CN107208014B - 细胞捕获系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的实施例包括用于从来自个体的样品捕获特定生物学物质的系统和方法。所述系统和方法采用包含氟聚合物涂层的设备(如容器，即套管或袋)，所述涂层经改性以包含一种或多种用于样品曝露于经改性的氟聚合物时结合所需生物制剂的部分。在特定方面中，所述生物学物质为特定类型的细胞，如特定血液或骨髓细胞，且借助于选择用于结合所述细胞的适体来捕获所需细胞。

Description

细胞捕获系统和方法
相关申请的交叉参考
本申请主张根据35U.S.C.§119(e)2014年12月22日提交的标题为“细胞捕获系统和方法”的美国第62/095,140号和2015年12月21日提交的U.S.14/976,043的权益，其内容以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明至少涉及细胞生物学、分子生物学、材料科学、细胞疗法和医学领域。本发明的某些实施例涉及用于捕获所需细胞且任选地处理其，包括用于体内递送的系统。
背景技术
人类的免疫系统可分成两部分：先天免疫系统，其迅速应答侵入物的主要部分，和适应性免疫系统，其能够设计病原体侵入的极特定应答。树突状细胞连接那些两个系统且为将引发针对侵入物病原体的较强响应的关键元素。单核细胞为可分化成各种细胞的多能细胞，包括巨噬细胞和树突状细胞。一般来说，单核细胞以1000细胞/μL的浓度存在于全血中。其表示大约5％白血细胞存在于成人血液中。
树突状细胞使淋巴结中的T细胞活化。一旦通过树突状细胞活化，T细胞为最有效的防卫组分，刺激免疫系统的其它部分且尤其能够大规模杀死经感染细胞。因此，适应性免疫系统的关键部分为通过树突状细胞使T细胞活化。树突状细胞桥连先天免疫系统和适应性免疫系统，吞噬侵入物以向T细胞呈现其抗原且使其活化以杀死经感染细胞。
因为单核细胞可分化成适用于先天免疫系统和适应性免疫系统的细胞，所以其为影响个体免疫系统的强有力工具。鉴于其在血液中的相对较低浓度，其未受损失的高产率分离和其纯度仍为一个挑战。因此，仍持续需要提供在不借助传统低效程序的情况下分离单核细胞的更有效途径。因而，需要用于分离这些和其它细胞的改良的生物系统。
发明内容
本发明的实施例包括用于从样品分离一种或多种所需生物制剂，如细胞的系统、方法和组合物。在特定实施例中，公开内容提供一种包含用于从样品捕获某些所需生物制剂的改性表面的系统。本发明的实施例包括用于从样品分离所需细胞且任选地还进一步处理细胞，包括至少培养用于细胞疗法的细胞(如免疫细胞)的封闭式无反应性系统。本发明的某些实施例包括用于细胞分离以及任选地其后生长和/或处理的离体系统。本发明的系统允许在一个步骤方法或一个系统方法中在不伤害细胞的情况下分离细胞以使得可随后利用其，包括至少用于体内应用。
在本发明的某些方面中，所述系统包含至少一种容器，如套管或袋，其包含被配置成用于从样品采集至少一种特定类型生物制剂的表面。在特定方面中，鉴于细胞具有多种表面标记物，超过一种细胞类型可通过相同部分捕获。在某些方面中，可通过相同系统中的不相同部分的混合物捕获超过一种细胞类型。在特定实施例中，所述系统包含具有膜薄片的容器，如其中所述薄片为在例如蛇形袋中焊接的激光器。在一些实施例中，所述容器包含珠粒、微结构或设备(套管或袋除外或除套管或袋以外)。可使用本发明的实施例分离任何细胞，但在特定实施例中，所述细胞为例如血细胞或免疫细胞。用于捕获的示例性免疫细胞至少包括单核细胞，但可用本发明的系统和方法获得其它免疫细胞。
一个实施例包含容器(如柔性管)，其包含：包含聚合物的内壁与官能化表面。在特定实施例中，所述容器具有细胞特异性适体(结合到特异性靶分子的寡核苷酸分子)的连续覆盖。在一些情况下，容器的内壁由小于约0.1mg/cm2，0.09mg/cm2，0.08mg/cm2，0.07mg/cm2，0.06mg/cm2，0.05mg/cm2，0.04mg/cm2，0.03mg/cm2，0.02mg/cm2，0.01mg/cm2，0.009mg/cm2，0.008mg/cm2，0.007mg/cm2，0.006mg/cm2，0.005mg/cm2，0.004mg/cm2，0.003mg/cm2，0.002mg/cm2，0.001mg/cm2或无法检测到的水中的总有机碳(TOC)的聚合物构成。在特定实施例中，水中的TOC小于0.001mg/cm2到0.1mg/cm2，0.001mg/cm2到0.095mg/cm2，0.001mg/cm2到0.075mg/cm2，0.001mg/cm2到0.05mg/cm2，0.001mg/cm2到0.01mg/cm2，0.001mg/cm2到0.005mg/cm2，或0.001mg/cm2到0.025mg/cm2范围内的量。在特定实施例中，水中的TOC小于0.01mg/cm2到0.1mg/cm2，0.01mg/cm2到0.075mg/cm2，0.01mg/cm2到0.05mg/cm2，或0.01mg/cm2到0.025mg/cm2范围内的量。在特定实施例中，水中的TOC小于0.05mg/cm2到0.1mg/cm2，0.05mg/cm2到0.09mg/cm2，0.05mg/cm2到0.075mg/cm2，或0.05mg/cm2到0.06mg/cm2范围内的量。在特定实施例中，水中的TOC小于0.005mg/cm2到0.1mg/cm2，0.005mg/cm2到0.095mg/cm2，0.005mg/cm2到0.075mg/cm2，0.005mg/cm2到0.05mg/cm2，0.005mg/cm2到0.025mg/cm2，或0.005mg/cm2到0.01mg/cm2范围内的量。
在特定实施例中，氟化乙烯丙烯(FEP)的TOC为0.00005mg/cm2制品(0.001mg/g制品)内部润湿表面；如硅酮套管的硅酮材料的TOC为0.021mg/cm2制品(0.023mg/cm套管)的内部润湿表面和0.008mg/cm2(0.009mg/cm)；历史上使用的细胞培养袋的TOC为0.002mg/cm2制品(0.032mg/g制品)的内部润湿表面。
在特定实施例中，对于包含聚合物的内壁，聚合物为氟聚合物(具有多个较强碳-氟键的基于氟碳的聚合物)，例如氟化乙烯丙烯(FEP)。内壁的官能化可通过适于系统的预期应用和/或适用于系统中的试剂的任何手段实现。在特定实施例中，内壁的官能化包括如用例如羧基、羟基、醛基、羰基、胺基、亚胺基、酰胺基、酯基、酸酐基、硫醇基、二硫基、苯酚、胍、硫醚、吲哚、咪唑或重氮表面基团使所述壁官能化以使得存在特定起始表面。在特定实施例中，用羧酸实现官能化，继而经由肽键将羧酸酯连接到抗生物素蛋白。在特定实施例中，固定化抗生物素蛋白用作生物素化引物或生物素化适体的键结位点。在至少一些情况下，官能基可直接或间接连接到作为引物的DNA序列上以使用RCA(滚环扩增)构筑适体。因此，在特定方面中，公开内容包括使用适体“触手(tentacle)”来捕获且释放样品中的特定细胞，而不伤害其。公开内容中涵盖了在不有害地影响细胞功能的情况下，在一个步骤方法或一个系统方法中从样品分离特定细胞。在特定实施例中，本发明的系统为单次使用式的。
实施例包括对如单核细胞的所需细胞具有较高特异性和亲和性的适体(如由细胞SELEX方法设计的适体)。采用封闭系统(包括至少一种容器，如袋或套管且至少部分由氟聚合物构成)，所述内表面用例如DNA的长序列官能化。这些触手可通过任何适合的方法产生，但在特定实施例中，其用涉及适体的第一模板的RCA产生。随后，各触手具有对所需细胞具有高度特异性的至少若干位点。在某些实施例中，适体的长度为至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30或更多个碱基对长以此类推。在特定实施例中，适体的长度为不超过5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30或更多个碱基对长。在系统(通过至少一种容器，其可为袋、套管、珠粒、板或微结构)的表面上处理样品，且其后仅所需细胞保持连接到触手。随后，使用方法以实现从与其它非所需细胞分离的系统释放所需细胞。可利用限制酶消化、加热和/或互补DNA以释放细胞。
在用于分离生物学物质的系统(包括所需细胞)的实施例中，存在包含氟聚合物层的设备。在某些实施例中，设备可配置为容器，包括袋或套管。在至少一些情况下，袋进一步定义为套管，且所述套管可由可弯曲材料构成以使得其能够经配置成一形状以便易于使用或储存(如蛇形构造)。氟聚合物层可包括至少一个主表面和包含官能基的反应性部分。反应性部分(RM)可连接到，如共价连接到氟聚合物的主表面。在至少一些方面中，反应性部分可为几何学上装配在表面上的化学基团的量。反应性部分可具有至少每方形微米50个反应性部分的表面浓度，即50RM/μm2主表面。在某些实施例中，反应性部分可具有至少55RM/μm2，60RM/μm2，65RM/μm2，70RM/μm2，75RM/μm2，80RM/μm2，85RM/μm2，90RM/μm2，95RM/μm2，100RM/μm2，200RM/μm2，500RM/μm2，750RM/μm2，或1000RM/μm2的表面浓度。
在一个实施例中，用于分离生物学物质的系统包含入口和连接到第一末端处的入口的容器(如套管)。套管可包括氟聚合物层。在某些方面中，氟聚合物层可包含主表面和包含官能基的反应性部分。反应性部分可共价连接到氟聚合物的主表面。反应性部分可具有每方形微米至少50个反应性部分(50RM/μm2)的表面浓度。在一些实施例中，所述系统进一步包括连接到套管的第二末端的出口。
在所述系统的特定实施例中，分离生物学物质的方法包含提供生物样品。所述方法可进一步包括通过套管施加生物样品。在特定实施例中，所述套管可包括氟聚合物层。在特定情况下，氟聚合物层包含主表面和反应性部分。反应性部分可连接到，如共价连接到氟聚合物的表面。共价连接的反应性部分具有表面浓度Sc。在特定实施例中，所述方法包含将来自生物样品的单一所需生物制剂固定到表面上。所述方法可进一步包括从套管去除少于所需生物制剂的生物样品。在一个实施例中，基于表面浓度Sc和长度L，至少90mol％单一生物制剂固定于表面上，但在一些情况下，基于表面浓度Sc和长度L，至少80mol％、81mol％、82mol％、83mol％、84mol％、85mol％、86mol％、87mol％、88mol％、89mol％、90mol％、91mol％、92mol％、93mol％、94mol％、95mol％、96mol％、97mol％、98mol％或99mol％单一所需生物制剂固定化。在一些实施例中，所述方法进一步包含从个体获得生物样品。可以任何手段进行获得，如从个体抽取血液，从个体采集骨髓，吸脂，手术取样(利用导管、内窥镜检查等)，固体和液体组织取样的其它方法等。
在一定实施例中，所述系统包含袋，其包括入口。在特定实施例中，所述袋包含出口。在一些情况下，所述袋可进一步包括捕获元件。捕获元件包含表面和捕获部分。在特定方面中，捕获部分可包括生物素化合物。捕获部分可包括抗生物素蛋白。捕获部分可包括生物素化合物或抗生物素蛋白任一者，但不包括两者。在系统的一个方面中，袋包含可共价连接到所述袋的表面的捕获部分。在特定实施例中，捕获部分可具有特异性以固定任何种类细胞(特定实例至少包括白血细胞)。在特定实施例中，抗生物素蛋白为连接DNA的直接或间接键且不捕获细胞自身。
在一个实施例中，系统包含袋，其包含每100mL体积至少1000万细胞捕获位点，但所述袋可包含每100mL体积至少1500万、2000万、2500万、3000万、5000万、7500万以此类推数目的细胞捕获位点；在特定情况下，所述细胞为例如造血干细胞。各捕获位点可包括捕获元件。捕获元件可包括表面和捕获部分。捕获部分可连接到，如共价连接到表面。
在一些实施例中，存在从样品分离细胞的方法，其包含提供样品。在某些情况下，存在分离血液或免疫细胞(至少包括白色血细胞)的方法，其包括提供来自个体的样品。在特定实施例中，所述方法包含提供来自个体血液或骨髓样品。所述方法可包括从个体提取血液或骨髓样品。所述方法可包括将样品(如血液样品)转移到本发明的设备，包括例如前述容器中。
在某些实施例中，从生物样品分离特定细胞的方法包括提供来自哺乳动物，如例如人类、狗、猫、马、猪、绵羊、黑猩猩、狒狒、大猩猩或山羊的样品。在一些情况下，从生物样品分离单核细胞的方法包括提供来自哺乳动物的血液样品。所述方法可包括将样品(如血液)转移到前述容器中的一个中。
本发明的实施例还包括诱导单核细胞连接到容器结构的表面上，且随后使用各种细胞因子诱导单核细胞连接到表面的人造血管，使得从全血分离单核细胞以及其后从容器表面去除其。容器环境可包含用于刺激单核细胞粘着的一种或多种趋化因子，且一旦粘着，单核细胞可基于其自身肌动蛋白骨架产生更强相互作用。因此，本发明的特定实施例允许不存在高剪切应力。
在一个实施例中，存在包含容器的细胞分离系统，其中所述容器包含：内表面，其包含具有小于0.1mg/cm2的水中的总有机碳(TOC)的聚合物；和连接到所述聚合物的多个官能基。在特定实施例中，氟化乙烯丙烯(FEP)的TOC为0.0005mg/cm2制品(0.001mg/g制品)的内部润湿表面；硅酮材料，如硅酮套管的TOC为0.021mg/cm2制品(0.023mg/cm套管)的内部润湿表面和0.008mg/cm2制品(0.009mg/cm套管)的内部润湿表面；历史上使用的细胞培养袋的TOC为0.002mg/cm2制品(0.032mg/g制品)的内部润湿表面。在特定实施例中，官能基直接或间接连接到生物学试剂捕获部分。在一些实施例中，官能基通过连接子连接到聚合物，且连接子可为直链亚烷基(亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基或亚己基)、支链亚烷基、环状亚烷基、芳烃二基、寡聚乙二醇基，如四乙二醇基、醣基或其组合。在特定实施例中，官能基具有直接连接到其上的结合对的第一成员。在某些方面中，生物学试剂捕获部分包含结合对的第二成员。在某些实施例中，官能基具有直接连接到其上的结合对的第一成员且生物学试剂捕获部分包含结合对的第二成员，其中结合对的所述第一和第二成员彼此结合。在结合对的第一成员为抗生物素蛋白物质时的情况下，结合对的第二成员为例如生物素。当结合对的第一成员为生物素时，结合对的第二成员为例如抗生物素蛋白物质。抗生物素蛋白物质的实例包括抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素或中性抗生物素蛋白。在一些情况下，官能基为羧基、羟基、醛基、羰基、胺基、亚胺基、酰胺基、炔基、烯烃基、氮丙啶基、环氧基、异腈基、胩基、四嗪基、烷基、氨基乙基酰胺基、酯基、硫醇基、酸酐基、二硫基、酚基、胍基、硫醚基、吲哚基、咪唑基、重氮基或其组合。在一些实施例中，生物学试剂捕获部分直接结合生物学试剂。在特定实施例中，生物学试剂捕获部分间接结合生物学试剂或产生直接结合生物学试剂的分子。在特定实施例中，通过生物学试剂捕获部分产生的生物学试剂捕获部分或分子为核酸。在特定实施例中，生物学试剂捕获部分包含核酸模板，且其可为圆形DNA模板。核酸模板可包含与直接结合到生物学试剂的序列互补的序列。在特定实施例中，生物学试剂捕获部分所产生的分子包含一种或多种适体。在特定方面中，聚合物为氟聚合物，如聚四氟乙烯(PTFE)、全氟烷氧基(PFA)、乙烯四氟乙烯(ETFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚氯三氟乙烯(PCTFE)、乙烯氯三氟乙烯(ECTFE)、氟化乙烯丙烯(FEP)、乙烯氟化乙烯丙烯(EFEP)、全氟聚醚(PFPE)、经改性的聚四氟乙烯(TFM)、聚乙烯氟化物或其组合。
在本发明的特定实施例中，所述系统为封闭系统。
在细胞分离容器的实施例中，所述容器进一步包含酶，如聚合酶，至少包括phi29聚合酶。所述容器可包含袋、套管、珠粒、烧瓶、滚瓶和/或刚性容器。所述容器可包含两个或更多个孔口。在某些实施例中，所述系统包含一个或多个串联连接到容器上的额外容器。在特定实施例中，第二容器包含一种或多种细胞生长试剂。在某些情况下，存在第三容器，其包含一种或多种抗原，如肿瘤抗原。在一些情况下，存在第四容器，其经配置以浓缩生物制剂，如细胞，其可为来自样品的细胞。细胞实例包括单核细胞、血细胞、免疫细胞或其混合物。
在系统的某些实施例中，存在第二容器，其包含一种或多种膜(参见美国临时专利申请第62/095,197号和美国临时专利申请第62/095,116号中的至少某些实施例，所述申请以全文引用的方式并入本文中)。所述膜可为多孔的。在一些情况下，存在第二容器，其包含两个或更多个孔口。在特定实施例中，第二容器包含两个入口和两个出口。在特定实施例中，存在第二容器，其包含一种或多种膜且包含两个、三个或四个孔口。在特定实施例中，第一膜经配置以选择性地以流体方式分离第一入口与容器中的腔室，且第二膜经配置以选择性地以流体方式分离第一出口与腔室。在特定实施例中，第二入口安置在腔室处，第二出口安置在腔室或这两者处。在特定实施例中，第二容器包含内表面，其包含具有小于0.1mg/cm2的水中的总有机碳(TOC)的聚合物。在特定实施例中，氟化乙烯丙烯(FEP)的TOC为0.0005mg/cm2制品(0.001mg/g制品)的内部润湿表面；硅酮材料，如硅酮套管的TOC为0.021mg/cm2制品(0.023mg/cm套管)的内部润湿表面和0.008mg/cm2制品(0.009mg/cm套管)的内部润湿表面；历史上使用的细胞培养袋的TOC为0.002mg/cm2制品(0.032mg/g制品)的内部润湿表面。
在一个实施例中，存在制备如本文所预期的系统的方法，其包含以下步骤：提供包含内表面的容器，所述内表面包含具有小于0.1mg/cm2的水中的TOC的聚合物；且将官能基连接到所述内表面。在特定实施例中，所述连接步骤通过氧化，通过格林纳试剂(Grignardreagent)或电晕处理进行。在一些实施例中，所述方法进一步包含将结合对的第一成员连接到官能基的步骤。在特定实施例中，将结合对的第一成员连接到官能基的步骤包含官能基活化。活化可包含使官能基曝露于乙酸钠和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合物。在特定实施例中，方法进一步包含将结合对的第二成员连接到生物学试剂捕获部分，如通过结合对的第二成员直接或间接连接到官能基的生物学试剂捕获部分的步骤。生物学试剂捕获部分可为圆形DNA模板和引物且所述方法进一步包含向所述容器提供聚合酶(如在适合的条件下延伸DNA模板的一种聚合酶)和核苷酸的步骤。聚合酶可为phi29聚合酶。
在某些实施例中，存在用于从来自至少一个个体的样品分离特定细胞的方法，其包含以下步骤：提供如本文所预期的系统；以及在混合物中的特定细胞能够选择性地结合到生物学试剂捕获部分或选择性地结合到生物学试剂捕获部分所产生的分子(如核酸)的条件下使系统处理包含细胞的混合物的样品。样品可为血液或骨髓。在某些实施例中，处理步骤进一步包含向系统提供酶，如聚合酶。本发明的方法可进一步包含从个体获得样品的步骤。个体可能需要细胞疗法，如癌症细胞疗法。在特定实施例中，在从样品分离特定细胞之后，从系统采集细胞。其可通过从生物学试剂捕获部分或生物学试剂捕获部分所产生的分子释放细胞来采集。在特定实施例中，在适合的条件下通过加热实现释放。在特定实施例中，当生物学试剂捕获部分或生物学试剂捕获部分所产生的分子为核酸时，通过曝露于一种或多种核酸内切酶和/或曝露于与各别部分或分子互补的核酸，释放细胞。在特定实施例中，在从样品分离特定细胞之后，进一步处理细胞，且其可在系统中的一个或多个额外容器中得到进一步处理。可通过培养细胞，使细胞曝露于一种或多种抗原，使细胞分化，使细胞扩增，浓缩细胞，纯化细胞或其组合进一步处理细胞。在特定实施例中，向需要细胞疗法的个体提供治疗有效量的所采集的细胞。
在一些实施例中，存在包含如本文所预期的系统的试剂盒，所述系统容纳在适合的容器中。在特定实施例中，所述系统进一步包含用于样品采集或样品储存或这两者的设备。所述设备可为小瓶、注射器、杯子、导管、袋、套管或其组合。所述试剂盒可进一步包含聚合酶，如phi29聚合酶。所述试剂盒可进一步包含核酸内切酶、缓冲液和/或一种或多种细胞因子、趋化因子或生长因子。
附图说明
为了更完整地理解本发明，现结合附图参考以下描述，在附图中：
图1A-1B说明用于细胞疗法的分离和培养细胞的封闭系统的示例性实施例；
图2表明使包含袋的适体曝露于血液以便捕获特定免疫细胞的实施例；
图3表明产生来自
Figure BDA0001361422150000081
Norton C处理FEP膜的氧化FEP作为实例；
图4显示连接到用于分离相关细胞的FEP衬底的珠粒；
图5显示经氧化的处理膜、未经氧化的处理膜以及未经氧化的处理膜的FTIR光谱；
图6说明使用添加到血液样品中且引入到包含FEP与中性抗生物素蛋白的涂料的套管的生物素化适体分离所需细胞的一个实例；
图7包括根据一个实施例的用于分离生物学物质的系统的图示；
图8包括根据一个实施例使表面改性的方法的流程图的一个实例；
图9包括用于从生物样品分离生物制剂的方法图示的一个实例；
图10说明在抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白(NAv)吸附之后未经处理的膜的4000-1400cm-1范围内的FTIR光谱。使对照样品与悬浮液和冲洗缓冲液(NaOAc和去离子H2O)接触。在1630cm-1处观测到酰胺存在。蛋白质样品的3400cm-1处的更高峰还显示表面上蛋白质的存在；
图11显示在抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白(NAv)吸附之后经C处理的膜的4000-1400cm-1范围内的FTIR光谱。使对照样品与悬浮液和冲洗缓冲液(NaOAc和去离子H2O)接触。在1630cm-1处观测到酰胺存在。蛋白质样品的3400cm-1处的更高峰还显示表面上蛋白质的存在；
图12表明未经处理的(第1管柱)、经C处理的(第2管柱)和氧化经C处理的FEP膜(第4管柱)上结合到羧基的亚甲基蓝分子的600nm处的吸收率。第3管柱显示在其与亚甲基蓝(空白对照)反应之前氧化经C处理的膜的吸收率；
图13显示未经处理的(第1管柱)、经C处理的(第2管柱)和氧化经C处理的FEP膜(第4管柱)上结合到羧基的亚甲基蓝分子的总吸收率和600nm处的吸收率。第3管柱显示在其与亚甲基蓝(空白对照)反应之前氧化经C处理的膜的吸收率；
图14显示UV-Vis范围350-1050nm内具有亚甲基蓝的FEP膜染料的典型的光谱。氧化对照为在与亚甲基蓝反应之前氧化经C处理的膜；
图15A-15D提供具有吸附的中性抗生物素蛋白的未经处理的FEP的SEM图像(A到D)。图像D显示生物素涂料珠粒连接到官能化中性抗生物素蛋白表面(具有吸附的中性抗生物素蛋白的未经处理的FEP)；
图16显示具有吸附的中性抗生物素蛋白(左图)和氧化的经共轭中性抗生物素蛋白处理的C(右图)的经C处理的FEP的SEM图像；
图17提供具有吸附的中性抗生物素蛋白的未经处理的FEP上经生物素涂布的微珠；
图18显示具有吸附的中性抗生物素蛋白的未经处理的FEP上生物素微珠的光学图像(d的黑色斑点约0.8-1μm)需要奥林巴斯(Olympus)DSX 500显微镜。标尺：341-342μm，放大率：在20X透镜上的3X；
图19提供包括未经处理的对照的经改性的FEP膜的不同类型上染色蛋白质的660nm处的吸收率。管柱的各群组的第一管柱代表仅曝露于缓冲溶液的对照样品，各群组的第二管柱代表吸附的抗生物素蛋白，且各群组的第三管柱代表具有吸附的中性抗生物素蛋白的样品。在进行蛋白质染色反应物之后获得所有测量结果；
图20表明在与蛋白质的染料反应之前和之后经C处理的膜上UV-Vis范围350-1050nm内的典型的光谱；
图21显示先前经吸附的中性抗生物素蛋白(NAv)改性的1％SDS洗涤的氧化经C处理的膜的FTIR光谱；
图22提供在高功率(US-A)和低功率(US-B)下超声波处理步骤5分钟之后具有吸附的中性抗生物素蛋白的未经处理的FEP上的FTIR光谱。未观测到变化。在超声波处理之前，细实线代表吸附的蛋白质的光谱；
图23显示在高功率(US-A)和低功率(US-B)下超声波处理步骤5分钟之后经C处理的FEP上的FTIR光谱；
图24说明FEP的连接的中性抗生物素蛋白膜上酶联结免疫吸附剂分析法的一个实例；
图25显示聚丙烯酸官能化FEP膜(pAA-FEP)的4000-1400cm-1范围内的FTIR光谱；已经MES缓冲液中的EDC/NHS化学物质活化的pAA-FEP的光谱；与抗生物素蛋白共轭的活化pAA-FEP膜表面的其它共轭反应物的光谱；以及出于参考目的表面上吸附的抗生物素蛋白的光谱；
图26提供靠近未用pAA官能化的FEP的对照部分的pAA-FEP表面的带荧光团标记的化学连接的抗生物素蛋白的荧光图像；以及
图27显示聚丙烯酸官能化FEP膜(pAA-FEP)的4000-1400cm-1范围内的FTIR光谱；曝露于无DNA镁离子偶合缓冲液的pAA-FEP膜的光谱；曝露于EDC/NHS试剂的pAA-FEP膜的光谱；在与胺封端DNA共轭反应物之后EDC/NHS活化pAA-FEP膜的光谱；浸泡在DNA溶液中的pAA-FEP膜的光谱。
具体实施方式
如本文说明书所使用，“一(a/an)”可意指一个或多个。如本文权利要求所使用，当与词“包含”结合使用时，词“一(a/an)”可意指一个或多于一个。如本文所使用，“另一个”可意指至少第二或更多。再者，术语“具有”、“包括”、“含有”和“包含”为可互换的且所属领域的技术人员认识到这些术语为开放术语。本发明的一些实施例可由本发明的一种或多种要素、方法步骤和/或方法组成或基本上由它们组成。预期本文所描述的任何方法或组合物可相对于本文所描述的任何其它方法或组合物实施。
本发明实施方式的目标为提供系统、方法和组合物，从而以较高特异性从生物样品分离至少一种生物学试剂。此实施方式还包括用于制备此类系统的一种或多种方法。在一个实施例中，生物制剂可在无机物质，如金属离子和阴离子到较小有机分子，如例如维生素、激素或肽范围内。在另一实施例中，生物制剂可包括大分子物质，如例如蛋白质、酶或核苷酸。在又一实施例中，生物制剂可甚至包括更复杂的系统，如细胞器，即，例如细胞核、核糖体、线粒体、细胞囊泡、粗糙和光滑内质网、高尔基体、溶酶体、中心体、细胞片段或细胞膜。在一个特定实施例中，生物制剂可包括整个细胞。在某些实施例中，生物制剂包含例如任何类型的血细胞、任何类型的干细胞或任何类型的免疫细胞。来自样品的细胞可为正常的或可为患病的。在另一特定实施例中，生物制剂包含血细胞，如白血细胞。在一些特定实施例中，生物制剂包含免疫细胞，如单核细胞或T细胞。在特定实施例中，生物学试剂为例如病毒、细胞组或微生物。因此，生物样品可包括来自包括人类的动物的任何器官或组织的样品。举例来说，血液可为生物样品以分离单核细胞。在另一实施例中，骨髓可为生物样品以分离造血干细胞，即，单核细胞的前体。在一个特定实施例中，系统允许分离大分子化合物、细胞次单元或具有特异性的细胞，同时维持物质的生物活性，即，在较低降解速率的情况下。
本发明的实施例提供允许从细胞的混合物，如来自样品的细胞的混合物分离所需细胞的系统。样品可来自个体，包括哺乳动物，如人类。在特定实施例中，所述系统包括经配置以分离所需细胞的容器。在一些实施例中，系统为多部分的，除用于细胞分离的容器外，还具有额外容器。此类容器可配置在用于移动细胞的顺序路径中，在一些情况下；在此类实施例中，使细胞经受不同环境或操控以便进一步处理。在一个特定实施例中，分离容器为用于顺序处理细胞的路径中的第一容器。在其中在系统中存在两个或更多个容器的情况下，容器可串联配置，以使得所处理的样品或细胞依次从一个容器移动到另一个容器。在特定实施例中，多容器系统以线性方式配置且此类线性路径可为水平或线性的或都不是。
在特定实施例中，在递送到系统之前，样品未经处理，但在递送到系统之前，样品可已储存在足够的条件下。在特定实施例中，在递送到系统之前，样品不经受分离技术(包括离心)，在递送到系统(包括例如抗凝固剂)之前，不添加一种或多种生物制剂等等。在特定实施例中，不使样品与表面接触经受，其将触发免疫细胞响应。样品可通过与进行系统处理的一方不同的另一方获自个体。
在一个实施例中，所述系统可为完整的且在其使用之前准备好生物学试剂分离。在另一实施例中，可在初步阶段向使用者提供系统，且如实验室技术员的使用者关于所需生物学试剂的特异性修改系统。在一个实施例中，可从进一步处理中分离系统。在另一实施例中，本发明的系统可包括于方法序列中，其中生物学试剂的分离为包括本发明的系统的多部分系统的一个部分。鉴于一些生物制剂的灵敏度，至少本发明的系统可为封闭系统，其中生物学试剂的分离和其进一步处理在单一控制系统中进行。
在系统的某些实施例中，容器包含用于捕获所需物质，如例如所需细胞的一种或多种生物学试剂捕获部分。在本发明的特定方面中，系统和方法的生物学试剂捕获部分包含适体和/或产生适体，所述适体可为结合到特异性靶分子(在此情况下，待捕获的所需生物制剂)的寡核苷酸。系统的使用者或申报者可能已知或可能不知道适体序列。在特定实施例中，特定适体对结合特定所需细胞具有特异性。系统的使用者可产生或鉴别出适体或适体可获自其它者，包括商业上获得的那些。举例来说，可通过从以较大随机合成方式产生的序列池选择其来产生寡核苷酸适体，但适体可存在于自然界中。本发明的系统的使用者或申报者可能不是鉴别出对特定生物学试剂具有特异性的适体的序列的一方。对于核酸实施例，所述适体可包含DNA或RNA且可包含寡核苷酸的多聚体。在特定实施例中，适体触手的长度范围为至少10、25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000或更多个触手内的适体。在特定实施例中，适体触手的长度范围为不超过10、25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000或更多个触手内的适体。
在本发明的特定实施例中，所述容器为包含至少一个由氟聚合物构成或涂布在氟聚合物中的袋或套管的封闭系统的部分以使得其内表面用核酸(如DNA，包括DNA的长序列)官能化，且所述核酸可间接连接到内表面。在特定实施例中，氟聚合物具有连接到其上的DNA的长序列的触手，其可由适于适体的第一模板产生(例如通过RCA或PCR)。因此，DNA的各触手具有对相关生物学试剂具有较高特异性的至少两个或更多个位点。
在一个特定实施例中，样品(如例如血液)获自个体且提供到容器中，其包含经改性的特定聚合物以便捕获样品(如所需细胞)中的所需生物制剂。在特定实施例中，聚合物经改性以具有能够结合细胞的连接到其上的核酸适体触手。在所需细胞结合到触手后，可从聚合物释放具有结合细胞的触手以便采集。可通过任何适合的手段释放，但在特定实施例中，例如通过使用加热、核酸内切酶(如限制酶)和/或互补DNA实现。当采用一种或多种限制酶时，可针对DNA触手的特定序列调整限制酶选择。可通过套管将所需细胞采集到例如袋中。
在本发明的特定实施例中，存在用于产生分离细胞系统的多步骤方法。所属领域的技术人员认识到，存在用于固定适体的多种化学方法，包括连接到金，共价连接到官能改性表面，包括用于连接子设计的适用的参数作为实例(Balamurugan等人，2008)。然而，在特定实施例中，本文中涵盖多步骤方法。在一个实施例中，一个步骤为选择特定起始FEP表面以便后续蛋白质固定，所述蛋白质如抗生物素蛋白或其衍生物中的一种。在特定实施例中，生物学捕获试剂直接连接到表面。可考虑表面能和表面化学的改性。另一步骤可为将抗生物素蛋白或其衍生物中的一种连接到FEP的所选表面，且在特定实施例中，此类步骤可包含物理吸附或化学共轭。取决于所选方法，FEP表面的起始官能化可为不同的。另一步骤涉及使生物素化适体与细胞表面标记物(如单核细胞表面标记物)的特定DNA序列偶合到抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白。最终，所需细胞从样品中分离(如从全血中分离单核细胞)。在此步骤中，细胞将通过其特异性细胞表面标记物结合到适体且在封闭系统中将与其它细胞分离。
在特定实施例中，系统封闭且包含至少一个表面。表面可或可不连续贯穿系统，如贯穿系统中的多个容器。在特定实施例中，系统的不同容器中的表面大体上相同，但在其它实施例中，系统的不同容器中的表面不同。系统的容器的内表面可具有系统的至少一部分中的一个或多个层，但在一些情况下，表面具有贯穿系统的一个或多个层。系统中的不同表面可具有不同修饰。
在一个实施例中，系统中的表面的第一层可考虑为基层，如包含容器的内表面。此类层可由具有较低可沥滤性、较低可萃取性的材料构成，对如细胞等生物制剂无反应性。第一层可为系统的容器结构的内表面或第一层可为系统的容器结构的内表面上的涂层。
在一个实施例中，系统中的表面的第二层可包含连接到第一层的官能基。官能基可经化学配置以用于将第一层与包含生物学试剂捕获部分的层或与生物学试剂捕获部分相关的层连接。此类官能基可为任何种类，取决于系统的一个或多个层的性质。在某些情况下，所述官能基包含酸以便于进一步修饰。在特定实施例中，官能基为羧基、羟基、醛基、羰基、胺基、亚胺基、酰胺基、酯基、酸酐基、硫醇基、二硫基、酚基、胍基、硫醚基、吲哚基、咪唑基、氨基乙基酰胺基、炔基、烯烃基、氮丙啶基、环氧基、异腈基、胩基、四嗪基、重氮表面基团、炔基、烯烃基、氮丙啶基、环氧基、异腈基、胩基、四嗪基、烷基、氨基乙基酰胺基、酯基、重氮基或其组合。第二层也可以包含连接到结合对的第一成员的官能基，如抗生物素蛋白物质(包括抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素)或生物素分子。
在一个实施例中，系统中的表面的第三层可包含生物学试剂捕获部分。生物学试剂捕获部分可为任何种类，但在特定实施例中，生物学试剂捕获部分为直接或间接细胞结合部分。在特定实施例中，生物学试剂捕获部分实现直接或间接细胞选择性。在特定实施例中，生物学试剂捕获部分可包含核酸或可产生核酸。生物学试剂捕获部分可包含例如单一适体、适体触手或抗体。在特定实施例中，生物学试剂捕获部分包含抗生物素蛋白(包括抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素)或生物素分子或与抗生物素蛋白或生物素分子间接相关。在第二层包含抗生物素蛋白物质或生物素中的一种的情况下，第三层包含各别对应物生物素或抗生物素蛋白物质。
参看图7，用于分离生物学试剂100的系统包含分离单元100a和转移单元100b。分离单元100a可包括蛇形袋102，其具有入口端口104和入口106(所述入口可包含限制装置，如例如阀门或夹具)；以及出口端口108与出口110(所述出口可包含限制装置，如例如阀门或夹具)。在一些实施例中，袋102可配置为套管。如图1中所示，分离单元可以蛇形方式配置以节约空间和/或以便于例如分离单元的温度维持。在其它实施例中，分离单元可为例如笔直套管或螺旋套管。
仍参看图7，分离单元可包含外部材料112，但在其它实施例中，所述单元不含外部材料(例如当所述单元包含100％氟聚合物时)。在某些方面中，外部材料可由热塑性聚合物、热塑性弹性体、硅酮、橡胶或其任何组合构成。外部材料可具有至少0.0005英寸、0.0010英寸、0.0050英寸、0.0075英寸、0.01英寸、0.02英寸、0.03英寸、0.04英寸、0.05英寸、至少0.06英寸、至少0.07英寸、至少0.08英寸、至少0.09英寸、至少0.1英寸或至少0.11英寸的厚度。在另一实施例中，外部材料可具有不超过0.2英寸、不超过0.18英寸、不超过0.16英寸、不超过0.14英寸或不大于0.12英寸的厚度。在一个实施例中，外部材料112的厚度可在0.06英寸到0.13英寸，如在某些实施例中0.09到0.126英寸范围内。外部材料112具有内表面1122。
如图7中所示，作为实例，外部材料112的内表面1122可通过氟聚合物材料114覆盖。氟聚合物可为任何种类，但在特定情况下，氟聚合物可选自聚四氟乙烯(PTFE)、全氟烷氧基(PFA)、乙烯四氟乙烯(ETFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚氯三氟乙烯(PCTFE)、乙烯氯三氟乙烯(ECTFE)、氟化乙烯丙烯(FEP)、乙烯氟化乙烯丙烯(EFEP)、全氟聚醚(PFPE)、经改性的聚四氟乙烯(TFM)、聚乙烯氟化物(PVF)或其任何组合。在一个特定实施例中，氟聚合物材料114包含FEP。FEP为适宜材料，因为其维持针对细胞分离的商品可加工性，至少包括白血细胞分离。举例来说，FEP不触发生物样品的先天性免疫应答。因此，在一个实施例中，氟聚合物材料114由FEP组成或主要由FEP组成。在聚合物为PTFE的实施例中，存在用于修饰其表面的已知反应，其采用射频辉光放电氨等离子体来在氟聚合物表面上引入氨基，继而与戊二酸和顺式乌头酸酐进一步反应以提供羧酸官能基(Gauvreau等人，2004)。针对PTFE起作用的表面官能化方法可延长到其它氟聚合物表面，如本文中论述的那些。
在某些情况下，不存在套管外表面且所述壁完全为氟聚合物。在任何情况下，在某些实施例中，氟聚合物材料114可具有至少0.0003英寸，至少0.0004英寸，至少0.0005英寸，至少0.0006英寸，至少0.001英寸，至少0.10英寸等的厚度。在另一实施例中，氟聚合物材料包含不超过0.100英寸，不超过0.080英寸，不超过0.070英寸，不超过0.050英寸，不超过0.030英寸，不超过0.018英寸，不超过0.016英寸，不超过0.014英寸，或不大于0.012英寸的厚度。在一个实施例中，氟聚合物材料114的厚度可以在0.001英寸到0.015英寸，如0.002到0.01英寸范围内。在特定实施例中，壁厚度可为至多0.100英寸且包括0.100英寸。氟聚合物材料114可上覆于内表面1122上，如图7中所示。在特定实施例中，氟聚合物材料114上覆于至少大部分内表面1122上。在一个实施例中，氟聚合物材料与外部材料112直接接触。氟聚合物可具有主表面1142。
主表面1142可为套管102的曝露管腔。氟聚合物材料114的主表面1142可经改性。在特定实施例中，氟聚合物材料114可经改性以包括至少一个反应性部分。反应性部分可包括可经化学改性以形成生物学试剂捕获部分的结合位点的官能基。在另一实施例中，反应性部分可为共轭物部分。共轭物部分包含蛋白质和/或核苷酸的大分子复合物，其(例如)包括生物学试剂的至少一个结合位点。对于包含超过一个结合位点的反应性部分，反应性部分可形成捕获部分。
进一步参看图7，转移单元100b允许在传送通过分离单元100a之后控制处理生物样品。转移单元100b可包括连接到出口阀110的套管120。套管120可由例如热塑性聚合物、热塑性弹性体或硅酮制成。在一个实施例中，套管120可内衬有氟聚合物。在特定实施例中，氟聚合物可与分离单元100a中相同，但具有未改性的主表面，即，套管120中的氟聚合物不包括反应性部分。氟聚合物可选自例如聚四氟乙烯(PTFE)、全氟烷氧基(PFA)、乙烯四氟乙烯(ETFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚氯三氟乙烯(PCTFE)、乙烯氯三氟乙烯(ECTFE)、氟化乙烯丙烯(FEP)、乙烯氟化乙烯丙烯(EFEP)、全氟聚醚(PFPE)、经改性的聚四氟乙烯(TFM)、聚乙烯氟化物(PVF)或其任何组合。在一个特定实施例中，氟聚合物材料包含FEP。
在至少一些情况下，转移单元可进一步包括用于在传送通过单元100a之后通过套管124从系统分流生物样品的分离器122。相反地，套管126允许通过连接器128将分离单元100a连接到另一系统。在特定实施例中，连接到另一系统为无菌连接，其可包含套管的无菌焊接或使用无菌连接器。
参看图8，此图示描绘用以制备具有氟聚合物202上的官能基的生物学试剂捕获部分的示例性处理200。在初始步骤A中，包含连接子204和官能基206的反应性部分制备在氟聚合物202的主表面上。如图8中所示，官能基206可为羧基。替代地，官能基可为羟基(-OH)、醛基(-CHO)、羰基(C(O)R，R为C1-C4烷基)、羧基(-COOH)、胺基(-NH2)、亚胺基(＝NH)、酰胺基(-C(O)NHR，R为H、烷基、肽或蛋白质)、氨基乙基酰胺基、酯基(-COOR，R为烷基、肽或蛋白质)、硫醇基、酸酐基、二硫基、酚基、胍基、硫醚基、吲哚基、咪唑基、重氮基、炔基、烯烃基、氮丙啶基、环氧基、异腈基、胩基、四嗪基、重氮表面基团、烷基或其组合。
在至少一些情况下，反应性部分还可包括连接子204。在一个实施例中，连接子可为共价键，将羧基(或其它官能基)直接连接到氟聚合物。在另一实施例中，连接基团可为有机基团。举例来说，连接基团可为线性亚烷基，包括例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基或其任何组合。在某些实施例中，官能基(如COOH)表面包含稳定涂料，而非共价结合基团。
含氟聚合物的表面修饰提供适用于本发明的某些实施例中的经改性的氟聚合物。一般来说，极性官能基连接到氟聚合物表面且在氟聚合物表面中产生，使其更易于湿润且提供化学键结机会。存在使氟聚合物表面官能化的若干方法，包括例如化学蚀刻、物理机械蚀刻、等离子体蚀刻、不同压力下的等离子体活化、电晕活化、化学处理、电晕处理、化学气相沉积或其任何组合。在一实施例中，化学蚀刻包括钠氨或钠萘。示例性物理机械蚀刻可包括喷砂和二氧化硅空气磨损。在另一实施例中，等离子蚀刻包括反应性等离子，如氢、氧、乙炔、甲烷以及其与氮、氩和氦的混合物。Lachmann等人(2011)描述利用氦气与适合的反应性物质或成膜试剂的气体混合物的表面修饰方法。等离子体活化可包括在表面中通过用包括(但不限于)氩气、氢气、氮气、二氧化碳和组合的气体进行处理来形成反应性物质。等离子体活化可在如0.1托到0.6托的低压下实现且在如700托到760托的大气压下关闭。可实现在包括(但不限于)氩气、氮气和氢气或其组合的气体下表面的电晕活化以在可进一步用于化学处理的表面中形成活性位点。化学处理由通过包括接枝聚合、偶合、点击化学、压缩和加成反应的化学反应的活性或现有表面的顺序化学修饰组成。作为实例，溶液中的接枝聚合可通过经由自由基聚合使乙烯基单体聚合实现。乙烯基单体包括(但不限于)丙烯酸、(甲基)丙烯酸酯、丙烯酸(甲基)烷酯、苯乙烯、二烯、α-烯烃、卤代烯烃、(甲基)丙烯腈、丙烯酰胺、N-乙烯基咔唑和N-乙烯基吡咯烷酮和马来酸酐。电晕处理可包括反应性烃蒸气，如酮，例如丙酮、醇、对氯苯乙烯、丙烯腈、丙烯二胺、无水氨、苯乙烯磺酸、四氯化碳、四亚乙基五胺、环己基胺、钛酸四异丙酯、癸基胺、四氢呋喃、二亚乙基三胺、叔丁基胺、乙二胺、甲苯-2,4-二异氰酸酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、三亚乙基四胺、己烷、三乙基胺、甲基醇、乙酸乙烯酯、甲基异丙基胺、乙烯基丁基醚、甲基丙烯酸甲酯、2-乙烯基吡咯烷酮、甲基乙基酮、二甲苯或其混合物。
一些技术使用包括这些方法中的一种的步骤的组合。举例来说，可在激发气体物质存在下通过等离子体或电晕实现表面活化。举例来说，可在如丙酮的溶剂气体存在下通过电晕处理实现表面活化。另一实例包括在低压下经由等离子体的表面活化或在如使用化学处理进一步经改性的氩气的气体中的大气压活化或电晕活化。化学处理可为乙烯基单体的接枝聚合反应，所述乙烯基单体包括(但不限于)丙烯酸、丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸酯、丙烯酸(甲基)烷酯、苯乙烯、二烯、α-烯烃、卤代烯烃、(甲基)丙烯腈、丙烯酰胺、N-乙烯基咔唑和N-乙烯基吡咯烷酮和马来酸酐。
不受理论限制，已发现所述方法在经改性的氟聚合物与非氟聚合物界面(或第二经改性的氟聚合物)之间提供较强的层间粘着。在一种方法中，氟聚合物和非氟聚合物形状各自单独形成。随后，通过美国专利3030290、3255099、3274089、3274090、3274091、3275540、3284331、3291712、3296011、3391314、3397132、3485734、3507763、3676181、4549921和6,726,979中所描述的处理方法对氟聚合物形状进行表面处理，所述专利的教示内容出于所有目的全文并入本文中。随后，所得经改性的氟聚合物和非氟聚合物形状例如通过热层压接触在一起以形成多层膜。最终，多层膜可经受UVA、UVB和/或UVC范围内的波长的UV辐射。
在一个方面中，氟聚合物衬底的表面用电晕放电处理，其中电极区域浸没丙酮、四氢呋喃甲基乙基酮、乙酸乙酯、乙酸异丙酯或乙酸丙酯蒸气。
通过两个间隔开的电极之间存在的气态介质的电容交换产生电晕放电，所述电极中的至少一个通过电介质阻挡层隔绝气态介质。电晕放电因为其电容性质在来源方面略微受限于交替电流。其为高电压、低电流现象，其中电压典型地以千伏特为单位测量且电流典型地以毫安为单位测量。可在较宽范围压力和频率下维持电晕放电。0.2到10个大气压的压力一般限定电晕放电操作的界限且大气压一般为优选的。可适宜地使用20Hz到100MHz范围内的频率：具体来说，范围为500Hz，尤其3000Hz到10MHz。
当使用电介质阻挡层来使两个间隔开的电极中的每一个隔绝气态介质时，电晕放电现象常常称为无电极放电，而当使用单一电介质阻挡层来使电极中的仅一个隔绝气态介质时，所得电晕放电常常称为半电晕放电。在整个本说明书中，使用术语“电晕放电”来表示两种类型电晕放电，即无电极放电和半电晕放电两者。
关于电晕放电处理程序的所有细节提供于转让给杜邦公司(E.I.du Pont deNemours and Company,USA)的一系列美国专利中，描述于期满的美国专利案第3,676,181号和圣戈班高功能塑料公司(Saint-Gobain Performance Plastics Corporation)美国专利案第6,726,979号中，其教示内容出于所有目的全文并入本文中。所提出的技术的一个实例可见于美国专利第3,676,181号(科沃斯基(Kowalski))。封闭处理设备的大气为氮中的20％丙酮(按体积计)用为连续的。使不断馈入的多层膜或颗粒填充膜的外层经受例如每平方英尺膜/薄片表面0.15与2.5瓦特小时之间。可在膜/形状的两侧上处理氟聚合物以提高粘着性。可随后将材料放置在用于储存的非硅化剥离衬垫上。经C处理的材料持续超过1年，而无表面可湿性、可粘固性和粘着性的显著缺失。
在另一个方面中，氟聚合物衬底的表面用等离子体处理。短语“等离子体增强式化学气相沉积(PECVD)”为所属领域中已知的且是指使薄膜在衬底上从气体状态(气相)沉积到固体状态的方法。所述方法中涉及一些化学反应，其在反应气体的等离子体产生之后发生。一般通过两个电极之间的RF(AC)频率或DC放电产生等离子体，其中在中间放置衬底且空间填充有反应气体。等离子体为任何气体，其中使显著百分比的原子或分子电离，产生反应性离子、电子、自由基和UV辐射。
在特定实施例中，可能利用FEP的等离子体表面活化的两步法，其在表面上产生自由基/过氧化物。随后使活化FEP表面曝露于湿化学法以允许表面充当自由基聚合引发剂。举例来说，可使用形成COOH基团的致密表面的丙烯酸单体，但也可使用其它自由基单体。
进一步参看图8，在步骤B中，使官能基连接到大分子物质208，如蛋白质。在一个实施例中，此类蛋白质可包括抗生物素蛋白。在步骤C中，生物素化物质可连接到抗生物素蛋白。尽管生物素化物质可包括所需生物制剂的特异性配体，如抗体，但生物素化物质还可仅包括生物素化核苷酸引物，如图7元件2104中所示。在一个实施例中，核苷酸模板可包括聚合酶2102或与其一起使用。为了形成配体，在方法的步骤D中可应用聚合酶技术(例如)以形成配体特异性DNA序列2106。在至少一些情况下，配体特异性DNA包括适体。
在持续参考图8时，提出适体制备的前述实施方式在步骤D中例示，其中DNA触手2106使用聚合酶2102产生。提供包含至少一种适体的反义序列和充当适体序列之间的间隔子的未结合DNA主链的反义序列的DNA，且在一些情况下，DNA为环形的。在特定实施例中，环形DNA为单链的且提供引物，如生物素化引物。在另一实施例中，间隔开的DNA序列可包括一些额外官能基。举例来说，出于测定结合到反应物部分212上的生物制剂的量的目的，间隔子可包括荧光部分。
图9描绘在具有固定化反应性部分212的套管中采用分离单元100a的捕获方法。套管的一个实例包括装备有所需细胞特异性部分，如适体的前述反应性部分。在步骤L中，使样品(如全血)302传送通过套管100a。在传送期间，所需细胞304尤其结合在单元212上，而样品的其余部分退出套管。在步骤M中，样品已传送过套管且套管已用无细胞缓冲液冲洗以从套管去除非特异性材料且洗涤固定化所需细胞。在步骤N中，随后从单元212移开细胞。在一个实施例中，套管N1可通过加热单元306加热直到克服细胞与共轭部分(即DNA触手)之间的缔合能量为止。注意不要将细胞加热到损伤水平。在加热期间和之后，介质可传送通过套管以接收细胞且将其输送到容器308。
在另一实施例中，套管内含物N2可用限制酶或破坏单元212的DNA序列的DNA酶310处理，进而释放所需细胞304。在消化期间，使介质传送通过套管以接收所需细胞且将其和酶输送到容器308。可通过简单过滤移出酶310。在另一实施例中，通过添加与连接到细胞的链段互补的DNA链段，使细胞从其DNA上的连接移位。
应注意，并非所有在以上一般描述或实例中所描述的活动都是所需要的，一部分特定活动可能是不需要的，且可以执行除那些所描述的活动之外的一种或多种进一步活动。再者，活动所列的次序未必是其被执行的次序。
I.用于分离的细胞和其处理
在本发明的实施例中，可通过本文所描述的系统分离任何细胞。用于分离的细胞包括细胞，如免疫细胞、血细胞或干细胞(包括胚胎干细胞、成体干细胞或诱导多能干细胞)。可用本文所描述的系统分离的血细胞包括红血细胞、白血细胞或血小板。白血细胞的实例包括粒细胞(如嗜中性白血球、嗜碱性血球或嗜酸性细胞)或无颗粒白细胞(如淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞)。可分离的免疫细胞的实例包括吞噬细胞(巨噬细胞和嗜中性白血球)；B细胞；T细胞(包括辅助T细胞和细胞毒性T细胞)；单核细胞；树突状细胞；自然杀伤细胞；调节T细胞等等。
在特定实施例中，在本发明的系统中分离单核细胞。单核细胞为多能细胞，其意指其可分化成不同种类的细胞。单核细胞可分化成的细胞的主要类型为巨噬细胞和树突状细胞。树突状细胞在免疫系统针对病原体的特异性应答设计方面具有关键作用。实际上，树突状细胞的抗原呈递刺激T细胞的重要步骤。
II.总有机碳
总有机碳(TOC)为有机化合物中结合的碳量且通常尤其用作医药学上制造设备的非特异性指标。利用TOC作为生物技术工业中的方法对照属性以监测采用纯化和分布系统的单元操作的性能。
在特定实施例中，可根据美国药典(USP)643且用利用UV促进化学氧化的高温湿润氧化反应的设备(《超净技术手册：第1卷：超纯水(Ultra-Clean Technology Handbook: Volume 1:Ultra-Pure Water)》,Ohmi,Tadahiro；CRC出版社,1993,第497-517页)测量TOC。在70℃下，例如以3cm2制品表面积与1mL水的比率使纯化水与聚合物接触24小时。使水与聚合物脱离接触且在TOC分析器中测试。设备的适合的片件为TEKMARDOHRMANN型号菲尼克斯(Phoenix)8000TOC分析器。
在特定实施例中，对于本发明的系统中采用的容器，可测量TOC，包括例如通过从容器的内表面区域提取(其中以mg/cm2为单位反映的结果用于每平方厘米内部区域的TOC)。在特定实施例中，且仅作为实例，可在纯化水70±2℃中提取容器持续24±2小时。可通过例如利用过硫酸钠的酸化和化学湿润氧化将TOC转化成二氧化碳分析提取物的TOC。从容器释放的二氧化碳可使用红外检测器测量。FEP容器的提取比率的一个实例为3cm2/mL(每3cm2容器的内部润湿表面积1mL水的典型的提取比率)。对于一些容器(如FEP袋)，不需要稀释，因为TOC水平小于卡(cal)曲线的上限，而对于其它实施例(如硅酮套管)，需要稀释，因为提取物中检测的TOC的水平。
FEP容器的TOC的一个实例为0.145mg/L(0.00005mg/cm2或0.001mg/g)。对于采用硅酮套管的实施例，提取比率可为14.6cm2/mL(如对于拜耳硅(Biosil))或可为15.9cm2/mL(如对于SR139)，且硅酮拜耳硅套管的TOC的一个实例为302mg/L(0.021mg/cm2或0.023mg/cm)，且硅酮SR139套管的TOC的一个实例为120mg/L(0.008mg/cm2或0.0009mg/cm)。在至少一定硅酮套管实施例中，样品可经稀释，因为提取的体积和浓度产生高于机器的最大检测的值。稀释和不同提取比率需要将这些样品与实际上在重量/面积价值基础上制得的袋样品进行比较。
所属领域的技术人员认识到TOC值可特征在于重量/体积。然而，所属领域的技术人员承认，容器(尤其FEP袋材料)的比率相对于硅酮套管的比率为可区别的；硅酮套管值可仅考虑为在mg/cm2起始基础上，因为此值与提取比率/稀释无关。所属领域的技术人员可使用重量/区域结果计算“标准化”重量/体积比率作为基础且假定标准3cm2/mL提取比率(作为实例)以便比较重量/体积值上的值。
在特定实施例中，热塑性弹性体(TPE)的TOC为0.002mg/cm2(0.032mg/g或5.88mg/mL)。在某些实施例中，FEP的TOC为0.00005mg/cm2制品的内部润湿表面(0.001mg/g或0.145mg/mL制品)。在特定实施例中，制品的内部润湿表面的硅酮的TOC为0.021mg/cm2或63mg/mL制品的内部润湿表面。
在一些情况下，容器的内壁由小于约0.1mg/cm2，0.09mg/cm2，0.08mg/cm2，0.07mg/cm2，0.06mg/cm2，0.05mg/cm2，0.04mg/cm2，0.03mg/cm2，0.02mg/cm2，0.01mg/cm2，0.009mg/cm2，0.008mg/cm2，0.007mg/cm2，0.006mg/cm2，0.005mg/cm2，0.004mg/cm2，0.003mg/cm2，0.002mg/cm2，0.001mg/cm2或无法检测到的水中的总有机碳(TOC)的聚合物构成。在特定实施例中，水中的TOC小于0.001mg/cm2到0.1mg/cm2，0.001mg/cm2到0.095mg/cm2，0.001mg/cm2到0.075mg/cm2，0.001mg/cm2到0.05mg/cm2，0.001mg/cm2到0.01mg/cm2，0.001mg/cm2到0.005mg/cm2，或0.001mg/cm2到0.025mg/cm2范围内的量。在特定实施例中，水中的TOC小于0.01mg/cm2到0.1mg/cm2，0.01mg/cm2到0.075mg/cm2，0.01mg/cm2到0.05mg/cm2，或0.01mg/cm2到0.025mg/cm2范围内的量。在特定实施例中，水中的TOC小于0.05mg/cm2到0.1mg/cm2，0.05mg/cm2到0.09mg/cm2，0.05mg/cm2到0.075mg/cm2，或0.05mg/cm2到0.06mg/cm2范围内的量。在特定实施例中，水中的TOC小于0.005mg/cm2到0.1mg/cm2，0.005mg/cm2到0.095mg/cm2，0.005mg/cm2到0.075mg/cm2，0.005mg/cm2到0.05mg/cm2，0.005mg/cm2到0.025mg/cm2，或0.005mg/cm2到0.01mg/cm2范围内的量。
在特定实施例中，氟化乙烯丙烯(FEP)的TOC为0.00005mg/cm2(0.001mg/g)；硅酮材料，如硅酮套管的TOC为0.021mg/cm2(0.023mg/cm)和0.008mg/cm2(0.009mg/cm)制品的内部润湿表面；历史上使用的细胞培养袋的TOC为0.002mg/cm2制品的内部润湿表面(0.032mg/g制品)。
所属领域的技术人员认识到，如果采用mg/cm2单元，那么TOC值可比较不同提取比率/稀释。如果单元为mg/L，那么必须已知提取比率。可如下进行转化：机器输出以mg/L为单位的值，考虑稀释，且随后使用提取物的表面积和总体积来将此数字转化成mg/cm2。提供硅酮拜耳硅的一个实例：
硅酮拜耳硅样品：302mg/L×1L/1000mL×23.7mL/347cm2＝.021mg/cm2
在特定实施例中，以mg/cm2为单位比较TOC，因为不需要提取比率或任何稀释。以下为基于硅酮套管拜耳硅样品和硅酮套管SR139样品的TOC计算的一个实例。测试制品提取
样品 内表面面积(cm<sup>2</sup>) 长度(cm) 纯化水的体积(mL)
硅酮套管拜耳硅样品 347 314 23.7
硅酮套管SR139样品 342 295 21.5
TOC分析结果
样品 mg/L mg/cm<sup>2</sup> mg/cm 检测极限(mg/L)
硅酮套管拜耳硅样品 302 0.021 0.023 0.1
硅酮套管SR139样品 120 0.008 0.009 0.1
以下为基于FEP袋和巴克斯特(Baxter)袋(单层袋主要由SEBS(苯乙烯嵌段共聚物)构成，且还可含有EVA和PP)的TOC计算的一个实例：
测试制品提取
样品 内表面面积(cm<sup>2</sup>) 重量(g) 纯化水的体积(mL)
FEP袋 650 30.9 217
巴克斯特袋 362.9 22.5 121
TOC分析结果
样品 mg/L mg/cm<sup>2</sup> mg/g 检测极限(mg/L)
FEP袋 0.145 0.00005 0.001 0.1
巴克斯特袋 5.88 0.002 0.032 0.1
在一个特定实施例中，PMP膜的TOC为0.07ppm(0.00002mg/cm2)。
在特定实施例中，容器包含内表面，其包含具有小于1mg/cm2、0.1mg/cm2、0.09mg/cm2、0.08mg/cm2、0.07mg/cm2、0.06mg/cm2、0.05mg/cm2、0.04mg/cm2、0.03mg/cm2、0.02mg/cm2、0.01mg/cm2、0.009mg/cm2、0.008mg/cm2、0.007mg/cm2、0.006mg/cm2、0.005mg/cm2、0.004mg/cm2、0.003mg/cm2、0.002mg/cm2、0.001mg/cm2等水中的总有机碳(TOC)的聚合物。
III.适体和适体触手的生产
本发明的实施例允许分离一种种类的细胞，形成含有数百种不同种类细胞的血液样品。此类方法需要将对所需细胞(如单核细胞)且将不识别任何其它细胞(包括其它血细胞)具有特异性的极特定工具。可具有此类特异性的抗体具有多种缺点，包括复杂程序，需要体内合成，且其可在细胞上产生剪应力和位阻效应，潜在地改变其官能基；此外，抗体仅提供细胞的一个连接点。
适体为结合到特定靶分子的寡核苷酸分子。其可为可结合到具有较高特异性和亲和性和较低毒性的几乎所有类别的小分子或大分子的单链DNA或RNA寡核苷酸。通常通过从较大无规序列池，如通过已知为SELEX的方法进行选择来产生适体：其表示通过指数增浓的配体的系统演变(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)。其具有与其靶标不匹配的特异性，因为其小尺寸和3D构象使其相比于抗体对靶标具有更高特异性。举例来说，适体可甚至使对映异构体和蛋白质同功异型物分化。产生适体的细胞类型特异性SELEX方法可为任何种类，尤其基于活细胞的SELEX(参见例如Ye等人(2012)；Ozer等人(2014)；Sun等人(2014)；以及Zhou和Rossi(2014))。
在特定实施例中，可应用用于分离所需细胞类型的特定适体序列以便从来自相同生物体的物质或属或家族的任何个体来分离相同细胞类型。在其它实施例中，用于分离的所需细胞类型的特定适体序列仅对特定个体具有特异性。
在特定实施例中，鉴别出适用于分离所需细胞类型的超过一种适体序列，且在本发明的系统中采用多种适体序列。
在一些情况下，适体具有连接在上面的部分，其中所述部分可为可检测的和/或可能够结合到另一部分。所述部分可为结合对的一个成员，如生物素或抗生物素蛋白物质。将生物素或抗生物素蛋白连接到DNA的方法为所属领域中已知的。
A.产生适体
在本发明的一个实施例中，适体经设计以便从样品，包括例如来自全血样品的单核细胞分离所需细胞。虽然可通过多种方式设计适体，但在特定实施例中，利用SELEX方法。
SELEX为可标靶任何小分子、生物聚合物或细胞的体外方法。当适体的序列为已知时，可如体外合成其。适体可以较高数量快速产生且为极稳定的：其保存期为无限的。此外，可向其添加使其更容易结合到表面的主链。适体已在生物医药工业中使用且未显示免疫原性的证据。
在特定实施例中，利用细胞-SELEX方法以产生用于本发明的系统的适体。适体基本上为DNA的一部分，且其可为多聚体化的。其为核苷酸序列，由四个不同单元：A、T、C、G的独特组合制成的聚合物。当已知对靶标具有特异性的适体的编码时，其相当容易合成。根据SELEX方法调适细胞-SELEX方法以产生对一种种类的细胞具有高度特异性的适体。在此方法中，单链DNA(ssDNA)库池与靶细胞一起培育。洗涤出非结合性序列，且从细胞回收结合序列，如通过在95℃下加热细胞-DNA复合物，继而离心。回收池与对照细胞系一起培育以滤出结合到靶标和对照两者上的共同分子的序列，导致靶标的特定粘结剂的增浓。如通过聚合酶链反应(熟知为PCR)扩增结合序列。此后去除反义链以产生用于后续选择回合的ssDNA池。可通过流式细胞测量结合分析监测所选库的增浓，其中所选库相比于未选DNA库具有提高的荧光。
当鉴别一种或多种适体时，可用其使表面官能化以分离所需细胞，如袋或套管。可使用依赖于适体分离细胞的替代技术，如亲和色谱法，用适体或含有水凝胶的适体或含有板的适体使磁性、塑料或玻璃珠粒官能化，只要在例如封闭系统中采用这些技术。在特定实施例中，结构可包含或另外具有氟聚合物层。
B.产生适体触手
在特定实施例中，使用系统中的每分子超过一种适体来使所需细胞结合到系统容器(但在替代情况下，在触手中仅采用一种适体)最大化。在特定实施例中，在单一触手分子中重复利用相同类型的两种或更多种适体。在此类情况下，不仅一个适体结合到表面，具有至少若干次适体序列的DNA长链也结合到表面。适体触手类似于章鱼触手，其中多个“洗盘”对所需细胞具有极高特异性。
利用具有细胞特异性适体的这些触手适用于轻轻地捕获所需细胞。实际上，通过这些触手进行的捕获无害，因为若干触手能够捕获一个细胞，产生较低剪应力与较高捕获效率。
为了从触手释放细胞，可进行一个或多个步骤。释放细胞的方法的实例包括使用限制酶切割DNA，使用核酸(DNA或RNA)转移细胞和/或加热。在某些实施例中，当使用加热时，可例如在45-50℃的温度范围下加热约10秒到约五分钟的持续时间。
触手策略呈现多种优点：从样品单步分离；单次使用式；较低剪应力，因此对细胞无伤害或伤害极小；较高特异性；以及相比于抗体或单一适体提高的捕获速率。
IV.用于系统的示例性材料和系统制备
A.一般方面
适用于系统表面的材料包括具有小于0.1mg/cm2的水中的总有机碳(TOC)的聚合物。含氟聚合物适用于系统的实施例，因为其为惰性的，含有较低可提取率，具有较低可沥滤性，具有足够的O2和CO2气体渗透率，具有较低水渗透性，为柔性的且为坚固的。
在本发明的特定实施例中，在单独容器中进行系统的不同步骤。在特定实施例中，除了一个或多个入口/出口以外，容器为封闭的实体。在特定方面中，除了一个或多个入口/出口以外，系统整体为封闭的实体。容器可为任何种类，但在特定实施例中，容器为袋、套管、珠粒(如珠粒包封于密闭容器中)、烧瓶、滚瓶或刚性容器。在特定实施例中，系统中的容器中的一种或多种经改性以从样品截获所需细胞。
在某些实施例中，系统的各步骤在单独容器中进行，但在替代实施例中，一个或多个步骤在相同容器中进行。在示例性情况下，利用第一容器以便分离细胞，利用第二容器以便生长细胞(在一些实施例中，如单核细胞膨胀以产生天然细胞)，利用第三容器以便转化细胞(其可考虑细胞活化，包括例如用抗原活化单核细胞)，且利用第四容器以便浓缩细胞(且至少在一些情况下纯化活化细胞)(图1A-1B)。
在特定实施例中，第一容器使得从样品中分离所需细胞。虽然来自样品的细胞可为来自任何种类样品的任何种类细胞，但在特定实施例中，细胞为来自血液样品，包括未经处理的血液样品的所需细胞(如单核细胞)。
本发明的实施例包括用基于DNA的适体触手使容器(如袋)官能化以选择来自样品(如血液)的细胞(例如免疫细胞)。适体物理上与细胞表面的特定结构相互作用且捕获细胞(图2或8)。在一些情况下，系统使用者已知与适体相互作用的细胞表面的特定结构，而在其它情况下结构为未知的。此方法可在如图2中所描画的物理袋中实现。
在特定实例中，对于94mL血液，允许血液样品的足够曝露的容器中所需的区域为380cm2。
图9说明当包含适体的容器已截留细胞时释放细胞。可通过任何适当的方法释放细胞，但在特定实施例中，充分加热容器以使得适体从结合细胞分离(其可称为熔融)。可随后收集或进一步处理细胞。用于释放细胞的其它手段为用酶(且所释放的细胞与酶的所得混合物可或可不进一步经处理以去除酶蛋白质)，如限制酶消化核酸适体。用于释放截留细胞的额外方法包括使细胞从具有互补DNA的适体移动到适体(部分或全部适体序列)。
本发明的特定方法的一个实例涉及重点在以下的分离单核细胞：
1)从个体收集单核细胞；
2)离体培养细胞且使其分化成天然树突状细胞
3)通过使其曝露于特定抗原来使天然树突状细胞成熟化；以及
4)将治疗有效量的活化成熟树突状细胞注回个体中且允许细胞疗法使免疫系统活化且对抗靶抗原(如表达抗原的癌细胞)。因此，将树突状细胞放回个体身体中以使其自身对抗医学病况。
因此，在一些情况下，用本发明的系统捕获单核细胞。单核细胞为极敏感性细胞，其可在与几乎任何表面接触后活化。氟聚合物表面并不活化单核细胞，且因此使用氟聚合物材料的系统可避免此活化。此外，需要在封闭系统中扩展细胞，需要连续输入O2和输出CO2，而其余不可渗透水，这些为FEP的所有特征，具有良好氧和二氧化碳渗透性和较低水渗透性的氟聚合物。此外，为了能够输送和保存细胞，需要具有耐受极低温(即低温储存)的能力的系统。FEP为持续在低温下极良好地起作用的材料。此所有一起产生FEP的良好情况，所述FEP为系统材料的适用的选择。
图8说明用于产生系统的步骤的示例性实施例，包括将适体链接枝到容器表面。在示例性情况下，步骤1涵盖用羧酸使衬底表面(如氟聚合物，包括氟化乙烯丙烯(FEP)膜)官能化。下一步骤包括经由肽键使蛋白质共价连接到羧酸；在特定实施例中，蛋白质具有与其结合以使得进一步处理将允许另一实体结合到蛋白质的配体。在特定情况下，蛋白质为抗生物素蛋白以使得结合到另一实体的生物素可间接结合到官能化表面。图8使得蛋白质偶合到配体，如抗生物素蛋白偶合到用于适体的生物素化环形模板。最终步骤包括模板的滚环扩增以产生适体触手。图3表明产生官能化衬底的一个实例，其中
Figure BDA0001361422150000251
Norton经C处理的FEP膜转化成氧化FEP。
在替代实施例中，使生物素化珠粒连接到用于分离相关细胞的FEP衬底(图4)。可在珠粒表面上通过滚环扩增产生适体。在特定实施例中，生物素化珠粒与具有上面连接的抗生物素蛋白的适体一起利用。在特定实施例中，涂布有抗生物素蛋白的珠粒可捕获生物素化适体/抗体。在特定实施例中，珠粒可或可不连接到FEP。在某些实施例中，珠粒由FEP构成且提供从样品分离出所需细胞的替代方式。举例来说，经抗生物素蛋白涂布的FEP珠粒(或其它材料)可曝露于生物素化适体以产生涂布有适体的FEP珠粒，且随后这些曝露于样品，如血液样品。举例来说，单核细胞将连接到此类珠粒，且随后可使这些流动通过特定过滤器/膜，其将保留具有与血液其余部分分离的上面连接的相关细胞的珠粒。随后，可使用解离方法(如加热、酶等)从珠粒移出细胞。
在特定实施例中，将生物素添加到适体末端中。生物素为通常用于将生物蛋白连接到表面的维生素。生物素对中性抗生物素蛋白具有较强亲和性，因此中性抗生物素蛋白可连接到衬底表面，且随后生物素化适体的模板进而间接连接到表面。在特定方面中，中性抗生物素蛋白(或抗生物素蛋白)以足够高密度连接在表面上，且在特定实施例中，FEP表面经COOH官能化。在特定实施例中，利用如中性抗生物素蛋白的蛋白质的氨基与表面上的羧酸之间的肽键来将中性抗生物素蛋白连接到表面。
在特定实施例中，系统环境有益于维持通过本发明的系统分离的任何细胞的完整性。系统经配置以允许细胞充分曝露于氧、水、细胞因子和/或葡萄糖。系统还经配置以防止细胞曝露于有害水平的有害物质，如二氧化碳、碳酸和/或乳酸。
B.衬底
至少一些系统实施例包括多层。在一个特定实施例中，第一层由具有较低可沥滤性、较低可萃取性且不有害地与细胞反应的材料构成。第一层可考虑为膜(film或membrane)。在某些实施例中，所述层包含聚合物。在特定实施例中，包含容器的润湿表面的聚合物具有小于0.1mg/cm2的水中的总有机碳(TOC)且可在将包含容器的润湿表面的表面上测量。在一些实施例中，聚合物由硅酮、聚(氯乙烯)(PVC)或
Figure BDA0001361422150000261
Norton经C处理的FEP膜构成。在特定实施例中，第一层包含氟聚合物，包括全氟烷氧基烷烃(PFA)。氟聚合物的一个实例为氟乙烯丙烯。氟聚合物可为任何种类，但在特定情况下，氟聚合物可选自PTFE、PFA、ETFE、PVDF、PCTFE、ECTFE、FEP、EFEP、PFPE、TFM、PVF或其任何组合。
在特定实施例中，第一层包含特定厚度。在某些方面中，所述层的最小厚度为0.0003英寸。在至少一些情况下，所述层的最大厚度为0.010英寸。
C.衬底的官能化
本发明的实施例允许适当的衬底的官能化以使得其适用于直接或间接连接适体。在特定实施例中，表面不需要官能化，因为适体直接连接到表面。举例来说，可不利用系统的抗生物素蛋白/生物素实施例，且在某些实施例中，生物学部分直接连接到氟聚合物的COOH(作为实例)表面。在适体直接连接到表面的情况下，可使用在用NH2末端使适体官能化的情况(如通过戊二醛连接子或马来酰亚胺连接子；参见例如Ponche等人，2012)下含有NH2的蛋白质的类似路径，将DNA适体共轭(例如直接)到改性表面。在此类实施例中，可避免使用抗生物素蛋白层且将适体直接连接到改性表面。在特定实施例中，经由特定端基，如例如氨基、醛基或环氧基(参见Oh等人，2006)，使DNA适体固定于表面。举例来说，当从醛官能化表面开始时，可使用希夫碱(Schiff base)反应(McGettrick等人，2009)固定DNA适体。其它官能DNA末端基团可包括氨基、生物素、叠氮基、巯基、二硫醇、地高辛、NHS酯、十八基、羧基、羟基、醛基、羰基、胺基、亚胺基、酰胺基、酯基、酸酐基、硫醇基、二硫基、苯酚基、胍基、硫醚基、吲哚基、咪唑基、氨基乙基酰胺基、炔基、烯烃基、氮丙啶基、环氧基、异腈基、胩基、四嗪基或重氮表面基团、炔基、烯烃、氮丙啶基、环氧基、异腈基、胩基、四嗪基、烷基、氨基乙基酰胺基、酯基和/或重氮基。
在表面需要官能化的实施例中，可采用至少四种一般固定技术：1)物理吸附；2)电化学活化；3)电化学接枝；以及4)抗生物素蛋白-生物素亲和性(评述于Ocana和del Valle，2013的石墨复合电极的上下文中)。在需要官能化的衬底的特定实施例中，鉴于特定起始表面，存在多种熟知反应路径。起始表面的实例包括羧基、羟基、醛基、羰基、氨基、亚胺基、酰胺基、酯基、酸酐基、硫醇基、二硫基、苯酚基、胍基、硫醚基、吲哚基、咪唑基、氨基乙基酰胺基、炔烃基、烯烃基、氮丙啶基、环氧基、异腈基、胩基、四嗪基、重氮表面基团、炔基、烯烃基、氮丙啶基、环氧基、异腈基、胩基、四嗪基、烷基、氨基乙基酰胺基、酯基、重氮基或其组合。所选官能化将指示将需要不同试剂和不同固定化学物质(例如希夫碱以连接到醛，与EDC/NHS以连接到羧酸)的反应。在特定实施例中，采用反应物，其中一键用蛋白质上的NH2基团形成。作为实例，含氟聚合物可通过多种方式实现此类不同官能性：等离子体处理、化学修饰、接枝等等。
在特定实施例中，可得益于使用FEP作为衬底的优点，其具有对单核细胞无反应性的表面，以便用适体捕获细胞。因此，在特定实施例中，用生物分子使FEP表面官能化。图8显示用于在FEP衬底(如膜)的表面上产生触手的示例性步骤。四个示例性步骤描述可如何使容器官能化。第四步骤可使用已知为Phi 29DNA聚合酶的酶进行。滚环扩增(RCA)产生数百到数千拷贝的模板链且为生物工业中熟知的方法。模板为由以下两部分构成的环：一个为抗适体的编码且另一个非编码。当所述酶将产生触手时，其将收集与模板编码互补的核碱基且制得其拷贝。因此，在特定方面中，触手将包含适体和未编码部分(也被称为间隔子)的序列；其为交替共聚物(A-B-A-B-A-B...)。可到反应的时候控制触手的最终长度。在特定实施例中，适体触手的长度在纳米与微米之间，包括数百纳米到数百微米。特定触手中的适体重复序列的长度或数目可关于系统中的另一触手变化。在一些情况下，适体重复序列的数目为2个或更多个，十个或更多个，几十个重复序列或更多个重复序列，数百个重复序列或更多个重复序列，数千个重复序列或更多个重复序列，数万个重复序列或更多个重复序列等等。
在特定实施例中，在衬底，如FEP衬底的表面上产生羧酸。在特定实施例中，可采用可在衬底表面上提供COOH基团的任何化学反应(参见例如Tong和Shoichet，1998)。在特定实施例中，所使用的处理为等离子体，包括例如用于含氟聚合物的经改性的等离子体处理：C处理。C处理在FEP袋的表面上添加极性基团的存在，最终允许细胞粘着。
在采用经C处理的膜且以便使用经C处理的膜作为基础以开始产生COOH官能化FEP表面的实施例中，表面表征。在X射线光电子光谱分析(XPS分析)、傅立叶变换红外光谱分析、扫描电子显微法、飞行时间次级离子质谱分析(TOF-SIMS)的组合中，测定出存在于经C处理的FEP衬底的表面上的羰基为已均匀地接枝在表面上的较小有机链中的醛或酮。因此，在用COOH使表面官能化的特定方面中，进一步用氧化使表面反应。
在存在更多酮的实施例中，合成策略为在羰基的α中引入氧原子，使酮变成酯。为了处理此反应物，可使用过酸，如MCPBA(间位氯过氧苯甲酸)。在第二步骤中，可处理皂化以切割酯且获得羧酸。
在存在更多醛的实施例中，可使表面剧烈氧化，使醛变成羧酸。在特定方面中，通过使用高锰酸钾(KMnO4)与硫酸(H2SO4)浓缩溶液来使表面剧烈氧化。反应结果通过FTIR分析。如图10中所示，结果显示-OH峰值的清晰较强提高，鉴于所述反应，其可具有仅来自醛到羧酸的转化。在特定实施例中，羰基峰值的轻微提高来自醇到羰基的氧化。在图5中的光谱上，存在反应的经C处理的膜光谱、未反应的经C处理的膜光谱和反应的未经处理的膜光谱。未经处理的膜光谱用作阴性对照，因为未经处理的FEP应不与KMnO4反应。此膜并不具有-OH或C-O的提高，其为预期结果。可在更高温度和时间下操作反应以便观测这些变量是否潜在地限制速率。
因此，C＝O的量表示3％的表面。根据所述结果，醛为这些基团的主要部分。其变成羧酸，因此在特定实施例中，至少1％的表面用COOH官能化。1％的表面代表每2nm21个羧酸基。然而，中性抗生物素蛋白覆盖约25nm2，因此当均匀地覆盖表面时，一个蛋白质将为至少10个羧酸基，其足以设计一个共价键。然而，关于COOH的量计算的百分比是基于XPS的结果，其产生10纳米深度上的O百分比。因此，实际上，可预期具有超过0.5COOH/nm2。
在氧化未设计足够的羧酸的情况下，可采用替代反应。在一个特定实施例中，利用格林纳试剂。实际上，在无水环境中，可在碳与卤素之间引入镁原子。以此方式设计的R-Mg-X极具反应性且允许用特定官能基，如羧酸添加碳链的选择方案。在针对格林纳试剂的设计的某些情况下，如果与氯或溴的反应并不过于困难，那么其可能与氟更复杂，但其仍可用溶剂的正确选择和催化剂处理。一个实例描述于《制备烷基氟化镁(Preparation ofAlkylmagnesium Fluorides)》，(Yu，1971)中，其以全文引用的方式并入本文中。其中，在大气压回流的条件下，使用碘作为催化剂，1,2-二甲氧基乙烷作为溶剂，在4小时内以92％产率产生己基氟化镁。
然而，存在用于将COOH基团赋予到表面上的多种选择方案。在特定实施例中，在衬底表面上产生羧酸包括例如丙烯酸的接枝(参见例如Racine等人，2010)。在FEP表面上获得COOH的额外反应包括以下：1)通过使未经处理的FEP曝露于钠萘处理来使表面还原，继而通过使经处理的FEP曝露于硫酸中的KClO3来使表面氧化；以及2)使未经处理的FEP曝露于氨等离子体，其中样品保持在无氧腔室中以便限制经处理的表面上的氧吸收，继而使经处理的表面曝露于戊二酸酐于丙酮中的溶液中。
在某些实施例中，在衬底的表面上产生除羧酸外的部分，且此类修饰可通过所属领域中任何适合的手段进行。举例来说，可通过衬底表面上以醛为起始物质的酰化反应，使聚合物共轭到蛋白质(Srivastava等人，2014)。此外，可采用利用戊二醛的氨基官能化乙酸纤维素(例如或环状半缩醛或聚合半缩醛)以获得活化表面以便共价生物分子最佳化(Heikkinen等人，2011)。
用于产生官能基，如COOH基团的方法包括使用如氩气、氢气、氮气、二氧化碳以及其组合的气体处理的等离子体活化。在特定实施例中，等离子体活化在如0.1托到0.6托的低压或接近于大气压，如700托到760托下实现。可利用在气体(例如氩气、氮气和氢气或其组合)下表面的电晕活化以在可进一步用于化学处理中的表面中形成活性位点。化学处理可包含通过包括接枝聚合、偶合、点击化学、压缩和加成反应的化学反应的活性或现有表面的顺序化学修饰。举例来说，溶液中的接枝聚合可通过经由自由基聚合使乙烯基单体(丙烯酸、(甲基)丙烯酸酯、丙烯酸(甲基)烷酯、苯乙烯、二烯、α-烯烃、卤代烯烃、(甲基)丙烯腈、丙烯酰胺、N-乙烯基咔唑、马来酸酐和N-乙烯基吡咯烷酮)聚合来实现。
D.抗生物素蛋白物质连接到表面
在特定实施例中，包含羧酸的表面上面连接有蛋白质物质，如例如抗生物素蛋白物质。蛋白质物质可通过任何适合的方法，包括例如吸附或共轭连接到羧酸基。抗生物素蛋白物质吸附在多种物质上为所属领域中已知的(Albers等人,2012；Orelma等人,2012；Vermette等人,2003；Vesel和Elersic,2012；Vesel等人,2012)，且在特定实施例中，如果缓冲液的pH在蛋白质获得与界面相对的电荷的位置处，那么所属领域的技术人员考虑到蛋白质更吸附在亲水性界面上。另外，在物质类别上抗生物素蛋白物质的共轭也为所属领域中已知的。此类方法包括EDC和NHS活化(Orelma等人,2012；Fabre等人,2012；Vermette等人,2003；Vesel等人,2012；Xia等人,2012)。
在一个特定实施例中，衬底表面为经C处理的氧化FEP(用羧酸官能化)。在初始研究中，可利用较小表面，如1cm2。考虑到，每nm2具有约1个COOH，在1cm2上将为106个COOH。以摩尔为单位，此对应于约1.7×10-18mol。另一限制因素为表面尺寸：一个蛋白质覆盖约20nm2，因此无法使超过50 000个蛋白质连接到表面。可使用过量蛋白质，如5,000,000个蛋白质，其对应于8.3×10-18mol。抗生物素蛋白重量约66kDa；其对应于6.6×104g.mol-1。随后，溶解的蛋白质的质量为5.5×10-13g。此数目说明，对于各初始研究，可利用极少量蛋白质。起始量的一个实例为以可能的最小体积计0.1mg/mL蛋白质。
示例性方案建议：
i.第一步骤将为用含有NHS(0.4mol.L-1)和EDC(0.1mol.L-1)的乙酸钠缓冲溶液(10mmol.L-1)使表面活化。
ii.第二步骤为通过使用含有中性抗生物素蛋白(100ug.mL-1)的相同缓冲溶液(10mM)结合中性抗生物素蛋白。
iii.随后，可通过在pH 8.5下用0.1M乙醇胺洗涤系统来去除过量NHS酯。然而，在所述方法中，此步骤不为必需的，因为预期无过量NHS酯。
iv.最终步骤为去除非特异性结合的中性抗生物素蛋白：对此，用100mM甘氨酸-HCl溶液(pH用HCl和NaOH调节到2.5)洗涤系统。
为了测定是否连接蛋白质，可采用AFM、FTIR、ζ电位、拉曼、蛋白质660nm分析、布莱德福测试、ELISA测试、荧光显微镜方法或TOF-SIMS以检测肽键。
E.适体连接到FEP表面
为了表明DNA连接到FEP表面，可将生物素化目标连接到结合到FEP的中性抗生物素蛋白。在特定实施例中，可使用在UV灯下可检测出固定的蛋白质的生物素化荧光素。在其它情况下，可使用生物素化聚合物珠粒；与EDS检测器耦接的SEM将检测出聚合物珠粒。在特定实施例中，可使用生物素化长无规DNA链：与EDS检测器耦接的SEM将检测出存在于DNA(如果其为固定的)中的磷量。
V.用于细胞分离的替代实施例
在利用适体触手以分离所需细胞的一个替代实施例中，可注入对样品中的所需细胞具有特异性的生物素化适体，继而向在中性抗生物素蛋白中经涂布的容器提供混合物以选择性地截获生物素，且随后在去除样品后保留所需细胞。
为了分离所需细胞，可选择性地用适体标靶其，且可通过细胞-SELEX方法工程改造适体。当对所需细胞具有特异性的适体的序列为已知的时，可以更高数量合成其。在所需细胞为单核细胞的情况下，存在于单核细胞上的至少一种表面标记物的确存在，其为CD14。化学合成的这些适体用生物素官能化。也可制备具有涂布有中性抗生物素蛋白或其它生物素-结合蛋白(抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素)的内表面的FEP的容器。为了实现这一点，可首先用羧酸基使FEP表面官能化，且随后使具有肽键的蛋白质连接到表面(通过NHS和EDC反应催化)。
示例性方法在图6中说明。方法的第一步骤为将适体与样品，如100mL血液样品混合。单核细胞在末端标记有生物素化适体。随后，在第二步骤中，可用血液样品填充套管，通过中性抗生物素蛋白(生物素-中性抗生物素蛋白复合物的Kd为1015)使得生物素尤其连接到表面。在第三步骤中，可通过用介质填充套管去除样品，如将用于培养细胞的介质。第四步骤为从套管壁分离细胞。可使用酶切割适体或酶以消化存在于细胞表面上的蛋白质。或者也可加热套管(例如48℃持续2分钟)；加热将使适体变形且释放细胞。在最终步骤中，在另一容器，如由FEP构成的容器中采集细胞。
VI.用于从系统分离细胞的示例性应用
用本发明的特定方法分离的细胞可在从适体释放细胞后用于一个或多个应用或可在进一步处理步骤后利用所述细胞。在特定实施例中，通过本发明的系统分离的细胞可用于储存，继而供将来使用，包括用于一个或多个个体的疗法的将来临床使用。在特定实施例中，将通过本发明的系统分离的细胞递送到对其有需要的个体，在某些实施例中，包括直接递送到对其有需要的个体。所述细胞可进一步经处理，如进一步浓缩细胞，添加药物载剂，添加生物学试剂(如细胞因子(包括一种或多种介白素)、趋化因子、生长因子或活化例如抗原呈递树突状细胞的任何因子)，重组操作细胞，如工程改造细胞以表达一种或多种特定T细胞受体、嵌合抗原受体等等。然而，在某些实施例中，所述细胞足够通过本发明的系统制备以使得其适用于直接递送到需要细胞疗法的个体。个体可为或可不为获得包含细胞的初始样品的个体。因此，在用系统分离之后递送到个体的细胞可为相对于个体自体性的(属于相同个体)或相对于个体同种异体的(属于除获得样品的个体外的个体)。进行系统步骤的个体可为或可不为从个体获得样品的个体或将样品递送到对其有需要的个体的个体。
本发明的特定实施例利用通过哺乳动物细胞疗法的系统分离的细胞。在特定实施例中，细胞用作具有医学病况的个体的个体化用药。在特定实施例中，医学病况为癌症、关节修复(包括脊椎盘)、神经系统修复或自身免疫病症。在特定方面中，细胞用作免疫原性组合物，包括例如疫苗。在个体患有癌症的实施例中，从系统中分离的细胞可对用于个体癌症的肿瘤抗原具有特异性。
在特定实施例中，对于超出从细胞混合物分离细胞类型的应用，可利用使用本公开内容中所概述的方法将特定细胞类型捕获到表面上。举例来说，在特定实施例中，在一些共同培养应用中，可能适用的是具有锚定于表面的一种细胞类型，同时仍与悬浮液中的细胞相互作用，以便能够区分两个群体。此外，对于偏爱生长为粘附性培养物的细胞，在一些实施例中，可能适用的是在培养期间利用所概述的方法以允许细胞可逆对接到表面；无论所述表面是否为如微载体中可见的扁平表面或球形表面。
VII.本发明的试剂盒
在试剂盒中可包含本文所描述的系统或方法的组分中的任一种。在非限制性实例中，在试剂盒中在适合的容器构件中可包含用于捕获生物制剂的设备。设备可为任何种类，只要其经配置以允许将聚合物放置在其上。设备可为袋且在一些情况下为可视为套管的细长袋。试剂盒可包含适用于设备中的一种或多种含氟聚合物(包括系统的袋)；包含氟聚合物、一种或多种反应性部分、与反应性部分一起使用的一种或多种连接子、适合的试剂的设备；和/或用于从个体提取样品的一种或多种装置和/或试剂。本发明的试剂盒可进一步包含抗原；用于样品采集或储存(如小瓶、注射器、杯子、刮刀或其组合)的设备；聚合酶(如phi29聚合酶)；核酸内切酶；以及缓冲液中的一种或多种。
试剂盒可包含适用于方法或适用于制备适用于方法中的设备的适当等分的液体。试剂盒的一定组分可以水性介质或冻干形式包装。试剂盒的容器构件一般可以包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它容器构件，可以向其中放置组分，且优选地适当等分。在试剂盒中存在超过一种组分的情况下，试剂盒一般还将含有第二、第三或其它额外容器，其中可以分别放置额外组分。本发明的试剂盒还将典型地包括用于含有试剂盒的组分中的任一种的构件，其密封以用于商业销售。此类容器可包括其中保留例如所需组分的注塑或吹塑塑料容器。
当试剂盒的一定试剂提供于一种或多种液体溶液中时，所述液体溶液可为水溶液，包括例如无菌水溶液。在此情况下，容器构件可自身为注射器、移液管和/或其它此类类似设备。然而，在一些情况下，试剂盒的组分可以干燥粉末形式提供。当试剂和/或组分以干燥粉末形式提供时，可通过添加适合溶剂使粉末复原。设想溶剂还可以提供在另一容器构件中。
实例
包括以下实例以展示本发明的优选实施例。本领域的技术人员应了解，以下实例中所公开的技术代表本发明人发现的在本发明的实践中操作良好的技术，且因此可以视为构成其实践的优选模式。然而，根据本发明，所属领域的技术人员应了解，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以对所公开的特定实施例作出许多改变且仍获得相同或类似结果。
实例1
估算分离的单核细胞的数量
本实例提供在本发明的实施例中分离的单核细胞的数目的估算。
鉴于套管：R＝0.5cm，L＝1.2m＝>V＝94mL，S＝3.8×10-2m2
一个单核细胞具有约7μm的半径。随后，如果其固定为1.5×10-10m2，那么其将覆盖平均表面。可在套管表面上捕获的单核细胞的最大数量为2.5×108。在示例性94mL血液中，存在7.5×107个单核细胞(假定平均血液样品中的浓度为8×108个单核细胞/L)。假定细胞捕获效率为25％，释放80％且最终存活率为80％，随后将分离约1.2×107个存活单核细胞。在某些方面中，需要106到107个单核细胞以用于处理树突状细胞疫苗。
实例2
表面制备
本实例涉及表面官能化和氟化乙烯丙烯(FEP)上的蛋白质固定作为材料的实例，其中包含容器或具有用其制备的壁。在一些实施例中，蛋白质的固定可通过两个不同方法：物理吸附和化学共轭进行。在三个不同FEP膜表面(未经处理的、经C处理的和经C处理的氧化的表面)上用两种类型蛋白质(抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白)中的一种进行本实例中描述的所有研究。本文以下提供表明吸附和化学共轭以及膜氧化的方案的实例。
吸附
吸附实施例涉及通过吸引力，如静电、疏水性和亲水性相互作用或范德华力表面上的蛋白质的物理吸附。此方法为直接了当的且吸附为自发的，仅需几秒来引发。可影响吸附过程的若干内部和外部参数，且最终，可考虑表面上的蛋白质的行为。如温度、pH和离子强度的外部参数可改变平衡状态和吸附动力学。举例来说，提高温度将允许熵增加且有助于从表面释放吸附分子和盐离子且帮助将使得更多蛋白质能够吸附到表面的蛋白质的结构重排。缓冲液pH将影响蛋白质的静电状态且将形成负或正电荷，这将改变与表面的吸引性或排斥性相互作用，取决于蛋白质的特定等电点(IEP)。最终，溶液中的较高离子强度将提高蛋白质于聚集体的倾向(表1；Rabe 2011)。
为了完成此方法，使表面与蛋白质溶液接触仅较短时间段(例如秒或分钟)。在此步骤之后，表面轻轻地洗涤且即用于下一步骤。此方法的简单性和速度使其成为在表面上获得蛋白质层的主要候选物。可考虑可影响反应可逆性(解吸附)和吸附后蛋白质的稳定性的多种参数。
表1：蛋白质的一般吸附倾向(Rabe，2011)
Figure BDA0001361422150000341
共轭
在另一实施例中，存在蛋白质到表面的化学共轭。在此方法的情况下，蛋白质通过特定化学反应与衬底共价偶合。为了完成此方法，通过将羧酸基添加到FEP表面上来改性表面。可使用两步法实现此官能化。第一方法称作C处理(可商购圣戈班(Saint-Gobain)的表面)，且第二方法为氧化反应。
当羧基存在于表面上时，羧基与胺共轭可用于将蛋白质结合到表面。在特定实施例中，通过使用通常已知为EDC(Drumheller and Hubbell 2003)的水溶性碳化二亚胺交联剂1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐使羧基活化。
在用EDC/NHS活化表面之后，蛋白质与NHS酯试剂接触且结合到表面。可使培育时间最佳化以便改进此方法的可扩展性。在共轭反应之后，用甘氨酸-氯化氢(甘氨酸-HCl)的溶液洗涤表面以去除所有静电结合蛋白质。(Orelma，等人2012)
在特定实施例中，此连接方法将更稳定蛋白质层诱导到表面。
膜选择的实例
在特定实施例中，用于系统的容器包含氟乙烯丙烯(FEP)，且在某些方面中，FEP可为未经处理的FEP、经C处理的FEP或氧化经C处理的FEP。未经处理的FEP为相当疏水性的(水接触角：99°)且具有相对较低表面能(19mJ/m2)。蛋白质吸附可在此表面上进行，但在特定实施例中，表面为经改性的。在进行共轭方法的实施例中，FEP表面经改性以便获得起始羧酸官能基。
经C处理的FEP(圣戈班)为所需极性表面提供化学反应官能性以向表面添加-COOH基团。C处理的效果为其升高膜的表面能(水接触角：66°和表面能：38mJ/m2)，同时还相比于其未经处理的对应物产生更高亲水性表面。在特定实施例中，已知表面能影响蛋白质吸附到膜，使经C处理的FEP膜成为吸附方法的替代候选物。
对于氧化经C处理的FEP，进行氧化反应以将羧酸基添加到表面以使蛋白质共价连接到FEP。存在于膜上的-COOH基团使得EDC/NHS反应且形成酰胺键以结合抗生物素蛋白。此反应可用两个产物进行：0.8mM高锰酸钾(KMnO4)和0.12M硫酸(H2SO4)。在特定实施例中，在表面上添加羧酸为能够使蛋白质共价结合到表面的前提条件。在特定实施例中，此氧化反应使经C处理的FEP膜更具亲水性且进一步提高表面能。除共轭以外，在特定实施例中，此氧化表面也是吸附过程的起始材料，因为其改变表面能和可湿性。
表2：三种不同类型FEP膜之间的比较
Figure BDA0001361422150000351
表面化学
方法用于评估存在于膜表面上的元素和化学基团。对于表面表征，考虑到氧原子和/或醛、酮和羧酸基的存在。在特定实施例中，在未经处理的FEP上仅可见C和F，在经C处理的FEP上存在N、O和醛/酮基团，且在氧化经C处理的FEP上存在COOH基团。对于具有蛋白质的样品，重点在于C、N和O较高存在量和少量S。存在于蛋白质上的主要化学基团为羧酸基(COOH)、酰胺键(CNO)和伯胺(NH2)。
X射线光电子光谱(XPS)
XPS用于测定表面上的定量原子组合物和化学物质。单能X射线轰击样品且使电子射出。元素鉴别由射出电子的动能进行。在
Figure BDA0001361422150000352
的深度范围上且在2mm×0.8mm的表面积上进行分析。(Brundle、Evans Jr和Wilson 1992)。XPS未检测出H和He存在。对于化学状态分析，数据以原子％或碳％形式给出。
以下显示在未经处理的FEP上仅存在正如预期的C和F原子。在经C处理的膜上还检测到N(2.6％)和O(3％)的存在。通过C处理将那些元素添加到表面中。表面上的氧原子可为醛和酮的存在的指示物。在以下表3中，碳化学状态分析的C＝O键(3％C)的存在证实羰基(C＝O)存在于表面上。观测到氧化经C处理的表面上O的少量提高(3.4％)，但不与预期结果匹配。预期氧量加倍，因为氧化反应将向醛基添加另一O。此外，双键O(＝O)似乎在氧化之后还原。此可指示，反应为从表面去除醛或酮基团，而不是在羧基中使其改性。
表3：根据XPS测量的碳化学状态(以C的原子％计)
Figure BDA0001361422150000361
XPS方法用于检验表面上蛋白质的存在。
表4显示不同类型FEP膜的XPS测量结果。
碳基 氮基 氧基 氟基 硫基
未经处理的FEP 32.4 0 0 67.6 0
经C处理的FEP 40.7 2.6 3.0 53.7 0
氧化经C处理的FEP 37.7 1.2 3.4 57.4 0
氧化未经处理的FEP 32.7 0 0 66.7 0.5
数据以原子％显示
表5显示未经处理的膜与具有吸附中性抗生物素蛋白的未经处理的膜之间的区别。第二膜显示N和O的存在。可在具有共轭中性抗生物素蛋白的氧化经C处理的膜上检测到相同类型信息。相比于氧化经C处理的样品，N和O的较高量存在指示膜的表面上存在蛋白质。
表5显示不同类型FEP膜的XPS测量结果。
Figure BDA0001361422150000362
此方法产生关于蛋白质的存在和不存在的信息，同时可利用其它方法来测定蛋白质的量和蛋白质层均一性。
傅立叶变换红外光谱分析(FTIR)
FTIR为提供关于固体或薄膜上元素的化学键结的信息的非破坏性方法。使用FTIR-ATR方法来集中于表面且获得分子振动的光谱。光谱为经校正的背景和大气压。改变数据以获得4000-1400cm-1的光谱区域之间的吸收率选择方案信息。集中于此区域以避免FEP的CF键(1100-1300cm-1)的较高信号。FTIR光谱上特定化学基团与其基团频率之间的相关性为所属领域中已知的(Coates 2000)。
为了检验样品上蛋白质的存在，应考虑～1640cm-1处酰胺基区域的氧双键(C＝O)。相比于对照膜，可决定性地看见吸附的蛋白质样品上此区域的峰值，其中表面仅与NaOAc缓冲液接触。此峰值存在于具有吸附的蛋白质的所有膜上且指示抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白都可吸附在FEP表面上。在未经处理的膜与经C处理的膜的抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白之间存在轻微的峰值强度差异。在特定实施例中，此差异为吸附的蛋白质量，且此可通过其它定量方法检验。图10-11显示具有固定化蛋白质的样品的光谱。
亚甲基蓝染料(MB)
研发出此方法以鉴别和测量氧化和/或官能化之后膜上羧基的存在。亚甲基蓝用于在表面上鉴别羧酸(-COOH)和非聚阳离子结合羧酸酯基(-COO-)。此带正电荷染料吸附在官能化表面上且通过可见光光谱分析在600nm的波长处测量。在特定实施例中，程序利用浸涂步骤，其中官能化膜与亚甲基蓝溶液接触10分钟。其后，所述膜在测量之前洗涤和干燥。通过在染色之前和之后获取样品的测量结果，可在600nm波长处观测到存在吸收。此显示亚甲基蓝的存在，因为其与膜表面上的可用的羧基和羧酸酯基团结合。在亚甲基蓝溶液中染色之后，在氧化经C处理的样品上，此吸收率变化使在图12、13和14中显色。对照为适用的，因为背景可随时间变化。获得比较的一种方法包括从最终吸收率测量减除对照(空白)。
表面形态和光学分析
方法涉及表面形态的评估，且存在视觉数据以查看化学修饰和蛋白质固定是如何改变FEP表面。
扫描电子显微法(SEM)
一种分析方法包括扫描电子显微法(SEM)。此方法提供样品表面的高分辨率和长场深图像。SEM用于查看表面的蛋白质层。在FEP表面上观测到层的不同图案。未经处理的FEP上观测到的网状层(图15)可解释为可能的蛋白质聚集，因为未经处理的膜的疏水性相互作用较高。在所述情况下，优先促进蛋白质与蛋白质相互作用以获得平衡状态。在其它类型FEP膜上未观测到此种层(图16)。
图15D显示连接到表面的一些生物素涂布聚苯乙烯微珠。预期那些珠粒的完整层以测试吸附的中性抗生物素蛋白的生物素结合位点(生物活性)的反应性。在未经处理的膜上仅观测到分散珠粒且其中一些在经C处理的和氧化经C处理的膜上。在特定实施例中，此差异可解释为珠粒(d＝1μm)与蛋白质(约20nm)之间的较大尺寸差异。图17更详细地显示珠粒连接。在珠粒下观测到蛋白质层的不同图案。在左侧拐角上还观测到具有相同层图案的另一光点。在特定实施例中，此可解释为改变其初始吸附构形的蛋白质，因为生物素的吸引力呈现给珠粒。考虑到表面上中性抗生物素蛋白构形修饰的不同图案迹线，在样品制备期间吸引性生物素力和冲洗步骤的组合可导致表面的生物素珠粒缺失。
光学显微法
光学显微法可用于借助于可见光和镜片获得较小样品的放大图像。图18图像显示连接到未经处理的膜上的蛋白质层的生物素微珠的存在。此技术可有助于借助于如微珠或显色染料的标记观测蛋白质层的均一性。
表面能
利用SurPASS的ζ电位
SurPASS为用于测量固体表面的流动电位/流动电流的仪器。可根据如FEP膜的平面样品的流动电流计算固体表面的ζ电位。使用安装的自动滴定系统，可测量随pH变化的ζ电位或随表面活性剂浓度变化的ζ电位。(Anton Paar 2013)。此方法为敏感性的且产生关于不同pH下和表面的IEP位置的样品的表面能的信息。在特定实施例中，此装置有助于在C处理、氧化反应和蛋白质吸附之后表征表面修饰。在某些实施例中，随着在相同离子和pH条件下获得的ζ电位值提高，在C处理和氧化之后可见IEP提高。SurPASS研究的数据可指示在处理之后FEP膜的亲水性特征的提高。可进行关于氧化经C处理的FEP的研究。
蛋白质分析
紧接着在下文描述的方法用于直接测试蛋白质。表明用于直接观察蛋白质和检验其稳定性的方法。
660nm蛋白质分析
此方法使用结合到蛋白质(如组氨酸、精氨酸、赖氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸)中主要碱性氨基酸残基的染料金属络合物(Antharavally，等人2009)。在酸性条件中，试剂为红褐色的，但当染料金属络合物结合到蛋白质时变为绿色。染料的最大吸收率在660nm处用UV-Vis分光光度计测量。此技术主要用于测量溶液中的蛋白质浓度，但在本文中经改性以鉴别表面上的蛋白质。在特定实施例中，具有蛋白质的官能化表面与试剂接触至少5分钟。其后，所述膜在通过UV-Vis光谱分析测量吸收率之前洗涤和干燥。
通过在染色蛋白质之前和之后获取样品的测量结果，可在660nm波长处获得观测结果。提高的吸收率显示膜表面上存在蛋白质。当相比于标记的“对照”的管柱(其中仅具有缓冲液残基的膜与试剂反应)，查看表示膜上染色的蛋白质的标记的“抗生物素蛋白”和“中性抗生物素蛋白”的第二和第三管柱时，此效果可在图19中显现。当使用共轭和吸附方法时，可查看具有蛋白质抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白两者的所有类型膜上存在蛋白质。未经处理的FEP上的抗生物素蛋白似乎显示与所有其它方法相比更少连接到表面。可考虑用于制备蛋白质溶液的缓冲液选择，因为一些缓冲剂可与“蛋白质分析试剂”相互作用且产生假阳性结果。图20显示经C处理的中性抗生物素蛋白光谱660nm蛋白质分析。
洗涤实验
在特定实施例中，可在膜上的蛋白质官能化之后使用两个洗涤步骤表征蛋白质稳定性。第一方法涉及使用严格离子清洁剂，如十二烷基硫酸钠(SDS)，其通常用于冲洗表面以去除蛋白质。此清洁剂通过分裂非共价键和使蛋白质变性而影响蛋白质的分子3D构形。图21显示在SDS洗涤之前和之后具有吸附的中性抗生物素蛋白的氧化经C处理的膜。正如预期，SDS几乎完全去除蛋白质层和其它缓冲液残余物。SDS曲线(黄色)上酰胺键峰值低于对照(红色)的值。在此实验的情况下，可测定可在蛋白质官能化表面上进行的冲洗步骤的限制。
第二方法涉及使用超声发生器。此机器一般用于洗涤表面且通过脉冲去除盐和粉尘残余物。图22和23显示对具有吸附的中性抗生物素蛋白的未经处理的和经C处理的FEP进行超声波处理的结果。在超声波处理步骤之后，仍存在酰胺峰值(1630cm-1)且产生膜上蛋白质的稳定性的指示。
用于表征蛋白质稳定性、层均一性和生物素结合活性的方法的实例
荧光标记
通过使用荧光显微术，共轭到生物素的荧光团用于观测吸附到表面的蛋白质(Sromqvist，等人2011)。当结合到抗生物素蛋白时，生物素-4-荧光素淬灭且用于一些研究中以滴定抗生物素蛋白的生物素结合位点。(蛋白质的荧光素标记典型地使荧光素量子产率降低60％，但仅使其消光系数降低10％(赛默科技(Thermo Scientific)2011))。在特定实施例中，此分子在所述膜上以相同方式使用以便检验固定化抗生物素蛋白的生物活性。
当荧光团连接到蛋白质时，为了避免淬灭效果，可使用更长臂间隔子。在特定实施例中，此间隔子可用聚乙二醇(PEG)分子制得。在特定实施例中，可采用当分子结合到抗生物素蛋白时保持荧光信号的生物素荧光团。
酶联结免疫吸附剂分析法(ELISA)
ELISA为经设计用于检测和定量如肽、抗体和蛋白质的不同分子的分析。此方法可用于测定样品上蛋白质的量且检验连接的蛋白质是否为活性的。(Vermette，等人2003)。图24显示可如何在FEP样品上进行ELISA的实施例。首先，使抗生物素蛋白/中性抗生物素蛋白连接到表面。在此步骤之后，用牛血清白蛋白(BSA)溶液洗涤FEP表面以阻挡表面且避免非特异性酶结合。其次，将生物素化酶溶液添加到官能化表面中且结合到生物素结合位点。小牛肠道碱性磷酸酶(CIP)和辣根过氧化酶(HRP)可共轭到生物素分子且用于FEP膜上的此分析。在培育之后，再次冲洗表面以去除未结合酶。第三，在表面上添加反应性衬底且取决于衬底培育特定时间量。衬底的选择取决于分析灵敏度和可用的仪器(例如分光光度计或微量培养板读取器)。发光和荧光衬底更敏感且可用于检测极少量蛋白质(皮米范围)。
在特定实施例中，ELISA方法产生连接的蛋白质的生物活性的良好想法。如果中性抗生物素蛋白在其连接之后保持活性，那么生物素化酶将能够结合到抗生物素蛋白/中性抗生物素蛋白的特定位点。那些结合酶将与衬底反应且产生显色或荧光产物。那些产物将通过测量溶液的吸收率记录。当溶液中的显色或荧光产物浓度将提高时，吸收率将提高，因此衬底产物浓度与膜的结合蛋白质的量之间存在直接相关性。
原子力显微术(AFM)
采用原子力显微镜来表征聚合物形态。其测量样品表面与安装于悬臂梁上的极尖锐的探针端部之间的力。此方法允许表面上固定的蛋白质的存在的观测结果。在特定实施例中，此方法为可见的且可以几μm计标测连接的蛋白质。轻敲模式还可用于检验蛋白质的稳定性和生物活性。通过在悬臂上使用生物素端部，可在表面上轻触蛋白质且分析所需的能量以去除表面上吸附的蛋白质。如果此能量类似于抗生物素蛋白与生物素之间的连接能量，那么可知抗生物素蛋白对表面的吸附比生物素-抗生物素蛋白相互作用更强。
实验方案的实例
以下提供本实例中提及的实验方案的实例。
用亚甲基蓝染色的FEP表面(鉴别出表面上的-COOH和羧酸酯基团)：
1.在pH 7.0下制备10-3M亚甲基蓝溶液。
a.在1升dH2O中混合0.32g亚甲基蓝
b.用HCl或NaOH调节pH以达到pH 7.0
2.使膜在亚甲基蓝溶液中浸没10分钟。
3.通过将表面浸泡在dH2O(pH＝7.0)中1分钟来冲洗膜且喷涂表面
4.用温和气流干燥或在烟通风橱中培育。
分析：通过UV/Vis光谱分析测定亚甲基蓝吸收。测量600nm处膜的吸收率。
染色膜上连接的蛋白质(允许鉴别连接在聚合物膜上的蛋白质的存在)
1.将2"×1.5"膜放置在表面玻璃上且用10mL试剂(可调节试剂体积以完全回收样品)回收官能化表面
2.在室温下覆盖且培育5分钟。
3.从溶液去除样品且用大量dH2O洗涤(浸渍5次且使用瓶子将dH2O喷涂在表面上)
4.用温和气流干燥样品且在通风橱下干燥
分析：通过UV/Vis光谱分析测定蛋白质试剂吸收率且在660nm处测量膜上的吸收率。
在表面官能化之前/之后溶液中的蛋白质浓度
1.在分析的工作范围(25-2000μg/mL)内制备标准曲线将10μL 1000μg/mL标准物与390μL 0.9％生理盐水和0.05％叠氮化钠混合以获得25μg/mL标准溶液。或，用10mMNaOAc缓冲液中的100μg/mL中性抗生物素蛋白溶液制备标准曲线。
2.将0.1mL标准物、样品空白样品的各复制物添加到试管中。(如果使用较小样品体积，那么比率保持为1:15)
3.将1.5mL蛋白质分析试剂添加到各套管中且涡旋以充分混合。
4.在室温下覆盖且培育5分钟。
分析：通过UV/vis光谱分析测定蛋白质试剂吸收率。在660nm处测量液体的吸收率。在测试样品之前制备标准曲线(吸收率与蛋白质浓度)且通过减去空白溶液(10mMNaOAc缓冲液或0.9％生理盐水和0.05％叠氮化钠)的吸收率来校正吸收率
表面上的中性抗生物素蛋白稳定性：SDS洗涤
1.制备SDS 1％洗涤溶液(也可使用2％)(SDS浓度测试范围：0.1mM(0.0288g/L)SDS(对于人类血清白蛋白)到>10mM；(2.88g/L)SDS(对于SOD和抗生蛋白链菌素))
a.在100mL dH2O中混合1g SDS
2.通过使膜在SDS洗涤溶液中潜水5分钟来洗涤膜表面。
3.用dH2O冲洗表面且干燥所述膜
在洗涤步骤之前和之后在膜上进行FTIR测量
可用Piece 660nm蛋白质分析来分析洗涤溶液中的蛋白质浓度。离子清洁剂相容性试剂(IDCR#22663)将需要SDS>0.0125％的浓度。
表面上的中性抗生物素蛋白稳定性：超声波处理为
1.将样品放置在50mL圆锥套管中且用适当的缓冲液填充套管。确保套管为完全封闭且密封的。
2.将锥形套管放置在填充有dH2O的超声发生器中
3.在超声发生器中在30kHz与200kHz之间操作样品5分钟。
4.从套管去除样品且用dH2O洗涤(浸渍5次)
5.在室温下在通风橱下干燥。
分析：
1.在超声波处理之前和之后在膜上进行FTIR测量
2.可用Piece 660nm蛋白质分析来分析缓冲液中的蛋白质浓度。
膜上与连接的抗生物素蛋白/中性抗生物素蛋白共轭的生物素珠粒
1.将官能化表面添加到100mL 1×PBS缓冲液
a.1×PBS缓冲液：450mL dH2O中的50mL 10×PBS
2.添加0.2mL生物素-聚苯乙烯珠粒溶液。在使用之前使珠粒溶液涡旋
3.在室温下在通风橱下培育1小时。
4.用PBS(1次)和大量dH2O(5次)洗涤。
5.在通风橱中使表面干燥。
分析：使用FTIR和/或SEM
FEP膜上抗生物素蛋白/中性抗生物素蛋白的吸附
1.制备10mM NaOAc缓冲溶液
a.在量瓶中，将1.7mL 3M NaOAc添加到498.3mL dH2O中
2.制备0.1mg/mL蛋白质溶液每1.5"×2"膜样品可利用10mL蛋白质溶液
a.在50mL圆柱形单次使用式套管中添加含0.004g蛋白质(抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白)的40ml 10mM NaOAc
3.在表面玻璃中向下放置膜样品且用10mL 0.1mg/mL蛋白质溶液覆盖膜。
4.在室温下培育1分钟
5.用10mM NaOAc洗涤样品(浸渍5次)
6.用dH2O洗涤样品(浸渍5次)
7.在皮氏培养皿中在室温下进行干燥
8.储存在冷冻器中在-80℃下
FEP膜上抗生物素蛋白/中性抗生物素蛋白的化学共轭
**此实验使用氧化经C处理的FEP膜样品
1.制备10mM NaOAc缓冲溶液
a.在量瓶中，将1.7mL 3M NaOAc添加到498.3mL dH2O中
2.制备0.14mg/mL NHS和0.20mg/mL EDC溶液
a.在量瓶中添加含0.07g NHS的500mL 10mM NaOAc
b.添加含0.1g EDC的溶液
3.制备0.1mg/mL蛋白质溶液每1.5"×2"膜样品可利用10mL蛋白质溶液
a.在50mL圆柱形单次使用式套管中添加含0.004g蛋白质(抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白)的40ml 10mM NaOAc
4.在NHS/EDC溶液中添加膜且在室温下培育10分钟
5.通过将其在10mM NaOAC溶液中浸渍5次来洗涤膜。
6.在表面玻璃中向下放置膜样品且用10mL 0.1mg/mL蛋白质溶液回收膜。
7.在室温下培育1小时
8.制备100mM甘氨酸-HCl溶液
a.在量瓶中，添加含2.79g甘氨酸-HCl的250mL dH2O
9.用甘氨酸-HCl溶液洗涤样品(浸渍5次)
10.用ddH2O洗涤样品(5次)
11.用10mM NaOAc洗涤样品(浸渍5次)
12.用dH2O洗涤样品(浸渍5次)
13.在皮氏培养皿中在室温下进行干燥
14.储存在冷冻器中在-80℃下
经C处理的FEP膜的氧化
1.在量瓶中制备氧化溶液
a.1g KMnO4
b.5mL H2SO4，98％
c.添加1000mL dH2O
2.在烧杯中，将样品浸渍在氧化溶液(100mL/样品，在相同烧杯中不放置超过2个膜)中
3.在室温下培育2小时。
4.用大量dH2O冲洗(浸渍5次和喷涂)
5.在真空烘箱中在65℃和-20(在Hg中)下使样品干燥过夜。
6.储存在室温下。远离光
实例3
示例性实验程序
实验
经由等离子体活化，继而溶液中的自由基聚合，实现接枝聚合到FEP膜上。用于接枝聚合的方法描述在以下步骤中；(i)清洁所述膜，(ii)在低压等离子体系统中处理所述膜，(iii)在溶液中聚合，(iv)清洁所述膜和(v)表征。
清洁膜
切割所述膜，且随后在丙酮中洗涤，用DI水冲洗，在空气中干燥且储存在铝箔膜内部。随后清洁方法包括首先用肥皂洗涤所述膜，用水冲洗，且随后用丙酮冲洗。在末端处的丙酮有助于从表面干燥过量水。
等离子体处理
如果其涉及在两个侧面中活化，那么将膜放置于瓶子中且与双面胶带粘着。4"×5"的膜适配瓶子侧面且所述方法中未使用胶带。仪器中使用的条件为：
a.气体：氩气MCF 1
b.气流：20sccm(cm3/min)，如文献中所推荐
c.时间：10分钟
d.功率：30％(最大100W)
聚合反应：
在使表面活化之前30分钟制备溶液以使用内部氮净化溶解于溶液中的氧。条件为：
e.溶剂：DI水
f.单体：丙烯酸
g.大气：N2
h.温度：60-70℃
i.时间：加热2-4小时，且随后在氮气下保持过夜。
清洁最终膜：
从反应器中取出膜，且随后将其在DI水中冲洗，在水中超声浴5分钟，在丙酮中冲洗且用空气干燥。用铝箔覆盖样品以避免污染。
现在用来自聚丙烯酸接枝聚合反应的多个羧酸基使FEP膜官能化。
实例4
PAA-FEP表面上的蛋白质固定
在本实例中使用两种示例性蛋白质固定方法：蛋白质共轭和蛋白质吸收率。为了以化学方式共轭蛋白质，利用两步EDC/NHS化学物质以使pAA-FEP表面上的羧酸基活化。简单来说，新鲜制备45mM EDC和15mM NHS且在0.1M 2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)缓冲溶液中混合。随后，将10ml此溶液放置在100ml表面玻璃上且将FEP膜样品(3.5×3.5cm2)的经pAA处理的侧面放置在液体上且充分处理15分钟。随后在膜表面上产生胺反应性NHS-酯中间物。随后通过将所述膜浸没在DI水中的10ml抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白(NAv)溶液(0.1mg/ml)中2小时来实现偶合反应。
在不通过先前EDC/NHS的情况活化下，通过用含10ml 0.1mg/ml蛋白质的DI水溶液处理经pAA处理的表面2小时来制备蛋白质吸收率膜样品。仅通过EDC/NHS活化的膜样品制备为阴性对照样品，其仅在无任何蛋白质的情况下通过DI水处理2小时。且通过仅用MES缓冲液处理膜样品15分钟来制备仅缓冲液样品。
随后通过10mM乙酸钠溶液、100mM甘氨酸-HCl溶液和去离子水冲洗所有膜样品，干燥隔夜，且在进一步分析之前储存于-20℃冷冻器中。
傅立叶变换红外特性化
为了检验pAA-FEP膜表面上蛋白质的存在，使用衰减全反射傅立叶变换红外(ATR-FTIR)特性化。测试膜样品(与蛋白质共轭的pAA-FEP，pAA-FEP具有蛋白质吸收率，通过仅EDC/NHS和未经处理的pAA-FEP处理pAA-FEP)。ATR-FTIR特性化设定参数为：分辨率＝4，扫描次数＝512，且波数范围：4000-1400cm-1(图25)。
具有生胞素荧光团的抗生物素蛋白/中性抗生物素蛋白的特性化
因为生物素分子可以高亲和力和选择性结合到抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白，与生物素共轭的荧光团能够检测蛋白质的存在。此处，生胞素四甲基罗丹明(B-TMR，激发波长＝554nm，发射波长＝581nm)用于染色稳定固定化的蛋白质。首先，将膜样品(1×1cm2)中的每一个放置在经处理的侧面朝上的24孔板孔上，且添加2mg/ml牛血清白蛋白溶液以阻挡膜上的所有非特异性结合侧面15分钟。通过此步骤去除通过EDC/NHS反应未连接到pAA-FEP表面的任何抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白。在通过1ml PBS洗涤5次之后，通过溶解于PBS中的1μM B-TMR溶液染色样品30分钟以便避光。随后去除荧光团溶液，且通过去离子水洗涤样品且干燥过夜。随后通过具有青蓝色(Cyan Blue)滤光片(宾夕法尼亚州哈特菲尔德的EM科学公司(EM Sciences,Hatfield,PA))的立体显微镜荧光适配器(激发：490-515nm，发射：550nm，长通)观测样品。
带荧光团标记的化学连接到pAA-FEP表面的抗生物素蛋白的图像靠近用pAA未官能化的FEP部分(作为内部控制)。(图26)
实例5
PAA-FEP表面上的DNA固定
制备适体DNA溶液
冻干适体DNA寡核苷酸(经改性的3'端胺，5'-适体-胺-3')和其FITC荧光团共轭形式购自碱基对生物技术公司(Base Pair Biotechnologies)(47-G06，Oligo#603，美国德克萨斯州皮尔兰(Pearland,TX,USA))。所有冻干适体储存在-20℃下，在使用之前避光。为了使适体再悬浮于溶液中，在微型离心机中使适体团粒离心5分钟以确保所有团粒在套管底部。随后使团粒溶解于无核酸酶水中以获得100μM浓度，继而培育30分钟。随后，获取50μL此适体溶液的等分试样以便进一步稀释，同时溶液的其余部分储存在-20℃下以便长期储存。在50nM下在折叠缓冲液(含有1mM MgCl2的1X磷酸盐缓冲盐水，无核酸酶，pH 7.4)中将等分试样稀释到其工作浓度。适体在工作浓度下通过水浴在85-95℃下折叠5分钟，继而在室温中冷却。当适体折叠时，不需要更多折叠步骤。
在工作浓度下将溶液折叠适体分离成10个等分试样且储存于-20℃中以便长期储存。为了避免重复冻融循环，当其解冻时，将适体溶液保持在4℃中。在4℃下，当溶解于无核酸酶水中时，建议寡核苷酸在4周内用完(www.atbio.com/content/52/Storage-of-oligonucleotides)。
DNA寡核苷酸的傅里叶红外转化(FTIR)特性化
为了检验FTIR光谱中的DNA寡核苷酸的特征性峰，将1mL 500pM DNA溶液浸渍到IR聚乙烯(PE)标准膜上，且随后在空气中干燥过夜。通过ATR模式(扫描次数为512，分辨率为4cm-1)测试FTIR光谱。未经处理的PE标准物首先采集为光谱的背景，且随后表征用DNA安装的PE膜。光谱经自动基线校正和共同标尺调节。
聚(丙烯酸)氟化聚乙烯丙烯(pAA-FEP)上DNA的共价固定
经胺改性的适体DNA寡核苷酸通过EDC/NHS化学物质化学共轭到pAA-FEP。除了使用偶合缓冲液以外，程序类似于蛋白质共轭实验。首先，在其工作浓度下折叠的适体缓冲液在偶合缓冲液(100mM磷酸钠，150mM氯化钠，无核酸酶，pH 7.2)中经稀释。pAA-FEP的表面羧酸基通过含2mM EDC(0.038g在100ml中)和5mM NHS(0.06g在100ml中)的0.1M无核酸酶MES缓冲液活化15分钟。在去除EDC/NHS试剂后，使活化膜表面与经稀释的DNA适体溶液反应2小时。对于DNA吸收率样品，使pAA-FEP膜样品浸没于DNA溶液中2小时。通过相同方法使带FITC荧光团标记的DNA(5'-FITC-适体-胺-3')寡核苷酸固定化且在整个程序中避光。且阴性对照样品包括仅在通过EDC/NHS(即仅经缓冲液处理的膜)活化之后用偶合缓冲液处理的pAA-FEP膜和仅通过EDC/NHS试剂处理的膜(表6)。在反应结束时，通过折叠缓冲液和随后无核酸酶水冲洗膜样品三次，且在进一步分析之前使具有固定化DNA的样品浸没在折叠缓冲溶液中且储存于4℃中。
Figure BDA0001361422150000471
表6：用于制备不同膜样品的化学物质和缓冲剂
用于pAA-FEP上固定化DNA的傅里叶红外转化(FTIR)特性化
ATR-FTIR特性化方法还用于检验膜样品上DNA的存在。首先校正环境空气作为背景。如先前所提及，将各干燥样品(DNA共轭膜，DNA吸收率膜，仅经EDC/NHS处理的膜和仅经缓冲液处理的膜)放置在ATR晶体上且通过部分3.2的相同条件测试。光谱经自动基线校正和共同标尺调节。(图27)。
实例6
表面修饰实例
包括抗生物素蛋白和适体DNA寡核苷酸的生物物质可共价固定于聚(丙烯酸)接枝的氟化聚乙烯丙烯(pAA-FEP)。主要修饰方法为EDC/NHS化学方法，继而各种特性化方法。表面修饰的这些程序适用于产生适体DNA固定化FEP袋。
1.使用两步EDC/NHS化学方法的抗生物素蛋白固定
材料：1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC或EDAC，储存在-20℃下)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，储存在4℃下)、BupH MES缓冲生理盐水袋(储存于室温中)、抗生物素蛋白(储存在4℃下)、甘氨酸-HCl、10mM乙酸钠缓冲液以及pAA-FEP
步骤：
1.使一袋MES缓冲生理盐水袋溶解于500ml DI水中以获得0.1M MES缓冲液
2.称取0.43g EDC和0.085NHS且使其一起溶解于50ml MES缓冲液中以获得45mMEDC和15mM NHS溶液。避免含有羧酸盐和胺的任何组分
3.切割出一件pAA-FEP膜样品。为了区分pAA接枝侧面，在未经处理的FEP侧面上连接较小件标记胶带，或简单地折起一角。
4.用移液器吸取EDC/NHS溶液以充分覆盖一件干净的玻璃表面玻璃。通常，3ml液体可充分覆盖50ml表面玻璃(对于3×3cm2膜样品)，且10ml液体可覆盖100ml表面玻璃(对于5×5cm2膜样品)
5.将膜样品放置在EDC/NHS溶液上。确保pAA接枝侧面可与溶液充分接触
6.反应进行15分钟
7.用DI水迅速洗涤经处理的膜表面(任选的)
8.使抗生物素蛋白溶解于DI水中以获得0.1mg/ml蛋白质浓度，且用移液器吸取此溶液以充分覆盖另一干净的玻璃表面玻璃
9.反应进行2小时
10.如下制备其它样品组：
a.抗生物素蛋白吸收率样品：仅用抗生物素蛋白溶液处理pAA-FEP膜2小时
b.仅EDC/NHS样品：用EDC/NHS溶液处理样品15分钟，且随后用不具有抗生物素蛋白的DI水处理其
c.仅缓冲液样品：仅用0.1M MES缓冲液处理样品
11.使2.79g甘氨酸-HCl溶解于100ml DI水中以获得100mM甘氨酸-HCl溶液
12.通过在烧杯中将其浸渍在洗涤溶液中用10mM乙酸钠溶液、100mM甘氨酸-HCl和随后DI水洗涤所有膜样品。使膜样品干燥过夜以便进一步研究。
2.生胞素荧光团的抗生物素蛋白特性化
材料：5-(和-6)-四甲基罗丹明生胞素(B-TMR，储存在-20℃下)、10×磷酸缓冲液生理盐水(PBS)、2mg/ml牛血清白蛋白(BSA)、青蓝色荧光滤波器组、24孔板
步骤：
1.将10×PBS缓冲液稀释10次
2.使1.7mg B-TMR荧光团团粒溶解于2ml PBS中以获得10mM溶液，随后稀释此溶液1000次以获得10μM B-TMR溶液
3.从膜样品中的每一个中切割出1×1cm2物件，且在经处理的侧面朝上的单独孔中将这些较小样品放置在24孔板上
4.用1ml 2mg/ml BSA溶液处理膜样品15分钟以阻挡非特异性结合位点。为了确保膜不会翻过来，当添加和去除液体时，使用较小玻璃杆保持一角
5.丢弃BSA溶液且用PBS缓冲液洗涤膜样品5次
6.在1μM下通过PBS缓冲液将10μM B-TMR溶液稀释到工作浓度
7.用1μM B-TMR溶液将样品染色30分钟
8.通过将其浸渍于DI水中洗涤样品且将其干燥过夜
9.当在立体显微镜荧光连接下观看样品时，根据供应商手册组装滤波器组，且通过黑色胶袋覆盖整个显微镜以避免肉眼直视光，且阻挡环境背景光
10.将样品放置在干净的黑色背景(即较小样品容器)上。略微倾斜样品以使激发光反射降到最小，且随后调节焦点。
3.制备适体DNA工作溶液
材料：无核酸酶水、适体DNA团粒(经胺改性的，具有和不具有FITC)、氯化镁溶液(MgCl2，1M)、无核酸酶PBS缓冲液、微型离心机、微型离心管、500ml无菌缸
步骤：
1.通过使其离心5分钟来使冻干适体DNA团粒以短暂离心到套管底部
2.通过使适体DNA团粒溶解于无核酸酶水中来使其再悬浮以达到100μM(所需溶剂体积在销售商的产物信息中列出)。培育此溶液30分钟
3.通过将0.1ml 1M MgCl2溶液与100ml无1×核酸酶PBS缓冲液混合，且随后将缓冲液储存在500ml无菌缸中来制备折叠缓冲液
4.在烧杯中将约50ml水加热到95℃
5.为了折叠适体DNA，获取100μM适体溶液的等分试样且在50ml无菌套管中将其稀释到工作浓度(即，2μM)。随后，在热水中水浴适体DNA溶液5分钟，且在室温下冷却溶液约15分钟
6.通过无核酸酶套管中的等分试样分离适体溶液。将未使用的溶液储存在-20℃下以便长期储存。当溶液解冻时，使其储存在4℃下以避免重复的冻融环。FITC-适体溶液应避光制备
4.使用两步EDC/NHS化学方法的适体DNA固定
材料：氯化钠和磷酸钠，EDC/NHS试剂
步骤：
1.制备偶合缓冲液：使0.87g氯化钠和1.64g磷酸钠溶解于无核酸酶水中，且随后将缓冲液储存在500ml无菌缸中
2.称取0.019g EDC和0.03NHS且使其一起溶解于50ml MES缓冲液中以获得2mMEDC和5mM NHS溶液。避免含有羧酸盐和胺的任何组分
3.切割出一件pAA-FEP膜样品。为了区分pAA接枝侧面，在未经处理的FEP侧面上连接较小件标记胶带，或简单地折起一角。
4.用移液器吸取EDC/NHS溶液以充分覆盖一件干净的玻璃表面玻璃。通常，3ml液体可充分覆盖50ml表面玻璃(对于3×3cm2膜样品)，且10ml液体可覆盖100ml表面玻璃(对于5×5cm2膜样品)
5.将膜样品放置在EDC/NHS溶液上。确保pAA接枝侧面可与溶液充分接触
6.反应进行15分钟
7.用DI水迅速洗涤经处理的膜表面(任选的)
8.通过偶合缓冲液将适体DNA溶液稀释到固定化所需浓度，且用移液器吸取适体溶液以充分覆盖一件干净的表面玻璃，随后将经处理的膜表面放置到适体溶液上
9.反应进行2小时
10.如下制备其它样品组：
a.适体DNA吸收率样品：仅用DNA溶液处理pAA-FEP膜2小时
b.仅EDC/NHS样品：用EDC/NHS溶液处理样品15分钟，且随后用无核酸酶水处理其
c.仅缓冲液样品：在进行EDC/NHS反应之后，用相同量的折叠缓冲液和含偶合缓冲液的适体溶液(即如果适体溶液为折叠缓冲液的50％体积比和偶合缓冲液的50％体积比，那么此处使用的缓冲液为相同成分)处理样品
11.用无核酸酶水洗涤所有样品，且将含有DNA的样品浸没于折叠缓冲液中且储存在4℃下。
参考文献
本说明书中提及的所有出版物都指示本发明涉及的所属领域的技术人员的水平。本文中的所有出版物以引用方式并入，其程度如同每一个别公开案专门且单独指定为以全文引用方式并入。
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虽然已详细地描述了本发明和它的优点，但是应理解，可以在不脱离如所附权利要求书所界定的本发明的精神和范围的情况下对本发明做出多种改变、替代和更改。此外，本申请案的范围既定不限于本说明书中描述的过程、机器、制品、物质组成、手段、方法及步骤的特定实施例。如所属领域的技术人员将易于从本发明的公开内容了解，可根据本发明利用执行与本文中所描述的对应实施例实质上相同的功能或实现与所述对应实施例实质上相同的结果的当前现有或稍后待开发的过程、机器、制造、物质组成、手段、方法或步骤。因此，所附权利要求书既定在其范围内包含这些过程、机器、制造、物质组成、手段、方法或步骤。

Claims (62)

1.一种用于分离和培养期望类型的特定细胞的封闭系统，所述系统包含袋或套管形式的容器，其中所述容器包含：
内表面，其包含具有小于0.1mg/cm2的水中的总有机碳(TOC)的聚合物，所述总有机碳(TOC)根据美国药典(USP)643测量，以及
连接到所述聚合物的多个官能基，
其中所述聚合物是选自由以下组成的群组的氟聚合物：聚四氟乙烯(PTFE)、全氟烷氧基(PFA)、乙烯四氟乙烯(ETFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚氯三氟乙烯(PCTFE)、乙烯氯三氟乙烯(ECTFE)、氟化乙烯丙烯(FEP)、乙烯氟化乙烯丙烯(EFEP)、全氟聚醚(PFPE)、经改性的聚四氟乙烯(TFM)、聚乙烯氟化物、或其组合，
其中所述官能基直接或间接连接到生物学试剂捕获部分，所述生物学试剂捕获部分配置为选择性地且可逆地捕获所述期望类型的特定细胞；
其中所述生物学试剂捕获部分为核酸。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述官能基通过连接子连接到所述聚合物，其中所述连接子为直链亚烷基、支链亚烷基、环状亚烷基、芳烃二基、或其组合。
3.根据权利要求1所述的系统，其中所述连接子为亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基或亚己基。
4.根据权利要求1所述的系统，其中所述官能基具有连接直接到其上的结合对的第一成员，且所述生物学试剂捕获部分包含结合对的第二成员，其中所述结合对的第一和第二成员彼此结合。
5.根据权利要求4所述的系统，其中当所述结合对的第一成员为抗生物素蛋白物质时，所述结合对的第二成员为生物素。
6.根据权利要求4所述的系统，其中当所述结合对的第一成员为生物素时，所述结合对的第二成员为抗生物素蛋白物质。
7.根据权利要求5或6所述的系统，其中所述抗生物素蛋白物质为抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素或中性抗生物素蛋白。
8.根据权利要求1所述的系统，其中所述官能基为羧基、羟基、醛基、羰基、胺基、亚胺基、酰胺基、酯基、酸酐基、硫醇基、二硫基、酚基、胍基、硫醚基、吲哚基、咪唑基、氨基乙基酰胺基、炔基、烯烃基、氮丙啶基、环氧基、异腈基、胩基、四嗪基、重氮表面基团、炔基、烯烃基、氮丙啶基、环氧基、异腈基、胩基、四嗪基、烷基、氨基乙基酰胺基、酯基、重氮基或其组合。
9.根据权利要求1所述的系统，其中所述生物学试剂捕获部分直接结合所述生物学试剂。
10.根据权利要求1所述的系统，其中所述生物学试剂捕获部分间接结合所述生物学试剂或产生直接结合所述生物学试剂的分子。
11.根据权利要求10所述的系统，其中所述生物学试剂捕获部分包含核酸模板。
12.根据权利要求11所述的系统，其中所述核酸模板为环形DNA模板。
13.根据权利要求11所述的系统，其中所述核酸模板包含与直接结合到所述生物学试剂的序列互补的序列。
14.根据权利要求10或11所述的系统，其中所述生物学试剂捕获部分所产生的分子包含一种或多种适体。
15.根据权利要求1所述的系统，其中所述氟聚合物为聚四氟乙烯(PTFE)、全氟烷氧基(PFA)、乙烯四氟乙烯(ETFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚氯三氟乙烯(PCTFE)、乙烯氯三氟乙烯(ECTFE)、氟化乙烯丙烯(FEP)、乙烯氟化乙烯丙烯(EFEP)、全氟聚醚(PFPE)、经改性的聚四氟乙烯(TFM)、聚乙烯氟化物或其组合。
16.根据权利要求1所述的系统，其中所述容器进一步包含酶。
17.根据权利要求16所述的系统，其中所述酶为聚合酶。
18.根据权利要求17所述的系统，其中所述聚合酶为phi29聚合酶。
19.根据权利要求1所述的系统，其中所述容器是袋。
20.根据权利要求1所述的系统，其中所述容器包含两个或更多个孔口。
21.根据权利要求1所述的系统，其进一步包含一个或多个串联连接到所述容器的额外容器。
22.根据权利要求21所述的系统，其中一个或多个额外容器包括第二容器，所述第二容器包含一种或多种细胞生长试剂。
23.根据权利要求22所述的系统，其中所述一个或多个额外容器包括第三容器，所述第三容器包含一种或多种抗原。
24.根据权利要求23所述的系统，其中所述抗原为肿瘤抗原。
25.根据权利要求23所述的系统，其中所述一个或多个额外容器包括第四容器，所述第四容器存在经配置以浓缩生物制剂。
26.根据权利要求1所述的系统，其中所述期望类型的特定细胞为血细胞、免疫细胞或其混合物。
27.根据权利要求1所述的系统，其中所述期望类型的特定细胞是单核细胞。
28.根据权利要求1所述的系统，其中所述期望类型的特定细胞为干细胞或T细胞。
29.根据权利要求23所述的系统，其中所述一个或多个额外容器包括第二容器，所述第二容器包含两个或更多个多孔膜。
30.根据权利要求23所述的系统，其中所述一个或多个额外容器包括第二容器，所述第二容器包含四个或更多个孔口。
31.根据权利要求30所述的系统，其中所述第二容器包含两个入口和两个出口。
32.根据权利要求23所述的系统，其中所述一个或多个额外容器包括第二容器，所述第二容器包含两个或更多个膜且包含四个孔口。
33.根据权利要求32所述的系统，其中第一薄膜经配置以选择性地以流体方式分离第一入口与所述容器中的腔室，且第二薄膜经配置以选择性地以流体方式分离第一出口与所述腔室。
34.根据权利要求33所述的系统，其中第二入口安置在所述腔室处。
35.根据权利要求33所述的系统，其中第二出口安置在所述腔室处。
36.一种制备根据权利要求1所述的系统的方法，其包含以下步骤：
提供包含内表面的容器，所述内表面包含具有小于0.1mg/cm2的水中的TOC的聚合物；
将官能基连接到所述内表面；以及
将所述生物学试剂捕获部分连接到所述官能基。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述连接步骤通过氧化、格林纳试剂或电晕处理实现。
38.根据权利要求36所述的方法，其进一步包含以下步骤：将结合对的第一成员连接到官能基，将结合对的第二成员连接到生物学试剂捕获部分，以及通过所述结合对的所述成员将所述生物学试剂捕获部分直接或间接连接到所述官能基。
39.根据权利要求38所述的方法，其中将结合对的第一成员连接到所述官能基的步骤包含所述官能基的活化。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述活化包含所述官能基曝露于乙酸钠和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合物。
41.根据权利要求39或40所述的方法，其中所述生物学试剂捕获部分为环形DNA模板且所述方法进一步包含向所述容器提供聚合酶和核苷酸的步骤。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述聚合酶在适合的条件下延伸所述DNA模板。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述聚合酶为phi29聚合酶。
44.根据权利要求36所述的方法，其中所述连接步骤由等离子体反应继而湿式化学反应构成。
45.一种从包含细胞混合物的样品分离期望类型的特定细胞的方法，其包含以下步骤：
提供根据权利要求1-35中任一权利要求所述的系统；以及
在所述混合物中的所述期望类型的特定细胞选择性地且可逆地结合到所述生物学试剂捕获部分的条件下，通过使所述样品暴露于所述容器的内表面而从所述样品分离所述期望类型的特定细胞。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述处理步骤进一步包含向所述系统提供酶。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述酶为聚合酶。
48.根据权利要求45所述的方法，其中所述生物学试剂捕获部分所产生的分子为核酸。
49.根据权利要求45所述的方法，其中在从所述样品分离所述期望类型的特定细胞之后，从所述系统采集所述细胞。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述细胞通过从所述生物学试剂捕获部分或所述生物学试剂捕获部分所产生的分子释放所述细胞采集。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述释放通过加热实现。
52.根据权利要求50所述的方法，其中当所述生物学试剂捕获部分或所述生物学试剂捕获部分所产生的分子为核酸时，通过曝露于一种或多种核酸内切酶和/或曝露于与各别部分或分子互补的核酸来释放所述细胞。
53.根据权利要求45所述的方法，其中在从所述样品分离所述期望类型的特定细胞之后，进一步处理所述细胞。
54.根据权利要求53所述的方法，其中在所述系统中的一个或多个额外容器中进一步处理所述细胞。
55.根据权利要求53所述的方法，其中通过培养所述细胞，使所述细胞曝露于一种或多种抗原，使所述细胞分化，使所述细胞扩增，浓缩所述细胞，纯化所述细胞或其组合来进一步处理所述细胞。
56.治疗有效量的使用权利要求49所述的方法所分离的细胞在制备用于治疗需要细胞疗法的个体的药物中的用途。
57.一种包含根据权利要求1到35中任一权利要求所述的系统的试剂盒，所述系统容纳在适合的容器中。
58.根据权利要求57所述的试剂盒，其进一步包含聚合酶。
59.根据权利要求58所述的试剂盒，其中所述聚合酶为phi29聚合酶。
60.根据权利要求57所述的试剂盒，其进一步包含核酸内切酶。
61.根据权利要求57所述的试剂盒，其进一步包含缓冲液。
62.根据权利要求57所述的试剂盒，其进一步包含一种或多种细胞因子、趋化因子或生长因子。
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