CN107212404A - 具有抗肿瘤作用的毛叶山桐子叶黄酮及其制法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了具有抗肿瘤作用的毛叶山桐子叶黄酮及其制备方法和应用，解决了现有技术中肿瘤的治疗尚无确切的手段和药物，且不良反应大的问题。本发明的毛叶山桐子叶黄酮，由毛叶山桐子叶经碱性稀乙醇提取后，经大孔吸附树脂两次吸附分离而得。本发明首次从毛叶山桐子叶中分离出具有抑制肿瘤作用的黄酮成分，且制备方法简单，操作简便，能够实现工业化生产，所用试剂对环境友好。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及具有抗肿瘤作用的毛叶山桐子叶黄酮及其制法和应用。
背景技术
肿瘤(tumor)是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物(neogrowth)，因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物(neoplasm)。一般认为，肿瘤细胞是单克隆性的，即一个肿瘤中的所有瘤细胞均是一个突变的细胞的后代。肿瘤的肉眼观形态肉眼观肿瘤的形态多种多样，并可在一定程度上反映肿瘤的良恶性。学界一般将肿瘤分为良性和恶性两大类。良性肿瘤细胞的异型性不明显，一般与其来源组织相似。恶性肿瘤常具有明显的异型性。现有技术中肿瘤的治疗尚无确切的手段和药物，且不良反应大。肿瘤病人的生存期短，生活质量低，因病导致家庭负担加重。
因此，临床上迫切需要一种具有抑制肿瘤的药物，效果确切，不良反应小，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题：提供具有抗肿瘤作用的毛叶山桐子叶黄酮，解决现有技术中肿瘤的治疗尚无确切的手段和药物，且不良反应大的问题。
本发明的第二个目的在于提供具有抗肿瘤作用的毛叶山桐子叶黄酮的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供毛叶山桐子叶黄酮的用途。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明所述的具有抗肿瘤作用的毛叶山桐子叶黄酮，由毛叶山桐子叶经碱性稀乙醇提取后，经大孔吸附树脂两次吸附分离而得。
本发明所述的具有抗肿瘤作用的毛叶山桐子叶黄酮的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤1：提取：取毛叶山桐子叶，加入碱性稀乙醇加热提取，过滤，滤液浓缩；
步骤2：一次吸附分离：将所述滤液加入大孔吸附树脂，室温搅拌吸附，过滤，取吸附后的大孔吸附树脂装柱，依次用水、5-15％乙醇水溶液、25-50％乙醇水溶液、60-75％乙醇水溶液、80-95％乙醇水溶液作为洗脱液进行洗脱，收集80-95％乙醇洗脱液；
步骤3：将所述80-95％乙醇洗脱液浓缩，得浓缩洗脱液；
步骤4：二次吸附分离：将所述浓缩洗脱液加入大孔吸附树脂，室温搅拌吸附，过滤，取吸附后的大孔吸附树脂装柱，依次用水、30-50％乙醇水溶液、60-75％乙醇水溶液、80-95％乙醇水溶液作为洗脱液进行洗脱，收集80-95％乙醇洗脱液；
步骤5：将步骤4所得的80-95％乙醇洗脱液浓缩后，低温干燥，即得。
进一步地，所述步骤1中，取毛叶山桐子叶，加入所述毛叶山桐子叶3-6倍质量的碱性稀乙醇50-70℃加热提取1-5次，过滤，滤液浓缩。
进一步地，所述碱性稀乙醇为pH值8-14的15-50％乙醇水溶液。
进一步地，所述步骤2中的大孔吸附树脂的型号为D-101，其用量按每克毛叶山桐子叶计为0.2-0.6g；所述步骤4中的大孔吸附树脂的型号为D-101，其用量按每克毛叶山桐子叶计为0.05-0.1g。
进一步地，所述步骤2中依次用水、10％乙醇水溶液、40％乙醇水溶液、70％乙醇水溶液、90％乙醇水溶液作为洗脱液进行洗脱，每个洗脱液的用量均为其洗脱的大孔吸附树脂柱柱体积的4-8倍，收集90％乙醇洗脱液。
进一步地，所述步骤4中依次用水、40％乙醇水溶液、60％乙醇水溶液、80％乙醇水溶液作为洗脱液进行洗脱，每个洗脱液的用量均为其洗脱的大孔吸附树脂柱的柱体积的4-8倍，收集80％乙醇洗脱液。
进一步地，所述步骤5中的低温干燥为冷冻干燥。
本发明所述的毛叶山桐子叶黄酮在制备具有抑制肿瘤作用的食品、保健食品和药品中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明首次从毛叶山桐子叶中分离出具有抑制肿瘤作用的黄酮成分，且制备方法简单，操作简便，能够实现工业化生产，所用试剂对环境友好。
本发明以毛叶山桐子叶为原料，价廉易得。采用碱性稀乙醇提取后，再经大孔吸附树脂两次吸附分离，得到纯度大于90％的黄酮，且收率高。动物试验表明，本发明抑制肿瘤作用确切，不良反应小。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。
具有抗肿瘤作用的毛叶山桐子叶黄酮，由毛叶山桐子叶经碱性稀乙醇提取后，经大孔吸附树脂两次吸附分离而得。
具有抗肿瘤作用的毛叶山桐子叶黄酮的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤1：提取：取毛叶山桐子叶，加入碱性稀乙醇加热提取，过滤，滤液浓缩；
步骤2：一次吸附分离：将滤液加入大孔吸附树脂，室温搅拌吸附，过滤，取吸附后的大孔吸附树脂装柱，依次用水、5-15％乙醇水溶液、25-50％乙醇水溶液、60-75％乙醇水溶液、80-95％乙醇水溶液作为洗脱液进行洗脱，收集80-95％乙醇洗脱液；
步骤3：将80-95％乙醇洗脱液浓缩，得浓缩洗脱液；
步骤4：二次吸附分离：将浓缩洗脱液加入大孔吸附树脂，室温搅拌吸附，过滤，取吸附后的大孔吸附树脂装柱，依次用水、30-50％乙醇水溶液、60-75％乙醇水溶液、80-95％乙醇水溶液作为洗脱液进行洗脱，收集80-95％乙醇洗脱液；
步骤5：将步骤4所得的80-95％乙醇洗脱液浓缩后，低温干燥，即得。
步骤1中，取毛叶山桐子叶，加入毛叶山桐子叶3-6倍质量的碱性稀乙醇50-70℃加热提取1-5次，过滤，滤液浓缩；碱性稀乙醇为pH值8-14的15-50％乙醇水溶液。
步骤2中的大孔吸附树脂的型号为D-101，其用量按每克毛叶山桐子叶计为0.2-0.6g；步骤4中的大孔吸附树脂的型号为D-101，其用量按每克毛叶山桐子叶计为0.05-0.1g。
步骤2中依次用水、10％乙醇水溶液、40％乙醇水溶液、70％乙醇水溶液、90％乙醇水溶液作为洗脱液进行洗脱，每个洗脱液的用量均为其洗脱的大孔吸附树脂柱柱体积的4-8倍，收集90％乙醇洗脱液。
步骤4中依次用水、40％乙醇水溶液、60％乙醇水溶液、80％乙醇水溶液作为洗脱液进行洗脱，每个洗脱液的用量均为其洗脱的大孔吸附树脂柱的柱体积的4-8倍，收集80％乙醇洗脱液。
步骤5中的低温干燥为冷冻干燥。
毛叶山桐子叶黄酮在制备具有抑制肿瘤作用的食品、保健食品和药品中的用途。
实施例1
具有抗肿瘤作用的毛叶山桐子叶黄酮的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤1：提取：取毛叶山桐子叶1000g，加入毛叶山桐子叶3000ml pH值8的碱性稀乙醇70℃加热提取5次，过滤，滤液浓缩至200ml。
步骤2：一次吸附分离：将滤液加入D-101大孔吸附树脂200g，室温搅拌吸附，过滤，取吸附后的大孔吸附树脂装柱，依次用水、10％乙醇水溶液、40％乙醇水溶液、70％乙醇水溶液、90％乙醇水溶液作为洗脱液进行洗脱，每个洗脱液的用量均为其洗脱的大孔吸附树脂柱柱体积的4倍，收集90％乙醇洗脱液。
步骤3：将90％乙醇洗脱液浓缩，得浓缩洗脱液。
步骤4：二次吸附分离：将浓缩洗脱液加入大孔吸附树脂，室温搅拌吸附，过滤，取吸附后的大孔吸附树脂装柱，依次用水、40％乙醇水溶液、60％乙醇水溶液、80％乙醇水溶液作为洗脱液进行洗脱，每个洗脱液的用量均为其洗脱的大孔吸附树脂柱的柱体积的6倍，收集80％乙醇洗脱液。
步骤5：将步骤4所得的80％乙醇洗脱液浓缩后，冷冻干燥，即得。
本实施例所得毛叶山桐子叶黄酮245mg，纯度为92.8％。
实施例2
具有抗肿瘤作用的毛叶山桐子叶黄酮的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤1：提取：取毛叶山桐子叶1000g，加入毛叶山桐子叶6000ml pH值14的碱性稀乙醇50℃加热提取1次，过滤，滤液浓缩至200ml。
步骤2：一次吸附分离：将滤液加入D-101大孔吸附树脂600g，室温搅拌吸附，过滤，取吸附后的大孔吸附树脂装柱，依次用水、5％乙醇水溶液、25％乙醇水溶液、60％乙醇水溶液、80％乙醇水溶液作为洗脱液进行洗脱，每个洗脱液的用量均为其洗脱的大孔吸附树脂柱柱体积的8倍，收集80％乙醇洗脱液。
步骤3：将90％乙醇洗脱液浓缩，得浓缩洗脱液。
步骤4：二次吸附分离：将浓缩洗脱液加入大孔吸附树脂，室温搅拌吸附，过滤，取吸附后的大孔吸附树脂装柱，依次用水、30％乙醇水溶液、70％乙醇水溶液、95％乙醇水溶液作为洗脱液进行洗脱，每个洗脱液的用量均为其洗脱的大孔吸附树脂柱的柱体积的4倍，收集95％乙醇洗脱液。
步骤5：将步骤4所得的95％乙醇洗脱液浓缩后，冷冻干燥，即得。
本实施例所得毛叶山桐子叶黄酮252mg，纯度为91.2％。
实施例3
具有抗肿瘤作用的毛叶山桐子叶黄酮的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤1：提取：取毛叶山桐子叶1000g，加入毛叶山桐子叶5000ml pH值10的碱性稀乙醇60℃加热提取3次，过滤，滤液浓缩至200ml。
步骤2：一次吸附分离：将滤液加入D-101大孔吸附树脂500g，室温搅拌吸附，过滤，取吸附后的大孔吸附树脂装柱，依次用水、15％乙醇水溶液、50％乙醇水溶液、75％乙醇水溶液、95％乙醇水溶液作为洗脱液进行洗脱，每个洗脱液的用量均为其洗脱的大孔吸附树脂柱柱体积的6倍，收集95％乙醇洗脱液。
步骤3：将90％乙醇洗脱液浓缩，得浓缩洗脱液。
步骤4：二次吸附分离：将浓缩洗脱液加入大孔吸附树脂，室温搅拌吸附，过滤，取吸附后的大孔吸附树脂装柱，依次用水、50％乙醇水溶液、60％乙醇水溶液、85％乙醇水溶液作为洗脱液进行洗脱，每个洗脱液的用量均为其洗脱的大孔吸附树脂柱的柱体积的8倍，收集85％乙醇洗脱液。
步骤5：将步骤4所得的85％乙醇洗脱液浓缩后，冷冻干燥，即得。
本实施例所得毛叶山桐子叶黄酮265mg，纯度为93.7％。
实施例4
毛叶山桐子叶黄酮的抗肿瘤作用。
受试样品：取实施例1所得毛叶山桐子叶黄酮作为样品。
对照样品：阿霉素。
剂量选择与受试物给予方式：根据该样品的人体推荐用量，人口服推荐剂量为每人(成人)每日3次，每次90mg，成人体重按60kg计算，折合剂量为1.5mg/kgBW，设3.75g/kgBW(低剂量组)、7.5mg/kgBW(中剂量组)、15mg/kgBW(高剂量组)(分别相当于人体推荐用量的2.5、5、10倍)剂量的试验组，同时设一个模型组对照组和一个空白对照组。
动物：SPF级BABLc小鼠，雌性，体重18.0-20.0g。
方法：将处于对数生长期的EMT-6细胞用0.25％的胰蛋白酶消化脱壁后，终止消化，加入RPMI-1640培养液，制成悬液，将悬液接种至小鼠左前肢腋窝皮下0.2ml/只，待肿瘤长到1cm3时剥离，剪碎，按比例加入生理盐水(1g:3ml)，再在玻璃匀浆器内研磨，经80-100目筛网过滤制成单细胞悬液，用台盼蓝染色法计数活细胞数。将制备好的细胞悬液按0.2ml/只接种于50只BABLc小鼠左前腋窝下。小鼠随机分组，每组10只。试验药物分高、中、低组，对照药物组，空白模型组。于接种后的第二天开始给药，连续给药1周，于接种后第6天开始测量肿瘤体积，待模型组平均瘤重大于1.0g(瘤体积约为0.5cm3)时停止试验，处死小鼠并称重，剥取肿瘤，计算抑瘤率。
对EMT-6乳腺癌小鼠移植瘤体积的影响表
| 组别 | 6d | 7d | 8d | 9d | 10d |
| 样品低剂量 | 0.027±0.016 | 0.076±0.048** | 0.194±0.035** | 0.405±0.033** | 0.441±0.042** |
| 样品中剂量 | 0.033±0.021 | 0.081±0.014** | 0.249±0.025** | 0.418±0.031** | 0.462±0.035** |
| 样品高剂量 | 0.029±0.039 | 0.088±0.051** | 0.201±0.019** | 0.336±0.045** | 0.451±0.039** |
| 模型对照组 | 0.054±0.101 | 0.176±0.109 | 0.399±0.102 | 0.642±0.072 | 0.785±0.031 |
| 阳性对照组 | 0.013±0.032** | 0.029±0.047** | 0.124±0.065** | 0.256±0.078** | 0.417±0.078** |
注：**与模型组比较，P＜0.01。
由上表可知，本发明具有抗肿瘤作用。
将饲喂本发明的小鼠解剖后，发现其脏器正常，且在饲喂期间无异常。本发明不良反应小。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.具有抗肿瘤作用的毛叶山桐子叶黄酮，其特征在于：由毛叶山桐子叶经碱性稀乙醇提取后，经大孔吸附树脂两次吸附分离而得。
2.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤作用的毛叶山桐子叶黄酮的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
步骤1：提取：取毛叶山桐子叶，加入碱性稀乙醇加热提取，过滤，滤液浓缩；
步骤2：一次吸附分离：将所述滤液加入大孔吸附树脂，室温搅拌吸附，过滤，取吸附后的大孔吸附树脂装柱，依次用水、5-15％乙醇水溶液、25-50％乙醇水溶液、60-75％乙醇水溶液、80-95％乙醇水溶液作为洗脱液进行洗脱，收集80-95％乙醇洗脱液；
步骤3：将所述80-95％乙醇洗脱液浓缩，得浓缩洗脱液；
步骤4：二次吸附分离：将所述浓缩洗脱液加入大孔吸附树脂，室温搅拌吸附，过滤，取吸附后的大孔吸附树脂装柱，依次用水、30-50％乙醇水溶液、60-75％乙醇水溶液、80-95％乙醇水溶液作为洗脱液进行洗脱，收集80-95％乙醇洗脱液；
步骤5：将步骤4所得的80-95％乙醇洗脱液浓缩后，低温干燥，即得。
3.根据权利要求2所述的具有抗肿瘤作用的毛叶山桐子叶黄酮的制备方法，其特征在于：所述步骤1中，取毛叶山桐子叶，加入所述毛叶山桐子叶3-6倍质量的碱性稀乙醇50-70℃加热提取1-5次，过滤，滤液浓缩。
4.根据权利要求3所述的具有抗肿瘤作用的毛叶山桐子叶黄酮的制备方法，其特征在于：所述碱性稀乙醇为pH值8-14的15-50％乙醇水溶液。
5.根据权利要求4所述的具有抗肿瘤作用的毛叶山桐子叶黄酮的制备方法，其特征在于：所述步骤2中的大孔吸附树脂的型号为D-101，其用量按每克毛叶山桐子叶计为0.2-0.6g；所述步骤4中的大孔吸附树脂的型号为D-101，其用量按每克毛叶山桐子叶计为0.05-0.1g。
6.根据权利要求5所述的具有抗肿瘤作用的毛叶山桐子叶黄酮的制备方法，其特征在于：所述步骤2中依次用水、10％乙醇水溶液、40％乙醇水溶液、70％乙醇水溶液、90％乙醇水溶液作为洗脱液进行洗脱，每个洗脱液的用量均为其洗脱的大孔吸附树脂柱柱体积的4-8倍，收集90％乙醇洗脱液。
7.根据权利要求6所述的具有抗肿瘤作用的毛叶山桐子叶黄酮的制备方法，其特征在于：所述步骤4中依次用水、40％乙醇水溶液、60％乙醇水溶液、80％乙醇水溶液作为洗脱液进行洗脱，每个洗脱液的用量均为其洗脱的大孔吸附树脂柱的柱体积的4-8倍，收集80％乙醇洗脱液。
8.根据权利要求7所述的具有抗肿瘤作用的毛叶山桐子叶黄酮的制备方法，其特征在于：所述步骤5中的低温干燥为冷冻干燥。
9.如权利要求1－8任意一项所述的具有抗肿瘤作用的毛叶山桐子叶黄酮在制备具有抑制肿瘤作用的食品、保健食品和药品中的用途。
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| 沈彤，等: "《天然药物化学》", 31 July 2010, 甘肃科学技术出版社 * |
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