CN107164559A - 基于POCKIT Micro荧光PCR平台的禽流感病毒H7亚型检测试剂及应用 - Google Patents

基于POCKIT Micro荧光PCR平台的禽流感病毒H7亚型检测试剂及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于POCKIT Micro荧光PCR平台的禽流感病毒H7亚型检测试剂及应用。本发明检测试剂中包含检测禽流感病毒H7亚型的特异性引物和探针；检测试剂盒中包含标准品和荧光定量PCR反应试剂，荧光定量PCR反应试剂包含dNTPs、Taq酶、缓冲液、特异性引物和探针；检测系统中包含核酸萃取试剂盒、检测试剂盒、POCKIT Micro荧光PCR核酸分析仪、微型离心机和移动电源。本发明检测试剂盒和检测系统具有检测结果准确、操作简单、方便易携、节省试剂、无需电泳、现场快速检测等优点，可广泛应用于禽流感的早期筛查和诊断。

Description

基于POCKIT Micro荧光PCR平台的禽流感病毒H7亚型检测试 剂及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于POCKIT Micro荧光PCR平台的禽流感病毒H7亚型检测试剂及应用，本发明还涉及针对禽流感病毒H7亚型的检测试剂盒及检测系统。
背景技术
禽流感(Avian Influenza)是禽流行性感冒的简称，它是由禽流感病毒引起的一种禽类急性传染病，被国际兽疫局定为甲类传染病。通常禽流感只在禽类之间感染和传播，但有时也能感染人类，自1997年香港首次发现人感染禽流感以来，全球多地均报告了人禽流感病例，病死率约60％。虽然禽流感被发现已逾百年，但至今人类并未掌握特异性的预防和治疗方法，仅能以消毒、隔离、大量宰杀禽畜的方法防止其蔓延。因此，禽流感目前已成为一个重大的公共安全问题，在给禽类和人类健康带来严重威胁的同时，也给社会造成了巨大的经济损失。
禽流感病毒(AIV)属于正粘病毒科的甲型流感病毒，多为球形，直径80～120nm，有囊膜，病毒表面有10～12nm的密集钉状物或纤突覆盖，病毒囊膜内有螺旋形核衣壳。禽流感病毒基因组由8个负链的单链RNA片段组成，共编码10个病毒蛋白。依据其套膜上的血凝素(H)/和神经氨酸酶(N)蛋白抗原性的不同，可分为16个H亚型(H1～H16)和9个N亚型(N1～N9)。在禽类中高致病性禽流感病毒为H5、H7亚型，典型的鸡禽流感病毒为H7N7型，人感染禽流感病毒主要为H5N1、H9N2、H7N7型。
H7亚型是1955年被发现并确定的禽流感病毒亚型，作为一种高致病性禽流感病毒，近年来，H7亚型病毒的暴发已导致全球超过七千万家禽的死亡，疫情波及欧洲、亚洲、北美洲、南美洲和大洋洲，由于该亚型病毒多为暴发型且破坏力巨大，因此引发了全球的广泛关注。虽然目前针对H7亚型的基础研究已取得了一定的进展，例如已经测定获得了其HA基因的全部序列以及血凝素基因的部分序列，但我们的研究还有很大的局限，对病毒进化、致病机制、流行规律等仍不甚了解，因此，只有进一步加强在人群和动物中对该亚型禽流感病毒的监测，同时致力于基础研究和相关疫苗及药物的研发，才能使我们从容地应对未来可能出现的禽流感疫情。为了实现上述目的，研究开发针对禽流感病毒H7亚型的检测试剂，并建立操作简便、快速、敏感性好、特异性强的检测方法和检测系统是很有必要的，将其推广应用于禽流感的早期筛查会对疫情的预防和控制产生积极的影响。
发明内容
针对上述问题，本发明人研究开发了一种基于POCKIT Micro荧光PCR平台的禽流感病毒H7亚型检测试剂，并在该检测试剂的基础上建立了禽流感病毒H7亚型的检测试剂盒及检测系统。本发明检测试剂盒及检测系统操作简单、检测速度快、敏感性好、特异性强、方便易携带且检测成本较低。
利用本发明检测试剂盒及检测系统可在实验室、医院、畜牧场、饲养场、活禽市场等各种场所即时的对禽流感病毒H7亚型进行检测，并能够准确、快速的获得检测结果。
第一方面，本发明提供了一种基于POCKIT Micro荧光PCR平台的禽流感病毒H7亚型检测试剂，所述检测试剂中包含检测禽流感病毒H7亚型的特异性引物和探针，其中，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，所述探针的核苷酸序列的5'端连接有荧光报告基团FAM标记，3'端连接有非荧光淬灭基团和MGB修饰基团。
进一步地，本发明涉及上述检测试剂在制备禽流感病毒H7亚型检测试剂盒中的应用。
尤其是，本发明还涉及上述检测试剂在制备禽流感病毒H7N7或H7N9亚型检测试剂盒中的应用。
此外，本发明还涉及上述检测试剂在制备H7亚型禽流感诊断或治疗药物中的应用。
第二方面，本发明提供了一种基于POCKIT Micro荧光PCR平台的禽流感病毒H7亚型检测试剂盒，所述检测试剂盒中包含标准品和荧光定量PCR反应试剂；所述荧光定量PCR反应试剂包含dNTPs、Taq酶、缓冲液、特异性引物和探针；其中，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示，所述探针的核苷酸序列的5'端连接有荧光报告基团FAM标记，3'端连接有非荧光淬灭基团和MGB修饰基团。
进一步地，上述检测试剂盒中还包含阳性对照品和/或阴性对照品。
优选地，上述检测试剂盒中的标准品为包含禽流感病毒H7亚型HA基因或该基因片段的重组质粒。
优选地，上述检测试剂盒中的荧光定量PCR反应试剂为冷冻干燥粉，该检测试剂盒中还包含ddH2O。
利用冷冻干燥技术将荧光定量PCR反应试剂制成冷冻干燥粉，可有效延长其保质期，所述荧光定量PCR反应试剂冷冻干燥粉在4℃条件下的保质期可达2年，且短途运输过程中无需冷链。
第三方面，本发明提供了一种基于POCKIT Micro荧光PCR平台的禽流感病毒H7亚型检测系统，所述检测系统中包含核酸萃取试剂盒、检测试剂盒、POCKIT Micro荧光PCR核酸分析仪、微型离心机和移动电源；
所述检测试剂盒中包含标准品和荧光定量PCR反应试剂；所述荧光定量PCR反应试剂包含dNTPs、Taq酶、缓冲液、特异性引物和探针；其中，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，所述探针的核苷酸序列的5'端连接有荧光报告基团FAM标记，3'端连接有非荧光淬灭基团和MGB修饰基团。
优选地，上述检测系统，其中所述检测试剂盒中包含的标准品为包含禽流感病毒H7亚型HA基因或该基因片段的重组质粒；所述荧光定量PCR反应试剂为冷冻干燥粉，所述检测试剂盒中还包含ddH2O。
本发明检测试剂盒和检测系统由于具有检测结果准确、操作简单、方便易携、节省试剂、无需电泳、现场快速检测等优点，可将其推广应用于禽流感的早期筛查和诊断，必定会对禽流感疫情的预防和控制产生积极的影响。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.Sambrook等著，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照实验器材制造厂商所建议的条件。
实施例1禽流感病毒H7亚型检测试剂盒1
本检测试剂盒中包含标准品和荧光定量PCR反应试剂。
其中，标准品为包含禽流感病毒H7亚型HA基因或该基因片段的重组质粒。
荧光定量PCR反应试剂包含dNTPs、Taq酶、缓冲液、特异性引物和探针，特异性引物和探针的核苷酸序列如下表1所示。
表1特异性引物和探针的核苷酸序列
实施例2禽流感病毒H7亚型检测试剂盒2
本检测试剂盒中包含标准品、荧光定量PCR反应试剂冷冻干燥粉、ddH2O、阳性对照品和阴性对照品。
其中，标准品为包含禽流感病毒H7亚型HA基因或该基因片段的重组质粒。
荧光定量PCR反应试剂冷冻干燥粉包含dNTPs、Taq酶、缓冲盐、特异性引物和探针，特异性引物和探针的核苷酸序列如上表1所示。
阳性对照品为含有禽流感病毒H7亚型HA基因或该基因片段的DNA样品，阴性对照品为不含有HA基因或该基因片段的DNA样品。
实施例3禽流感病毒H7亚型检测系统
本检测系统中包含核酸萃取试剂盒、检测试剂盒、POCKIT Micro荧光PCR核酸分析仪、微型离心机和移动电源。
检测试剂盒中包含标准品和荧光定量PCR反应试剂。
其中，标准品为包含禽流感病毒H7亚型HA基因或该基因片段的重组质粒。
荧光定量PCR反应试剂包含dNTPs、Taq酶、缓冲液、特异性引物和探针，特异性引物和探针的核苷酸序列如上表1所示。
实施例4禽流感病毒H7亚型检测
一、检测对象
经实验室PCR方法确诊的感染H7亚型禽流感病毒的家禽咽喉拭子为检测样本，未感染H7亚型禽流感病毒的家禽咽喉拭子作为阴性对照样本。
二、样品核酸提取
实验试剂：
使用PetNAD核酸萃取试剂盒(金瑞鸿捷生物科技有限公司)，应用纯化管柱萃取系统。
萃取试剂盒产品组成如下表2所示。
表2萃取试剂盒产品组成
品名 体积 注意事项：初次使用前
PB1 36ml/瓶 -
PB2 1ml/瓶 使用前加入35ml 95％酒精
PB3 20ml/瓶 使用前加入20ml 95％酒精
PB4 15ml/瓶 使用前加入25ml 95％酒精
PB5 12ml/瓶 -
纯化管柱&收集管 50组/袋 -
实验仪器：
Cubee微型离心机(瑞基海洋生物科技股份有限公司)。
提取方法：
按照PetNAD核酸萃取试剂盒使用说明书，提取样品基因组DNA，操作步骤如下：
1、样本的处理
分别将检测样本和阴性对照样本的咽喉拭子放置在含有1ml DEPC水或是生理盐水中充分震荡混合，丢弃拭子，置于微型离心机中先离心数秒，取200μl上清液备用。
2、核酸提取
(1)取600μl PB1加入上述离心管中，将离心管盖上盖子后，迅速地上下摇动1分钟；
(2)再加入600μl PB2(含酒精)，将离心管盖上盖子后，迅速地上下摇动10秒；
(3)取600μl的混合溶液，加到纯化管柱中；
(4)离心1分钟后，倒掉收集管内液体；
(5)加入600μl PB3(含酒精)到纯化管柱中；
(6)离心1分钟，倒掉收集管内液体；
(7)加入600μl PB4(含酒精)到纯化管柱中；
(8)离心1分钟，倒掉收集管内液体；
(9)再离心3分钟，除去残留乙醇；
(10)丢掉收集管，将纯化管柱套至新的离心管上；
(11)在纯化管柱中加入50μl的PB5，放置在室温下1分钟；
(12)离心1分钟后，丢弃纯化管柱，所得核酸萃取物可以立即使用，或存放在4℃下1小时内用完。
三、PCR检测
采用绝热恒温聚合酶链反应(iiPCR)技术，在特殊设计的毛细管针对单点进行恒温加热，然后利用荧光检测系统对样品核酸进行检测分析，并在45分钟内获得检测结果。
实验仪器：
POCKIT Micro荧光PCR核酸分析仪(瑞基海洋生物科技股份有限公司)。目的基因：
禽流感病毒H7亚型HA基因。
标准品：
包含禽流感病毒H7亚型HA基因或该基因片段的重组质粒。
iiPCR反应体系如下表3所示。
表3 iiPCR反应体系
体系成分 浓度(终浓度) 体积(μl)
dNTP 25mM(0.5mM) 1
冻干buffer - 6.3
引物1 10μM(0.5μM) 2.5
引物2 10μM(0.5μM) 2.5
探针1 5μM(0.05μM) 0.5
探针2 5μM(0.05μM) 0.5
iiPCR MMLV RTase 4U/μl(8U) 2.00
RNase inhibitor 2U/μl(2U) 1.00
No glycerol Taq 35unit/μl(26.25U) 0.75
ddH2O - 加至50μl
引物与探针：
引物1序列：5'-GCTTCGGGGCATCATGTT-3'(SEQ ID NO:1)；
引物2序列：5'-GCACCGCATGTTTCCATTCTT-3'(SEQ ID NO:2)；
探针1序列：5'-ATTGCAATGGGCCTTGTC-3'(SEQ ID NO:3)；
探针2序列：5'-ATTGCAATGGGATTGGTT-3'(SEQ ID NO:4)。
检测步骤：
1、标准品制备
初次使用干燥标准品先用100μl标准品回溶液回溶，回溶后的标准品溶液在4℃条件下保存。
2、样本检测
(1)按照上表3所示的体系组成制备iiPCR反应液；
(2)向三个装有上述iiPCR反应液的PCR反应管中分别加入5μl检测样本核酸萃取物、阴性对照样本核酸萃取物和标准品溶液，利用移液器反复吹吸混合均匀；
(3)分别吸取50μl上述混合物移入R-tubeTM；
(4)将R-tubeTM盖上盖子后，利用微型离心机将R-tubeTM里的液体离心至管底；
(5)启动检测仪，待检测仪完成自检后将R-tubeTM放入反应槽中；
(6)盖上机器盖子后，开机启动扩增程序并完成核酸检测，结果将于反应完成后显示在LCD面板上。
四、检测结果
结果显示：检测样本核酸萃取物和标准品溶液检测结果均为“+”(阳性)，阴性对照样本核酸萃取物检测结果为“－”(阴性)，说明利用本检测系统可对H7亚型禽流感病毒进行快速检测，检测结果准确，特异性好。
实施例5禽流感病毒H7亚型检测系统灵敏度测试
一、检测对象
将实施例4中包含禽流感病毒H7亚型HA基因片段的重组质粒进行测序，测序结果正确的质粒采用NanoDrop2000精确定量，然后根据质粒分子量计算摩尔量，制备出100、33、10和0拷贝/μl的标准品用于灵敏度测试。
二、检测方法
iiPCR反应体系与检测方法同实施例4。
三、测试结果
测试结果如下表4所示。
表4禽流感病毒H7亚型检测系统灵敏度测试
拷贝数(μl) 重现性 Mean S/N SD
100 4/4 3.85 0.13
33 4/4 3.44 0.45
10 4/4 3.54 0.44
0 0/4 1.01 0.04
结果显示：本检测系统检测灵敏度可达到10拷贝(4/4)。
以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。
SEQUENCE LISTING
<110> 金瑞鸿捷（厦门）生物科技有限公司、北京华安瑞基生物科技有限公司
<120> 基于POCKIT Micro荧光PCR平台的禽流感病毒H7亚型检测试剂及应用
<130> 2017
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcttcggggc atcatgtt 18
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcaccgcatg tttccattct t 21
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
attgcaatgg gccttgtc 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
attgcaatgg gattggtt 18

Claims (10)

1.一种基于POCKIT Micro荧光PCR平台的禽流感病毒H7亚型检测试剂，其特征在于：所述检测试剂中包含检测禽流感病毒H7亚型的特异性引物和探针，其中，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，所述探针的核苷酸序列的5'端连接有荧光报告基团FAM标记，3'端连接有非荧光淬灭基团和MGB修饰基团。
2.如权利要求1所述的检测试剂在制备禽流感病毒H7亚型检测试剂盒中的应用。
3.如权利要求1所述的检测试剂在制备禽流感病毒H7N7或H7N9亚型检测试剂盒中的应用。
4.如权利要求1所述的检测试剂在制备H7亚型禽流感诊断或治疗药物中的应用。
5.一种基于POCKIT Micro荧光PCR平台的禽流感病毒H7亚型检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒中包含标准品和荧光定量PCR反应试剂；所述荧光定量PCR反应试剂包含dNTPs、Taq酶、缓冲液、特异性引物和探针；其中，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，所述探针的核苷酸序列的5'端连接有荧光报告基团FAM标记，3'端连接有非荧光淬灭基团和MGB修饰基团。
6.如权利要求5所述的检测试剂盒，所述检测试剂盒中还包含阳性对照品和/或阴性对照品。
7.如权利要求5所述的检测试剂盒，其中所述标准品为包含禽流感病毒H7亚型HA基因或该基因片段的重组质粒。
8.如权利要求5所述的检测试剂盒，其中所述荧光定量PCR反应试剂为冷冻干燥粉，所述检测试剂盒中还包含ddH2O。
9.一种基于POCKIT Micro荧光PCR平台的禽流感病毒H7亚型检测系统，其特征在于：所述检测系统中包含核酸萃取试剂盒、检测试剂盒、POCKIT Micro荧光PCR核酸分析仪、微型离心机和移动电源；
所述检测试剂盒中包含标准品和荧光定量PCR反应试剂；所述荧光定量PCR反应试剂包含dNTPs、Taq酶、缓冲液、特异性引物和探针；其中，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，所述探针的核苷酸序列的5'端连接有荧光报告基团FAM标记，3'端连接有非荧光淬灭基团和MGB修饰基团。
10.如权利要求9所述的检测系统，其中所述检测试剂盒中包含的标准品为包含禽流感病毒H7亚型HA基因或该基因片段的重组质粒；所述荧光定量PCR反应试剂为冷冻干燥粉，所述检测试剂盒中还包含ddH2O。
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