验样品准备：利用PBS对料体进行稀释，稀释后的浓度分别为5％，10％，50％。

测试方法：

A、96well plate上选取4个空，按照下表中各个物质的添加量进行添加：

B、震荡充分混合后放置于37℃的培养箱中反应；

C、25分钟后利用酶标仪在490nm波长处测试吸光度(Ab，Absorbance)；

D、利用以下的公式计算酪氨酸酶活性的抑制效果：

实验结果(如图1和下表)：

含量(％)	对照样1	对照样2	对照样3	实施例1	实施例2	实施例3
							5	6.12	8.51	6.38	6.91	10.64	9.84
10	15.69	15.43	15.16	17.02	26.33	26.86
							50	56.12	56.91	56.12	57.71	61.44	61.97

(2)细胞产生的黑色素量测试：

实验材料：B16F10，DMEM培养基，胰蛋白酶，DPBS，70％酒精，NaOH，DMSO；

实验方法：

1)将B16F10细胞消化后，利用DMEM培基分散细胞，利用Hemacytometer来计数细胞，然后利用DMEM来稀释细胞，稀释到浓度为5×10⁴cells/ml。

2)稀释后的细胞溶液分别接种到6well中，每一孔为2ml，即1×10⁵cells/well。

3)在37℃，5％CO2的培养箱中培养24小时。

4)待测样品准备：待测样品用DMEM培基稀释，稀释后的浓度分别为：50％(该浓度通过前面的MTT测试，结果为无毒)；

5)细胞培养24小时后，观察细胞是否完全贴壁生长，如果细胞完全贴壁生长的话，将原培基移除，用DPBS洗涤。

6)将DPBS移除之后，分别加入前面准备好的样品。样品的溶度根据毒性测试的结果选择安全浓度100ppm(2ml/well)。

7)样品加入之后，放入37℃，5％CO2的培养箱中培养48小时。

8)分别收集培基和细胞，分别测试细胞外与细胞内的黑色素的含量。

9)培基部分：13500rpm x 10mins离心后，取上层清液在波长415nm处测量吸光光度。

10)细胞部分：将B16F10细胞消化后收集起来，13500rpm x 10mins离心后，移除上层清液。底部的B16F10细胞中加入0.3ml的10％DMSO，1N NAOH溶液，80℃水浴中裂解1小时。

11)1小时后裂解液冷却至室温，13500rpm x 10mins离心后收集上层清液。

12)利用酶标仪在波长415nm处测量上层清液的吸光光度OD。

13)配置黑色素标样，浓度为1.0到100.0ppm，分别测试标样的吸光光度，绘制出浓度与吸光光度的线性关系图。

14)利用上述的线性关系图可以得出细胞内与细胞外黑色素的含量。

实验结果(如图2和下表)：

(3)UV对黑色素的产生的影响

实验原理：在一定强度UV照射下，小鼠黑色素细胞会产生大量的黑色素。通过专利样处理与否的小鼠黑色素细胞在紫外光处理后产生的黑色素的含量进行比较来确认防晒组分的功效。

实验材料：B16F10，DMEM培养基，胰蛋白酶，DPBS，70％酒精，NaOH，DMSO。

实验方法：

1)将B16F10细胞消化后，利用DMEM培基分散细胞，利用Hemacytometer来计数细胞，然后利用DMEM来稀释细胞，稀释到浓度为5×10⁴cells/ml。

2)稀释后的细胞溶液分别接种到培养皿中，每一孔为10ml，即5×10⁵cells/dish。

3)在37℃，5％CO2的培养箱中培养24小时。

4)待测样品准备：待测样品用DMEM培基稀释，稀释后的浓度分别为：0.01％，即100ppm(该浓度通过前面的MTT测试，结果为无毒)。

5)细胞培养24小时后，观察细胞是否完全贴壁生长，如果细胞完全贴壁生长的话，将原培基移除，用DPBS洗涤。

6)将DPBS移除之后，分别加入前面准备好的样品。样品的溶度根据毒性测试的结果选择安全浓度100ppm。

7)样品加入之后，按照以下条件对细胞进行紫外线照射处理：

8)按照上述表格对细胞进行处理后，放入37℃，5％CO2的培养箱中培养48小时。

9)分别收集培基和细胞，分别测试细胞外与细胞内的黑色素的含量。

10)培基部分：13500rpm x 10mins离心后，取上层清液在波长415nm处测量吸光光度。

11)细胞部分：将B16F10细胞消化后收集起来，13500rpm x 10mins离心后，移除上层清液。底部的B16F10细胞中加入0.3ml的10％DMSO，1N NAOH溶液，80℃水浴中裂解1小时。

12)1小时后裂解液冷却至室温，13500rpm x 10mins离心后收集上层清液

13)利用酶标仪在波长415nm处测量上层清液的吸光光度OD。

14)配置黑色素标样，浓度为1.0到100.0ppm，分别测试标样的吸光光度，绘制出浓度与吸光光度的线性关系图。

15)利用上述的线性关系图可以得出细胞内与细胞外黑色素的含量。

实验结果(如图3、4和下表所示)：

从图4中可以发现，紫外先处理后的细胞(Sample-1))的培基的颜色要比空白样(blank)深；加入实施例3处理的细胞(Sample-2)和Sample-1在同样强度的紫外线照射后，Sample-2培基的颜色要比Sample-1的培基颜色浅很多。综上可知，本发明控制诱导黑色素靶向组合物具有防止紫外线刺激黑色素细胞产生黑色素的功效。本发明控制诱导黑色素靶向组合物能针对紫外线防护，消除炎症因子，抑制α-MSH和BT-1活性，使得黑色素细胞内外含量相对较低。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种控制诱导黑色素靶向组合物，其特征在于，包括苯基苯并咪唑磺酸、十一碳烯酰基苯丙氨酸、水解贝壳蛋白、甘草酸二钾和羟苯基丙酰胺苯甲酸。

2.根据权利要求1所述的控制诱导黑色素靶向组合物，其特征在于，包括如下质量份的组分：

3.根据权利要求1所述的控制诱导黑色素靶向组合物，其特征在于，包括如下质量份的组分：

4.根据权利要求1所述的控制诱导黑色素靶向组合物，其特征在于，包括如下质量份的组分：

5.权利要求1-4任一项所述的控制诱导黑色素靶向组合物在化妆品中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述化妆品选自化妆水、乳液、膏霜、精华液或彩妆。

7.一种化妆品，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的控制诱导黑色素靶向组合物。