CN107206121B - 组织支架装置和用于制造其的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种组织支架装置和一种用于制造组织支架装置的方法。组织支架装置包括多孔芯，所述多孔芯包括多根纤维，以及外部部分，所述外部部分至少基本上围绕所述多孔芯，其中所述外部部分包括沿着所述组织支架装置的纵向轴线延伸的多个孔。组织支架装置优选是肌腱支架，并且纤维优选包括胶原和聚(ε‑己内酯)(PCL)，掺入或不掺入羟基磷灰石纳米颗粒。

Description

组织支架装置和用于制造其的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年11月13日提交的申请号为10201407543V的新加坡专利申请的优先权，其全部内容通过广泛的引用并入本文。

技术领域

本发明涉及组织支架装置和制造组织支架装置的方法。

背景技术

肌腱修复和再生成为具有生物体系结构和功能的原生特性一直是一个重要的临床挑战，尚未解决。据估计，肌腱损伤是影响生活质量的最常见的伤害，仅在美国，每年就进行超过10万次手术修复。然而，肌腱再生成具有高机械支撑的专门组织结构一直是一个具有挑战性的问题，尚待解决。在许多肌腱修复中已经发展了包括自体移植、同种异体移植和异种移植在内的一些传统方法，取得了相当大的成功。然而，这些方法的应用可能会遇到内在的限制。例如，自体移植具有有限的可用性，并且对供体部位的不可避免的损伤可能导致后续发病。同种异体移植和异种移植价格昂贵，并且它们可能潜在地将捐赠者的疾病传播给接受者。此外，由于诸如缺乏血管化以及移植物和骨之间的整合较差等因素，例如在慢性肩袖修复中，同种异体移植和异种移植的失败率可以在20％至高达90％的范围内。虽然涉及细胞和合适的支架的组织工程可以为挑战提供答案，但是目前可用的肌腱支架都没有显示出类似于天然肌腱的良好效果。诸如编织物的支架可能是致密的，因此限制营养物传播和细胞浸润，导致组织仅在支架表面上形成。针织支架可具有内部部分连通空间，带有良好的机械性能。然而，针织支架可能需要诸如纤维蛋白和胶原之类的凝胶系统或用于细胞接种、粘附和增殖的纤维网。针织支架也可能缺乏将肌腱组织重建成自然各向异性结构的肌腱的能力。针织支架可以结合各向异性电纺丝网以促进细胞接种和有序细胞组织。然而，来自旋转盘和心轴的各向异性电纺丝网可以具有明显的纤维填充物，其抑制细胞和组织向内生长。因此，需要一种便于肌腱修复的替代解决方案。

发明内容

根据各种实施例，可以提供一种组织支架装置，其包括多孔芯，所述多孔芯包括多根纤维；以及外部部分，所述外部部分至少基本上围绕所述多孔芯，所述外部部分包括沿着所述组织支架装置的纵向轴线延伸的多个孔。

根据各种实施例，可以提供一种用于制造组织支架装置的方法，所述方法包括形成多孔芯，所述多孔芯包括多根纤维；以及形成外部部分，所述外部部分至少基本上围绕所述多孔芯，所述外部部分包括沿着所述组织支架装置的纵向轴线延伸的多个孔。

附图说明

在附图中，相同的附图标记通常在不同的视图中指代相同的部分。附图不一定按比例绘制，而是通常重点在于说明本发明的原理。在下面的描述中，参考以下附图描述各种实施例，其中：

图1示出了根据各种实施例的组织支架装置的概念图。

图2示出了根据各种实施例的用于制造组织支架装置的方法的流程图。

图3A-3B示出了根据各种实施例的部分完成的组织支架装置的各种视图。

图3C示出了根据各种实施例的组织支架装置的透视图。

图4A-4D示出了根据各种实施例的制造组织支架装置的外部部分的各种步骤。

图5A-5D示出了根据各种实施例的制造组织支架装置的内部部分的各种步骤。

图6A示出了根据各种实施例的组织支架装置的外部部分的照片。

图6B示出了根据各种实施例的组织支架装置的内部部分的照片。

图6C示出了根据各种实施例的组织支架装置的照片。

图7A-7B示出了根据各种实施例的组织支架装置的外部部分的扫描电子显微镜(SEM)图像。

图8A-8C示出了纤维的SEM图像。

图9示出了显示培养肌腱细胞的不同时间段的荧光强度的柱状图。

图10示出了显示活肌腱细胞的照片。

图11示出了显示细胞结构的各种照片。

图12A示出了显示对照样本中细胞核的角度分布的图。

图12B示出了显示接种在组织支架装置上的肌腱细胞的细胞核的角度分布的图。

图13A示出了显示培养肌腱细胞的不同时间段的角度±15°内的核数量的图。

图13B示出了显示培养肌腱细胞的不同时间段的细胞核形状指数(CNSI)的图。

图14A示出了显示临床前模型中的后腿髌骨肌腱的照片。

图14B示出了显示在图14A的后腿髌骨肌腱中产生的肌腱缺损的照片。

图14C示出了植入到临床前模型中的根据各种实施例的组织支架装置的照片。

图15A示出了显示临床前模型中的体内肌腱再生的照片。

图15B示出了显示肌腱新组织的放大视图的照片。

图15C示出了显示肌腱新组织的横截面的照片。

图16示出了显示肌腱新组织的切片方法的示意图。

图17A示出了天然微型猪髌骨肌腱的组织学分析。

图17B示出了图17A的放大视图。

图18A示出了组织支架装置内的重建肌腱组织的组织学分析。

图18B示出了图18A中可见组织重塑的一部分的放大视图。

图19A示出了组织支架装置的周边区域的重建肌腱组织的组织学分析。

图19B示出了图19A中可见组织重塑和组织成熟的一部分的放大视图。

具体实施方式

下述关于装置的实施例对于对应的方法同样地有效，反之亦然。此外，应当理解，下述实施例可以组合，例如，一个实施例的一部分可以与另一个实施例的一部分组合。

为了使得本发明可以容易地理解并付诸实践，现将通过示例而非限制的方式，并参照附图来描述具体实施例。

为装置提供了各种实施例，并且为方法提供了各种实施例。应当理解，装置的基本特性也适用于方法，反之亦然。因此，为了简洁起见，可以省略对这些特性的重复描述。

应当理解，本文所述的特定装置的任何特性也可以适用于本文所述的任何装置。应当理解，本文所述的特定方法的任何特性也适用于本文所述的任何方法。此外，应当理解，对于本文所述的任何装置或方法，不一定必须将所述的所有部件或步骤全部包含在装置或方法中，而可以只包括一些(但不是全部)部件或步骤。

应当领会和理解，术语“基本上(substantially)”可以包括“精确地(exactly)”和“类似的(similar)”，其程度可以被认为是“精确的(exact)”。出于说明的目的而非作为限制性示例，术语“基本上”可以被定量为与精确或实际有±5％的差异。

在各种实施例的上下文中，“组织支架装置”可以但不限于可互换地称为“肌腱支架”或“管状支架”。

在各种实施例的上下文中，“纤维(fibres)”可以但不限于可互换地称为“纤维(fibers)”，“丝(filaments)”或“原纤维(fibrillae)”。

在各种实施例的上下文中，“孔(pores)”可以但不限于可互换地称为“穿孔(perforative holes)”，“通孔(through-holes)”或“细长孔(elongated pores)”。

在各种实施例的上下文中，“外部部分”可以但不限于可互换地称为“外壳”或“外层”。

在各种实施例的上下文中，“多孔芯”可以但不限于可互换地称为“芯部”或“内部部分”。

肌腱修复和再生成为具有生物体系结构和功能的原生特性一直是一个重要的临床挑战，尚未解决。据估计，肌腱损伤是影响生活质量的最常见的伤害，仅在美国，每年就进行超过10万次手术修复。然而，肌腱再生成具有高机械支撑的专门组织结构一直是一个具有挑战性的问题，尚待解决。在许多肌腱修复中已经发展了包括自体移植、同种异体移植和异种移植在内的一些传统方法，取得了相当大的成功。然而，这些方法的应用可能会遇到内在的限制。例如，自体移植具有有限的可用性，并且对供体部位的不可避免的损伤可能导致后续发病。同种异体移植和异种移植价格昂贵，并且它们可能潜在地将捐赠者的疾病传播给接受者。此外，由于诸如缺乏血管化以及移植物和骨之间的整合较差等因素，例如在慢性肩袖修复中，同种异体移植和异种移植的失败率可以在20％至高达90％的范围内。虽然涉及细胞和合适的支架的组织工程可以为挑战提供答案，但是目前可用的肌腱支架都没有显示出类似于天然肌腱的良好效果。诸如编织物的支架可能是致密的，因此限制营养物传播和细胞浸润，导致组织仅在支架表面上形成。针织支架可具有内部部分连通空间，带有良好的机械性能。然而，针织支架可能需要诸如纤维蛋白和胶原之类的凝胶系统或用于细胞接种、粘附和增殖的纤维网。针织支架也可能缺乏将肌腱组织重建成自然各向异性结构的肌腱的能力。针织支架可以结合各向异性电纺丝网以促进细胞接种和有序细胞组织。然而，来自旋转盘和心轴的各向异性电纺丝网可以具有明显的纤维填充物，其抑制细胞和组织向内生长。

图1示出了根据各种实施例的组织支架装置100。组织支架装置100可以包括多孔芯102，多孔芯102可以包括多根纤维106；以及外部部分104，外部部分104可以至少基本上围绕多孔芯102。外部部分104可以包括多个孔108，孔108可以沿着组织支架装置100的纵向轴线延伸。

换句话说，根据各种实施例，组织支架装置100可以包括多孔芯102和外部部分104。多孔芯102可以包括多根纤维106。外部部分104可以围绕多孔芯102。外部部分104可以包括多个细长孔108。孔108可以沿着纵向轴线，或者换句话说，沿着组织支架装置100的长度延伸。组织支架装置100可以至少基本上为管状的形状，或者换句话说，圆柱形的形状。多孔芯102或外部部分104中的至少一个可以包括生物聚合物或生物聚合物复合材料中的至少一种。多孔芯102可以包括功能梯度的羟基磷灰石。可以包括电纺纤维的多根纤维106可以沿着组织支架装置100的纵向轴线设置。多根纤维106可以在基底上对齐，且基底可以卷起以形成螺旋状物(helix)。螺旋状物可以具有螺旋形横截面。多根纤维106可以设置成在多孔芯102内限定螺旋通道。基底可以是水溶性膜，并且可以包括聚(环氧乙烷)或聚(乙二醇)中的至少一种。多孔芯102的结构可以是多层的。外部部分104可以包括聚合物。外部部分104的多个孔108中的每个孔108可以至少基本上完全通过外部部分104的厚度限定。换句话说，每个孔108可以穿透外部部分104。外部部分104可以包括单层生物聚合物或单层生物聚合物复合材料中的至少一种。外部部分104可以包括生物反应材料或生物可再吸收材料中的至少一种。外部部分104可以具有沿着纵向轴线对齐的脊或沿着纵向轴线对齐的槽中的至少一个。槽可夹在两个脊之间。

图2示出了根据各种实施例的用于制造组织支架装置的方法的流程图200。在202中，可以形成多孔芯，多孔芯包括多根纤维。在204中，可以形成外部部分，外部部分至少基本上围绕多孔芯，外部部分包括沿着组织支架装置的纵向轴线延伸的多个孔。

换句话说，根据各种实施例，用于制造组织支架装置的方法可以包括202，其中可以形成多孔芯；以及204，其中可以形成外部部分。多孔芯可以包括多根纤维。外部部分可以包括多个细长孔，并且可以至少基本上围绕多孔芯。多个细长孔可以沿着组织支架装置的长度延伸。

组织支架装置和多孔芯可以各自至少基本上为管状。形成多孔芯的过程可以包括电纺丝多根纤维，并且还可以包括沿组织支架装置的纵向轴线设置多根纤维。形成多孔芯的过程还可以包括单轴拉伸多根纤维，并且还可以包括在基底上对齐多根纤维。基底可以是膜，膜可以是水溶性的。形成多孔芯的过程还可以包括沿垂直于多根纤维的长度的方向卷制基底以形成螺旋结构。基底可以由聚(环氧乙烷)或聚(乙二醇)中的至少一种形成。形成多孔芯的过程还可以包括设置多根纤维以形成多层多孔芯。多根纤维可以设置成在多孔芯内限定螺旋通道。多孔芯可以由生物聚合物或生物聚合物复合材料中的至少一种形成。多孔芯可以由功能梯度的羟基磷灰石形成。形成外部部分的过程可以包括在片材中形成多个孔，片材可以是生物反应材料或生物可再吸收材料中的至少一种。片材可以由聚合物形成。多个孔的每个孔可以完全通过片材的厚度形成。可以通过激光冲压片材来形成多个孔。外部部分可以通过将片材卷制成管而形成，并且卷制片材的过程可以包括热焊片材。形成外部部分的过程可以包括沿着纵向轴线单轴拉伸管，从而在外部部分上形成脊或槽中的至少一个。脊或槽可以沿着纵向轴线对齐。形成外部部分的过程还可以包括将多孔芯装配到外部部分中并且在外部部分内疏松多孔芯。外部部分可以由生物聚合物或生物聚合物复合材料中的至少一种形成。多孔芯可以由单层生物聚合物或单层生物聚合物复合材料中的至少一种形成。

三维(3D)组织支架装置可用于辅助肌腱移植的组织工程。组织支架装置可以生物模拟肌腱组织的性质。组织支架装置可能能够在肌腱修复部位引发天然肌腱再生。组织支架装置还可以为肌腱生长提供机械支撑。根据各种实施例的组织支架装置可以是管状的形状，例如包括同心圆或椭圆形。组织支架装置可以由多层各向异性结构构成。各向异性结构可以由脊、槽或原纤维中的至少一种提供。组织支架装置还可以包括仿生肌腱结构的互连的多孔通道，同时仍然提供足够的弯曲、拉伸和扭转强度，以便抵抗骨折。各向异性结构可以被配置为引导肌腱细胞的组织和细胞外基质的分泌到对齐的结构中。互连的多孔通道可以促进质粒与生长中的细胞的运输，以形成3D的肌腱组织。互连的多孔通道还可以通过其他细胞和微血管的整合来建立重建肌腱及其周围组织之间的连接。

根据各种实施例的组织支架装置可以由两部分组成，即内部部分和外部部分。内部部分可以是多层多孔部分，其具有朝向管状长轴方向定向的多根原纤维。内部部分可以提供用于内部细胞生长和细胞发育的位点以形成有序的3D组织结构。外部部分可以是缠绕于内部部分的单层多孔部分。外部部分可以具有沿着管状长轴，换句话说，沿着组织支架装置的纵向轴线，或者换句话说，沿着组织支架装置的长度设置的高度定向的脊或槽阵列。脊或槽阵列可以提供用于种子细胞粘附(adhesion)、排列(alignment)和发育(tenogenesis)的初步位点。外部部分还可以包括穿孔结构，以允许大量运输和细胞迁移跨越外层，以便到达内部部分。外部部分也可以用作提供弯曲、拉伸和扭转强度中的至少一种的主要结构。

根据各种实施例的用于制造组织支架装置的方法可以包括分别制造组织支架装置的内部部分和组织支架装置的外部部分。该方法可以包括单轴拉伸由生物聚合物或生物聚合物复合材料制成的膜，以形成脊/槽或纤维结构的各向异性结构。生物聚合物或生物聚合物复合材料可以包括胶原(collagen)和聚(ε-己内酯)(PCL)，掺入或不掺入羟基磷灰石(HA)纳米颗粒。该方法还可以包括将内部部分填充到外部部分内，并且当内部部分在外部部分内时通过疏松内部部分来将内部部分紧固到外部部分。内部部分可以具有多层结构。内部部分的直径和外部部分的直径可以根据植入位置和对机械强度的要求来决定。

制造内部部分可以包括沿着垂直于对齐的纤维或丝的方向卷制设有单轴拉伸的电纺纤维或丝的膜，以形成多层螺旋结构。膜可以是水溶性聚合物膜，例如聚(环氧乙烷)(PEO)或聚(乙二醇)(PEG))。在多层螺旋结构中，相邻薄片可以被膜层隔开。螺旋结构的直径可以通过控制卷制薄片的数量来调节。

制造外部部分可以包括利用热熔以单轴拉伸卷制膜和利用直射式激光冲压穿孔，以形成覆盖有高度定向的脊和槽的管状结构。穿孔在本文中也称为外部部分的孔。拉伸卷制膜的过程可以在刚好低于卷制膜的熔点的温度下进行。可以调整脊和槽的参数以及穿孔的尺寸，以便使用不同的拉伸比例，如拉伸比2、3、4和5来控制细胞排列、细胞浸润和血管化的程度。

根据各种实施例的管状支架可以用于将互连的孔隙和各向异性结构的特性组合，以增强细胞浸润和组织向内生长进入支架内，以形成真正的三维的具有一致的细胞和细胞外基质(ECM)的组织的天然肌腱结构。外部部分可以提供脊和槽结构作为用于支架表面上种子细胞粘附和定向生长的脉络，以及提供穿孔用于细胞迁移并穿过外部部分进入支架。同时，内部部分可以提供薄片内的例如源于电纺丝网的单轴拉伸的互连的孔隙，和薄片之间的螺旋通道，以连接孔，用于进一步的细胞迁移以进入支架的较深区域，以及在定向丝的引导下，在天然各向异性结构中形成三维肌腱组织。管状支架的设计可以允许不同的目的结合不同的材料，例如使用聚(ε-己内酯)(PCL)作为外部部分来提供主要的机械支撑，并且使用胶原作为内部部分以产生生物相容性功能如发育(tenogenesis)。定向的纤维网的内部部分可以进一步用功能梯度的羟基磷灰石进行改性，以仿生腱-骨界面的结构和组成。因此，管状支架可以实现这些功能的整合，使其比特性不完美并且缺乏强大的肌腱再生能力的现有支架更有利。管状支架可以用于再生医学中以取代肌腱缺损或增加人体上下两侧的肌腱相关组织的长度。

根据各种实施例的组织支架装置可以包括内部部分和外部部分。内部部分可以包括卷起的纤维束。在卷起之前，纤维可以首先设置在膜上。在卷起的纤维束中，纤维的外层可以通过膜与纤维的内层分离，该膜可以是水溶性聚合物膜如PEO或PEG。该膜可以溶解在磷酸盐缓冲盐水或细胞培养基中，使得纤维束形成螺旋通道，以将纤维外层中的孔连接到纤维内层内的孔中。组织支架装置的内部部分的直径可以取决于肌腱骨架的植入部位，并且可以通过控制卷制的薄片的数量来调节。外部部分可以通过在刚好低于熔点的温度例如针对PCL膜为54℃，以恒定拉伸比例如针对PCL膜的拉伸比为4，单轴拉伸多孔管制成，该多孔管通过热熔以不同的直径例如1至20mm缠绕芯部的半结晶聚合物如PCL膜获得。

根据各种实施例的管状支架可以具有互连孔隙的结构，其被设计成允许大量运输和细胞向内生长到管状支架的内位点，以形成3D的有序的肌腱结构。用于制造管状支架的方法可以包括激光冲压和电纺丝。管状支架可以由第一部分和第二部分构成。第一部分可以包括内部多层多孔部分，其中原纤维朝向管状长轴定向，其将提供用于内部细胞生长和发育的位点以形成真正的三维的有序的组织结构。第二部分可以是外部单层多孔部分，其具有沿着管状长轴设置的定向的脊或槽阵列。定向的脊或槽阵列可以提供用于种子细胞粘附、排列、延伸和发育的初步位点。第二部分可以包括穿孔结构，其允许细胞迁移穿过第二部分进入第一部分的大量运输。

图3A示出了根据各种实施例的部分制造的管状肌腱支架的顶部横截面图300A。管状肌腱支架300A可以包括内部部分302和围绕内部部分302的外部部分304。内部部分302可以包括粘附到中间层310的多根纤维306。中间层310可以包括水溶性材料。中间层310可以被卷制，使得顶部横截面图300A示出了螺旋形的中间层310。中间层310可以是水溶性基底。外部部分304可以由卷制成圆柱形结构的膜形成。膜可以具有贯穿膜的厚度的多个细长孔，使得外部部分具有形成在其中的多个孔308。

图3B示出了图3A的部分制造的管状肌腱支架的顶侧透视图300B。顶侧透视图300B示出了外部部分304的外表面。外部部分304可以具有多个孔308，多个孔308沿管状肌腱支架的纵向轴线314延伸。外部部分的外表面可以包括形成在其中的多个脊312。外部部分的外表面还可以包括形成在其中的多个槽，槽为每两个凸脊312之间的凹陷空间。

图3C示出了图3B的管状肌腱支架去除中间层310后的顶侧透视图300C。在去除中间层310后，螺旋通道316可以形成在内部部分302中。可以通过将中间层溶解在水中去除中间层310。如300C所示，管状肌腱支架可具有3D各向异性结构和互连的孔隙，使其适用于肌腱组织工程中的应用。各向异性结构可以由沿着纵向轴线314延伸的孔308和平行于纵向轴线314设置的脊312形成。各向异性结构可以提供用于肌腱细胞粘附和增殖的主要位点，最重要的是触发细胞排列、延伸和分化，将细胞外基质分泌到有序组织中，以产生优异的轴向拉伸承载能力。

图4A-4D示出了根据各种实施例的用于制造组织支架装置的外部部分的方法的示意图。图4A示出了图400A，其显示热压的膜440A。膜440A可以是聚合物膜，并且其可以是生物可再吸收的。膜440A可以是生物可再吸收的聚合物膜，例如聚(ε-己内酯)(PCL)。

图4B示出了图400B，其显示图4的热压膜440A使用激光冲头442穿孔以形成多孔膜440B。热压膜440A可以被激光冲压，使得在膜440A中形成多个孔408B。孔408B可以是通孔。用于冲压膜440A的激光可以是例如二氧化碳连续波长激光，其能量_脉冲(Energy_pulse)＝0.154μJ，数量_脉冲(Number_pulse)＝150，其中能量_脉冲指的是每一脉冲的能量，或者换句话说，脉冲能量，而数量_脉冲指的是脉冲数量。

图4C示出了图400C，其显示图4B的激光冲压膜440B卷制成管440C。激光冲压膜440B可以围绕圆筒444加热和卷制。卷制的激光冲压膜440B可以被热焊，从而形成管440C。

图4D示出了图400D，其显示图4C的管440C的被拉伸以形成组织支架装置的外部部分304。图4D的外部部分304可以是图3A-3C的外部部分304，也可以是图1的外部部分104。管440C可以沿着纵向轴线314单轴拉伸，使得多个孔408B延伸为孔308。多个孔308可以与图3A-3C中的孔308和图1中的孔108相同。。管440C的拉伸也可以形成多个脊312和形成在外部部分304上的多个槽。脊312可以是微脊，并且槽可以是微槽。管440C可以以恒定的拉伸比在刚好低于用于制造管440C的膜440A的熔点的温度下拉伸。如果膜440A是PCL，拉伸比可以是4，温度可以是54℃。

图5A-5D示出了根据各种实施例的用于制造组织支架装置的内部部分的方法的示意图。内部部分可以是图1的多孔芯102。图5A示出了图500A，其显示多根纤维550A，多根纤维550A可以是聚合物网，例如PCL或胶原。多根纤维550A可以在室温下电纺丝。

图5B示出了图500B，其显示图5A的多根纤维550A拉伸成为对齐的纤维550B。多根纤维550A可以以不同的拉伸比，例如针对PCL网为3至5，沿着纵向轴线314单轴拉伸，以获得对齐的纤维550B。

图5C示出了图500C，其显示图5B的对齐的纤维550B设置在中间层310上。中间层310可以是水溶性膜。对齐的纤维550B可以设置成至少基本上平行于纵向轴线314。

图5D示出了图500D，其显示与对齐的纤维550B一起的中间层310被卷制成螺旋形(spiral)或螺旋(helix)结构552。中间层310可以在与对齐的纤维的被拉伸的方向垂直的方向上卷制，换句话说，中间层310可以在与纵向轴线314垂直的方向上卷制。

然后，可以将螺旋结构552插入图4D的外部部分304中。螺旋结构552可以在外部部分304内膨胀，使得螺旋结构552可以牢固地联接到外部部分304。随后，例如通过将中间层310溶解在水中或溶液中，可以去除中间层310，在外部部分304内留下已经变成螺旋设置的对齐的纤维550B。对齐的纤维的螺旋设置可以是图1的多孔芯102，也可以是图3C的内部部分302。

图6A-6C示出了根据各种实施例的组织支架装置的照片。图6A示出了外部部分304。外部部分304可以用作组织支架装置的提供弯曲、拉伸和扭转强度的主要结构。

图6B示出了内部部分302。内部部分302可以与外部部分304分开制造。

图6C示出了外部部分304和内部部分302组合以形成组织支架装置600。组织支架装置600可以与图1的组织支架装置100相同。组织支架装置600可以具有1mm至15mm之间的直径。

图7A-7B示出了根据各种实施例的组织支架装置的外部部分的扫描电子显微镜(SEM)图像。图7A示出了SEM图像700A，其显示穿孔，换句话说，组织支架装置的外部部分的孔108。孔108沿着组织支架装置的纵向轴线314延伸。换句话说，孔108的形状可以是椭圆形的，并且其在纵向轴线314上可以比在垂直于纵向轴线314的横向轴线上更长。可以通过首先利用直射式激光冲压膜来形成孔108，以在膜中产生穿孔，然后拉伸膜以将穿孔转变成尺寸扩大的细长孔108。孔108可以，例如在纵向轴线314上至少基本上在0.5-3mm的范围内，并且在横向轴线上至少基本上等于50-300μm的范围内。孔108可以在纵向轴线上至少基本上等于1mm，并且在横向轴线上至少基本上等于100μm。

图7B示出了的SEM图像700B，其示出图7A的组织支架装置的外部部分。外部部分具有多个脊312和多个槽770。每两个脊312之间有一个槽770。从图7B中可以看出，脊312和槽770平行于纵向轴线314。脊312和槽770可以通过单轴拉伸形成。脊312的长度可以至少基本上在30-90μm的范围内，并且相邻的脊312之间的距离可以至少基本上在6-17μm的范围内，而脊312的深度可以至少基本上等于700nm。脊312可以在内部部分的内表面和外表面上沿着纵向轴线314朝向拉伸方向定向。外部部分的直径取决于要插入的内部部分的尺寸，并且可以通过在不同直径例如1-20mm单轴拉伸聚合物管例如1-15mm来实现。

图8A-8C示出了在内部部分制造的不同阶段中根据各种实施例在组织支架装置的内部部分中使用的纤维的SEM图像。

图8A示出了SEM图像800A，其显示随机电纺网。如800A所示，电纺纤维在它们的取向上是随机的。

图8B示出了SEM图像800B，其显示单轴拉伸的电纺网。图8A的随机电纺网可以沿着纵向轴线314拉伸，使得先前随机取向的纤维或丝被定向成至少基本上平行于纵向轴线314。

图8C示出了图8B的SEM图像800B的放大图像800C。放大图像800C示出了单轴拉伸网。单轴拉伸网的丝沿着平行于纵向轴线314的拉伸方向定向。丝是波浪形的，并且在丝之间形成互连的孔隙。

图9示出了图900，其显示肌腱支架的细胞相容性，换句话说，是肌腱细胞与肌腱支架的相容性。进行实验以研究临床应用的根据各种实施例的组织工程肌腱支架的潜力。图900示出了与热压PCL(HP-PCL)上的细胞生长和组织培养板(TCP)上的细胞生长相比，肌腱支架上的肌腱细胞生长的对比。将人类肌腱细胞的第一样本接种到HP-PCL上作为阴性对照；将人类肌腱细胞的第二样本接种到肌腱支架上；将人类肌腱细胞的第三样本接种到TCP上作为阳性对照。第一样本、第二样本和第三样本中的每一个均含有密度为10,000个每平方厘米的人类肌腱细胞。将第一样本、第二样本和第三样本中的每一个培养12天。使用阿拉玛蓝测定，将肌腱细胞的增殖呈现为荧光强度。样本大小为6。图900包括垂直轴902和水平轴904。垂直轴902代表以任意单位(a.u.)表示的荧光强度，而横轴904代表培养人类肌腱细胞样本的天数。换句话说，垂直轴902也表示肌腱细胞的量。图900还包括柱状图906、908和910。柱状图906表示第一样本的荧光强度；柱状图908表示第二样本的荧光强度；柱状图910表示第三样本的荧光强度。柱状图906、908和910中的每一个均记录1天(D1)、3天(D3)、6天(D6)和12天(D12)的培养持续时间。根据各个样本获得的各个荧光强度计算p值，也表示为p，以确定两个样本组之间是否存在统计学差异。柱状图表示为“*”，指p<0.05；“**”，指p<0.01；“***”，指p<0.001；以及“NS”，指没有观察到显著差异。假设零假设为真，p值给出了在实验中获得结果的概率。例如：当测试中p<0.05时，这意味着一个样本组的95％以上的结果被认为与其他样本组的结果不同。“0.95”、“0.99”和“0.999”是经常选择用于进行p值分析的阈值，分别代表测试的三个显著性水平(分别为“0.05”、“0.01”和“0.001”)。在图900中，从统计分析获得结果。如图900所示，肌腱支架在12天的研究期内支撑人类肌腱细胞的持续增殖。与HP-PCL相比，随着培养时间的增加，在肌腱支架上培养的肌腱细胞以更高的速率增殖，接近TCP。

图10示出照片1000，其显示培养13天后肌腱支架上的人类肌腱细胞。使用荧光素/碘化丙啶(FDA/PI)法对肌腱细胞进行染色，使得活细胞看起来是绿色的，而死细胞看起来是红色的。原始照片的绿色部分在照片1000中显示为浅灰色，照片1000是原始照片的灰度版本。在原始照片中没有观察到红色。因此，照片1000示出了肌腱支架允许人类肌腱细胞的非细胞毒性的生长，大约100％的肌腱细胞在培养13天后存活。

图11示出了照片1102-1116，其显示人类肌腱细胞的细胞结构。将密度为10,000个每平方厘米的人类肌腱细胞接种到肌腱支架上，以及用作阴性对照的HP-PCL上。培养人类肌腱细胞多个时间段，并使用细胞骨架F-肌动蛋白和核DNA染色进行标记。照片1102、1104、1106和1108分别显示持续1天、3天、6天和12天后的HP-PCL上的肌腱细胞的细胞结构。照片1110、1112、1114和1116分别显示持续1天、3天、6天和12天后接种到肌腱支架上的肌腱细胞的细胞结构。照片的对比表明，组织工程肌腱支架已证明能够以天然肌腱的方式引导细胞结构再生。在照片1110、1112、1114和1116中，这些肌腱细胞在工程肌腱支架的引导下，与定向的F-肌动蛋白丝呈现定向生长。即使在仅仅1天的培养之后，天然肌腱状细胞结构也迅速建立。此外，形成天然肌腱状细胞结构的细胞的取向在12天内保持一致。相比之下，即使细胞达到汇合，HP-PCL上培养的人类肌腱细胞仍然随机组织。因此，已经证明肌腱支架有助于肌腱细胞结构的重建。

图12A示出了图1200A，其显示对照样本中的肌腱细胞的核角度(nucleus angles)分布。图1200A包括垂直轴1202和水平轴1204。垂直轴1202代表以百分比(％)表示的频率，而横轴1204代表以度(°)表示的核角度(nucleus angle)。图1200A还包括显示培养1天后的核角度分布的第一曲线1206，显示培养3天后的核角度分布的第二曲线1208，显示培养6天后的核角度分布的第三曲线1210，显示培养12天后的核角度分布的第四曲线1212，显示各向同性对照样本的第五曲线1214。

图12B示出了图1200B，其显示接种到肌腱支架上的肌腱细胞的核角度分布。图1200B包括垂直轴1202和水平轴1204。垂直轴1202代表以百分比(％)表示的频率，而横轴1204代表以度(°)表示的核角度。图1200B还包括显示培养1天后的核角度分布的第一曲线1206，显示培养3天后的核角度分布的第二曲线1208，显示培养6天后的核角度分布的第三曲线1210，显示培养12天后的核角度分布的第四曲线1212，显示各向同性对照样本的第五曲线1214。从图1200A和1200B可以看出，在12天的培养过程中，肌腱支架导出的肌腱细胞的细胞结构与±30°内的细胞核的集中的角度分布耦合，而对于对照组，核角度呈现均匀分布。

图13A示出了图1300A，其显示细胞排列效率，表现为与各向同性对照相比，角度±15°内的细胞核的数量。各向同性对照是均匀分布的细胞核，效率约为16.7％。图1300A包括垂直轴1302A和水平轴1304B。垂直轴1302A代表以百分比(％)表示的角度±15°内的细胞核数量，而横轴1304A代表培养的持续时间。图1300A还包括表示各向同性对照样本的第一图1306；表示对照样本，例如接种在HP-PCL上的肌腱细胞，的第二图1308；以及表示接种在肌腱支架上的肌腱细胞的第三图1310。样本大小为4。与阴性对照1308相比，柱状图表示为，“***”,指p<0.001。定量分析表明，如第三图1310所示，在肌腱支架上培养的人类肌腱细胞与由第二图1308表示的对照样本的1.7-2x，p<0.001相比，±15°内的细胞核的数量获得显着增加，表明获得了更高的细胞排列效率。

图13B示出了图1300B，其显示随时间推移的肌腱细胞的细胞延伸。图1300B包括指示细胞核形状指数(CNSI)的垂直轴1302B和指示培养持续时间的水平轴1304B。图1300B还包括表示控制样本的第一图1308和表示接种到肌腱支架上的肌腱细胞的第二图1310。样本大小为4。柱状图表示为“***”，指p<0.001；以及“NS”，指与阴性对照1308相比不存在显著差异。从图1300B可以看出，与对照样本中的肌腱细胞相比，人类肌腱细胞在肌腱支架上培养6天后，观察到细胞核的延伸更高，表明发生基因变异。肌腱支架上的细胞核的CNSI约为对照样本中细胞核的CNSI的0.9倍，p<0.001。这些观察结果表明，工程化的肌腱支架能够对肌腱细胞的细胞核进行调节，从而有利于将肌腱细胞结构从遗传重建为形态学水平。

在下文中，将描述用于证明组织支架装置用于体内肌腱重建的适用性的临床前试验。可以使用微型猪(μ-pig)建立肌腱缺损的临床前大型动物模型，在两个后腿的髌骨肌腱中产生组织间隙。根据各种实施例的组织支架装置可以在植入微型猪以填充组织间隙之前使用γ-辐射来消毒。即使在灭菌后，组织支架装置也能保持其多孔和各向异性结构。

图14A示出了照片1400A，其显示临床前模型中的后腿髌骨肌腱。

图14B示出了照片1400B，其显示在后腿髌骨肌腱中产生的肌腱缺损1440。肌腱缺损1440具有约10mm长度的组织间隙。

图14C示出了照片1400C，其显示用于连接天然髌骨肌腱的两端的植入的组织支架装置。组织支架装置经过γ-辐射消毒，保留了完整的多孔和各向异性结构。组织支架装置可以通过连接肌腱中组织间隙的两端来填充组织缺损1440。组织支架装置具有操作舒适性，易于处理，并允许手术后后腿伸展和弯曲。

图15A示出了照片1500A，其显示图14A-14C的临床前大动物模型中的体内肌腱再生。照片1500A显示植入组织支架以修复组织缺损6周后，收集的微型猪髌骨肌腱。从照片1500A可以看出，形成了肌腱新组织1550。不仅在组织支架装置的两端区域中，还在组织支架装置的长度上，肌腱缺损成功地被肌腱新组织1550修复。也已证明，肌腱新组织1550与天然肌腱组织结合地很好。

图15B示出了照片1500B，其显示肌腱新组织1550的放大视图。从照片1500B可以看出，肌腱新组织1550表现出与天然肌腱相似的正常闪亮白色外观。

图15C示出了照片1500C，其显示肌腱新组织1550的横截面。可以从肌腱新组织1550的横截面观察不同愈合阶段的多个部分。然后将重建的肌腱新组织沿其纵向方向分为不同平面，采用苏木精和伊红(H&E)染色法，通过比较肌腱新组织的组织学分析以及天然微型猪的髌骨肌腱的组织学分析，评估组织支架装置重建肌腱组织学成分的潜力。

图16示出了显示重建肌腱新组织的切片方法的示意图。首先通过沿着纵向方向切除重建肌腱的两个端部，获得重建肌腱新组织的样本1660。然后，在与纵向方向平行的不同平面上对样本1660进行切片。样本1660包括形成在支架内部部分的内部部分，本文也称为支架内侧1662。样本1660还包括形成在支架外部部分的外部部分，本文也称为支架外侧1664。

图17A示出了图像1700A，其显示使用H&E染色法的天然微型猪的髌骨肌腱的组织学分析。将天然微型猪髌骨肌腱的组织学分析用作重建肌腱新组织的组织学分析的比较基础。血管1770在图像1700A中可见，如箭头所示。

图17B示出了图17A的图像1700A的放大视图1700B。

图18A示出了图像1800A，其显示在组织支架装置内使用H&E染色法的重建肌腱新组织的组织学分析。在图像1800A中，可以看到血管1770、炎症1886、纤维增生1884、组织重塑1882和新组织成熟1880。血管1770在图像中用箭头指示；炎症用符号“％”表示；纤维增生1884用符号“&”表示；组织重塑1882用符号“#”表示；新组织成熟1880用符号“@”表示。H&E染色结果显示，细胞和血管可穿透组织支架装置支架的外壳(也称为外层)，接近组织支架装置的深芯部。组织支架装置可以同时触发多个愈合反应。如图像1800A所示，在组织支架装置植入6周之后，发现组织支架装置的外壳附近的区域有炎症1886，而芯部的区域被发现有纤维增生1884、组织重塑1882和新组织成熟1880。

图18B示出了图像1800A中可见组织重塑1882的一部分的放大视图1800B。从放大视图1800B可以看出，细胞外基质(ECM)已经开始沉积在组织支架装置的芯部上，观察到细胞沿着组织支架装置的纵向方向重新组织成波纹状排列的模式。

图19A示出了图像1900A，其显示在组织支架装置的周边区域使用H&E染色法的重建肌腱组织的组织学分析。在组织支架装置的周边区域中观察到肌腱新组织形成，对于图18A-18B所示的组织支架装置内发生的那些有相似的多个愈合反应。比较上述多个愈合阶段，组织支架装置的内侧和外侧的巩固的成熟肌腱新组织表现出较低的细胞性，伴随较高的胶原沉积含量，原纤维束形成以及ECM丝波纹状排列，接近于如图17A-B所示的天然微型猪髌骨肌腱。

图19B示出了图19A中可见组织重塑和组织成熟的一部分的放大视图。

虽然已经参考具体实施例具体示出和描述了本发明的实施例，但是本领域技术人员应当理解，在不脱离由所附权利要求书限定的本发明的精神和范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。因此，本发明的范围由所附权利要求书表示，并且因此旨在包含落在权利要求的等同物的含义和范围内的所有改变。应当理解，在相关附图中，使用共同的标记表示用于相似或相同目的的部件。

Claims (20)

1.一种组织支架装置，包括：

外部部分，所述外部部分包括卷制片材，所述卷制片材包括沿着所述组织支架装置的纵向轴线延伸的多个孔和脊；以及

螺旋结构芯，所述螺旋结构芯被所述外部部分包围，所述螺旋结构芯包括位于所述外部部分内的卷制纤维层，其中，所述螺旋卷制纤维层在所述外部部分内膨胀并与所述外部部分牢固连接，并且所述螺旋卷制纤维层限定螺旋通道。

2.根据权利要求1所述的组织支架装置，其中，所述纤维层包括多根纤维，所述多个纤维沿着所述组织支架装置的所述纵向轴线设置。

3.根据权利要求1所述的组织支架装置，其中，所述外部部分的所述多个孔中的每个孔完全通过所述卷制片材的厚度限定。

4.根据权利要求1所述的组织支架装置，其中，所述外部部分具有沿着所述纵向轴线对齐的槽。

5.根据权利要求1所述的组织支架装置，其中，所述组织支架装置为管状的形状。

6.根据权利要求1所述的组织支架装置，其中，所述螺旋通道由设置在所述卷制纤维层之间的水溶性膜溶解后形成。

7.根据权利要求1所述的组织支架装置，其中，所述螺旋结构芯包括生物聚合物或生物聚合物复合材料中的至少一种。

8.根据权利要求1所述的组织支架装置，其中，所述外部部分包括生物聚合物或生物聚合物复合物中的至少一种。

9.根据权利要求1所述的组织支架装置，其中，所述螺旋结构芯包括功能梯度的羟基磷灰石。

10.一种用于制造组织支架装置的方法，所述方法包括：

形成外部部分，所述外部部分包括卷制片材，所述卷制片材包括沿着所述组织支架装置的纵向轴线延伸的多个孔和脊；以及

形成螺旋结构芯，所述螺旋结构芯被所述外部部分包围，所述螺旋结构芯包括位于所述外部部分内的卷制纤维层，其中，所述螺旋卷制纤维层在所述外部部分内膨胀并与所述外部部分牢固连接，并且所述螺旋卷制纤维层限定螺旋通道。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，形成所述螺旋结构芯包括电纺丝多根纤维以形成所述纤维层。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，形成所述螺旋结构芯包括单轴拉伸所述多根纤维。

13.根据权利要求11所述的方法，其中，形成所述螺旋结构芯包括在基底上对齐所述多根纤维。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，在所述基底上对齐所述多根纤维包括在可溶性基底上对齐所述多根纤维。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，形成所述螺旋结构芯包括沿着垂直于所述多根纤维的长度的方向卷制所述基底以形成螺旋结构，并且溶解水溶性基底以形成所述螺旋通道。

16.根据权利要求10所述的方法，其中，形成所述外部部分包括在所述片材中形成所述多个孔。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，形成所述外部部分还包括将所述片材卷制成管。

18.根据权利要求17所述的方法，其中，将所述片材卷制成所述管包括热焊所述片材。

19.根据权利要求17所述的方法，其中，形成所述外部部分还包括沿着所述纵向轴线单轴拉伸所述管。

20.根据权利要求10所述的方法，其中，形成所述外部部分包括将所述卷制纤维层装配到所述外部部分中并且在所述外部部分内疏松所述卷制纤维层。

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