CN107192594A - 一种蜕膜和绒毛配对组织芯片、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种蜕膜和绒毛配对组织芯片、制备方法及其应用。本发明将正常妊娠或病理妊娠患者的蜕膜和绒毛标本设置在组织芯片点样孔中,制成成组织芯片,使源自同一病例标本的蜕膜和绒毛组织形成配对,实现生理结构上的母‑胎界面在组织芯片上的功能呈现。其优点表现在:1)高通量,一次即获大量信息,成百上千倍地提高效率;2)并行化,可比性强、准确性高;3)实验误差小,实验条件保持一致;4)便于设置各种实验对照,且大量缩减研究费用。本发明可用于病理妊娠病因筛查及分子分型、新型标志物筛选与验证、个体化治疗患者筛选以及疗效和预后判断等,对于正常妊娠维持机制和病理妊娠发病机制的研究具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体地说,是一种蜕膜和绒毛配对组织芯片、制备方法及其应用。
背景技术
生物芯片是指包被在硅片、尼龙膜等固相支持物上的高密度组织、细胞、蛋白质、核酸、糖类以及其他生物组分的高通量微阵列。利用高通量生物芯片,通过特异性分子杂交及染色技术,对受检样本进行检测,可准确、快速获取大量的分子检测信息。目前已广泛应用于生命科学研究、临床医学分子诊断、以及生物抗体靶向药物筛查和验证等领域。组织芯片技术可将成百上千不同个体、不同来源的临床组织标本根据研究的目的,按预先设计的顺序集成在一张固相载体上进行分析。研究者可在相同的条件下对大量正常或疾病,以及疾病发展不同阶段的病理生理状态下的组织样本中的某一个或多个特定的基因、蛋白质或与其相关的表达产物进行平行分析研究。组织芯片的制作有手工制作和机械制作两种,其基本流程包括:建立高质量的组织样本库、设计并拟定组织芯片、核对组织相关疾病的病理诊断、组织定位、阵列蜡块的制作、组织芯片切片等。在组织芯片制作过程中,受体蜡块的石蜡质量对于构建一个完整的组织芯片具有极其重要作用。构建熔点、硬度和柔韧性等物理特性能达到最佳状态的受体石蜡是制备优质组织芯片的必要条件和基础。组织芯片受体蜡块的软硬度应当与供体组织芯相似,现有技术受体蜡块的软硬度是通过在石蜡溶液中加入蜂蜡来调节硬度,本发明在制备蜕膜组织芯的过程中,加入蜂蜡后仍然存在裂痕现象,组织芯染色后仍有掉片情况。因此针对不同组织芯的特点,提供与组织芯匹配的受体蜡块,提高组织芯与受体蜡块的相容性,避免组织芯片制作过程中掉片,提高组织芯片利用效率,是高质量组织芯片的制备基础。
正常妊娠是一个复杂的生理过程,胎儿虽携有遗传自父系的HLA抗原,但却并未引发母体产生针对胎儿这种特殊半同种“天然移植物”的排斥。妊娠期母-胎间存在着复杂的分子对话机制,以维持胎儿胎盘正常发育。妊娠早期胎儿绒毛外滋养细胞(EVT)侵入蜕膜组织,与母体蜕膜免疫细胞(DIC)及蜕膜基质细胞(DSC)直接接触,形成精细调控的母-胎界面。母-胎界面主要由3种细胞构成:胚胎来源的滋养细胞(trophoblast,Tro),母体来源的蜕膜基质细胞(decidual stromal cell,DSC)和蜕膜免疫细胞(decicidual immune cell,DIC)。作为母-胎界面唯一携带有父系抗原的滋养细胞,其侵袭与迁移是胚泡着床、胎盘发育,并建立母-胎关系的关键步骤。蜕膜基质细胞除参与蜕膜营养供应之外,还分泌多种活性分子调节胚泡着床与胎盘发育,并作为免疫潜能细胞,参与抗原提呈和分泌细胞因子,发挥重要的免疫调节作用。蜕膜免疫细胞是母-胎免疫耐受的基础,通过表达特殊的活化标记和分泌大量的细胞因子,在母-胎界面局部发挥着不同于外周的免疫调节作用。正常生理妊娠时母-胎界面呈现Th2型免疫优势和调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)扩增现象,一旦这种耐受状态被打破,Th1型免疫反应占优势,将导致妊娠失败或妊娠并发症如复发性流产、子痫前期等。对母-胎界面形成的深入研究是揭示正常妊娠维持机制和病理妊娠发病机制的重要途径和手段,因此针对蜕膜和绒毛的特点,提供一种蜕膜和绒毛配对组织芯片及其制备方法,对母-胎界面形成、病理妊娠病因筛查、新型标志物筛选与验证、个体化治疗患者筛选以及疗效和预后判断具有重要意义,而现有技术中尚未发现利用蜕膜和绒毛组织制备组织芯片的技术及应用的报道。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足,提供一种蜕膜和绒毛配对组织芯片。
本发明的第二个目的是针对现有技术中的不足,提供如上所述蜕膜和绒毛配对组织芯片的制备方法。
本发明的第三个目的是针对现有技术中的不足,提供如上所述蜕膜和绒毛配对组织芯片的用途。
为实现上述第一个目的,本发明采取的技术方案是:
一种蜕膜和绒毛配对组织芯片,包括固相载体;以及位于所述固相载体上的石蜡切片;所述石蜡切片的厚度为1-10微米,所述石蜡切片上设有4-1000个点样孔,将正常妊娠或病理妊娠患者的蜕膜和绒毛标本设置在组织芯片点样孔中,使源自同一病例标本的蜕膜和绒毛组织形成配对,实现生理结构上的母-胎界面在组织芯片上的功能呈现。
作为本发明一种优选技术方案,所述源自同一病例标本的蜕膜和绒毛组织分别固定在相邻的两个点样孔内;所述病理妊娠为妊娠时限异常、异位妊娠、妊娠特有疾病、妊娠晚期出血或其它妊娠性疾病,所述妊娠时限异常包括流产、早产和过期妊娠,所述妊娠特有疾病包括妊娠高血压疾病、妊娠剧吐,所述妊娠晚期出血包括前置胎盘和胎盘早剥,所述其它妊娠性疾病包括羊水量异常、胎儿窘迫、胎膜早破、多胎妊娠和母儿血型不合。
作为本发明一种优选技术方案,所述每个组织芯片上设有来自2个以上不同病例标本的蜕膜或绒毛组织,对不同病例标本建立临床资料数据库,记录每个标本病例的年龄、BMI、流产次数、治疗方案、内分泌、自身抗体、血凝,免疫、染色体筛查或遗传性易栓症筛查的资料参数;所述点样孔呈等距排列在石蜡切片上,点样孔的直径为2毫米,每个点样孔之间的间距为0.2-4毫米。
作为本发明一种优选技术方案,所述固相载体为载玻片和塑料基片。
作为本发明一种优选技术方案,所述石蜡切片由莱卡石蜡96.5%、脱水山梨醇三硬脂酸酯3%、田箐胶0.5%制成。
为实现上述第二个目的,本发明采取的技术方案是:
如上任一所述蜕膜和绒毛配对组织芯片的制备方法,包括如下步骤:
(1)取空白受体蜡块,所述受体蜡块上设有4-1000个点样孔,所述点样孔呈等距排列在石蜡切片上,点样孔的直径为2毫米,每个点样孔之间的间距为0.2-4毫米;
(2)取蜕膜组织和绒毛组织,将蜕膜组织和绒毛组织分别推入受体蜡块的点样孔中,每个受体蜡块设有来自2个以上不同病例标本的蜕膜或绒毛组织;
(3)将步骤2中制备好的受体蜡块切成1-10微米的石蜡切片,将石蜡切片设置在固相载体上形成蜕膜和绒毛配对组织芯片。
作为本发明一种优选技术方案,所述相同病例标本的蜕膜和绒毛组织固定在相邻的两个点样孔内,每个受体蜡块上设有来自2个以上不同病例标本的蜕膜或绒毛组织。
作为本发明一种优选技术方案,所述制备方法为:
(1)建立临床数据库,采集术中留取的蜕膜和绒毛组织标本进行石蜡包埋,选取典型组织区域标记定位,作为供体蜡块;
(2)设计每张组织芯片包括4-1000个点样孔,点样孔呈等间距矩阵式排列在石蜡切片上,点样孔的直径为2毫米,每个点样孔之间的间距为0.2-4毫米;
(3)取莱卡石蜡96.5%、脱水山梨醇三硬脂酸酯3%、田箐胶0.5%,加热至65-75摄氏度混匀,倒入模具中冷却成型,脱模得到原始受体蜡块;
(4)按照步骤2的点阵设计在原始受体蜡块打孔,得到空白受体蜡块;
(5)将供体蜡块于45℃保温5分钟,在标记区域打孔采集蜕膜和绒毛组织芯;
(6)将采集到的蜕膜和绒毛组织芯插入到空白受体蜡块的点样孔内,源自相同病例标本的蜕膜和绒毛组织芯插入相邻的点样孔内,得到组织芯片蜡块;
(7)将组织芯片蜡块于60℃保温15min,冷却,修整,切成1-10微米的石蜡切片,将石蜡切片设置在固相载体上形成蜕膜和绒毛配对组织芯片。
作为本发明一种优选技术方案,在选取组织标本前,对不同病例标本建立临床资料数据库,记录每个标本病例的年龄、BMI、流产次数、治疗方案、内分泌、自身抗体、血凝,免疫、染色体筛查或遗传性易栓症筛查的资料参数。
为实现上述第三个目的,本发明采取的技术方案是:
如上任一所述蜕膜和绒毛配对组织芯片的用途,用于病理妊娠病因筛查及分子分型、新型标志物筛选与验证、个体化治疗患者筛选以及疗效和预后判断;所述病理妊娠为妊娠时限异常、异位妊娠、妊娠特有疾病、妊娠晚期出血或其它妊娠性疾病,所述妊娠时限异常包括流产、早产和过期妊娠,所述妊娠特有疾病包括妊娠高血压疾病、妊娠剧吐,所述妊娠晚期出血包括前置胎盘和胎盘早剥,所述其它妊娠性疾病包括羊水量异常、胎儿窘迫、胎膜早破、多胎妊娠和母儿血型不合。
如上任一所述蜕膜和绒毛配对组织芯片的用途,用于HE染色、免疫组织化学染色、原位杂交、荧光原位杂交、原位PCR、原位RT-PCR或寡核苷酸启动的原位DNA合成。
本发明还提供了一种用于蜕膜和绒毛配对组织芯片的受体蜡块,所述受体蜡块由莱卡石蜡96.5%、脱水山梨醇三硬脂酸酯3%、田箐胶0.5%制成。在组织芯片制作过程中,受体蜡块的石蜡质量对于构建一个完整的组织芯片具有极其重要,受体蜡块的性能影响后期组织芯片的使用效果。本发明提供的受体蜡块与蜕膜和绒毛组织的相容性好,受体蜡块在制备过程中不产生裂痕,组织芯与点样孔的固定效果好。HE染色、免疫组织化学染色后组织芯掉片数少,组织芯利用率高。
对母-胎界面形成的深入研究是揭示正常妊娠维持机制和病理妊娠发病机制的重要途径和手段,本发明取孕早期流产妇女的蜕膜和绒毛组织,制作成组织阵列,即组织芯片。其特点:(1)每一位流产妇女分别取其蜕膜和绒毛组织形成配对,集中在同一芯片上,实现生理结构上的母-胎界面在体外芯片上功能呈现;(2)高通量,一张芯片至少可以集成45例患者蜕膜和绒毛配对组织,一次即获大量信息,成百上千倍地提高效率;3)并行化,可比性强、准确性高;4)实验误差小,实验条件保持一致;5)便于设置各种实验对照;6)大量缩减研究费用。蜕膜和绒毛组织芯片适用HE染色、免疫组织化学(IHC)染色、原位杂交(ISH)、荧光原位杂交(FISH)、原位PCR、原位RT-PCR、寡核苷酸启动的原位DNA合成(PRINS)等研究方法,可用于但不限于病理妊娠病因筛查及分子分型、新型标志物筛选与验证、个体化治疗患者筛选以及疗效和预后判断等,对于正常妊娠维持机制和病理妊娠发病机制的研究具有重要意义。
具体实施方式
下面结合具体实施方式,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明记载的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明中,所述蜕膜和绒毛组织取自本院孕早期(孕龄小于12周)妇女,因各种原因导致流产及自愿终止妊娠妇女,在清宫术中留取蜕膜和绒毛组织。新鲜组织样本用无菌PBS清洗后,置福尔马林中浸泡,待用。
实施例1蜕膜和绒毛配对组织芯片的制备(一)
(1)收集清宫术中蜕膜和绒毛组织,记录患者的年龄、BMI、流产次数、治疗方案、内分泌、自身抗体、血凝,免疫、染色体筛查或遗传性易栓症筛查的资料参数,建立临床资料数据库。(2)采集蜕膜和绒毛组织标本,分割成约5mm×15mm×15mm大小,组织标本经常规脱水、石蜡包埋,挑选具有完整临床资料的标本作为供体蜡块。(3)用全自动石蜡切片机将供体蜡块切成4-8微米厚的组织切片。(4)用全自动染色机对组织切片进行HE染色,显微镜下标记典型组织区域。(5)设计每张组织芯片包括90个点样孔,点样孔呈等间距矩阵式排列在石蜡切片上,点样孔的直径为2毫米,每个点样孔之间的间距为2毫米。(6)按照质量比取莱卡石蜡(德国徕卡鳞片状切片石蜡,熔点范围58~60℃)96.5%、脱水山梨醇三硬脂酸酯3%、田箐胶0.5%,混合盛于烧杯中,充分混匀,于60-75摄氏度烤箱中使其融合,倒入相应的石蜡模具中,石蜡完全变硬后拆开模具,得到原始受体蜡块。(7)在组织芯片仪上选择2mm直径的样品针在受体蜡块上按照点阵设计打孔,得到空白受体蜡块。(8)将供体蜡块置于45℃保温箱中5分钟,用另一直径2mm的打孔针在供体蜡块标记区域打孔采集组织芯,其长度比受体蜡块孔径深0.1mm左右。(9)取45个病例组织样本,每个病例样本取蜕膜和绒毛各1份,将采集到的蜕膜和绒毛组织芯分别用镊子小心夹取插入到空白受体蜡块的点样孔内,源自相同病例标本的蜕膜和绒毛组织芯插入相邻的点样孔内,反复直至完成全部样品点的制备。最后用载玻片将所有组织芯按平,使组织芯片蜡块平坦光滑。(10)将制成的组织芯片蜡块再放入模具,放入60℃烤箱内15min,使组织芯与受体腊块的蜡融为一体,然后轻轻从烤箱中取出模具,让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30min,再放入-20℃冰箱冷冻6min后将组织芯片蜡块从模具中取出,切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片,厚度定为4μm,将连续切片漂在凉水中,让其自然展开,再将分开的切片转移到45℃的温水中展片30秒,用2%APES丙酮液处理过的载玻片裱贴切片,将制成的组织芯片放入60℃烤箱内烤片2小时,取出室温冷却,放入-4℃冰箱保存。
实施例2蜕膜和绒毛配对组织芯片的制备(二)
(1)收集清宫术中蜕膜和绒毛组织,记录患者的年龄、BMI、流产次数、治疗方案、内分泌、自身抗体、血凝,免疫、染色体筛查或遗传性易栓症筛查的资料参数,建立临床资料数据库。(2)采集蜕膜和绒毛组织标本,分割成约5mm×15mm×15mm大小,组织标本经常规脱水、石蜡包埋,挑选具有完整临床资料的标本作为供体蜡块。(3)用全自动石蜡切片机将供体蜡块切成4-8微米厚的组织切片。(4)用全自动染色机对组织切片进行HE染色,显微镜下标记典型组织区域。(5)设计每张组织芯片包括160个点样孔,点样孔呈等间距矩阵式排列在石蜡切片上,点样孔的直径为2毫米,每个点样孔之间的间距为1毫米。(6)按照质量比取莱卡石蜡(德国徕卡鳞片状切片石蜡,熔点范围58~60℃)95.5%、脱水山梨醇三硬脂酸酯4%、田箐胶0.5%,混合盛于烧杯中,充分混匀,于60-75摄氏度烤箱中使其融合,倒入相应的石蜡模具中,石蜡完全变硬后拆开模具,得到原始受体蜡块。(7)在组织芯片仪上选择2mm直径的样品针在受体蜡块上按照点阵设计打孔,得到空白受体蜡块。(8)将供体蜡块置于45℃保温箱中5分钟,用另一直径2mm的打孔针在供体蜡块标记区域打孔采集组织芯,其长度比受体蜡块孔径深0.1mm左右。(9)取80个病例组织样本,每个病例样本取蜕膜和绒毛各1份,将采集到的蜕膜和绒毛组织芯分别用镊子小心夹取插入到空白受体蜡块的点样孔内,源自相同病例标本的蜕膜和绒毛组织芯插入相邻的点样孔内,反复直至完成全部样品点的制备。最后用载玻片将所有组织芯按平,使组织芯片蜡块平坦光滑。(10)将制成的组织芯片蜡块再放入模具,放入60℃烤箱内15min,使组织芯与受体腊块的蜡融为一体,然后轻轻从烤箱中取出模具,让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30min,再放入-20℃冰箱冷冻6min后将组织芯片蜡块从模具中取出,切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片,厚度定为2μm,将连续切片漂在凉水中,让其自然展开,再将分开的切片转移到45℃的温水中展片30秒,用2%APES丙酮液处理过的载玻片裱贴切片,将制成的组织芯片放入60℃烤箱内烤片2小时,取出室温冷却,放入-4℃冰箱保存。
实施例3蜕膜和绒毛配对组织芯片的制备(三)
(1)收集清宫术中蜕膜和绒毛组织,记录患者的年龄、BMI、流产次数、治疗方案、内分泌、自身抗体、血凝,免疫、染色体筛查或遗传性易栓症筛查的资料参数,建立临床资料数据库。(2)采集蜕膜和绒毛组织标本,分割成约5mm×15mm×15mm大小,组织标本经常规脱水、石蜡包埋,挑选具有完整临床资料的标本作为供体蜡块。(3)用全自动石蜡切片机将供体蜡块切成4-8微米厚的组织切片。(4)用全自动染色机对组织切片进行HE染色,显微镜下标记典型组织区域。(5)设计每张组织芯片包括400个点样孔,点样孔呈等间距矩阵式排列在石蜡切片上,点样孔的直径为2毫米,每个点样孔之间的间距为3毫米。(6)按照质量比取莱卡石蜡(德国徕卡鳞片状切片石蜡,熔点范围58~60℃)97.5%、脱水山梨醇三硬脂酸酯2%、田箐胶0.5%,混合盛于烧杯中,充分混匀,于60-75摄氏度烤箱中使其融合,倒入相应的石蜡模具中,石蜡完全变硬后拆开模具,得到原始受体蜡块。(7)在组织芯片仪上选择2mm直径的样品针在受体蜡块上按照点阵设计打孔,得到空白受体蜡块。(8)将供体蜡块置于45℃保温箱中5分钟,用另一直径2mm的打孔针在供体蜡块标记区域打孔采集组织芯,其长度比受体蜡块孔径深0.1mm左右。(9)取200个病例组织样本,每个病例样本取蜕膜和绒毛各1份,将采集到的蜕膜和绒毛组织芯分别用镊子小心夹取插入到空白受体蜡块的点样孔内,源自相同病例标本的蜕膜和绒毛组织芯插入相邻的点样孔内,反复直至完成全部样品点的制备。最后用载玻片将所有组织芯按平,使组织芯片蜡块平坦光滑。(10)将制成的组织芯片蜡块再放入模具,放入60℃烤箱内15min,使组织芯与受体腊块的蜡融为一体,然后轻轻从烤箱中取出模具,让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30min,再放入-20℃冰箱冷冻6min后将组织芯片蜡块从模具中取出,切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片,厚度定为6μm,将连续切片漂在凉水中,让其自然展开,再将分开的切片转移到45℃的温水中展片30秒,用2%APES丙酮液处理过的载玻片裱贴切片,将制成的组织芯片放入60℃烤箱内烤片2小时,取出室温冷却,放入-4℃冰箱保存。
实施例4蜕膜和绒毛配对组织芯片的制备(四)
(1)收集清宫术中蜕膜和绒毛组织,记录患者的年龄、BMI、流产次数、治疗方案、内分泌、自身抗体、血凝,免疫、染色体筛查或遗传性易栓症筛查的资料参数,建立临床资料数据库。(2)采集蜕膜和绒毛组织标本,分割成约5mm×15mm×15mm大小,组织标本经常规脱水、石蜡包埋,挑选具有完整临床资料的标本作为供体蜡块。(3)用全自动石蜡切片机将供体蜡块切成4-8微米厚的组织切片。(4)用全自动染色机对组织切片进行HE染色,显微镜下标记典型组织区域。(5)设计每张组织芯片包括48个点样孔,点样孔呈等间距矩阵式排列在石蜡切片上,点样孔的直径为2毫米,每个点样孔之间的间距为4毫米。(6)按照质量比取莱卡石蜡(德国徕卡鳞片状切片石蜡,熔点范围58~60℃)98.5%、脱水山梨醇三硬脂酸酯1%、田箐胶0.5%,混合盛于烧杯中,充分混匀,于60-75摄氏度烤箱中使其融合,倒入相应的石蜡模具中,石蜡完全变硬后拆开模具,得到原始受体蜡块。(7)在组织芯片仪上选择2mm直径的样品针在受体蜡块上按照点阵设计打孔,得到空白受体蜡块。(8)将供体蜡块置于45℃保温箱中5分钟,用另一直径2mm的打孔针在供体蜡块标记区域打孔采集组织芯,其长度比受体蜡块孔径深0.1mm左右。(9)取24个病例组织样本,每个病例样本取蜕膜和绒毛各1份,将采集到的蜕膜和绒毛组织芯分别用镊子小心夹取插入到空白受体蜡块的点样孔内,源自相同病例标本的蜕膜和绒毛组织芯插入相邻的点样孔内,反复直至完成全部样品点的制备。最后用载玻片将所有组织芯按平,使组织芯片蜡块平坦光滑。(10)将制成的组织芯片蜡块再放入模具,放入60℃烤箱内15min,使组织芯与受体腊块的蜡融为一体,然后轻轻从烤箱中取出模具,让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30min,再放入-20℃冰箱冷冻6min后将组织芯片蜡块从模具中取出,切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片,厚度定为0.6μm,将连续切片漂在凉水中,让其自然展开,再将分开的切片转移到45℃的温水中展片30秒,用2%APES丙酮液处理过的载玻片裱贴切片,将制成的组织芯片放入60℃烤箱内烤片2小时,取出室温冷却,放入-4℃冰箱保存。
组织芯片评价方法
将取自同一组织标本的蜕膜和绒毛组织,按照上述实施例1的方法制作组织芯片蜡块,每个蜡块包含90个组织芯,在组织芯片蜡块烘烤前观察蜡块表面组织芯周围蜡块开裂及缝隙情况,以缝隙或开裂长度大于0.5毫米为裂痕标准,统计组织芯裂痕的数量。60摄氏度烘烤后,用切片机将组织芯片蜡块切成厚度定为4μm的石蜡切片,在相同条件分别进行HE染色、免疫组织化学染色。以组织芯片染色后留存组织芯数占原有组织芯数的百分比作为利用率(%),以烘烤前蜡块表面组织芯周围裂痕数量作为裂痕率(%),用裂痕率及利用率作为评价组织芯片质量。
表1不同材料制备的受体蜡块组织芯质量
不同材料的受体蜡块制备的组织芯HE染色、免疫组织化学染色及裂痕情况如表1所示。当受体蜡块由纯石蜡制成时,蜡块在打孔时会有较多裂痕产生,裂痕率为45.5%,组织芯片染色后利用率为分别为84.4%、82.2%。受体蜡块由石蜡、脱水山梨醇三硬脂酸酯和田箐胶制成时,裂痕率显著降低,当脱水山梨醇三硬脂酸酯用量在2%以上时蜡块基本无裂痕产生,组织芯片染色后利用率达到100%。组织芯片蜡块在切片前通常需要进行烘烤使石蜡与组织芯充分接触融合,提高烘烤温度有利于两者融合,但提高烘烤温度容易造成石蜡融化,且过高的烘烤温度会影响后续的HE染色及免疫组化检测结果。本发明采用石蜡、SPAN、田箐胶制备受体蜡块,当三者比例为95.5:3:0.5时,所制备的受体蜡块无裂痕,HE染色、免疫组织化学染色后组织芯的利用率是相同染色方法中最高的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种蜕膜和绒毛配对组织芯片,其特征在于,包括固相载体;以及位于所述固相载体上的石蜡切片;所述石蜡切片的厚度为1-10微米,所述石蜡切片上设有4-1000个点样孔,将正常妊娠或病理妊娠患者的蜕膜和绒毛标本设置在组织芯片点样孔中,使源自同一病例标本的蜕膜和绒毛组织形成配对,实现生理结构上的母-胎界面在组织芯片上的功能呈现。
2.根据权利要求1所述蜕膜和绒毛配对组织芯片,其特征在于,所述源自同一病例标本的蜕膜和绒毛组织分别固定在相邻的两个点样孔内;所述病理妊娠为妊娠时限异常、异位妊娠、妊娠特有疾病、妊娠晚期出血或其它妊娠性疾病,所述妊娠时限异常包括流产、早产和过期妊娠,所述妊娠特有疾病包括妊娠高血压疾病、妊娠剧吐,所述妊娠晚期出血包括前置胎盘和胎盘早剥,所述其它妊娠性疾病包括羊水量异常、胎儿窘迫、胎膜早破、多胎妊娠和母儿血型不合。
3.根据权利要求1所述蜕膜和绒毛配对组织芯片,其特征在于,所述每个组织芯片上设有来自2个以上不同病例标本的蜕膜或绒毛组织,且对不同病例标本建立临床资料数据库,记录每个标本病例的年龄、BMI、流产次数、治疗方案、内分泌、自身抗体、血凝,免疫、染色体筛查或遗传性易栓症筛查的资料参数;所述点样孔呈等距排列在石蜡切片上,点样孔的直径为2毫米,每个点样孔之间的间距为0.2-4毫米。
4.根据权利要求1所述蜕膜和绒毛配对组织芯片,其特征在于,所述固相载体为载玻片和塑料基片。
5.根据权利要求1所述蜕膜和绒毛配对组织芯片,其特征在于,所述石蜡切片由莱卡石蜡96.5%、脱水山梨醇三硬脂酸酯3%、田箐胶0.5%制成。
6.权利要求1-5任一所述蜕膜和绒毛配对组织芯片的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)取空白受体蜡块,所述受体蜡块上设有4-1000个点样孔,所述点样孔呈等距排列在石蜡切片上,点样孔的直径为2毫米,每个点样孔之间的间距为0.2-4毫米;
(2)取蜕膜组织和绒毛组织,将蜕膜组织和绒毛组织分别推入受体蜡块的点样孔中,每个受体蜡块设有来自2个以上不同病例标本的蜕膜或绒毛组织;
(3)将步骤2中制备好的受体蜡块切成1-10微米的石蜡切片,将石蜡切片设置在固相载体上形成蜕膜和绒毛配对组织芯片。
7.根据权利要求6所述的蜕膜和绒毛配对组织芯片的制备方法,其特征在于,所述相同病例标本的蜕膜和绒毛组织固定在相邻的两个点样孔内,每个受体蜡块上设有来自2个以上不同病例标本的蜕膜或绒毛组织。
8.根据权利要求6所述的蜕膜和绒毛配对组织芯片的制备方法,其特征在于,所述制备方法为:
(1)建立临床数据库,采集术中留取的蜕膜和绒毛组织标本进行石蜡包埋,选取典型组织区域标记定位,作为供体蜡块;
(2)设计每张组织芯片包括4-1000个点样孔,点样孔呈等间距矩阵式排列在石蜡切片上,点样孔的直径为2毫米,每个点样孔之间的间距为0.2-4毫米;
(3)取莱卡石蜡96.5%、脱水山梨醇三硬脂酸酯3%、田箐胶0.5%,加热至65-75摄氏度混匀,倒入模具中冷却成型,脱模得到原始受体蜡块;
(4)按照步骤2的点阵设计在原始受体蜡块打孔,得到空白受体蜡块;
(5)将供体蜡块于45℃保温5分钟,在标记区域打孔采集蜕膜和绒毛组织芯;
(6)将采集到的蜕膜和绒毛组织芯插入到空白受体蜡块的点样孔内,源自相同病例标本的蜕膜和绒毛组织芯插入相邻的点样孔内,得到组织芯片蜡块;
(7)将组织芯片蜡块于60℃保温15min,冷却,修整,切成1-10微米的石蜡切片,将石蜡切片设置在固相载体上形成蜕膜和绒毛配对组织芯片。
9.权利要求1所述蜕膜和绒毛配对组织芯片的用途,其特征在于,用于病理妊娠病因筛查及分子分型、新型标志物筛选与验证、个体化治疗患者筛选以及疗效和预后判断;所述病理妊娠为妊娠时限异常、异位妊娠、妊娠特有疾病、妊娠晚期出血或其它妊娠性疾病,所述妊娠时限异常包括流产、早产和过期妊娠,所述妊娠特有疾病包括妊娠高血压疾病、妊娠剧吐,所述妊娠晚期出血包括前置胎盘和胎盘早剥,所述其它妊娠性疾病包括羊水量异常、胎儿窘迫、胎膜早破、多胎妊娠和母儿血型不合。
10.权利要求1所述蜕膜和绒毛配对组织芯片的用途,其特征在于,用于HE染色、免疫组织化学染色、原位杂交、荧光原位杂交、原位PCR、原位RT-PCR或寡核苷酸启动的原位DNA合成。
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Citations (4)
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---|---|---|---|---|
CN101231282A (zh) * | 2007-01-23 | 2008-07-30 | 北京市农林科学院 | 一种用于功能基因组研究的组织芯片、及其制备方法和应用 |
CN103217534A (zh) * | 2012-01-20 | 2013-07-24 | 上海市公共卫生临床中心 | 肺癌标志物sbp-1及其用途 |
CN103900864A (zh) * | 2012-12-25 | 2014-07-02 | 泰州医药城博奥邦科生物科技有限公司 | 脱落细胞芯片 |
CN105717082A (zh) * | 2016-02-02 | 2016-06-29 | 管晓翔 | 一种用于检测三阴性乳腺癌瘤内异质性的方法 |
-
2017
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---|---|---|---|---|
CN101231282A (zh) * | 2007-01-23 | 2008-07-30 | 北京市农林科学院 | 一种用于功能基因组研究的组织芯片、及其制备方法和应用 |
CN103217534A (zh) * | 2012-01-20 | 2013-07-24 | 上海市公共卫生临床中心 | 肺癌标志物sbp-1及其用途 |
CN103900864A (zh) * | 2012-12-25 | 2014-07-02 | 泰州医药城博奥邦科生物科技有限公司 | 脱落细胞芯片 |
CN105717082A (zh) * | 2016-02-02 | 2016-06-29 | 管晓翔 | 一种用于检测三阴性乳腺癌瘤内异质性的方法 |
Non-Patent Citations (1)
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---|
刘君星 等: "《分子生物学仪器与实验技术》", 30 June 2009, 黑龙江科学技术出版社 * |
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