CN107189933A - 利用声驻波的生物反应器系统和相关方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于从生物反应器的细胞培养物中分离所需产物的系统以及用于从生物反应器的细胞培养物中分离所需产物的方法。所述系统包括生物反应器，所述生物反应器包括反应容器、搅拌器、供料入口和出口。所述系统还包括声致泳动过滤装置，该过滤装置具有入口、流动腔室和围绕该流动腔室的套管，其中所述套管包括超声换能器。所述超声换能器被驱动以在所述流动腔室中产生多维驻波，该多维驻波从所述相关流体培养基中分离所需产物。

Description

利用声驻波的生物反应器系统和相关方法

本申请是申请日为2014年2月7日，发明名称为“利用声驻波的生物反应器”的中国专利申请No.2014800196513的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2013年2月7日提交的美国临时专利申请序列号61/761,717的优先权。本申请还是于2013年9月13日提交的美国专利申请序列号14/026,413、和于2013年3月15日提交的美国专利申请序列号13/844,754的部分延续案，所述美国专利申请序列号14/026,413要求于2012年10月2日提交的美国临时专利申请序列号61/708,641的优先权，所述美国专利申请序列号13/844,754要求于2012年3月15日提交的美国临时专利申请序列号61/611,159、同样于2012年3月15日提交的美国临时专利申请序列号61/611,240、和于2013年1月21日提交的美国临时专利申请序列号61/754,792的优先权。这些申请的全部内容均以引用的方式并入本文。

背景技术

在过去的20年间，生物技术领域飞速发展。这种发展由许多因素导致，其中一些因素包括可用于生物反应器的设备的改进、对生物系统的了解增加、以及对各种物质(例如单克隆抗体和重组蛋白)与人体各系统的相互作用的认知提高。

设备的改进使得可大量和低成本地进行生物衍生物质的生产，例如重组蛋白。这在药物领域尤其普遍，在药物领域中，多种新药治疗的成功直接归因于能够通过基于蛋白的生产方法大量生产这些物质。

用于基于生物学的新药的生产工艺的关键因素之一是生物反应器及与其相关的附属工艺。生物反应器领域的一部分发展是由于灌注式工艺。灌注式工艺由于其较低的资本成本和较高的生产量而区别于分批补料式(fed-batch)工艺。

在分批补料式工艺中，将培养物接种于生物反应器中。采用在生长周期过程中逐步添加大量新鲜的所选的营养物来提高生产率和生长。在收集培养物之后回收产物。由于分批补料式生物反应器工艺简单，并且由公知的发酵工艺发展而来，因此其是吸引人的。然而，分批补料式生物反应器的启动成本高，并且为了在生长周期结束时获得具有成本效益的量的产物而具有大的体积。在分批补料完成后，生物反应器必须清洁并灭菌，这导致非生产性停工期。

灌注式生物反应器处理被供入生物反应器中的一批连续的新鲜培养基，同时抑制生长的副产物被不断地移除。灌注式生物反应器工艺可以减少或消除非生产性停工期。灌注式培养所达到的细胞密度(3000-10000万个细胞/ml)通常高于分批补料模式的细胞密度(500-2500万个细胞/ml)。然而，灌注式生物反应器需要细胞保持装置以防止当移除副产物时培养物逸出。这些细胞保持系统增加了灌注式工艺的复杂程度，并且需要管理、控制和维持以有效运转。以前，诸如细胞保持设备的故障或失灵等操作问题是灌注式生物反应器的难题。这在过去限制了它们的吸引力。

发明内容

在多个实施方案中，本公开涉及用于生产如重组蛋白或单克隆抗体等生物分子、以及用于从生物反应器的细胞培养物中分离这些所需产物的系统。通常，包含细胞和所需产物的流体培养基经过或流过过滤装置。

在多个实施方案中，公开了一种系统，该系统包括生物反应器和过滤装置。所述生物反应器包括反应容器、搅拌器、供料入口和出口。所述过滤装置包括：入口，其流体连接至所述生物反应器出口以从所述生物反应器接收流体；流动腔室，通过该流动腔室，所述流体能够流动；和围绕所述流动腔室的套管，所述套管包括至少一个超声换能器以及位置与所述至少一个超声换能器相对的反射器，所述至少一个超声换能器被驱动以在所述流动腔室中产生多维驻波。

所述过滤装置还可以包括产物出口，通过该产物出口回收所需产物。所述过滤装置还可以包括再循环出口，其用于将流体送回所述生物反应器。

所述多维驻波可以具有相同数量级的轴向分力和横向分力。所述生物反应器可以作为灌注式生物反应器来运转。

所述套管可以是与所述流动腔室可分离的。有时，所述过滤装置还包括位于所述套管和所述流动腔室之间的夹套，该夹套用于调节所述流动腔室中的所述流体的温度。所述夹套、所述套管和所述流动腔室可以是彼此可分离的，并且可以是一次性的。

在具体的实施方案中，所述超声换能器包括能够以高阶模态振动的压电材料。所述压电材料可以具有矩形形状。

所述超声换能器可以包括：具有顶端、底端和内部容积的外壳；和位于所述外壳的底端的晶体，该晶体具有暴露的外表面和内表面，并且当受到电压信号驱动时，所述晶体能够振动。在一些实施方案中，衬里层接触所述晶体的所述内表面，所述衬里层由基本上透声的材料制成。所述基本上透声的材料可以为轻木、软木、或泡沫。所述基本上透声的材料的厚度可以为至多1英寸。所述基本上透声的材料可以为栅格的形式。在其他实施方案中，所述晶体的外表面由厚度为小于或等于半波长的磨损面材料覆盖，所述磨损面材料为氨基甲酸酯涂层、环氧树脂涂层、或硅酮涂层。在其他实施方案中，所述晶体不具有衬里层或耐磨层。

所述多维驻波可以为三维驻波。

所述反射器可以具有非平面表面。

以下更具体地描述这些和其他非限制性特征。

附图说明

以下是对附图的简单描述，其是为了说明本文所公开的示例性实施方案的目的，不旨在对其进行限制。

图1示出由超声换能器和反射器产生的单驻声波。

图2为比较分批补料式生物反应器系统和灌注式生物反应器系统的图。

图3为示出生物反应器的各部件的截面图。

图4示出本公开的声致泳动(acoustophoretic)过滤装置的一个实施方案，其具有围绕作为流动腔室并且为一次性的的管的套管。

图5示出本公开的声致泳动过滤装置的另一个实施方案，其显示了围绕流动腔室的夹套和围绕该夹套的套管。所述套管含有用于调节经过所述流动腔室的流体的温度的流体。

图6为示出本公开的系统的示意图，所述系统包括具有声致泳动分离装置的灌注式生物反应器、和再循环通路。

图7为常规超声换能器的截面图。

图8为常规换能器的耐磨板的照片。

图9为本公开的超声换能器的截面图。该换能器中存在气隙，并且不存在衬里层或耐磨板。

图10为本公开的超声换能器的截面图。该换能器中存在气隙，并且存在衬里层或耐磨板。

图11为以不同频率驱动的正方形换能器的电阻抗振幅对频率的图。

图12示出图11中的峰振幅中的七个的沿流体流的正交方向的捕获线(trappingline)结构。

图13为声压振幅(右手边刻度为Pa)和换能器面外位移(左手边刻度为米)的计算机模拟。左手边刻度顶部的文字为“x10^-7”。左手边刻度顶部带有向上三角形的文字为“1.473x10^-6”。左手边刻度底部带有向下三角形的文字为“1.4612x10^-10”。右手边刻度顶部的文字为“x10⁶”。右手边刻度顶部带有向上三角形的文字为“1.1129x10⁶”。右手边刻度底部带有向下三角形的文字为“7.357”。这些三角形示出图中所示的给定刻度的最大值和最小值。水平轴为腔室中沿X轴的位置，单位为英寸；垂直轴为腔室中沿Y轴的位置，单位为英寸。

图14示出晶体的面内和面外位移，其中存在复合波。

图15示出具有一个流动腔室、用于执行一些示例性分离的声致泳动分离器的分解图。

图16示出具有两个流动腔室的堆叠声致泳动分离器的分解图。

图17为示出在一个实验中利用Beckman Coulter细胞活力分析仪获得的从培养基中移除细胞的效果的图。

图18为示出在另一个实验中利用Beckman Coulter细胞活力分析仪获得的从培养基中移除细胞的效果的图。

具体实施方式

通过参照以下对所需实施方案及其所包括的例子的详细描述，本公开将更加易于理解。在以下说明书及其所附权利要求中，提及了大量术语，其应当被定义为具有以下含义。

虽然为了清楚起见在以下描述中使用了特定术语，但这些术语仅旨在指代被选择在图中示出的实施方案的特定结构，而不旨在限定或限制本公开的范围。在图中以及下文的描述中，应当理解相同的数字标号指代相同功能的部件。

除非特别说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“这种”包括复数的所指对象。

本文所用术语“包括”是指存在所指部件，并且允许存在其他部件。术语“包括”应当被解释为包括术语“由……构成”，术语“由……构成”只允许存在所指部件，以及来自所指部件制造过程中的任何杂质。

数值应当被理解为包括当简化为相同数目的有效数字时相同的那些数值，以及本申请中所述的用于确定所述值的常规测量技术实验误差以内的与所述值不同的数值。

本文所公开的所有范围包括所述的端点和独立的组合(例如，范围“2g至10g”包括端点2g和10g，以及所有中间的值)。本文公开的范围的端点和任意值均不限制为精确的范围或值；它们的不精确足以包括与这些范围和/或值近似的值。

与数量连用的修饰语“约”包括所述的值，并且具有上下文所指的含义(例如，其至少包括与特定数量的测量有关的误差程度)。当在范围中使用时，还应当认为修饰语“约”公开了由两个端点的绝对值限定的范围。例如，范围“约2至约10”还公开了范围“2至10”。

应当注意到，本文所用的很多术语为相对术语。例如，术语“上部”和“下部”在位置上彼此相对，即，在给定的方向，上部部件位于比下部部件更高的高度，但如果装置倒转，这些术语可以改变。术语“入口”和“出口”是相对于流体流经给定结构而言的，例如，流体流过入口进入结构，并且流过出口流出结构。术语“上游”和“下游”是相对于流体流过各部件的方向而言的，即，流体在流过下游部件之前流过上游部件。应当注意到，在环路中，第一部件可以被描述为第二部件的上游也可以被描述为第二部件的下游。

本申请涉及“相同的数量级”。如果大数值除以小数值的商为小于10的值，那么两个数值为相同的数量级。

生物反应器对于生产如重组蛋白或单克隆抗体等生物分子是有用的。通常，在具有培养基的生物反应器容器中培养细胞以产生所需产物，然后通过从细胞和培养基中进行分离来收集所需产物。已经证明使用包括中国仓鼠卵巢(CHO)、NS0杂交瘤细胞、婴儿仓鼠肾(BHK)细胞和人细胞等哺乳动物细胞培养物对于生产/表达现今药物所需的重组蛋白和单克隆抗体是非常有效的。有两种常用类型的生物反应器工艺：分批补料和灌注。

虽然分批补料反应器是目前的标准(主要由于其是许多科学家和技术人员所熟悉的工艺)，但灌注式技术正在非常迅速地发展。很多因素促进了灌注式生物反应器工艺的使用。与分批补料相比，灌注式生物反应器的资金和启动成本较低，需要较小的上游和下游容量，并且该工艺使用较小的体积和较少的接种步骤。灌注式生物反应器工艺还使得其自身能够更好地进行发展、扩大规模、优化、参数灵敏度研究和确认。

近年来灌注式生物反应器技术的发展也促进了其使用。用于灌注式生物反应器的控制技术和普通的支持设备正在得到改进，这增加了灌注式工艺的鲁棒性。目前，灌注式工艺可以扩大规模至体积高达1000升(L)的生物反应器。与以前所见的情况相比，用于灌注式生物反应器的更好的细胞保持系统导致更少的细胞损失和更大的细胞密度。现在可以实现大于5000万个细胞/ml的细胞密度，与此相比，分批补料的细胞密度为约2000万个细胞/ml。更低的污染和感染率提高了灌注式生物反应器的产量。因此，灌注式工艺实现了收集物中更高的产物浓度和更好的收率，而成本没有显著增加。

使用高细胞浓度生物反应器的一个独立的方面为在生物反应器运行的最后进行物质的“排水”。从生物反应器污泥中“排水”或去除间隙液体对于提高所需生物反应器产物的回收效果是重要的。目前，在运行的最后使用具有内部结构的高能离心机(称为叠盘式(diskstack)离心机)来从生物反应器污泥中去除间隙液体。叠盘式离心机的资金成本和操作成本是高的。需要一种不需要叠盘式离心机的高资金成本和高操作成本的、从剩余的生物反应器污泥中去除间隙液体的简单方法。此外，目前的过滤或离心方法会损坏细胞，将蛋白质碎片和酶释放到纯化过程中，从而增加纯化系统的下游部分的负荷。

简言之，本公开涉及由一个或多个压电换能器产生三维(3-D)声驻波，其中所述换能器以电或机械方式激发以使得它们以“鼓面(drumhead)”或多激发模式移动，而不是以“活塞式”或单激发模式移动。通过产生这种方式的波，与压电换能器以仅产生一个大驻波的“活塞式”模式被激发相比，产生了更高的横向捕获力。因此，与单声驻波相比，在相同的压电换能器输入功率下，3-D声驻波能够具有更高的横向捕获力。这可以用于促进生物反应器内容物的蛋白质流体的纯化。因此，本公开涉及工艺系统，其包括生物反应器和过滤装置，所述过滤装置利用声致泳动来分离各种成分。

通过利用引入3-D驻波的声致泳动过滤装置，还可以实现通量率的保持和多产物系统交叉污染风险的最小化。通过使用能够产生3-D声驻波的装置，还可以实现其他优点，例如标准操作规程(SOP)中通常详细说明和认定的清洁过程和相关要求。可以消除生物反应器和外部工艺之间的交叉污染风险。

声致泳动是从流体分散体中去除颗粒的低功率、无压降、不堵塞、固态的方法：即，其用于实现更通常使用多孔过滤器进行的分离，但其不具有过滤器的缺点。具体地，本公开提供了适用于生物反应器，并且在具有高流速的流动系统中进行大规模分离的过滤装置。声致泳动过滤装置被设计为产生高强度三维超声驻波，从而获得大于流体动力阻力与浮力或重力的组合效果的声学辐射力，因此能够捕获(即，保持固定)悬浮相(即，细胞)以获得更多的时间使声波增加颗粒聚集、凝聚和/或聚结。本发明的系统能够产生超声驻波场，其能够捕获颗粒以线性速度0.1mm/秒至速度超过1cm/秒存在于流动场中。该技术为分离次级相提供了绿色且持久的选择，并且对能量的耗费显著降低。已证明获得了优异的颗粒分离效果，粒径小到1微米。

超声驻波可以用于将次级相颗粒(即，细胞)捕获(即，保持固定)在宿主流体流(例如细胞培养基)中。这是与以前的方法的重要区别，在以前的方法中，声学辐射力的效果仅改变颗粒轨迹。从颗粒散射的声场导致三维声学辐射力，其用作三维捕获场。当颗粒相对于波长较小时，声学辐射力与颗粒体积(例如半径的立方)成比例。其与频率和声学对比系数成比例。其还与声能(例如声压振幅的平方)成比例。对于谐波激励，力的正弦空间变化驱动颗粒处于驻波内的稳定位置。当施加于颗粒上的声学辐射力强于流体动力阻力与浮力或重力的组合效果时，颗粒被捕获在声驻波场中。作用于被捕获的颗粒上的声学力的作用导致颗粒的聚集、凝聚和/或聚结。此外，次级的颗粒间力(例如Bjerkness力)增加颗粒凝聚。

通常，3-D驻波过滤系统在一定电压下操作以使得产生蛋白的物质(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)，其为重组蛋白治疗的工业生产中最常用的宿主)被捕获在超声驻波中，即，保留在固定的位置。在各个节平面中，CHO细胞被捕获在最小的声辐射势能中。与细胞悬浮在其中的培养基相比，大多数细胞类型都具有较高的密度和较低的压缩率，因此细胞与培养基之间的声学对比系数为正值。因此，轴向声学辐射力(ARF)驱动CHO细胞朝向驻波声压节点(pressure node)移动。声学辐射力的轴向分力驱动具有正的对比系数的细胞朝向声压波节面(pressure nodal plane)移动，而具有负的对比系数的细胞或其他颗粒被驱动为朝向声压波腹平面(pressure anti-nodal plane)移动。声学辐射力的径向或横向分力是捕获细胞的力。ARF的径向或横向分力大于流体动力阻力与重力的组合效果。对小细胞或乳浊液而言，阻力F_D可以表示为：

其中U_f和U_p为流体和细胞速度，R_p为颗粒半径，μ_f和μ_p为流体和细胞的动力粘度，为动力粘度的比。浮力F_B表示为：

对于要在超声驻波中捕获的细胞，在细胞上的力平衡必须为0，由此可以得到横向声学辐射力F_LRF的表达式，如下：

F_LRF＝F_D+F_B。

对于已知大小和材料性质的细胞，并且对于给定流速，该等式可以用于估计横向声学辐射力的大小。

用于计算横向声学辐射力的理论模型基于由Gor’kov¹⁷开发的公式。初级横向声学辐射力F_A被定义为场势能U的函数，F_A＝-▽(U)，

其中场势能U被定义为

f₁和f₂为单极和偶极贡献，其被定义为

其中p为声压，u为流动颗粒速度，Λ为细胞密度ρ_p与流体密度ρ_f的比，σ为细胞声速c_p与流体声速c_f的比，V_o为细胞体积，<>表示求经过波周期的时间平均值。

由本公开的超声换能器产生的总声学辐射力(ARF)的横向力是可观的，并且足以克服线性速度高达1cm/秒的流体动力阻力。因此，该横向ARF可以用于在生物反应器工艺连续进行的同时将细胞保持在生物反应器中。这对于灌注式生物反应器而言尤其如此。

本发明的使用超声换能器和声致泳动的过滤装置还可以改善生物反应器批次剩余物质(即，生物反应器污泥)的排水，因此可减少或消除叠盘式离心机的使用。这简化了工艺并且降低了成本。

在灌注式生物反应器系统中，希望能够从流体流(即，细胞培养基)中的被表达的物质中过滤和分离细胞和细胞碎片。被表达的物质包含生物分子，例如重组蛋白或单克隆抗体，并且包含要收集的所需的产物。

声致泳动过滤装置可以以至少两种不同的方式使用。第一，驻波可用于捕获表达的生物分子并且从细胞、细胞碎片和培养基中分离这些所需的产物。表达的生物分子随后可以被转移并收集以用于进一步加工。可供选择地，驻波可以捕获存在于细胞培养基中的细胞和细胞碎片。具有正对比系数的细胞和细胞碎片向驻波的波节(与波腹相对)移动。当细胞和细胞碎片凝聚在驻波的波节时，还存在细胞培养基的物理洗涤作用，由此，由于细胞与已经保持在驻波中的细胞接触，因此更多的细胞被捕获。这通常可从细胞培养基中分离细胞和细胞碎片。当驻波中的细胞凝聚到质量不能再由声波保持的程度时，已被捕获的凝聚的细胞和细胞碎片可以通过重力从流体流中落下，并且可以独立地收集。为了帮助细胞和细胞碎片的重力沉降，可以中断驻波以允许所有细胞从经过过滤的流体流中落下。该过程可以用于排水。表达的生物分子可以预先移除，或者保留在流体流中(即，细胞培养基)。

期望地，超声换能器在流体中产生三维驻波，该三维驻波对悬浮的颗粒施加横向力以伴随轴向力，由此增加声致泳动过滤装置的颗粒捕获能力。发表在文献中的典型结果记载，横向力比轴向力小两个数量级。与此形成对比的是，本申请公开的技术提供了与轴向力相同数量级的横向力。

本公开的声学过滤装置被设计为保持高强度的三维声驻波。该装置由函数发生器和放大器(未示出)驱动。由计算机监控和控制装置性能。有时，由于声流动，需要调整驻波的频率和电压振幅。这可以通过振幅调节和/或频率调节来完成。驻波传播的工作周期也可以用于实现捕获物质的一定结果。换言之，可以在不同频率下打开和关闭声束以实现所需结果。

图1示出单驻波系统100，其包括反射器板101和设置为共振的超声换能器103以形成驻波102。通过换能器103施加通常在几百kHz至几十MHz范围内的激发频率。在换能器103和反射器101之间产生一个或多个驻波。驻波是频率和强度相等并且传播方向相反(即，从换能器到反射器，以及相反)的两个传播波的总和。传播波破坏性地相互干扰，由此产生驻波。虚线105用于指示振幅。波节为波具有最小振幅的点，其由参考标号107示出。波腹为波具有最大振幅的点，其由参考标号109示出。

图2为比较分批补料式生物反应器系统201(左侧)和灌注式生物反应器系统202(右侧)的示意图。从位于左侧的分批补料式生物反应器开始，生物反应器201包括反应容器220。通过供料入口222将细胞培养基供入反应容器。搅拌器225用于使培养基在细胞培养物中循环。在此，搅拌器被示为一组旋转叶片，但是可以预期任何类型的导致循环的系统。生物反应器使得接种的培养物经过生长/生产周期生长，在该过程中，碎片、废物和没用的细胞会积累在生物反应器中，并且会产生所需产物(例如，如单克隆抗体、重组蛋白、激素等)。由于所述积累，分批补料式工艺的反应容器通常远远大于灌注式工艺的反应容器。然后，在生产周期结束时收集所需产物。反应容器220还包括用于移除物料的出口224。

现将说明位于右手边的灌注式生物反应器202，该生物反应器包括反应容器220，其具有细胞培养基的供料入口222。搅拌器225用于使培养基在细胞培养物中循环。反应容器的出口224与过滤装置230的入口232流体连接，并且连续将培养基(包含细胞和所需产物)供入过滤装置。过滤装置位于反应容器的下游，将所需产物与细胞分离。过滤装置230具有两个分开的出口，为产物出口234和再循环出口236。产物出口234将过滤装置230流体连接至位于该过滤装置下游的收容容器240，该收容容器从过滤装置接收集中的所需产物流(加上培养基)。从此处开始，可以进一步进行加工/纯化以分离/回收所需产物。再循环出口236将过滤装置230流体连接回反应容器220的再循环入口226，再循环出口236用于将细胞和细胞培养基送回反应容器中以进行继续的生长/生产。换言之，反应容器与过滤装置之间具有流体环路。灌注式生物反应器系统202的反应容器220具有连续的产物生产量，因此可以做的更小。过滤工艺对于灌注式生物反应器的生产量是至关重要的。差的过滤工艺仅可获得低的生产量，并且导致所需产物的收率低。

图3是可用于本公开的系统的普通生物反应器300的截面图。如图所示，该生物反应器包括具有内部容积323的反应容器320。位于容器顶端的供料入口322用于将细胞培养基供入容器。具有搅拌器325。出口324示于容器的底部。热夹套310围绕反应容器，其用于调节细胞/培养基的温度。鼓风器312位于容器的底部，用于将气体提供至内部容积。传感器314被示为位于容器的顶部右侧。示出用于将细胞培养基供入容器的泵316，另一个泵318用于将细胞培养基移出容器。

本公开的灌注式系统还使用声致泳动过滤装置。使生物反应器的内容物连续地流过过滤装置以捕获所需产物。

图4为声致泳动过滤装置400的第一实施方案。该装置包括流动腔室410，其在此被示为圆筒状管道或管。供料入口412在此被示为位于流动腔室的底部，通过该入口接收来自生物反应器的流体。出口414被示为位于流动腔室的顶部，箭头(参考标号415)示出流体流动的方向。套管420围绕流动腔室。套管包括至少一个超声换能器422以及至少一个反射器424，它们被设置为彼此相对。换能器与反射器一起产生一个或多个驻波425，其中反射器使最初的传播波以相似的频率和强度振动返回换能器从而形成声驻波。特别预期地，套管可以从流动腔室/管道分离下来。管道可以报废并更换新的管道。这允许过滤装置具有一次性部分，因此降低了永久性过滤器可能具有的清洁和灭菌成本。应当指出，如之前所述，过滤装置可以包括图中未示出的其他入口和出口。

图5为声致泳动过滤装置的第二实施方案。图中，过滤装置400还包括夹套430，其位于套管420和流动腔室410之间。夹套含有温度调节流体432，其可以用于控制流过流动腔室的流体的温度。在此方面，通常希望保持细胞培养物的温度低于38℃以防止细胞受损。温度调节流体与流过流动腔室410的细胞培养基/流体完全分离。应当指出，由换能器422和反射器424产生的驻波425会传播通过夹套430及其中的温度调节流体432，并且会在流动腔室中连续运行以分离流动腔室中的目标物质。

图6示出本公开的示例性加工系统，其包括生物反应器610和过滤装置630。将系统安装以作为灌注式生物反应器使用。生物反应器610包括反应容器620，其具有供料入口622、出口624和再循环入口626。通过添加管650将培养基加入供料入口622。用搅拌器625混合反应容器的内容物(参考标号605)。所需产物(例如重组蛋白)由位于容器620中的细胞连续地生产，并且存在于生物反应器的培养基中。灌注式生物反应器中的产物和细胞通过管652从反应容器中抽出，并且通过入口632进入声致泳动过滤装置630中。在那里，通过使用多维驻波将所需产物从细胞中分离。所需产物可以通过产物出口634和管654被排放入收容容器640。在分离之后，细胞从过滤装置的再循环出口636通过管656到达反应容器的再循环入口626，从而返回灌注式生物反应器，这形成再循环通路。由于声致泳动装置的3-D驻波的增强的横向捕获力，3-D驻波使得灌注式反应器获得高的生产量。应当指出，虽然反应容器出口624被示为位于该容器的顶部，再循环入口626被示为位于该容器的底部，但如果需要，这种排布是可以颠倒的。这可以取决于待获得的所需产物。

现在更详细地描述用于声致泳动过滤装置的超声换能器可能是有帮助的。图7为常规超声换能器的截面图。该换能器具有位于底端的耐磨板50、环氧树脂层52、陶瓷晶体54(由例如锆钛酸铅(PZT)制成)、环氧树脂层56、和衬里层58。在陶瓷晶体的两侧具有电极：正电极61和负电极63。环氧树脂层56将衬里层58附接到晶体54。整个组件被包括在可以由例如铝制成的外壳60中。电适配器62为电线穿过外壳并连接至附接于晶体54上的导线(未示出)提供连接。通常，衬里层被设计为增加阻尼并形成在宽的频率范围内具有均匀位移的宽带换能器，并且被设计为抑制在特定的振动本征模式(vibrational eigen-mode)下的激发。耐磨板通常被设计为阻抗变换器以更好地匹配介质(换能器向其中进行辐射)的特征阻抗。

图8为具有泡64的耐磨板50的照片，其中由于波动压力和加热，该耐磨板已经从陶瓷晶体上分离。

图9为本公开的用于本公开的声致泳动过滤装置的超声换能器81的截面图。换能器81具有铝外壳82。PZT晶体86限定了换能器的底端，并且其暴露于外壳的外部。晶体在其外周由位于晶体和外壳之间的小弹性层98(例如硅酮或相似的材料)支持。换言之，不存在耐磨层。

螺丝(未示出)通过螺纹88将外壳的铝顶板82a附接至外壳的壳体82b。所述顶板包括连接器84以将功率传递至PZT晶体86。PZT晶体86的底面和顶面各连接至电极(正和负)，例如银或镍。卷绕电极片90连接至底部电极，并且与顶部电极绝缘。通过晶体上的电极将电能提供至PZT晶体86，其中卷绕片90为接地点。应指出，晶体86不具有图5中示出的衬里层或环氧树脂层。换言之，在换能器中在铝顶板82a和晶体86之间具有气隙87(即，气隙完全是空的)。如图10所示，在一些实施方案中可以提供极小的衬里58和/或耐磨板50。

换能器的设计可影响系统的性能。通常的换能器为层状结构，其中陶瓷晶体结合至衬里层和耐磨板。由于换能器负荷有驻波赋予的高机械阻抗，因此耐磨板的传统的设计准则(例如，对于驻波应用的半波长厚度或对于辐射应用的四分之一波长厚度)和制造方法可能是不合适的。相比较，在本公开的一个实施方案中，换能器不具有耐磨板或衬里，这使得晶体以其本征模式之一振动并具有高的Q-因数。振动陶瓷晶体/盘直接暴露于流过流动腔室的流体。

去除衬里(例如使晶体以空气作为衬里)还使得陶瓷晶体以很小的阻尼以振动的高阶模振动(例如高阶模位移)。在晶体具有衬里的换能器中，晶体以更均匀的位移振动，就像活塞。去除衬里使得晶体以非均匀位移模式振动。晶体的模态的阶越高，晶体就具有越多的波节线。尽管捕获线与波节的关联不一定是一对一的，并且以更高的频率驱动晶体不一定产生更多的捕获线，但晶体的高阶模位移产生更多的捕获线。

在一些实施方案中，晶体可以具有极少地影响晶体的Q-因数(例如小于5％)的衬里。衬里可以由基本上透声的材料制成，例如轻木、泡沫或软木，其使得晶体以高阶模态振动并保持高的Q-因数，同时还为晶体提供一定的机械支持。衬里层可以是实心的，或者可以是在层中具有孔的栅格，这样栅格跟随以特定的高阶振动模式振动的晶体的波节，从而在波节位置提供支持，同时允许其余的晶体自由振动。栅格结构或透声材料的目的是提供支持，而不降低晶体的Q-因数或干扰特定模态的激发。

使晶体直接与流体接触避免了环氧树脂层和耐磨板的阻尼和能量吸收效应，从而也提供了高的Q-因数。其他实施方案可以具有耐磨板或耐磨表面以防止含有铅的PZT接触宿主流体。这在(例如)如分离血液的生物应用中可能是希望的。这种应用可以使用诸如铬、电解镍或非电解镍的耐磨层。也可以使用化学气相沉积涂覆聚(p-亚二甲苯)(例如Parylene)或其他聚合物的层。诸如硅酮或聚氨酯等有机或生物相容性涂层也可用作耐磨表面。

在一些实施方案中，超声换能器具有1英寸的直径和额定2MHz的共振频率。各换能器可以消耗约28W的功率以使液滴限制为3GPM的流速。这换算为能量消耗为0.25kW时/m³。这表明所述技术具有非常低的能量消耗。期望地，各换能器由其自身的放大器供电和控制。在其他实施方案中，超声换能器使用正方形晶体，例如1”x1”的尺寸。可供选择地，超声换能器可以使用矩形晶体，例如1”x2.5”的尺寸。每个换能器的功率消耗为每1”x1”换能器截面面积和每英寸声驻波跨度10W，从而得到足够的声学捕获力。对于4”跨度的中规模系统，每1”x1”正方形换能器消耗40W。在中规模系统中，较大的1”x2.5”矩形换能器使用100W。三个1”x1”正方形换能器的阵列消耗总共120W，两个1”x2.5”换能器的阵列消耗约200W。紧密间隔的换能器的阵列代表了所述技术的可选的潜在实施方案。换能器尺寸、形状、数目和位置可以根据需要改变以产生所需的三维声驻波样式。

换能器的尺寸、形状和厚度决定了换能器在不同激发频率下的位移，这进而影响了分离效果。通常，换能器在接近厚度共振频率(半波长)的频率下运行。换能器位移梯度(gradient)通常导致更多的对于细胞/生物分子的捕获位置。高阶模位移在声场中在所有方向上产生具有强梯度的三维声驻波，由此在所有方向上产生相等的强声学辐射力，这导致了多个捕获线，其中捕获线的数目与换能器的特定的模态有关。

为了研究换能器位移特性曲线对声学捕获力和分离效果的影响，使用1”x1”正方形换能器重复进行实验10次，其中除了激发频率以外所有条件均相同。将10个连续的声共振频率(图11中以被圈起来的数字1-9和字母A示出)用作激发频率。条件为：实验持续时间30分钟，1000ppm油浓度的约5微米SAE-30油液滴，流速500ml/分钟，输入功率20W。由于油比水致密，并且能够利用声致泳动从水中分离，因此使用了油液滴。

图11示出所测量的正方形换能器的作为在2.2MHz换能器共振附近的频率的函数的电阻抗振幅。换能器电阻抗的最小值对应水柱的声共振，并且其代表用于运行的可能的频率。数值模拟表明，换能器位移特性曲线在这些声共振频率处变化显著，由此直接影响声驻波和所得捕获力。由于该换能器在接近其厚度共振下运行，因此电极表面的位移是本质上异相的。换能器电极的典型位移是不均匀的，并且根据激发频率改变。作为一个例子，在一个激发频率下，产生了单行被捕获的油液滴，位移在电极的中间具有单一最大值，在换能器边缘附近具有最小值。在另一个激发频率下，换能器特性曲线具有多个最大值，这导致产生多行受捕获的油液滴。更高阶的换能器位移模式导致更高的捕获力以及多个稳定的被捕获的油液滴捕获线。

作为换能器经过的油-水乳液，观察并研究了油液滴捕获线的特征。如图12所示，对图11所发现的10个共振频率中的七个进行了捕获线特征研究，包括对流动通道中的捕获线数目进行观察和绘制图案。换能器的不同位移特性曲线可在驻波中产生不同的(更多的)捕获线，其中位移特性曲线存在更多梯度通常会产生更高的捕获力和更多的捕获线。

图13是示出匹配9条捕获线模式的压力场的数值模型。该数值模型为二维模型；因此只观察到3条捕获线。在垂直于页面平面的第三维度还存在两组3条捕获线。

在本发明的系统中，该系统在一定电压下运行从而使得颗粒(即生物分子或细胞)被捕获在超声驻波中，即，保持在固定的位置。颗粒沿着很好限定的捕获线集中排列，这些捕获线分开半个波长。在每个波节面中，颗粒被捕获在最小声辐射势能处。声辐射力的轴向分力驱动具有正对比系数的颗粒向声压波节面移动，而具有负对比系数的颗粒被驱动为向声压波腹平面移动。声辐射力的径向或横向分力为捕获颗粒的力。因此，其必须大于流体动力阻力和重力的组合效果。在使用通常的换能器的系统中，声辐射力的径向或横向分力通常比声辐射力的轴向分力小几个数量级。然而，由本公开的换能器产生的横向力能够可观地与轴向分力在一个数量级，并且足以克服在高达1cm/秒的线性速度下的流体动力阻力。

可以通过将换能器驱动为高阶模态来提高横向力，这种高阶模态与其中晶体有效地像具有均匀位移的活塞那样移动的振动形式不同。声压与换能器的驱动电压成比例。电能与电压的平方成比例。换能器通常为薄的压电板，在z轴具有电场，在z轴具有初级位移。通常，换能器的一侧与空气(即，换能器中的气隙)结合，另一侧与细胞培养基中的流体结合。在所述板中所产生的波的类型被称为复合波。压电板中的一部分复合波与漏对称(leaky symmetric)(还称为压缩或延伸)兰姆波相似。所述板的压电性质通常导致对称兰姆波的激发。由于波辐射到水层中，因此它们发生泄漏，这导致在水层中产生声驻波。兰姆波存在于其表面处于无应力状态的无限广度的薄板中。由于本实施方案的换能器实际上是有限的，因此实际的模态位移更加复杂。

图14示出板的厚度上的面内位移(x-位移)和面外位移(y-位移)的典型变化，面内位移是板的厚度的偶函数，面外位移是奇函数。由于板的有限尺寸，位移分量在板的宽度和长度上变化。通常，(m，n)模式是这样的换能器位移模式，其中如图14所示，随着厚度变化，换能器位移在宽度方向上具有m个波动，在长度方向上具有n个波动。m和n的最大值是晶体尺寸和激发频率的函数。

换能器被驱动为使得压电晶体以高阶模通式(m，n)振动，其中m和n独立地为1或更大。通常，换能器以大于(2，2)的高阶模振动。高阶模将产生更多的波节和波腹，从而在水层中产生三维驻波，该三维驻波的特征为在声场中在所有方向上(不仅在驻波的方向上，也在横向方向上)具有强的梯度。结果，声学梯度导致在横向方向上具有更强的捕获力。

在一些实施方案中，驱动换能器的脉冲电压信号可以具有正弦、矩形、锯齿或三角波形；并且频率为500kHz至10MHz。脉冲电压信号可以用脉冲宽度调制驱动，这产生任何所需的波形。脉冲电压信号还可以具有振幅或频率调制启动/停止能力以消除流(streaming)。

换能器用于建立可产生相同数量级的与驻波方向垂直和沿驻波方向的力的压力场。当力为大致相同数量级时，大小为0.1微米至300微米的颗粒更有效地向凝聚区域(“捕获线”)移动。由于垂直声致泳动分力具有相等的大梯度，因此在换能器与反射器之间具有在驻波方向上位置规则分布的“热点”或颗粒集中区。热点位于声学辐射势能最大或最小的位置。这些热点代表颗粒集中位置，其使得能够在集中过程中在换能器和反射器之间实现更好的波传递，以及更强的颗粒间作用力，这导致更快和更好的颗粒凝聚。

图15和图16是示出声致泳动分离器的各部分的分解图。图15只具有一个分离腔室，图16具有两个分离腔室。

参照图15，流体通过四端口入口191进入分离器190。提供转换件192以建立通过分离腔室193的活塞流。换能器40和反射器194位于分离腔室的相对的壁上。之后，流体通过出口195流出分离腔室193和分离器。

图16具有两个分离腔室193。系统连接器196位于两个腔室193之间以将其连接在一起。

用不同的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系测试了声致泳动分离器。在一个实施方案中，利用图15所示的系统对起始细胞密度为8.09×10⁶个细胞/mL、浊度为1,232NTU、细胞活力约为75％的溶液进行了分离。换能器为2MHz晶体，在大约2.23MHz下运转，消耗24-28瓦。采用25mL/分钟的流速。该实验的结果示于图17。

在另一个实验中，对起始细胞密度为8.09×10⁶个细胞/mL、浊度为1,232NTU、细胞活力约为75％的溶液进行了分离。CHO细胞系具有双模态粒度分布(粒度12μm和20μm)。结果示于图18。

图17和图18由Beckman Coulter细胞活力分析仪生成。其他测试显示，在从流体中分离细胞方面，1MHz和3MHz的频率不如2MHz那样有效。

在流速为10L/小时的其他测试中，捕获了99％的细胞，并且证实细胞活力大于99％。流速为50mL/分钟(即3L/小时)的测试获得了3×10⁶个细胞/mL的最终细胞密度，活力接近100％，并且几乎没有或完全没有温度升高。在其他测试中，6L/小时的流速获得了95％的浊度降低。

进行了进一步的测试，利用酵母模拟CHO进行生物应用。对于这些测试，流速为15L/小时，测试了不同的频率和功率水平。表1示出了测试结果。

表1：15L/小时流速下的2.5”x 4”系统结果

频率(MHz)	30瓦	37瓦	45瓦
				2.2211	93.9	81.4	84.0
2.2283	85.5	78.7	85.4
				2.2356	89.1	85.8	81.0
2.243	86.7	-	79.6

在生物应用中，预期所述系统的所有部分(例如流动腔室、导向或出自生物反应器或过滤装置的管道、包括超声换能器和反射器的套管、温度调节夹套等)都可以彼此分离，并且为一次性的。避免离心和过滤使得能够更好地分离CHO细胞而不会降低细胞活力。换能器还可以被驱动为产生迅速的压力变化以防止或清除由于CHO细胞凝聚而导致的堵塞。还可以改变换能器的频率以在给定功率下获得最佳效果。

已经参照示例性实施方案描述了本公开。显然，通过阅读并理解上文的详细描述，本领域技术人员可以进行改变或修改。本公开旨在被理解为包括所附权利要求及其等价形式的范围以内的所有这些改变和修改。

Claims (20)

1.一种用于从生物反应器的细胞培养物中分离所需产物的系统，包括：

生物反应器，其包括具有内部容积的反应容器、供料入口和出口；和

声致泳动过滤装置，其包括：

入口，其流体连接至所述生物反应器的出口以从所述生物反应器连续地接收相关流体培养基；

流动腔室，通过该流动腔室，所述相关流体培养基能够流动；

超声换能器以及位置与所述超声换能器相对的反射器，所述超声换能器被驱动以在所述流动腔室中产生多维驻波，该多维驻波从所述相关流体培养基中分离所需产物；和

产物出口，通过该产物出口回收所需产物的浓缩流，其中所述多维驻波产生具有相同数量级的轴向分力和横向分力的声学辐射力。

2.根据权利要求1所述的系统，其中所述生物反应器为灌注式生物反应器。

3.根据权利要求1所述的系统，其中所述过滤装置还包括用于调节所述流动腔室中的所述流体的温度的夹套。

4.根据权利要求1所述的系统，其中所述超声换能器包括能够以高阶模态振动的压电材料。

5.根据权利要求4所述的系统，其中所述压电材料具有矩形形状。

6.根据权利要求1所述的系统，其中所述超声换能器包括：

具有顶端、底端和内部容积的外壳；

位于所述外壳的底端的晶体，该晶体具有暴露的外表面和内表面，并且当受到电压信号驱动时，所述晶体能够振动；和

介于所述晶体和所述外壳的顶端之间的气隙。

7.根据权利要求6所述的系统，其中衬里层接触所述晶体的所述内表面，所述衬里层由实质上透声的材料制成。

8.根据权利要求7所述的系统，其中所述实质上透声的材料为轻木、软木、或泡沫。

9.根据权利要求7所述的系统，其中所述实质上透声的材料的厚度为至多1英寸。

10.根据权利要求7所述的系统，其中所述实质上透声的材料为栅格的形式。

11.根据权利要求6所述的系统，其中所述晶体的外表面由厚度为小于或等于半波长的磨损面材料覆盖，所述磨损面材料为氨基甲酸酯涂层、环氧树脂涂层、或硅酮涂层。

12.根据权利要求6所述的系统，其中所述晶体不具有衬里层或耐磨层。

13.根据权利要求1所述的系统，其中所述多维驻波为三维驻波。

14.根据权利要求1所述的系统，其中所述反射器具有非平面表面。

15.根据权利要求1所述的系统，其中所述所需产物为重组蛋白和单克隆抗体。

16.根据权利要求1所述的系统，还包括用于进一步加工所述浓缩流的至少一个装置，所述至少一个装置位于所述声致泳动过滤装置的下游。

17.根据权利要求16所述的系统，其中所述用于进一步加工的至少一个装置适于转移并收集所述所需产物，以用于进一步加工。

18.根据权利要求16所述的系统，其中所述用于进一步加工的至少一个装置适于从所述所需产物的浓缩流中分离或回收所述所需产物。

19.一种用于从生物反应器的细胞培养物中分离所需产物的方法，包括：

使包含所述所需产物的流体培养基由生物反应器流过声致泳动过滤装置，所述声致泳动过滤装置包括：

入口，其从所述生物反应器连续地接收相关流体培养基；

流动腔室，通过该流动腔室，所述相关流体培养基能够流动；

超声换能器以及位置与所述超声换能器相对的反射器，所述超声换能器被驱动以在所述流动腔室中产生多维驻波，所述多维驻波产生具有相同数量级的轴向分力和横向分力，并且该多维驻波从所述流体培养基中分离所需产物；

以及

通过所述声致泳动过滤装置的产物出口回收所需产物的浓缩流。

20.根据权利要求19所述的方法，还包括：在用于进一步加工的装置中从所述所需产物的浓缩流中分离或回收所述所需产物。