CN107205953A - 减少人畜共患传染病的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种组合物和使用该组合物向受试个体口服递送生物活性剂的方法。更具体地，本发明涉及包含层叠在基质上的有效量的至少一种生物活性剂的组合物和通过向受试个体施用该组合物来减少人畜共患传染病的方法。本发明还涉及制备该组合物的方法。
Description
相关申请
本申请要求于2014年6月26日提交的第62/017,699号美国临时申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及一种组合物和使用该组合物向受试个体口服递送生物活性剂的方法。更具体地，本发明涉及包含基质和层叠(layered)在该基质上的有效量的至少一种生物活性剂的组合物以及减少人畜共患传染病的方法。本发明还涉及制备该组合物的方法。
背景技术
控制人畜共患传染病和抗菌剂耐药性有助于降低疾病的传播性。当前控制人畜共患传染病的策略包括部署杀虫剂作为消除地方性动物病循环的媒介的手段。然而，杀虫剂的使用对受试个体和环境具有毒性脱靶效应。预防性和治疗性抗生素的使用会不经意地一起导致在人畜共患传染病循环中得以留存的致病原的抗菌剂耐药性菌株的进化。此外，尽管易感宿主预防剂或治疗剂的施用通常采用肠胃外给药，但是这些给药方法带来了成本和物流方面的挑战。此外，与肠胃外方法相比，口服递送的预防剂或治疗剂的制造更加经济，提供显著的易用性，并且引起的副作用较少。
发明内容
发明内容部分描述了本发明的几个实施方案，并且在许多情况下列出了这些实施方案的变型和变换。发明内容部分仅仅是许多不同实施方案的示例。提及指定实施方案的一个或多个代表性特征同样是示例性的。这样的实施方案通常可以具有或不具有所提及的特征；同样地，这些特征可以适用于本发明的其他实施方案，无论该实施方案是否在发明内容部分中列出。为了避免过度重复，发明内容部分没有列出或暗示这些特征的所有可能的组合。
本发明涉及一种组合物和使用该组合物向受试个体口服递送生物活性剂的方法。更具体地，本发明涉及包含基质和层叠在该基质上的有效量的至少一种生物活性剂的组合物以及减少人畜共患传染病的方法。在一些实施方案中，本发明提供了通过将该组合物施用给受试个体来降低抗菌剂耐药性的方法。
在本发明的一些实施方案中，提供了一种组合物。所述组合物包括基质、层叠在该基质上的有效量的至少一种生物活性剂和交联剂。在一些实施方案中，在有利于脱水生活(anhydrobiosis)的条件下在稳定剂中稳定所述至少一种生物活性剂。在一些实施方案中，所述组合物通过以下步骤制备：(1)在稳定剂中稳定至少一种生物活性剂，(2)将经过稳定的至少一种生物活性剂施用于基质表面，(3)通过将交联剂施加到基质上来交联该经过稳定的至少一种生物活性剂，和(4)在一定温度范围的环境温度下以及强制通风(forcedair)的条件下干燥。在一些实施方案中，该温度为约20℃至约35℃。
在一些实施方案中进一步提供的组合物还包括组合物的外表面上的包衣。在一些实施方案中，该外表面上的包衣为虫胶包衣。在一些实施方案中，所述包衣为肠溶包衣。
在一些实施方案中，基质的平均直径为约100μm至约2cm。在一些实施方案中，稳定剂包括但不限于水胶体聚合物或增塑糖。在一些实施方案中，增塑糖包括蔗糖、海藻糖的非限制性实例。在一些实施方案中，水胶体聚合物的非限制性实例为藻酸钠。在一些实施方案中，交联剂为钙盐。交联剂的实例包括但不限于乳酸钙、氯化钙、硫酸钙、碳酸钙、乙酸钙或抗坏血酸钙。
在本发明的一些实施方案中，基质的实例包括但不限于颗粒(pellet)、可咀嚼物(chewable)、珠粒(bead)和粉末。在一些实施方案中，珠粒包括微晶纤维素珠粒的非限制性实例。在一些实施方案中，基质包括植物基物质或土基(earthen-based)物质。在一些实施方案中，土基物质包括但不限于土壤或水。在一些实施方案中，生物活性剂为被改造(engineered)成表达一种或多种抗原的重组全细胞细菌。在一些实施方案中，全细胞细菌包括但不限于乳杆菌(lactobacillus)，包括嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、短乳杆菌(L.brevis)、干酪乳杆菌(L.casei)、卷曲乳杆菌(L.crispatus)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、加氏乳杆菌(L.gasseri)、植物乳杆菌(L.plantarum)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnzosus)和唾液乳杆菌(L.salivarius)。在一些实施方案中，一种或多种抗原为一种或多种伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)抗原。
在一些实施方案中，进一步提供的基质的量为组合物的约85％w/w至约99％w/w。在一些实施方案中，基质为本发明组合物的约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％w/w和约99％w/w。在一些实施方案中，稳定剂的量为组合物的约1％w/w至约15％w/w。稳定剂为本文公开的组合物的约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％w/w和约15％w/w。在一些实施方案中，生物活性剂的有效量是最小免疫剂量(MID)为约5×103CFU至约5×107CFU的致免疫有效量(immunogenically effective amount)。在一些实施方案中，MID为约5×103CFU、5×104CFU、5×105CFU、5×106CFU和约5×107CFU。在一些实施方案中，交联剂的量为组合物的约0.5％w/w至约7.5％w/w。交联剂为组合物的约0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％w/w和约7.5％w/w。此外，在一些实施方案中，包衣的量为组合物的约1.5％w/w至约22.5％w/w。包衣为本文公开的组合物的约1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％、15％、15.5％、16％、16.5％、17％、17.5％、18％、18.5％、19％、19.5％、20％、20.5％、21％、21.5％、22％和约22.5％。
在本发明的一些实施方案中，还提供了用于口服递送生物活性剂的组合物。所述组合物包括基质、涂覆或层叠在基质上的有效量的至少一种生物活性剂和促进抗原(antigenic)在基质表面上稳定剂中的包封的交联剂。在一些实施方案中，在选自水胶体聚合物、增塑糖和海藻糖的稳定剂中稳定至少一种生物活性剂。在一些实施方案中，生物活性剂为抗原剂。
此外，在一些实施方案中，还提供了制备用于口服递送生物活性剂的组合物的方法。该方法包括以下步骤：(1)在稳定剂中稳定至少一种抗原剂；(2)将经过稳定的至少一种抗原剂涂覆在基质上；(3)施加交联剂；(4)进行交联以促进抗原剂的凝胶化或包封；以及(5)在环境温度下以及强制通风条件下干燥。在一些实施方案中，该温度在约20℃至约35℃的范围内。该温度为约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃和约35℃。在一些实施方案中，借助风扇达到环境温度。在一些实施方案中，该方法还包括在外表面上涂覆糖果釉层(confectionary glaze layer)用作防潮层或用作调味引诱剂的步骤。在一些实施方案中，该方法还包括在外表面上涂覆虫胶层用作防潮层的步骤。
本发明在一些实施方案中提供了通过给有需要的受试个体接种疫苗来控制人畜共患传染病的方法。该方法包括向受试个体口服施用本文公开的组合物。
在一些实施方案中进一步提供了通过给有需要的受试个体接种疫苗来控制人畜共患传染病的方法。该方法包括向受试个体口服施用组合物。该组合物包括层叠在基质上的有效量的至少一种生物活性剂，其中在有利于脱水生活的条件下在稳定剂中稳定所述至少一种生物活性剂；和交联剂。
本发明在一些实施方案中提供了通过给有需要的受试个体接种疫苗来控制人畜共患传染病的方法。该方法包括将组合物以适于饮用的悬浮液直接加入水源中。该组合物包括层叠在基质上的有效量的至少一种生物活性剂，其中在有利于脱水生活的条件下在稳定剂中稳定所述至少一种生物活性剂；和交联剂。
在一些实施方案中，受试个体为人畜共患传染病循环的储存宿主。在一些实施方案中，受试个体为人畜共患传染病的易感宿主。在一些实施方案中，受试个体为异体接种诊断携带者(xenodiagnostic carrier)。在某些实施方案中，受试个体为节肢动物或昆虫。在一些实施方案中，受试个体为哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物为包括小鼠、花栗鼠、松鼠、鼩鼱、田鼠、大鼠、浣熊、负鼠、臭鼬、兔子和鹿中的一种或多种的野生动物。在一些实施方案中，受试个体为鸟。在一些实施方案中，受试个体为鱼。在一些实施方案中，受试个体为驯养动物或伴生动物。在一些实施方案中，驯养动物包括狗、猫、牛和马中的一种或多种。
在研究了本文中的描述、附图和非限制性实施例之后，本发明的优点对于本领域普通技术人员会变得显而易见。
附图说明
图1为载有ospA的pET9c质粒的限制性消化图像。
图2为DNA碱基对梯状分子量标准品(ladder)的图像。
图3为对质粒载有的ospA在正向方向进行测序分析所得的结果的图像。
图4为对质粒载有的ospA在反向方向进行测序分析所得的结果的图像。
图5为对载有ospA(ospA-vectored)的大肠杆菌的OspA蛋白表达进行的蛋白质印迹分析图像。
图6为蛋白质分子量标记物标准品的图像。
图7为显示疫苗涂覆、交联和分层(layering)过程的图。
图8为显示使用鼓涂覆(drum-coating)处理和配制的当前操作实例的图。
图9显示作为储存时间的函数的、通过疫苗产生的CFU计数测定的本文公开的疫苗实施方案的保质期。
图10显示响应于疫苗施用的OspA抗体滴度负荷(load)，所述疫苗施用使用载有ospA的大肠杆菌。
图11显示与确立疫苗效能的研究相对比的本文公开的实施方案的效能。数据确立了等同于疫苗效能的血清保护性OspA抗体滴度的阈值水平。
序列表简要说明
SEQ ID NO:1为T7启动子引物序列。
SEQ ID NO:2为T7终止子引物序列。
SEQ ID NO:3为ospA基因参照序列的核酸序列。
具体实施方式
本文件中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。在研究了本文件中提供的信息之后，对本文件中描述的实施方案的修改和其他实施方案对于本领域的普通技术人员而言是显而易见的。本文件中提供的信息，特别是所描述的示例性实施方案的具体细节，主要是为了清楚理解本发明而提供，不应将其理解为是不必要的限制。为了防止出现冲突，以本文件中的包括定义在内的详细描述为准。
提供的每个实施例都被当作对本发明的解释，而不是对本发明的限制。实际上，对于本领域技术人员而言明显的是，在不脱离本发明的范围的情况下，可以对本发明的教导做出各种修改和变化。例如，作为一个实施方案的一部分进行说明或描述的特征可与另一个实施方案一起使用，以再得到一个实施方案。
虽然认为本文使用的术语对本领域普通技术人员而言是很好理解的，但是仍然在本文中给出了定义以便于解释本发明。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文所描述的方法、装置和材料类似或等同的任何方法、装置和材料均可用于本发明的实践或测试，但现在仍然对代表性的方法、装置和材料进行了描述。
根据长期存在的专利法惯例，当在本申请(包括权利要求)中使用时，术语“一种(a、an)”和“该(the)”指“一个或多个”。因此，例如，提及“一种细胞”时，其包括多个这样的细胞，等等。
本发明中所有提及的单数特征或限制应包括相应的复数特征或限制，反之亦然，除非另有说明或提及之处的上下文清楚地暗示了相反的情形。
本文使用的方法或工艺步骤的所有组合可以以任何顺序进行，除非另有说明或做出所提及的组合之处的上下文清楚地暗示了相反的情形。
本发明的方法和组合物(包括其组分)可包括或由下述组成或基本组成：本文所述的实施方案的基本要素和限制，以及本文所述的任何额外或任选的组分或限制或其他有用的要素或限制。
除非另有说明，在说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、性质(例如反应条件)等的所有数字都应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。因此，除非有相反说明，否则本说明书和权利要求书中所述的数值参数为近似值，该近似值可以根据本发明寻求获得的期望性质而变化。
当涉及质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的值或量时，如本文所用的术语“约”，在一些实施方案中意在涵盖与指定的量相比±20％的变化，在一些实施方案中该变化为±10％，在一些实施方案中该变化为±5％，在一些实施方案中该变化为±1％，在一些实施方案中该变化为±0.5％，在一些实施方案中该变化为±0.1％，因为这样的变化适于实施所述公开的方法。
如本文所用，范围可以表示为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。还应理解，本文公开了多个值，并且除了该值本身之外，每个值还在本文中被公开为“约”该特定值。例如，如果公开数值“10”，则还公开了“约10”。还应当理解，两个特定单元之间的每个单元也被公开了。例如，如果公开了10和15，则也公开了11、12、13和14。
本发明涉及一种组合物和使用该组合物向受试个体口服递送生物活性剂的方法。更具体地，本发明涉及包含基质和通过在基质上分层包封(layered encapsulation)而被稳定的有效量的至少一种生物活性剂的组合物，以及通过向受试个体施用该组合物来减少人畜共患传染病的方法。本发明还涉及制备该组合物的方法。
在本发明的一些实施方案中，提供了一种组合物。所述组合物包含基质、层叠在基质上的有效量的至少一种生物活性剂和交联剂。在一些实施方案中，在有利于脱水生活的条件下在稳定剂中稳定该至少一种生物活性剂。
术语“生物活性剂”是指具有医学或兽医学方面的治疗、预防或诊断效用的任何物质。在一些实施方案中，生物活性剂包括治疗剂。如本文所用，治疗剂是指当施用于患病个体时将治愈或至少在一定程度上缓解疾病或病症的一种或多种症状的生物活性剂。在一些实施方案中，生物活性剂包括预防剂。如本文所用，预防剂是指一种生物活性剂，当其施用于患病个体时预防疾病或病症发生，或者如果其在治疗剂之后施用，则预防或延迟疾病或病症复发。在一些实施方案中，生物活性剂是指引发免疫应答的抗原，或可以调节免疫系统的蛋白质，用以增强治疗功效潜力。在一些实施方案中，生物活性抗原剂的施用可引发预防性免疫应答以预防疾病感染和传播或引发治疗性免疫应答以消除已存在的疾病感染。
在某些实施方案中，组合物包含基质和涂覆或层叠在基质上的有效量的至少一种活性剂。如本文所用，术语“基质”是指疫苗组合物可施用于其上的固体支撑组合物，例如载体。基质的非限制性实例包括颗粒、可咀嚼物、珠粒例如微晶纤维素(MCC)。
在一些实施方案中，基质具有约100μm至约2cm的平均直径。在一些实施方案中，组合物可以具有约100μm(MCC)至约2cm(颗粒形式)的尺寸范围以适应目标动物物种的消耗。在一些实施方案中，稳定剂包括但不限于水胶体聚合物或增塑糖。在一些实施方案中，增塑糖包括蔗糖、海藻糖的非限制性实例。在一些实施方案中，水胶体聚合物的非限制性实例为藻酸钠。在一些实施方案中，交联剂为钙盐。交联剂的实例包括但不限于乳酸钙、氯化钙、硫酸钙、碳酸钙、乙酸钙或抗坏血酸钙。
此外，在本发明的一些实施方案中，基质的实例包括但不限于颗粒、可咀嚼物、珠粒和粉末。在一些实施方案中，珠粒包括微晶纤维素珠粒的非限制性实例。在一些实施方案中，基质包括植物基物质或土基物质。在一些实施方案中，土基物质包括但不限于土壤或水。在一些实施方案中，生物活性剂是被改造为表达一种或多种抗原的重组全细胞细菌。
如本文所用，“全细胞细菌”是指在保持细菌细胞结构完整性(即，全细胞结构完整性和抗原性)的条件下维持的细菌细胞，其在某些实施方案中作为用于稳定呈递抗原的生物活性载体。有利于这种全细胞结构完整性的条件将被定义为“稳定的”。在某些实施方案中，全细胞将保持稳定，不被分解成细胞碎片和/或其他生物材料和/或细胞器。在维持稳定的全细胞结构架构中，一些实施方案可涵盖被定义为活的全细胞细菌单位的“活性制剂”；其他实施方案可包括被定义为灭活的全细胞细菌单位的“无活性制剂”。
在一些实施方案中，全细胞细菌包括大肠杆菌的脱水生活制剂(anhydrobioticpreparations)，而在其它实施方案中，全细胞细菌包括但不限于乳杆菌，包括嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、发酵乳杆菌、加氏乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和唾液乳杆菌。在一些实施方案中，全细胞细菌为被改造成表达一种或多种抗原的重组细菌。在一些实施方案中，重组细菌被改造成表达用作莱姆病疫苗的布氏疏螺旋体的至少一种外表面蛋白(参见第8,821,893号美国专利，其通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，重组细菌被冻干/冷冻干燥。
在一些实施方案中，基质还包括但不限于包括植物和/或饲料材料(包括草、草本豆科植物、豆科树木，青贮饲料)或作物残余物(包括诸如玉米的谷粒或大豆秸秆)或其他土基物质(例如土壤、堆肥)或直接添加到水中。在某些实施方案中，基质是可食用的，并且适于与疫苗制剂形成组合物喂给动物。在一些实施方案中，基质可以包括干燥的颗粒或粗粒，例如通过压缩原始材料产生的颗粒，该原始材料可在咀嚼时破碎为颗粒材料；和/或可咀嚼颗粒，其具有柔软和柔韧的性质使得其在咀嚼时不容易破碎或分解为颗粒物质，但可容易地溶解；微晶纤维素珠粒或用于粉末制剂形式的疫苗的制备和应用的其它基质，该粉末制剂经鼻吸入给药或直接加入水中通过饮用口服给药；植物；食物来源，例如在野外可获得的食物来源；和/或另一种泥土物质、土壤或其它活性疫苗组合物可施用于其上然后进行干燥以达到稳定的物质，或水，活性疫苗组合物可施用于水以供饮用消耗。
在一些实施方案中，活性疫苗剂的非限制性实例包括作为抗原剂的生物载体的全细胞细菌。在一些实施方案中，对活性剂进行渗透预处理用于脱水生活和稳定化(stabilization)。如本文所用，术语“渗透预处理”是指在干燥至完全干燥前使用特定溶质以在物理上稳定和保护完整细菌中的膜和蛋白质。非限制性渗透预处理剂包括增塑剂，例如糖(包括蔗糖和/或海藻糖)，或羟基四氢嘧啶。如本文所用，术语“脱水生活”是指对干燥的生物耐受性的物理状态。生物干燥有助于在没有水的条件下维持生物活性组合物，从而提高保存期稳定性以延长疫苗效力。
在一些实施方案中，在稳定剂中稳定活性剂。非限制性稳定剂包括水胶体的使用。如本文所用，术语“水胶体”是指分散在水溶液中的亲水性聚合物胶体家族的任何物质。在一些实施方案中，水胶体作为具有约1nm至约1000nm的直径的小颗粒存在，并用于包封和稳定生物材料。本发明的水胶体可以包括但不限于琼脂、藻酸盐、角叉菜胶、壳聚糖、明胶和/或树胶。
合适的水胶体还包括一种或多种天然和合成聚合物，其在含水体系中形成胶体溶液。合适的水胶体包括聚乙烯吡咯烷酮；淀粉；多糖，例如藻酸、藻酸钠和藻酸钙；纤维素和纤维素衍生物，例如乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)和羧甲基纤维素(CMC)；聚乙二醇(PEG)；或其混合物。
在一些实施方案中，某些水胶体聚合物(例如藻酸钠)可以在钙盐的存在下交联。在诸如钙的二价阳离子的存在下的交联是指将水胶体聚合物(藻酸钠)的聚合键在结构上连接至钙以产生具有藻酸钙交联键的聚合物的能力；钙离子替代了藻酸盐聚合物中的钠离子。交联有利于稳定活性疫苗剂的包封。
在一些实施方案中，组合物还包括组合物的外表面上的包衣。在一些实施方案中，外表面上的包衣为虫胶包衣。在一些实施方案中，所述包衣为肠溶包衣。在一些实施方案中，一旦交联就顺序地逐层施加基质外表面上的包衣作为表面处理(top-dressing)，并且所述基质外表面上的包衣包括肠溶包衣。在一些实施方案中，基质的量为组合物的约85％w/w至约99％w/w。在一些实施方案中，稳定剂的量为组合物的约1％w/w至约15％w/w。在一些实施方案中，生物活性剂的有效量为致免疫有效量，其最小免疫剂量(MID)为约5×103CFU至约5×107CFU。在一些实施方案中，交联剂的量为组合物的约0.5％w/w至约7.5％w/w。此外，在一些实施方案中，包衣的量为组合物的约1.5％w/w至约22.5％w/w。
此外，不管根据本发明方法使用的具体的给药模式和时间如何，细菌(包括本文所述的基于细菌的组合物和抗原剂)通常以有效实现期望的反应(即，实现针对抗原剂的保护)的量给予。因此，术语“有效量”在本文中用于指足以产生可测量的生物反应(例如，针对伯氏疏螺旋体感染的免疫应答)的治疗组合物的量。从这个意义上说，在一些实施方案中，术语“治疗有效”与短语“致免疫有效”在本文中可互换使用，用以指表达本发明公开的至少一种或多种抗原剂的全细胞细菌的量，其足以在宿主中诱导针对强致病性(virulent)细菌的有效免疫应答。本发明的治疗组合物中活性成分(例如细菌)的实际剂量水平可以变化，以便施用有效地在特定受试个体和/或应用中实现期望的治疗反应的量的组合物。当然，对这种组合物中的细菌和其它组分的剂量水平和量的选择会取决于多种因素，包括细菌的活性、制剂、施用途径、与其它药物或治疗的组合、所治疗的病症的严重程度，以及所治疗的受试个体的身体状况和先前的病史。优选地，施用最小剂量，并且在不存在剂量限制性毒性的情况下将剂量递增至最低有效量。治疗有效剂量的确定和调整以及评估何时和如何进行这种调整是本领域普通技术人员已知的。如本文所用，例如，在一些实施方案中，至少一种抗原剂的治疗有效剂量为最小免疫剂量(MID)，以表达活性抗原的菌落形成细菌单位(CFU)计为约5×103CFU至约5x107CFU。
在一些实施方案中，本申请中公开的组合物还包含佐剂。如本文所用，术语“佐剂”或“佐剂化的”是指能够增强动物中疫苗诱导的免疫应答的任何物质。在一些实施方案中包含(embodying)全细胞细菌单位的组合物、分子工程抗原性融合蛋白或生物化学免疫调节剂作为天然佐剂。大肠杆菌细菌全细胞单位通过脂多糖(LPS)的呈递具有免疫原反应性；LPS为激活Toll样受体4(TLR4)的配体，其是对革兰氏阴性细菌感染的免疫监视和先天免疫系统的激活所必需的(Flanagan et al.,J.Endotoxin Res.6:481,1996)。OspA氨基末端的22个氨基酸解释了蛋白质(OspA脂蛋白)的脂化部分，并且作为能够诱导促炎细胞因子的天然免疫原性疏水信号肽(Erdile et al.,Infect.Immun.61:81,1993)存在。在一些实施方案中，OspA脂蛋白可以在近端与其他抗原性蛋白框内融合作为表达的分子佐剂融合蛋白构建体。当与大肠杆菌细菌全细胞单位混合时，使用霍乱毒素(CT)的制剂作为肠道粘膜免疫应答的有效生物化学免疫调节剂(Bowman and Clements,Infect.Immun.69:1528,2001)。
在本发明的一些实施方案中，提供了用于口服递送生物活性剂的组合物。所述组合物包含基质、涂覆或层叠在基质上的有效量的至少一种生物活性剂以及促进抗原剂在基质表面上稳定剂中的包封的交联剂。在一些实施方案中，在选自水胶体聚合物、增塑糖和海藻糖的稳定剂中稳定所述至少一种生物活性剂。在一些实施方案中，生物活性剂为抗原剂。
此外，在一些实施方案中，提供了制备用于口服递送生物活性剂的组合物的方法。该方法包括以下步骤：在稳定剂中稳定至少一种抗原剂；将经过稳定的至少一种抗原剂涂覆到基质上；施加交联剂；进行交联以促进抗原剂的凝胶化或包封；以及在环境温度下以及强制通风的条件下干燥。在一些实施方案中，温度在约20℃至约35℃的范围内。在一些实施方案中，借助风扇达到环境温度。在一些实施方案中，所述方法还包括在外表面上涂覆糖果釉层用作防潮层或调味引诱剂的步骤。在一些实施方案中，该方法还包括在外表面上涂覆虫胶层用作防潮层的步骤。
目前生成藻酸钙包封的生物材料的方法需要生成水凝胶或藻酸钙珠粒。通过将藻酸钠加压分配到一定体积的钙盐中生成包封生物材料的珠粒，该方法采用特定的包封设备(包封器，encapsulator)(Mazzitelli et al.,J.Biomat.Appl.23:123,2008)。可以收集由包封器产生的藻酸钙珠粒并干燥用于下游应用。珠粒形式本身并不有利于在限定的基质上均匀施用以实现靶向分布或给药，也不会使限定的基质上均匀施用以实现靶向分布或给药变得高效。Id.
用于口服施用的抗原的包封实例包括以下授权专利。例如，第5,352,448号美国专利描述了水凝胶的配制和产生，该水凝胶可以作为硬的透明珠粒负载用于口服施用的抗原。此外，第5,900,238号美国专利类似地描述了用于粘膜疫苗接种的包封抗原的水凝胶微珠的配制和产生。其他实例包括：WO2013/096883，其提供了在通过多价离子交联的聚合物中产生喷雾干燥的微胶囊化生物部分和化学品的方法。
本发明提供了制备用于口服递送生物活性抗原剂的组合物的方法。例如，该方法包括以下步骤：通过渗透处理稳定至少一种抗原剂，使用藻酸钠悬浮液作为用于进行分层施用的液体载体将至少一种抗原剂涂覆到基质上，通过再施加钙盐层进行交联，从而通过藻酸钙对抗原载体的包封促进分层凝胶化，以及在环境温度下和强制通风条件下风干，得到生物活性抗原剂的分层脱水生活制剂。在一些实施方案中，本发明的方法包括在抗原载体和/或基质的外表面上涂覆釉层以提供防潮层和/或调味引诱剂的步骤。此外，在一些实施方案中，本发明的方法包括在抗原载体和/或基质的外表面上涂覆虫胶层以提供防潮层的步骤。因此，采用更简化的顺序喷涂和包封的生物材料的分层施用提供了将经稳定的生物活性材料作为基质上的分层包衣施用的有效且商业上可行的方法。在基质上分层包封(encapsulated layering)提供了用于使生物活性剂靶向分布的载体方法。
在一些实施方案中，本发明涉及用于粘膜施用的抗原的稳定表达的组合物和方法，更具体地，涉及向诸如哺乳动物的受试个体口服施用。
在本发明的一些实施方案中，活性疫苗剂首先在约500mM至约625mM蔗糖和/或约500mM至约625mM羟基四氢嘧啶中进行渗透预处理。然后将预处理的活性剂与含有约500mM至约625mM蔗糖的约1.0％至约1.5％藻酸钠悬浮液基质混合，然后通过喷涂将其施加到基质的表面上。通过喷涂将浓度约200mM至约225mM的第二层钙盐施加到基质的表面上。在一些实施方案中，在施加第一层之后约1秒至约60秒，将第二层施加到基质的表面。如本发明中所用，钙盐为乳酸钙。在一些实施方案中，钙盐可以为氯化钙、硫酸钙、碳酸钙、乙酸钙或抗坏血酸钙。
如本文中所用，术语“虫胶”在一些实施方案中是指外部施用于涂覆有疫苗的基质的外部可食用釉、树脂和/或包衣。在一些实施方案中，虫胶包衣包含防潮层，例如在口服施用的疫苗的部署中，防潮层用于增强疫苗的保质期和稳定性。
本发明在一些实施方案中提供了通过对有需要的受试个体接种疫苗来控制人畜共患传染病的方法。该方法包括向受试个体口服施用本文公开的组合物。在一些实施方案中，本发明涉及一种口服施用利用抗原表达系统的基于生物制品的疫苗的方法，所述疫苗包含具有载体的细菌(vectored bacteria)，消耗其时在目标哺乳动物群体中引发免疫应答。
本发明还涉及稳定疫苗的活性生物制剂/组分的方法，使得抗原活性可以得以保持，并用剂量来衡量；该剂量保持对于免疫活性GALT(肠相关淋巴组织)或NALT(鼻咽相关淋巴组织)的吸收的抗原性；并且免疫应答产生对疫苗的反应，该反应在通过抗体滴度测定的血清反应性水平上是持续的、可测量的且是预防性或治疗性的。抗体滴度可作为预防活性化合物传递以压制目标人畜共患病的感染的发生。
关于本发明的使用方法，动物粘膜表面是许多感染原的主要进入部位。因此，粘膜免疫提供了抵抗感染原的初始防线。粘膜免疫应答通过阻碍病原体附着于粘膜上皮、中和病毒剂和细菌剂并提供通过吞噬作用去除病原体的手段而干扰感染过程。粘膜相关的免疫系统发挥作用以防止微生物穿透并感染动物的内部区域。由于广泛存在与粘膜免疫系统相关的免疫学性质，疫苗施用也有效靶向该区域以引发针对几种病原体的预防性免疫应答(Chen and Cerutti,Immunity33:479,2010；Fujkuyama et al.,Expert Rev Vaccines11:367,2012；Neutra and Kozlowski,Nature Rev.Immunol.6:148,2006；Ogra et al.,Clin.Microbiol.Rev.14:430,2001；Woodrow et al.,Annu.Rev.Biomed.Eng.14:17,2012)。
将抗原直接施加到粘膜表面会最有效地诱导局部免疫应答。然而，天然构象的抗原的位点特异性呈递在可用的施用载体和与抗原相关的毒性方面提出了挑战。因此，可以通过刺激粘膜相关淋巴组织(MALT，一种免疫活性粘膜组织的综合网络)来诱导局部免疫。在肠或肺的粘膜表面处的抗原暴露触发淋巴细胞向产生抗原反应性抗体的所有粘膜区域的复杂迁移。抗原暴露进一步诱导记忆淋巴细胞群，这有助于响应随后同一抗原的暴露而产生抗体。因此，MALT通过触发局部免疫应答而作为有效疫苗接种的靶点(Chen andCerutti,Immunity33:479,2010；Fujkuyama et al.,Expert Rev Vaccines 11:367,2012；Neutra and Kozlowski,Nature Rev.Immunol.6:148,2006；Ogra et al.,Clin.Microbiol.Rev.14:430,2001；Woodrow et al.,Annu.Rev.Biomed.Eng.14:17,2012)。
在免疫活性粘膜表面中，肠中的肠相关淋巴组织(GALT)的MALT为淋巴组织的最大堆积物。GALT含有功能性T淋巴细胞群和功能性B淋巴细胞群以及抗原呈递辅佐细胞。具体地，GALT的B淋巴细胞群包含致力于产生免疫球蛋白A(IgA)类抗体的重要细胞亚群。作为中和抗体，GALT局部获得IgA的能力提供了防止入侵袭病原体附着和穿透粘膜表面的上皮层的有效手段。这种形式的免疫应答不同于全身性淋巴组织的免疫应答，在全身性淋巴组织中通过常规的肌内(IM)或皮下(SubQ)免疫施用方法不能有效诱导IgA类抗体(Chen andCerutti,Immunity 33:479,2010；Fujkuyama et al.,Expert Rev Vaccines 11:367,2012；Neutra and Kozlowski,Nature Rev.Immunol.6:148,2006；Ogra et al.,Clin.Microbiol.Rev.14:430,2001；Woodrow et al.,Annu.Rev.Biomed.Eng.14:17,2012)。
GALT的上皮细胞层将粘膜下面的淋巴层与肠的内腔分开。散布在上皮层内的是具有抗原呈递功能的辅佐细胞。这样的辅佐细胞主动地对腔内抗原样品进行取样并将样品内化用于处理和呈递到相邻淋巴细胞。将抗原呈递和暴露于GALT启动抗原特异性B淋巴细胞和T淋巴细胞的克隆扩增。因此，致力于产生IgA的B淋巴母细胞迁移通过roesenteric淋巴结以在包括肠道、鼻咽和呼吸道、肺、口腔、眼部区域、乳腺和泌尿生殖道的所有粘膜部位中引发增强的特异性免疫应答。因此，通过口服疫苗接种对GALT进行免疫刺激可在各种粘膜表面预防传染病(Chen and Cerutti,Immunity33:479,2010；Fujkuyama et al.,ExpertRev Vaccines 11:367,2012；Neutra and Kozlowski,Nature Rev.Immunol.6:148,2006；Ogra et al.,Clin.Microbiol.Rev.14:430,2001；Woodrow et al.,Annu.Rev.Biomed.Eng.14:17,2012)。
根据本发明的实施方案，通过口服给药使用涂覆在可食用的递送基质上的、水胶体稳定/包封的全细胞载体为动物接种疫苗。
成功且有效的口服疫苗需要在其通过消化道时抗原具有稳定性。作为依赖于构象结构的功能蛋白，抗原的构象可以在消化道的消化过程下变性。已经开发了肠道药物递送系统以保护药物活性化合物通向肠。此外，水胶体可用于全细胞包封和/或维持细胞酶反应潜能。在本发明的一些实施方案中，使用水胶体作为稳定全细胞抗原以有效呈递至MALT的肠溶包衣。诸如藻酸盐的水胶体提供亲水性凝胶网络稳定基质，其保护包封的生物制剂有效通向目标粘膜组织，例如GALT。
在一些实施方案中，本发明提供了一种有效刺激针对所呈递的抗原的粘膜免疫应答的方法。具体地，在某些实施方案中，本发明涉及水胶体稳定的生物载体(例如全细胞细菌)作为用于表达天然构象的抗原的载体的用途。本发明还涉及将经稳定的生物载体与基质组合物复合(complexing)的方法，所述基质组合物有助于通过口服和/或鼻腔给药将抗原递送至粘膜相关淋巴组织。
在一些实施方案中，还提供了通过给有需要的受试个体接种疫苗来控制人畜共患传染病的方法。该方法包括向受试个体口服施用组合物。该组合物包括层叠在基质上的有效量的至少一种生物活性剂，以及交联剂，其中在有利于脱水生活的条件下在稳定剂中稳定所述至少一种生物活性剂。
本发明在一些实施方案中提供了通过给有需要的受试个体接种疫苗来控制人畜共患传染病的方法。该方法包括将组合物以适于饮用的悬浮液直接加入至水源中。该组合物包括层叠在基质上的有效量的至少一种生物活性剂，以及交联剂，其中在有利于脱水生活的条件下在稳定剂中稳定所述至少一种生物活性剂。
在一些实施方案中，本发明提供了用于减少媒介传播的人畜共患传染病和/或其它人畜共患传染病的口服疫苗组合物。如本文所用，术语“人畜共患的”或“人畜共患传染病”是指可以在物种之间传播的传染性疾病。在一些实施方案中，疾病传播媒介可促进传染病传播，疾病传播媒介包括但不限于昆虫(蚊子或其它)和/或节肢动物(蜱或其它)。在一些实施方案中，人畜共患疾病是由媒介传播的。
如本文所用，“媒介”是指可在人类之间或由动物向人类传播传染性疾病的活生物体。这些媒介中的许多是吸血昆虫，其在从受感染的宿主(人或动物)吸食血液期间摄入致病的微生物，并且在随后的血液吸食期间将导致病的微生物注射到新的宿主中。在一些实施方案中，媒介传播的人畜共患疾病为莱姆病。“媒介传播疾病”是指人群中由病原体和寄生虫引起的疾病。媒介传播的人畜共患传染病和其他类型的人畜共患传染病包括但不限于无形体病(Anaplasmosis)、巴贝虫病(Babesiosis)、艾里希体病(Ehrlichiosis)、洛基山斑疹热(Rocky Mountain Spotted Fever)、登革热(Dengue)或疟疾(Malaria)。
在本发明的一些实施方案中，提供了通过给有需要的受试个体接种疫苗来控制人畜共患传染病的方法。该方法包括向受试个体口服施用包含基质和涂覆或层叠在基质上的有效量的至少一种活性剂的组合物。在一些实施方案中，受试个体为人畜共患传染病循环的储存宿主。在一些实施方案中，受试个体为人畜共患传染病循环的易感宿主。在一些实施方案中，受试个体为一种异体接种诊断携带者。受试个体的非限制性实例包括节肢动物、昆虫、哺乳动物、鸟、鱼和/或驯养动物或伴生动物。在一些实施方案中，哺乳动物包括野生动物，包括小鼠、花栗鼠、松鼠、鼩鼱、田鼠、大鼠、浣熊、负鼠、臭鼬、兔子和鹿中的一种或多种。在一些实施方案中，受试个体为驯养动物或伴生动物。在一些实施方案中，驯养动物包括狗、猫、牛和马中的一种或多种。在一些实施方案中，受试个体为鸟。在一些实施方案中，受试个体为鱼。
如本文所使用的，术语“储存宿主”是指携带传染性疾病微生物或病原体但无症状表现的生物体。具体地，如本文所提及的，储存宿主通过携带可传播到其他储存宿主或随后的易感宿主的传染原而在人畜共患传染病的传播循环中起作用。在一些实施方案中，储存宿主可将一定量的感染原传播至例如饲养媒介，感染原可以传播至随后的储存宿主和/或随后的易感宿主。
如本文所用，术语“易感宿主”是指倾向于患病的、易受疾病攻击和/或易于接受疾病的个体生物体。具体地，如本文所提及的，易感宿主可接受由携带疾病的媒介载体传播的疾病。具体地，如本文所提及的，术语“异体接种诊断载体”可用于描述通过将可能的感染性组织暴露于未受感染的(naive)媒介，然后测定媒介是否存在(摄取)相同的感染原来证明是否存在具有传染病的微生物或病原体的诊断方法。
本发明通过本文提供的具体但非限制性的实施例进行进一步说明。此外，以下示例可以包括数据的汇编，该数据汇编代表在与本发明相关的开发和实验过程中在各个时间收集的数据。
提供本文公开的方法和结果以报告疫苗效能的分析结果。有效的疫苗被定义为基于指定的施用方案诱导持续的免疫应答的疫苗。免疫反应性取决于抗原向免疫系统的呈递。对于本公开，抗原呈递考虑了生物系统(维持的细菌全细胞载体)的效用，通过其施用后所述抗原在细胞表面上稳定表达以有效呈递给免疫系统。细菌载体系统进一步作为天然佐剂，用于增强疫苗诱导的免疫应答。使用以下测试措施来测定疫苗的有效性；下面的实施方案包括用于莱姆病的靶向候选储主的疫苗。测试涉及细菌菌株身份和纯度测定、基于限制性消化和测序的质粒序列测定以及蛋白质表达测定，以上测定是按照符合9CFR 113.27(b)的针对修饰的活生物产品的无菌性测试的标准操作步骤进行的。疫苗效能验证和测试按照符合VSM 800.202的操作步骤进行。
实施例1疫苗生物纯度和身份
本研究涉及用于确认大肠杆菌抗原载体细菌培养物的身份和纯度的方法。
在本研究中，为了测定疫苗的效价和效能所需的活培养物/活性培养物，向每瓶含有40mL流体巯基乙酸盐的10个瓶中分别接种来自OD600＝1.2培养物样品瓶的0.2mL培养物样品。将瓶在30-35℃温育14天。此外，向每瓶含有40mL胰蛋白胨大豆肉汤的10个瓶中分别接种来自样品瓶的0.2mL样品。将瓶在20-25℃温育14天。在14天的温育期结束时，所有20个瓶子均显示生长。在宏观检查时，在所有瓶中均未观察到外来物生长(extraneousgrowth)。
从每个瓶中取出0.2mL样品涂布在具有5％绵羊血的胰蛋白酶大豆琼脂上，并在37±2℃下温育24小时。在温育24小时后，每个样品瓶的菌落形态是均一的并与大肠杆菌的一致。显微镜检查显示了与大肠杆菌一致的均一的革兰氏阴性杆状菌(rod)。
使用96孔Biolog Microstation系统，按照微生物鉴定程序，证实微生物的身份为大肠杆菌。Biolog Microstation系统鉴定该生物体为大肠杆菌，似然度为80.4％。
实施例2疫苗抗原表达稳定性
以下研究进一步涉及确认质粒稳定性并从培养物中分离的方法，其中借助实施例1中概述的方法，该培养物被鉴定为大肠杆菌。
对于2个不同的样品瓶A和B，使用1％细菌蛋白胨制备10倍稀释系列。将0.1mL 10-7稀释液转移到含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上，并在37±2℃温育24小时。对于A和B样品板，使用分离的菌落接种含有10.0mL具有100μg/mL卡那霉素的LB肉汤的三个培养管，并在37±2℃以及连续、低水平搅动下温育16小时。然后将管以8000rpm(×4300g)离心3分钟以使细胞沉淀(pellet)。使用Qiagen Spin MiniPrep试剂盒从细胞培养物中分离质粒DNA。使用NanoVue分光光度计定量质粒DNA产率。选择具有最高质粒产率的样品，即质粒产率分别为53.5μg/mL和83.0μg/m的A1和B1，用于另外的分析。然后将分离的质粒用于测序和限制性消化分析以验证OspA基因成功转化至大肠杆菌中。
分离的质粒的限制性消化。使用表1所示的BamHI和NdeI消化分离的OspA质粒样品A1和B1(这些样品在37±2℃温育1小时)。
表1限制性消化稀释方案
| OspA质粒样品(A1或B1) | 10μL |
| NE缓冲液3.1 | 5μL |
| BamHI | 1μL |
| NdeI | 1μL |
| 去离子水 | 33μL |
按照表2所示稀释未消化的分离的OspA质粒样品A1和B1。
表2未消化的OspA稀释方案
| OspA质粒样品(A1或B1) | 10μL |
| 去离子水 | 40μL |
用9μL去离子水稀释一(1.0)μL的1kb的梯状分子量标准品(ladder)。用5μL去离子水稀释五(5.0)μL超螺旋DNA梯状分子量标准品。将每个样品取十(10.0)μL加入到2μL的6X上样染料中。将每种样品取十二(12)μL上样到1％琼脂糖凝胶+4μL溴化乙锭上，如表3所示。
表3 SDS PAGE泳道说明(key)
| 泳道 | 样品 |
| 1 | 1kb梯状分子量标准品 |
| 2 | SC梯状分子量标准品 |
| 3 | 未消化的A1 |
| 4 | 经消化的A1 |
| 5 | 未消化的B1 |
| 6 | 经消化的B1 |
将凝胶用0.5X TBE+24μL溴化乙锭在100V下运行90分钟。在透射照明器上用UV光分析凝胶。接受标准要求(1)OspA条带必须在1.0kb处与1kb梯状分子量标准品的条带对齐。质粒主链必须与略高于4kb条带的分子量梯状标准品对齐；(2)未消化的样品的条带必须略高于梯状分子量标准品的5kb条带；和(3)存在条带且尺寸合适(参见表4以及图1和图2)。结果令人满意。
表4消化后DNA片段的估算长度
| 估算片段尺寸 | |
| OspA | 1079bp |
| 质粒主链 | 4301bp |
| 未切割质粒 | 5380bp |
对质粒的T7区进行测序。用于表达质粒构建体的T7区域测序的引物包括(1)以下序列的T7启动子引物：TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO：1)和(2)以下序列的T7终止子引物：GCTAGTTATTGCTCAGCGG(SEQ ID NO：2)。分离的质粒和T7引物被送到艾奥瓦州进行正向和反向的Sanger法测序。使用在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/处在线找到的Blast软件，将从艾奥瓦州获得的实验序列(Sbjct)与在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ 1194357处找到的已知的OspA基因参考序列(Query)(SEQ ID NO：3)进行核苷酸Blast比对。结果表明，正向序列和反向序列分别具有100％(图3)和99％(图4)的同一性得分。
实施例3测定疫苗蛋白抗原表达的方法
通过用于测定表达的蛋白质产物OspA的蛋白质印迹分析验证质粒稳定性和表达。在扩增有ospA载体的大肠杆菌培养物之后，提取蛋白用于蛋白质印迹分析。将大肠杆菌样品接种到含有100μg/mL卡那霉素的10mL LB+肉汤中，并在37±2℃以及连续、低水平搅动下温育过夜。将样品以8000rpm(×4300g)离心3分钟以使细胞沉淀。然后弃去上清液。将沉淀再次悬浮于1mL冰冷的PBS缓冲液中。将样品在8000rpm离心3分钟以使细胞沉淀。然后弃去上清液。将沉淀再次悬浮于于1mL冰冷的PBS缓冲液中，并转移至干净的1.5mL微量离心管中。将样品以8000rpm(×4300g)离心3分钟以使细胞沉淀。然后弃去上清液。将沉淀再次悬浮于1mL冰冷的20mM tris-HCl溶液中，并在冰上静置30分钟作为细胞溶解步骤。将所得细胞溶解产物以10,000rpm(×6720g)离心10分钟。将含有可溶性蛋白质部分的上清液转移到干净的微量离心管中。将含有不溶性蛋白质部分的细胞沉淀再次悬浮于1mL冰冷的20mMtris-HCl溶液中。将可溶性蛋白质部分和不溶性蛋白质部分用于蛋白质印迹分析。
蛋白质印迹：提取蛋白质后，如表5所示制备样品。
表5蛋白质还原剂+缓冲液反应
| OspA样品A1、B1或PC | 6.5μL |
| 样品缓冲液 | 2.5μL |
| DTT | 1.0μL |
将样品在加热块上于70℃加热10分钟。将每种样品取十(10)μL上样到如表6所示的4-12％Bis-Tris凝胶上。
表6蛋白质印记泳道说明
| 泳道 | 样品 |
| 1 | MWM |
| 2 | PC |
| 3 | 样品A1 |
| 4 | 样品B1 |
将凝胶在Bio Rad凝胶系统上在1X Novex MES SDS运行缓冲液+1mL抗氧化剂中在220v下运行30分钟。将PVDF转移膜、滤纸和垫浸在1X NuPAGE转移缓冲液(75mL 20X NuPAGE转移缓冲液+1.5mL抗氧化剂+150mL甲醇+1273.5mL去离子水)中。用转移膜制备凝胶并在30V下运行约1小时。在室温下用甲醇活化OspA蛋白转移的PVDF膜2分钟。将膜分配到容器中的1X TBST(100mL TBS+900mL去离子水+500μL吐温20)+3％脱脂乳中并摇晃该膜1小时。弃去溶液，然后加入少量LA2.2.1杂交瘤OspA单克隆抗体(100μLOspA单克隆抗体+9.9mL 1XTBST)+1％脱脂乳，将膜在室温下摇晃1小时。然后将膜用1X TBST洗涤三次。在每次洗涤时将膜摇晃5分钟。加入1X TBST+1％脱脂乳中的二抗(山羊抗小鼠IgG AP)(稀释度1:1000)，并在室温与膜一起摇晃30分钟。将膜再次用1X TBST洗涤三次。在每次洗涤时将膜摇晃5分钟。然后加入五(5.0)mL BCIP/NBT膜磷酸酶底物。使该溶液显影该膜，并通过加入水停止反应。将膜在室温下干燥。接受标准要求条带必须在MWM上的紫色30398道尔顿条带处存在。结果表明，每个样品都在30398道尔顿处存在条带(参见图5和6)。结果令人满意。
OspA蛋白抗原的稳定质粒表达为阳性的大肠杆菌符合用作疫苗抗原的生物全细胞载体所必需的标准，并且可以涂覆在合适的基质上以施用于目标动物。
实施例4合适的疫苗载体基质材料的组成
在一些实施方案中，本发明的基质为颗粒型、挤出的和/或无营养价值或具有低营养价值。此外，所述基质可以包括磨碎的玉米、麦麸、甘蔗糖蜜、碳酸钙、动物脂肪(例如用丁基羟基茴香醚(BHA)保存的猪脂肪)、去壳大豆粉、磨碎的燕麦、盐、脱水苜蓿粉、全麦、磨碎的大豆皮、鱼粉、干甜菜浆、磷酸二钙、小麦胚芽、玉米面筋粉和大豆油。在某些实施方案中，本发明的组合物包括挤出的颗粒；在一些实施方案中，挤出的颗粒具有高的颗粒耐久性指数(PDI>90)，并且可以是例如球形或圆柱形。所述颗粒基质的高耐久性和球状形状使颗粒在用高效的商业转鼓涂覆方法涂覆疫苗时保持其完整性和形状。
实施例5疫苗稳定化和包衣基质的组成
在一些实施方案中，为了使疫苗适应本发明中所用的涂覆工艺，全细胞细菌生物质首先在标准发酵方法下扩大至落入固定相的细胞密度。支持全细胞细菌生物质生长的培养条件遵循Studier(2005)提出的条件，用于具有pET9c质粒表达载体的培养物生长。简言之，在Kan+选择固体培养基上培养有ospA载体的BL21(DE3)大肠杆菌的单菌落分离物。将分离物在3mL的TBY+Kan液体选择培养基中单独生长过夜。然后将液体培养物以1:1000的比例传代到TBY+Kan诱导培养基中，以诱导T7启动子驱动的ospA基因表达。在一些实施方案中，本发明的生物质经历中空纤维过滤以减少液体介质从而产生湿细胞糊状物(wet-cellpaste，WCP)。液体介质的减少包括使用PBS缓冲液将WCP洗涤成悬浮液。为了维持全细胞抗原载体作为指示最小免疫剂量(MID)的度量标准，将生物质稳定化。
如本文所用，PBS是指不含钙和/或镁的二价阳离子的磷酸盐缓冲盐水。
如本文所用，用于本发明的方法的稳定化基质是指完全溶解在PBS中的最终浓度为500mM至625mM的蔗糖的溶液。稳定化基质用作(1)用于生物组合物的冷冻保存的冷冻稳定基质，和/或用作(2)基质溶液，以在下游包封处理和脱水生活的干燥条件下渗透稳定(osmotically stabilize)全细胞细菌细胞。在一些实施方案中，使用最终浓度为100mM的海藻糖作为稳定化基质中使用的糖。
在一些实施方案中，通过在4℃下将1:1的生物质-PBS悬浮液与1mM-1.25mM的稳定化基质的浓溶液缓慢混合来确保稳定化过程，产生最终浓度为500mM-625mM的蔗糖的PBS溶液。该实施方案产生经过渗透稳定(osmotically stabilized)的液体疫苗组分。液体疫苗组分可以立即用作施用于合适的基质材料的组合物，或者在可以进行涂覆之前冷冻至-80℃。
在一些实施方案中，藻酸钠用作在脱水生活的条件下稳定活细胞的包封平台。在某些实施方案中，按照诸如“Standard Guide for Immobilization or Encapsulation ofLiving Cells or Tissue in Alginate Gels(用于藻酸盐凝胶中活细胞或组织的固定化或包封的标准指南)”(ASTM，Designation F2315-10,2010，由FMC Biopolymer提供的参考文献)的参考文献中描述的方法和根据Smidsrod和Skjak-Braek概述的方法(Trends.Biotechnol.,8:71,1990)制备藻酸钠混合物。
给出了表示交联反应的线性化学方程的实例：2藻酸钠+CaCl2→藻酸钙+2NaCl。在一些实施方案中，水胶体聚合物作为肠溶聚合物。在一些实施方案中，本发明的组合物的一些或所有组分的聚合物稳定化可以保护组分免受胃的消化pH的破坏，从而保存组分用于在肠中靶向释放。例如，在某些实施方案中，口服施用的生物疫苗组合物包含一种或多种聚合物稳定化(polymerically stabilized)的成分/组分。在一些实施方案中，本发明的组合物包含与钙交联的藻酸钠。
在一些实施方案中，在500mM-625mM蔗糖的蒸馏水/去离子水溶液中制备藻酸钠水性悬浮液，例如1％至4％的悬浮液。将悬浮液在室温下搅拌混合约6小时或直到完全溶解，得到藻酸钠-蔗糖糖浆的悬浮液。然后将该渗透稳定的液体疫苗组分在室温下与藻酸盐溶液轻轻混合。然后将液体疫苗-藻酸钠混合物施用到球状动物食品颗粒上。随后用100mM-225mM乳酸钙的喷雾混合物(高达7％的溶液，作为具有增强的味道的交联多价离子的来源；也可以使用5％至7％的氯化钙溶液)作为交联剂涂覆半干燥疫苗-藻酸钠包衣，以促进在颗粒基质上产生藻酸钙微胶囊化的细菌细胞层，如图7中的示意图所示。藻酸钙交联/包封保持了基于细菌的疫苗抗原的生存力和免疫原性完整性。
实施例6将经稳定的疫苗作为表面处理喷涂于基质组合物上的方法
喷雾干燥是用于生物材料的稳定干燥和保质期延长的通常做法。现有技术包括将生物材料喷雾干燥技术应用于下游收集和利用。通过包封过程增强了生物稳定性，因此所述生物材料与水胶体聚合物组合，然后与交联化合物混合。然后收集喷雾干燥的包封的生物材料以进行使用。本发明介绍了将生物材料与水胶体或其他包封组合物的组合物喷涂到基质材料上的应用。基质材料用作固体支撑载体，在该固体支撑载体上喷涂生物材料，随后将(1)交联剂喷涂于其上以促进包封，以及将(2)防潮釉或虫胶、调味剂或香味诱饵引诱剂喷涂于其上。然后可以对经涂覆的颗粒进行温和的干燥过程，从而可以干燥涂覆的材料。
在转鼓涂覆过程中，球状的基质材料或“干净的”颗粒基质有利于“流体”翻滚过程。将颗粒基质以给定的速率进料到涂覆转鼓中以在被喷涂时有效地产生适当的剂量范围。将颗粒在转鼓内轻轻地、均匀地滚动/翻滚，同时用蔗糖稳定的细菌/藻酸盐包封的细菌进行喷涂。严格控制喷涂(可以静电输送)并自动与翻滚持续时间相关联以确保均匀的包衣覆盖和适当的剂量，该剂量等于以每个颗粒的菌落形成单位(CFU)测量的指定的MID。二次喷涂促进与钙进行的交联反应。糖果釉和/或药用虫胶与引诱剂/调味添加剂组合而成的最终外部密封剂的任选的第三包衣有利于自由流动颗粒的处理、储存和分配；调味添加剂为莱姆病的目标动物储存宿主提供可口的引诱剂。在翻滚时进行干燥，或通过将产品铺展在高表面积干燥台上进行干燥。该方法在连续批量操作下具有高产量。
在一些实施方案中，考虑使用离心分批涂布工艺将生物材料与水胶体或其它包封组合物的组合物以及随后的交联剂作为涂覆基质施用于颗粒表面上。如图8所示并且如在本发明中使用，将离心涂覆设备用于高效涂覆基质颗粒(本文中为颗粒)材料的高产量商业操作。装入大量颗粒(101)(配料斗，106)以进入涂覆转鼓(107)，在标准机动系统(108)驱动下，在涂覆转鼓内于恒定转速下拌入并搅拌颗粒。将生物材料与藻酸钠水胶体稳定化基质(试剂A，102)(或其它包封组合物)的组合物通过机载电动机驱动的混合器(110-111)保持在容器(109)中并保持在悬浮液中。类似地，乳酸钙交联剂(试剂B，103)和防潮剂也放在容器(113)中。通过蠕动泵送过程(112,114)连续地添加两种试剂(115)并通过雾化过程(104)涂覆到拌入的颗粒上，通过分配至相对于拌入基质的旋转位于中心的、单独的、机动(117)旋转离心盘(116)促进所述雾化过程，由此以指定的MID均匀地涂覆颗粒(105)。
实施例7证明疫苗稳定性的方法
本文提出的实施方案的有效保质期必须与配送计划和活动相适应。稳定化疫苗涂覆的颗粒是用于口服的不溶于水的制品，其在肠内稳定以将疫苗有效地施用于GALT。对干燥的、疫苗涂覆的颗粒进行稳定性/保质期分析。简言之，将每个单独的疫苗颗粒测试制品在4mL体积的pH7.4的55mM柠檬酸钠HEPES缓冲盐水溶液中再水合。将其在搅拌下于35℃温育1小时。将含有释放的/解封的活的有OspA载体的全细胞大肠杆菌的100μL颗粒上清液涂覆在TB+Kan琼脂平板上并培养过夜以评估菌落生长。将得到的菌落换算为近似的CFU/mL，其代表再水合时每个疫苗涂覆的颗粒释放的菌落；将所得CFU计数作为疫苗稳定性和随时间衰减(保存期限)的替代标志物进行评价。在疫苗涂覆的颗粒生产之后每周执行这个步骤，时间长达10周。如图9所示的结果表明在8周的测定期内活性疫苗组分(大肠杆菌抗原载体)保持稳定和且是存活的，衰减系数为2。
实施例8证明疫苗效能的方法
疫苗效能是基于施用抗原后在动物中诱导血清反应性的能力确定的。使用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)测定的针对抗原或免疫原产生的抗体滴度是疫苗效能的替代标志物。如本文所用，间接ELISA方法的使用适合于检测针对OspA的血清抗体。实施测定，其中将纯化的OspA靶蛋白/捕获抗原蛋白包被在固体支撑物上。然后使OspA特异性单克隆抗体(阳性对照，MAb LA2.2)或OspA血清抗体(测试物)形式的一抗结合靶抗原。然后加入对一抗具有特异性的二抗缀合物，对该反应进行显色以指示血清OspA特异性应答抗体的相对水平。该过程使用平底孔。然后将纯化的蛋白质在包被缓冲液(一个96孔板使用10mL涂覆缓冲液)中稀释至0.5-2μg/mL的最终浓度，并且以100μL体积分配至每个孔中(使用8通道移液器)。将板覆盖并在无振荡的条件下于室温温育1小时或在4℃过夜(理想地)。将溶液弃去并在纸巾上干燥。向每个孔中加入300μL封闭缓冲液(PBST+1％BSA)。再次覆盖该板并在37℃(无振荡)温育1小时。将板用300μL 1×PBST洗涤每孔3次。向每个孔中加入100μL封闭/样品稀释液中的稀释的血清样品(1:100,1:500)；对于对照孔，加入MAb标准曲线(500、250、125、62.5、31.25ng/mL)。覆盖板并在室温温育1小时。将溶液弃去，并再次在纸巾上干燥。将板的每个孔用300μl 1×PBST(用于ELISA)洗涤4次。每孔中分配100μL(使用8通道吸液器)在封闭/样品稀释液中的、最终浓度为0.3μg/mL的稀释Bt-MAb纯化蛋白(一个96孔板使用10mL包被缓冲液)。将板覆盖并在室温温育1小时，之后弃去溶液，并将板在纸巾上干燥。每孔用300μl 1×PBST(用于ELISA)洗涤4次。将中性抗生物素蛋白缀合的HRP在封闭/样品稀释液中以1:1000的比例稀释，并以100μL的体积加入每个孔中。将板覆盖并在室温温育30分钟，之后弃去溶液，并在纸巾上干燥板。将板的每个孔用300μl 1×PBST(用于ELISA)洗涤4次。向每个孔中加入100μl SureBlue(KPL)基质(阳性样品将变为蓝色)。将板覆盖并在室温下温育30分钟至1小时。在加入100μL终止溶液(KPL)后，在650nm处读取蓝色吸光度，在450nm处读取黄色吸光度。
如本文所公开的，通过评估等同于通过ELISA测定的OD450值的OspA特异性血清抗体滴度来考虑疫苗效能或血清保护。如在Richer et al.,Clin.Vaccine Immunol.18:1809,2011中所提出的并且也在本文中公开(如US 8,821,893中所提及的，该文献通过引用整体并入本文)的关于核心疫苗技术的早期优化研究，旨在定义通过合格的ELISA方法测量的、小鼠中响应于口服疫苗给药的血清反应性。疫苗“单位”表示剂量，并且等于约log5x105CFU。每周向小鼠施用相当于0、6、12和30单位的多种剂量(第0、14、28和42天)，持续长达6周。如图10所示，血清反应峰在约等于1.5的OD450血清抗体滴度附近出现。对于商业应用，认为使用最小数目的剂量以产生最有效的血清反应是有意义的，从而定义MID。根据图10中显示的结果，对于本发明公开的疫苗技术应用的商业演变，考虑使用总共多达6剂的周剂量；数据证明在以6单位/周的剂量施用疫苗约21天后获得约等于0.6的OD450血清抗体滴度。
当对多个小鼠物种口服施用时，实验证据进一步证明了核心疫苗技术的效能。研究总结概述于表7中。
表7疫苗效能总结
| 研究# | 1 | 2 | 3 | 4 |
| #小鼠 | 4 | 68 | 6 | 6 |
| 诱饵形式 | RTV | RTV | USB疫苗 | USB对照 |
| 给药 | 每周 | 每天 | 每周 | 每周 |
| 剂量 | 1剂/周 | 自由采食 | 1剂/周 | 1剂/周 |
| 持续时间 | 4周 | 1年 | 3周 | 3周 |
| 测定 | 每周 | 每周 | 第4周 | 第4周 |
| 攻击 | 是，实验物 | 是，野生型 | 不适用 | 不适用 |
| 反应 | 中和 | 中和 | 效能 | 不适用 |
研究1是疏螺旋体(Borrelia)攻击的实验室研究，其按照Richer et al.,Clin.Vaccine Immunol.18:1809,2011中所述进行，并且也在本文中公开，如US 8,821,893B2中所提及的。在研究中将总共4只远交的白足小鼠(Peromyscus leucopus)作为受试动物(作为代表性的野生的、储存宿主靶向动物)用于疫苗施用。按照Richer et al.,2011.中所述生成疫苗(储存宿主靶向疫苗，RTV)。按照每周一剂的剂量每周施用疫苗，施用时间共4周。如Richer et al.,2011.中所述，在最后一次给药后2周进行疏螺旋体攻击，以评估疫苗中和疏螺旋体感染的效能。简而言之，将6-8个伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)感染的蜱幼虫置于受试动物头的后部，并使其保持3天直到吸食血液充血时自然落下。然后收获小鼠组织(心脏和膀胱)和血清。通过在BSK-H培养基中于34℃下培养长达6周测定组织的疏螺旋体感染，每周通过暗视野显微镜检查培养物。无疏螺旋体培养物(从分离的小鼠组织中培养了0个活的螺旋体)表明通过疫苗施用感染被中和以及产生的OspA抗体滴度负载量。通过ELISA在收获的血清样品中测量中和OspA特异性全身IgG反应滴度。对于商业应用，该研究定义了诱导保护性免疫应答所需的MID(图11，研究1)。
研究2是将研究1平移到基于R&D的预期5年的野外试验。按照Richer et al.,J.Infect.Dis.209:1972,2014中所述开发核心疫苗技术(RTV)。作为图11中所示的研究数据的一部分，研究2代表疫苗接种活动的结果，在该疫苗接种活动中，每天施用疫苗，并且每周监测和测定动物对OspA抗原的血清反应性。来自68个经评估的小鼠的结果证明，使用疫苗核心技术的实验室优化的MID对白足小鼠口服接种疫苗，使得通过ELISA测量的血清抗体滴度有效地中和疏螺旋体(自然挑战模型)的蜱幼虫感染流行。从该研究中得到的等于0.6的平均OD450 OspA特异性血清抗体滴度表示所施用的MID所需的保护的足够相关性。该研究还得出以下结论：在5年活动期间在野外施用疫苗致使幼虫感染患病率减少高达76％。
研究3是对商业疫苗进行的实验室研究，商业疫苗的配方是本发明公开的主题(USB Vaccine)。使用C3H近交系小鼠。使用小鼠诱饵颗粒作为基质，该基质上涂覆有MID为5×105CFU的稳定化疫苗。在总共三周的给药时间内每只小鼠每周接受一次给药；在研究的第4周结束时通过ELISA测定小鼠的血清反应性。将结果与未接种疫苗的对照(USB对照，研究4)进行比较。与那些施用非疫苗涂覆的颗粒的动物相比，在仅3次给药后，从接种疫苗的动物获得的结果显示在所有6只测量的小鼠中均有血清反应(图11，研究3和4)。
图11还提供了建立针对疏螺旋体的保护的相关性所需的最小OD450OspA血清抗体滴度等同值(equivalents)的综合概要。已经通过等同于OD450≥0.6的吸光度的小鼠血清OspA特异性抗体滴度来定义效能值。当所有实验室数据和野外数据归一化为血清反应性的OD450等同值时，所有数据进行集体校准。
通过引用并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，并入程度如同明确地且单独地指出通过引用并入每个单独的出版物、专利或专利申请。
应理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以改变本发明的各种细节。此外，以上描述仅仅是为了说明的目的，而不是为了限制的目的。
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T7启动子引物序列
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<212> DNA
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<223> 伯氏疏螺旋体B31质粒 lp54，完整序列
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Claims (39)
1.组合物，其包含：
基质；
层叠在所述基质上的有效量的至少一种生物活性剂，其中在有利于脱水生活的条件下在稳定剂中稳定所述至少一种生物活性剂；和
交联剂。
2.组合物，其中所述组合物通过以下步骤制备：
在稳定剂中稳定至少一种生物活性剂；
将经过稳定的所述至少一种生物活性剂施加到基质的表面；通过向所述基质施加交联剂交联所述经过稳定的至少一种生物活性剂；以及
在约20℃至约35℃的环境温度下以及强制通风的条件下干燥。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其还包含在所述组合物的外表面上的包衣。
4.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述基质的平均直径为约100μm至约2cm。
5.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述稳定剂包括水胶体聚合物或增塑糖。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述增塑糖包括蔗糖或海藻糖。
7.根据权利要求5所述的组合物，其中所述水胶体聚合物为藻酸钠。
8.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述交联剂为选自乳酸钙、氯化钙、硫酸钙、碳酸钙、乙酸钙或抗坏血酸钙的钙盐。
9.根据权利要求3所述的组合物，其中所述外表面上的包衣为虫胶包衣。
10.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述基质选自颗粒、可咀嚼物、珠粒和粉末。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述珠粒为微晶纤维素珠粒。
12.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述基质包括植物基物质或土基物质，其中所述土基物质包括土壤或水。
13.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述生物活性剂为被改造成表达一种或多种抗原的重组全细胞细菌。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述全细胞细菌包括选自嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、短乳杆菌(L.brevis)、干酪乳杆菌(L.casei)、卷曲乳杆菌(L.crispatus)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、加氏乳杆菌(L.gasseri)、植物乳杆菌(L.plantarum)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnzosus)和唾液乳杆菌(L.salivarius)的乳杆菌(lactobacillus)。
15.根据权利要求13所述的组合物，其中所述一种或多种抗原是一种或多种伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)抗原。
16.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述基质的量为所述组合物的约85％w/w至约99％w/w。
17.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述有效量是最小免疫剂量(MID)为约5×103CFU至约5×107CFU的致免疫有效量。
18.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述稳定剂的量为所述组合物的约1％w/w至约15％w/w。
19.根据权利要求3所述的组合物，其中所述包衣为肠溶包衣。
20.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述交联剂的量为所述组合物的约0.5％w/w至约7.5％w/w。
21.根据权利要求3所述的组合物，其中所述包衣的量为所述组合物的约1.5％w/w至约22.5％w/w。
22.用于口服递送免疫原性剂的组合物，其包含：
基质，
涂覆或层叠在基质上的有效量的至少一种抗原剂，其中在选自水胶体聚合物、增塑糖和海藻糖的稳定剂中稳定所述至少一种抗原剂；和
交联剂，其促进抗原剂在所述基质表面上稳定剂中的包封。
23.制备用于口服递送抗原剂的组合物的方法，其包括以下步骤：
在稳定剂中稳定至少一种抗原剂；
将经过稳定的至少一种抗原剂涂覆到基质上；
施加交联剂；
交联以促进抗原剂的凝胶化或包封；以及
在约20℃至约35℃的环境温度下以及强制通风的条件下干燥。
24.根据权利要求23所述的方法，其还包括在外表面上涂覆糖果釉层用作防潮层或调味引诱剂的步骤。
25.根据权利要求23所述的方法，其还包括在外表面上涂覆虫胶层用作防潮层的步骤。
26.根据权利要求23所述的方法，其中借助风扇达到所述环境温度。
27.通过给有需要的受试个体接种疫苗来控制人畜共患传染病的方法，包括：
向受试个体口服施用权利要求1或2所述的组合物。
28.通过给有需要的受试个体接种疫苗来控制人畜共患传染病的方法，其包括向所述受试个体口服施用组合物，所述组合物包含：
层叠在基质上的有效量的至少一种生物活性剂，其中在有利于脱水生活的条件下在稳定剂中稳定所述至少一种生物活性剂；和
交联剂。
29.通过给有需要的受试个体接种疫苗来控制人畜共患传染病的方法，其包括将组合物以适于饮用的悬浮液直接加入至水源中，所述组合物包含：
层叠在基质上的有效量的至少一种生物活性剂，其中在有利于脱水生活的条件下在稳定剂中稳定所述至少一种生物活性剂；和
交联剂。
30.根据权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述受试个体为所述人畜共患传染病循环的储存宿主。
31.根据权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述受试个体为所述人畜共患传染病的易感宿主。
32.根据权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述受试个体为异体接种诊断携带者。
33.根据权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述受试个体为节肢动物或昆虫。
34.根据权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述受试个体为哺乳动物。
35.根据权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物为包括小鼠、花栗鼠、松鼠、鼩鼱、田鼠、大鼠、浣熊、负鼠、臭鼬、兔子和鹿中的一种或多种的野生动物。
36.根据权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述受试个体为鸟。
37.根据权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述受试个体为鱼。
38.根据权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述受试个体为驯养动物或伴生动物。
39.根据权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述驯养动物包括狗、猫、牛和马中的一种或多种。
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