CN107137761A - 一种甲壳素‑两亲离子/季铵盐天然敷料及其制备方法与应用 - Google Patents

一种甲壳素‑两亲离子/季铵盐天然敷料及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种甲壳素‑两亲离子/季铵盐天然敷料及其制备方法与应用，所述制备方法包括以下步骤：将贝壳用HCl溶液预处理，制备抗菌单体，制备冻干贝壳，将冻干贝壳进行浸泡处理得到RAFT‑shell，即为甲壳素；将RAFT‑shell进行浸泡处理得到甲壳素+季铵盐材料；将甲壳素+季铵盐材料进行浸泡处理得到甲壳素‑两亲离子/季铵盐天然敷料；制备得到的甲壳素‑两亲离子/季铵盐天然敷料抗菌抗污染效果均较好，亦能促进创面愈合，从而为天然敷料的创面应用提供新的手段和思路。

Description

一种甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于药物制备领域，具体地说，涉及一种甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料及其制备方法与应用。
背景技术
对于大面积严重皮肤缺损的病人而言，急需通过各种手段快速有效的封闭创面从而防止细菌入侵，同时防止体液、水电解质和能量的流失。创面敷料可以重建皮肤屏障，加速创面愈合，为后期手术做好准备。理想的创面敷料应该有以下一些特点：良好的力学性能、适当的水气通透性和优异的生物相容性。更为重要的是，感染、炎症反应失调等会引起创面的愈合减慢甚至不愈合，理想的创面敷料还应当能为创面局部提供一个无菌适宜生长的微环境。而天然材料如甲壳素与壳多糖、葡聚糖类、纤维素类、海藻酸盐、蚕丝蛋白等，由于取材方便，具有良好的生物相容性，被认为是用作制备创面敷料的很好的材料。因此，天然材料负载各种抗菌制剂、生长因子或者其他化学物质促进感染性创面的愈合已成为创面修复领域研究的热点及重点。
甲壳素，又名甲壳质、几丁质等，是由N-乙酰-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖以13-1，4糖苷键形式连接而成的天然多糖，广泛存在于低等动物特别是甲壳动物的外壳及低等植物菌藻类的细胞壁中，是一种天然的生物高分子，在自然界的产量仅次于纤维素。甲壳素由于具有良好的生物相容性，且具有无毒性、成本低、易改质、机械强度好、广谱抗菌性强等优点，在医疗领域应用广泛。它可作为医用生物材料，如吸收性手术缝合线、止血剂、免疫促进剂、肿瘤抑制剂和愈合剂等。但甲壳素分子之中具有规则的环状结构和其分子之间(内)存在很强的氢键作用，从而使得其结晶度高，导致它的溶解性能变差，不溶于水、稀碱、稀酸和一般的有机溶剂中，使其应用受到很大的限制。为了克服甲壳素溶解性能不足的缺点，可以对甲壳素进行季铵盐化，这是甲壳素化学改性的重要领域之一。
甲壳素季铵盐具有良好的溶解性能，具有良好的生物相容性，具有无毒性，具有简单的制备方法，并且其制备成本低以及应用范围极为广泛。作为一种常用的杀菌剂，季铵盐与甲壳素的脱乙酰基衍生物壳聚糖的聚合研究同样较为成熟。壳聚糖引入亲水性季铵盐基团得到的一类水溶性壳聚糖衍生物，不仅继承了壳聚糖的成膜性、抗菌性、絮凝性、生物可降解性等特性，还具有更好的水溶性，更强的正电性，更广的pH值。而两亲离子作为同时具有亲水性以及亲脂性的化合物，具有较好的抗污染作用，目前在创面敷料领域已有初步应用。
因此，将甲壳素与季铵盐/两亲离子相结合已成为一个热门的研究领域，其不仅可以有效的利用天然甲壳素来源广泛、低廉环保的优势，同时可有效的结合季铵盐的抑菌作用及两亲离子的抗污染作用。因此，我们特制备甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料，并研究其体外抗污染抗菌活性以及对小鼠创面愈合的影响，为天然敷料的进一步研究提供参考。
发明内容
有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料及其制备方法与应用。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、预处理：将贝壳浸入HCl溶液中3天，制备得到预处理后的贝壳；
步骤2、合成抗菌单体：将N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基溶于乙腈，得到N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基的乙腈溶液，然后向N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基的乙腈溶液中加入己基溴并进行搅拌处理，然后使用真空过滤将混合物过滤，最后在冷冻干燥后得到白色固体，即为抗菌单体N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基己基-1-铵；
步骤3、制备冻干贝壳：将氨丙基硅油加入到稀酸性酸和乙醇溶液的混合物中，得到混合溶液，然后将预处理后的贝壳浸入混合溶液中浸泡；用水洗浸泡后的贝壳15次，然后进行冻干，制备得到冻干贝壳；
步骤4、具有抗菌表面的壳的制备：
将N,N-二甲基甲酰胺、N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基和gEDC-HCl加入烧杯中，然后将冻干贝壳浸入混合物中，浸泡3天；然后使用N,N-二甲基甲酰胺和水清洗冻干贝壳，冻干后得到RAFT-shell；将RAFT-shell浸入N，N-二甲基甲酰胺、抗菌单体和偶氮二异丁腈的溶液中，然后使用N2将混合物脱气，过夜反应；然后使用N，N-二甲基甲酰胺和水清洗反应后的贝壳并进行冻干处理，得到具有抗菌表面的壳；
步骤5、甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料的制备：
将N,N-二甲基甲酰胺，2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和偶氮二异丁腈混合搅拌，然后加入甲壳素+双亲离子材料，冰镇条件下N2除气，然后将烧瓶放入反应过夜；反应结束后用氯仿、N，N-二甲基甲酰胺和水依次清洗壳并冻干，即为甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料。
进一步地，步骤1中的HCl溶液的浓度为3％-8％。
进一步地，步骤2中的N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基的乙腈溶液的浓度为10％-20％；N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基与己基溴的摩尔比为1:1-1:1.5；搅拌处理温度为75-85℃，搅拌处理时间为12-20小时，搅拌处理转速为50-80r/min；真空过滤温度为35-40℃，真空过滤时间为45-75min；冷冻干燥温度为-25℃--15℃，冷冻干燥时间为45-75min。
进一步地，步骤3中的稀酸性酸的体积浓度为8％-12％；氨丙基硅油、稀酸性酸和乙醇的体积比为1-5：4-8:100；浸泡时间为12-18分钟。
进一步地，步骤4中的N,N-二甲基甲酰胺、N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基和gEDC-HCl的配比为10ml：36.4g:28.7g；N，N-二甲基甲酰胺、抗菌单体和偶氮二异丁腈的配比为8-12ml：0.1-0.3g：8-12mg；脱气时间为15-25分钟，反应温度为55-65℃。
进一步地，步骤6中的N，N-二甲基甲酰胺，2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和偶氮二异丁腈的配比为8-12ml：0.1-0.3g：8-12mg；脱气时间为15-25分钟，反应温度为55-65℃。
本发明还公开了一种由上述的制备方法制备得到的甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料。
本发明还公开了一种上述的甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料在制备治疗创面愈合药物中的应用。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明的甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料具有高效抗菌性：季铵盐抗菌活性强，抗菌谱广，不易产生耐药菌株，在防治创面感染方面有独特的优越性。壳聚糖引入亲水性季铵盐基团得到的一类水溶性壳聚糖衍生物，不仅继承了壳聚糖的成膜性、抗菌性、絮凝性、生物可降解性等特性，还具有更好的水溶性，更强的正电性，更广的pH值。而本发明体外实验表明，甲壳素/季铵盐能有效抑制和杀灭细菌和真菌，将其制成纳米复合材料后抗菌活性更高。
2)本发明的甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料具有高效抗粘附性：两亲离子作为同时具有亲水性以及亲脂性的化合物，具有较好的抗污染作用，其机制可能在于通过降低了蛋白质和细菌、微生物与表面的相互作用，从而降低了附着物的黏附强度。也有研究认为，两亲离子可通过改变表面的形貌、电荷、表面基团的移动性和机械性能也能达到降低表面能的效果。本发明中，将具有亲水性抗生物黏附性能的聚合物和具有疏水性聚合物或低表面能的物质相结合，即两亲离子与甲壳素结合，研制具有高效抗生物黏附的两亲性表面。
3)本发明的甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料具有高生物相容性：本发明中，细胞毒性来看仅当到第7日时，D组对细胞有轻微增值抑制。这与壳聚糖及壳聚糖季铵盐、两亲离子均具有安全、无毒的特点，所以它们可以被广泛应用于食品工业中作为食品的保鲜剂、添加剂有关。
当然，实施本发明的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料的制备及评价指标简示示意图；
图2是本发明甲壳素与甲壳素-两亲离子/季铵盐在不同倍数镜下的纹理结构图，其中，A1、A2和A3分别为2×102倍，2×103倍和2×104倍下的甲壳素纹理结构；B1、B2和B3分别为2×102倍，2×103倍和2×104倍下的甲壳素-两亲离子/季铵盐结构；
图3是本发明甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料的接触角测试结果，其中A为甲壳素，B为甲壳素+双亲离子，C为甲壳素+季铵盐，D为甲壳素+季铵盐/双亲离子；
图4是本发明甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料的抗菌测试结果；其中，Control为不加任何材料，A为甲壳素，B为甲壳素+双亲离子，C为甲壳素+季铵盐，D为甲壳素+季铵盐/双亲离子；
图5是本发明甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料的抗粘附测试结果；其中，S-A为甲壳素，S-B为甲壳素+双亲离子，S-C为甲壳素+季铵盐，S-D为甲壳素+季铵盐/双亲离子，均为对金黄色葡萄球菌的影响；E-A为甲壳素，E-B为甲壳素+双亲离子，E-C为甲壳素+季铵盐，E-D为甲壳素+季铵盐/双亲离子，均为对大肠杆菌的影响；
图6是本发明甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料的抗粘附测试结果的柱状图；其中，Control为不加任何材料，A为甲壳素，B为甲壳素+双亲离子，C为甲壳素+季铵盐，D为甲壳素+季铵盐/双亲离子；
图7是本发明甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料的细胞毒性结果，其中，Control为不加任何材料，A为甲壳素，B为甲壳素+双亲离子，C为甲壳素+季铵盐，D为甲壳素+季铵盐/双亲离子；
图8是本发明甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料的创面愈合结果，其中Control为不加任何材料，A为甲壳素，B为甲壳素+双亲离子，C为甲壳素+季铵盐，D为甲壳素+季铵盐/双亲离子；每组中左侧代表直接0.6cm的标准化小圆片，右侧代表小鼠创面面积；
图9是本发明3天和7天时甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料的创面愈合结果，其中Control为不加任何材料，A为甲壳素，B为甲壳素+双亲离子，C为甲壳素+季铵盐，D为甲壳素+季铵盐/双亲离子；
图10是本发明甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料的新生上皮长度结果的电镜图，其中Control为不加任何材料，A为甲壳素，B为甲壳素+双亲离子，C为甲壳素+季铵盐，D为甲壳素+季铵盐/双亲离子；
图11是本发明本发明甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料的新生上皮长度结果的柱状图，其中Control为不加任何材料，A为甲壳素，B为甲壳素+双亲离子，C为甲壳素+季铵盐，D为甲壳素+季铵盐/双亲离子。
具体实施方式
以下将配合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
本发明公开了一种甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、预处理：将贝壳浸入质量百分含量为3％-8％的HCl溶液3天，制备得到预处理后的贝壳；
步骤2、合成抗菌单体：将N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基溶于乙腈(MeCN)，得到质量浓度为10％-20％的N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基的乙腈溶液，然后向N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基的乙腈溶液中加入己基溴(摩尔比：N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基己基溴＝1:1-1:1.5)，混合物在75-85℃的剧烈搅拌下反应12-20小时；搅拌处理转速为50-80r/min；反应完成后，使用真空过滤将混合物过滤，最后在冷冻干燥后得到白色固体(a)，即为抗菌单体N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基己基-1-铵(ADMHA，a)；其中，真空过滤温度为35-40℃，真空过滤时间为45-75min；冷冻干燥温度为-25℃--15℃，冷冻干燥时间为45-75min；
步骤3、将步骤1中制备得到的预处理后的贝壳表面增加氨基：将氨丙基硅油(APMS)加入到稀酸性酸(8％-12％，体积浓度)和乙醇溶液中，得到混合溶液，然后将步骤1中制备得到的预处理后的贝壳浸入混合溶液中浸泡12-18分钟；用水洗壳15次，然后进行冻干，制备得到冻干贝壳(b)，其中，氨丙基硅油、稀酸性酸和乙醇的体积比为1-5：4-8:100；
步骤4、具有抗菌表面的壳的制备：
使用可逆的加成断裂链转移(RAFT)来制备抗菌和防污表面；首先通过COOH-和NH2-基团的反应将N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基(RAFT试剂)加入到步骤3制备得到的冻干贝壳(b)表面上，然后使用RAFT试剂在表面上加入抗菌和防污分子，具体地，
在20ml烧杯中加入10mlN,N-二甲基甲酰胺，36.4gN-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基和28.7g EDC-HCl，混合均匀后在室温下泡入冻干贝壳(b)。三天后将冻干贝壳(b)取出，用N,N-二甲基甲酰胺和水清洗壳，冻干后得到RAFT-shell(A)，即为甲壳素。季铵盐有很好的抗菌功效，因此使用季铵盐分子为抗菌分子处理RAFT-shell(A)。将RAFT-shell(A)泡入含有N，N-二甲基甲酰胺、抗菌单体(a)和偶氮二异丁腈中，用N2去气15-25min后，将烧瓶放在55-65℃下过夜反应。反应结束后用N，N-二甲基甲酰胺和水清洗材料并冻干，得到甲壳素+季铵盐材料(C)，其中，N，N-二甲基甲酰胺、抗菌单体和偶氮二异丁腈的配比为8-12ml：0.1-0.3g：8-12mg；
步骤5、具有抗粘连表面的壳的制备：将使用具有CF3-结构的分子来执行抗粘连性能，
首先，将N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和偶氮二异丁腈(AIBN)加入20ml的烧瓶中，搅拌均匀后泡入RAFT-shell(A)，冰镇条件下N2除气15-25min，然后将烧瓶放入55-65℃的温度条件下反应过夜。反应结束后用氯仿、N，N-二甲基甲酰胺和水依次清洗壳并冻干，制备得到甲壳素+双亲离子材料(B)，其中，N，N-二甲基甲酰胺，2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和偶氮二异丁腈的配比为8-12ml：0.1-0.3g：8-12mg。
步骤6、甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料的制备：
将N，N-二甲基甲酰胺、2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和偶氮二异丁腈加入烧瓶中，搅拌均匀后泡入甲壳素+双亲离子材料(B)，冰镇条件下N2除气15-25min，然后将烧瓶放入55-65℃的温度条件下反应过夜。反应结束后用氯仿,N,N-二甲基甲酰胺和水依次清洗壳并冻干，即为甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料(D)，其中，N，N-二甲基甲酰胺，2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和偶氮二异丁腈的配比为8-12ml：0.1-0.3g：8-12mg；本发明甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料材料的制备及评价简示如图1所示。
实施例1
一种甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、预处理：将贝壳浸入质量百分含量为5％的HCl溶液3天，制备得到预处理后的贝壳；
步骤2、合成抗菌单体：
将N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基溶于乙腈(MeCN)，得到质量浓度为15％的N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基的乙腈溶液，然后向N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基的乙腈溶液中加入己基溴(摩尔比：N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基己基溴＝1:1.2)，在80℃下混合物在剧烈搅拌下反应16小时，搅拌转速为65r/min；反应完成后，使用真空过滤(37℃，1小时)将混合物过滤，最后在冷冻干燥(-20℃，1小时)后得到白色固体(a)，即为抗菌单体N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基己基-1-铵(ADMHA)；
步骤3、将步骤1中制备得到的预处理后的贝壳表面增加氨基：将0.3ml氨丙基硅油加入到0.6ml稀酸性酸(10％，体积浓度)和10ml乙醇溶液中，得到混合溶液，然后将贝壳浸入混合溶液中浸泡15分钟；用水洗壳15次，然后进行冻干，制备得到冻干贝壳(b)；
步骤4、具有抗菌表面的壳的制备：
在20ml烧杯中加入10mlN,N-二甲基甲酰胺，36.4g N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基和28.7Gedc-HCl，混合均匀后在室温下泡入冻干贝壳(b)。三天后将B取出，用N，N-二甲基甲酰胺和水清洗壳，冻干后得到RAFT-shell(A)。将C泡入含有10ml N,N-二甲基甲酰胺，0.2g抗菌单体(a)和10mg偶氮二异丁腈中，用N2去气20min后，将烧瓶放在60℃下过夜反应。反应结束后用N,N-二甲基甲酰胺和水清洗材料并冻干，得到甲壳素+季铵盐材料(C)。
步骤5、具有抗粘连表面的壳的制备：
将10mlN,N-二甲基甲酰胺，0.2g 2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和10mg偶氮二异丁腈加入20ml的烧瓶中，搅拌均匀后泡入RAFT-shell(A)，冰镇条件下N2除气20min，然后将烧瓶放入60℃反应过夜。反应结束后用氯仿、N,N-二甲基甲酰胺和水依次清洗壳并冻干，制备得到甲壳素+双亲离子材料(B)。
步骤6、甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料的制备：
将10mlN,N-二甲基甲酰胺，0.2g 2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和10mg偶氮二异丁腈加入20ml的烧瓶中，搅拌均匀后泡入甲壳素+双亲离子材料(B)，冰镇条件下N2除气20min，然后将烧瓶放入60℃反应过夜。反应结束后用氯仿、N，N-二甲基甲酰胺和水依次清洗壳并冻干，得甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料(D)。
实施例2
一种甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、预处理：将贝壳浸入质量百分含量为3％的HCl溶液3天，制备得到预处理后的贝壳；
步骤2、合成抗菌单体：将N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基溶于乙腈(MeCN)，得到质量浓度为20％的N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基的乙腈溶液，然后向N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基的乙腈溶液中加入己基溴(摩尔比：N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基己基溴＝1:1)，在75℃的剧烈搅拌条件下反应20小时，搅拌处理转速为50r/min；反应完成后，使用真空过滤将混合物过滤，最后在冷冻干燥后得到白色固体(a)，即为抗菌单体N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基己基-1-铵(ADMHA，a)；真空过滤温度为35℃，真空过滤时间为75min；冷冻干燥温度为-25℃，冷冻干燥时间为75min；
步骤3、将步骤1中制备得到的预处理后的贝壳表面增加氨基：将0.1ml氨丙基硅油(APMS)加入到0.8ml稀酸性酸(8％，体积浓度)和10ml乙醇溶液中，得到混合溶液，然后将步骤1中制备得到的预处理后的贝壳浸入混合溶液中浸泡12分钟；用水洗壳15次，然后进行冻干，制备得到冻干贝壳(b)；
步骤4、具有抗菌表面的壳的制备：
在20ml烧杯中加入10mlN,N-二甲基甲酰胺，36.4g N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基和28.7g EDC-HCl，混合均匀后在室温下泡入冻干贝壳(b)。三天后将冻干贝壳(b)取出，用N,N-二甲基甲酰胺和水清洗壳，冻干后得到RAFT-shell(A)，即为甲壳素。季铵盐有很好的抗菌功效，因此使用季铵盐分子为抗菌分子处理RAFT-shell(A)。将RAFT-shell(A)泡入含有N，N-二甲基甲酰胺、抗菌单体(a)和偶氮二异丁腈中，用N2去气15min后，将烧瓶放在65℃下过夜反应。反应结束后用N，N-二甲基甲酰胺和水清洗材料并冻干，得到甲壳素+季铵盐材料(C)，其中，N，N-二甲基甲酰胺、抗菌单体和偶氮二异丁腈的配比为8ml：0.3g：8mg；
步骤5、具有抗粘连表面的壳的制备：
首先，将N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和偶氮二异丁腈(AIBN)加入20ml的烧瓶中，搅拌均匀后泡入RAFT-shell(A)，冰镇条件下N2除气15min，然后将烧瓶放入65℃的温度条件下反应过夜。反应结束后用氯仿、N，N-二甲基甲酰胺和水依次清洗壳并冻干，制备得到甲壳素+双亲离子材料(B)，其中，N，N-二甲基甲酰胺，2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和偶氮二异丁腈的配比为8ml：0.3g：8mg。
步骤6、甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料的制备：
将N,N-二甲基甲酰胺、2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和偶氮二异丁腈加入烧瓶中，搅拌均匀后泡入甲壳素+双亲离子材料(B)，冰镇条件下N2除气15min，然后将烧瓶放入65℃的温度条件下反应过夜。反应结束后用氯仿,N,N-二甲基甲酰胺和水依次清洗壳并冻干，即为甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料(D)，其中，N，N-二甲基甲酰胺，2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和偶氮二异丁腈的配比为8ml：0.3g：12mg。
实施例3
一种甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、预处理：将贝壳浸入质量百分含量为8％的HCl溶液3天，制备得到预处理后的贝壳；
步骤2、合成抗菌单体：将N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基溶于乙腈(MeCN)，得到质量浓度为10％的N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基的乙腈溶液，然后向N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基的乙腈溶液中加入己基溴(摩尔比：N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基己基溴＝1:1.5)，混合物在剧烈搅拌下在85℃下反应12小时；反应完成后，使用真空过滤将混合物过滤，最后在冷冻干燥后得到白色固体(a)，即为抗菌单体N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基己基-1-铵(ADMHA，a)；其中，搅拌处理温度为85℃，搅拌处理时间为12小时，搅拌处理转速为80r/min；真空过滤温度为40℃，真空过滤时间为45min；冷冻干燥温度为-15℃，冷冻干燥时间为45min；
步骤3、将步骤1中制备得到的预处理后的贝壳表面增加氨基：将0.5ml氨丙基硅油(APMS)加入到0.4ml稀酸性酸(12％，体积浓度)和10ml乙醇溶液中，得到混合溶液，然后将步骤1中制备得到的预处理后的贝壳浸入混合溶液中浸泡18分钟；用水洗壳15次，然后进行冻干，制备得到冻干贝壳(b)；
步骤4、具有抗菌表面的壳的制备：
在20ml烧杯中加入10mlN,N-二甲基甲酰胺，36.4g N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基和28.7g EDC-HCl，混合均匀后在室温下泡入冻干贝壳(b)。三天后将冻干贝壳(b)取出，用N,N-二甲基甲酰胺和水清洗壳，冻干后得到RAFT-shell(A)，即为甲壳素。季铵盐有很好的抗菌功效，因此使用季铵盐分子为抗菌分子处理RAFT-shell(A)。将RAFT-shell(A)泡入含有N，N-二甲基甲酰胺、抗菌单体(a)和偶氮二异丁腈中，用N2去气15min后，将烧瓶放在65℃下过夜反应。反应结束后用N，N-二甲基甲酰胺和水清洗材料并冻干，得到甲壳素+季铵盐材料(C)，其中，N，N-二甲基甲酰胺、抗菌单体和偶氮二异丁腈的配比为12ml：0.1g：12mg；
步骤5、具有抗粘连表面的壳的制备：将使用具有CF3-结构的分子来执行抗粘连性能，
首先，将N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和偶氮二异丁腈(AIBN)加入20ml的烧瓶中，搅拌均匀后泡入RAFT-shell(A)，冰镇条件下N2除气25min，然后将烧瓶放入55℃的温度条件下反应过夜。反应结束后用氯仿、N，N-二甲基甲酰胺和水依次清洗壳并冻干，制备得到甲壳素+双亲离子材料(B)，其中，N，N-二甲基甲酰胺，2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和偶氮二异丁腈的配比为12ml：0.1g：12mg。
步骤6、甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料的制备：
将N,N-二甲基甲酰胺、2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和偶氮二异丁腈加入烧瓶中，搅拌均匀后泡入甲壳素+双亲离子材料(B)，冰镇条件下N2除气25min，然后将烧瓶放入55℃的温度条件下反应过夜。反应结束后用氯仿,N,N-二甲基甲酰胺和水依次清洗壳并冻干，即为甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料(D)，其中，N，N-二甲基甲酰胺，2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和偶氮二异丁腈的配比为12ml：0.1g：12mg。
下面结合具体的实验数据来说明本发明的技术效果：
1、实验方法：
1.1、扫描电镜观察
将样品(甲壳素(A)与甲壳素+双亲离子/季铵盐材料(D))用去离子水小心清洗，烘干、喷金后，利用扫描电镜真空条件下观察膜的孔径结构并拍照。
1.2、材料学表征
将材料(甲壳素(A)、甲壳素+双亲离子(B)、甲壳素+季铵盐(C)与甲壳素+季铵盐/双亲离子(D))用去离子水小心清洗，烘干后，利用接触角测试仪检测样品的亲疏水性。
1.3、细菌共培养
细菌来源于第三军医大学西南医院全军烧伤研究所冻存Staphylococcusaureus(S.aureus)和Escherichia coli(E.coli)菌株，扩增细菌(摇菌过夜)至1*109CFU/ml，用LB培养基稀释菌液为1*104CFU/ml，吸取100ml菌液酶标仪检测OD值约0.07即符合标准。取2个96孔板，将各组材料放置孔中，每组3个复孔，每孔加入200ul配制菌液，37℃摇床孵育24h后测各组OD值变化，重复三次。
1.4、粘附细菌培养定量计数实验
扩增金黄色葡萄球菌和大肠杆菌(摇菌过夜)至109CFU/ml，然后稀释菌液为1*104CFU/ml。材料75％酒精室温浸泡20min灭菌后PBS洗3遍。向含膜片的孔内加入200ul稀释菌液，37℃孵育1.5hPBS后漂洗1遍。将膜材料贴于平皿的底部，展平，倒入预热冷却至45℃的LB琼脂，凝固后，37℃培养过夜。取出平皿，拍照计数，重复三次。
1.5、细胞增值抑制
取普通原代新生小鼠，剥离培养原代成纤维细胞，当细胞传至第2和第3代时可使用。细胞计数，按96孔板每孔2000个细胞计算所需要量用DMEM培养基配制。将各组材料放置孔中，每组12个复孔(测1，3，5，7日四次)，每孔加入150ul配置好的培养基，37℃孵箱放置，重复三次。
1.6、小鼠实验
1.6.1实验标本
Balb/c小鼠(雄性，体重25g左右)购于第三军医大学动物研究所，共25只，每组5只。动物饲养于SPF级饲养间，室温25℃；相对湿度：50％；昼夜节律：12小时。在实验开始前实验小鼠分单笼饲养，并提前适应一周。所有实验操作均遵从第三军医大学实验动物伦理委员会的相关伦理要求。
1.6.2小鼠皮肤全层感染缺损创面模型的制作
实验前一天小鼠1％戊巴比妥钠溶液腹腔注射(70ul/g)后脱毛备皮,并分开单笼饲养。次日，小鼠背部麻醉消毒后，使用打孔器在小鼠背部中下部制备直径约0.6mm的圆形全层皮肤缺损创面，左右对称各一个。将同细菌共培养步骤制备的金葡和大肠杆菌菌液，每孔创面各滴入5ul，细菌浓度均为108个/ml。材料用75％酒精消毒后，PBS缓冲液漂洗以彻底去除酒精，将材料贴于创面处，并用粘贴手术巾固定。伤后第0,1,3,5,7天对创面进行拍照，更换新的同种材料。
1.6.3小鼠创面愈合率及HE染色
创面愈合率：原始创面面积以及伤后各个时相点创面面积可通过IPP6.0软件进行测量，即用其AOI功能选定创面,利用“count size”测量创面像素面积,通过比例尺的换算可得出创面的面积。创面愈合率＝(原始创面面积-伤后第n天残余创面面积)/原始创面面积×100％。
HE染色：取伤后3天和7天小鼠创面组织标本，制备石蜡切片，并选取高质量图片进行HE染色，由不同的病理专家采取盲法的方式测量新生上皮长度。
2.实验结果
2.1电镜观察
如图2所示，A1-A3组甲壳素(制备中的A)在不同倍数镜下基本保留纹理完整清晰的壳膜结构；而B1-B3组甲壳素-两亲离子/季铵盐组制备中的D)，B1下可见毛刷样结构层，B2可见规则纹理结构改变，而B3可见析出铺垫的两亲离子/季铵盐晶层。
2.2材料学表征
如图3所示，甲壳素-双亲离子/季铵盐具有良好的亲水性。
2.3体外抗菌
如表1，表2，图4所示，金黄色葡萄球菌及大肠杆菌共培养12h和24h，抗菌活性D>C>B>A>Control，仅AB组间差异不明显(P>0.05)，其余组间差异有统计学意义(P<0.05)，其中，Control为不加任何材料，A为甲壳素材料，B为甲壳素+双亲离子材料，C为甲壳素+季铵盐材料，D为甲壳素+季铵盐/双亲离子材料，下同。
表1甲壳素-两亲离子/季铵盐敷料与金黄色葡萄球菌共培养的OD值变化
表2甲壳素-两亲离子/季铵盐敷料与大肠杆菌共培养的OD值变化
2.4体外抗污染
如图5和图6所示，抗污染活性D>B>C>A，且各组间差异有统计学意义(P<0.05)。具体地，如图5所示，粘附细胞数量D<B<C<A，各组间差异有统计学意义(P<0.05)；如图6所示，粘附细胞数量D<B<C<A，各组间差异有统计学意义(P<0.05)。
2.5细胞毒性
由表3及图7可知，1-5天，4组对细胞基本无增值抑制(P>0.05)，仅当到第7日时，D组对细胞有轻微增值抑制(P<0.05)。
表3甲壳素-两亲离子/季铵盐敷料对小鼠成纤维细胞增值抑制的OD值变化
2.6感染创面愈合影响
如图8和图9所示，伤后3天，Control，A，B，C，D组愈合率分别为17.9％，23.8％，29.3％，35.6％，39.7％，即D>C>B>A>Control(P<0.05)；伤后7天分别为34.6％，44.7％，59.8％，62.2％，70.4％，即D>C>B>A>Control，仅B、C组间差异不明显(P>0.05)。具体地，如图8所示，伤后7天创面愈合率分别为D>C≈B>A>Control；如图9所示，伤后3天，创面愈合率D>C>B>A>Control(P<0.05)；伤后7天创面愈合率分别为D>C≈B>A>Control，B、C组间差异不明显(P>0.05)。
2.7新生上皮长度
如图10和图11所示，伤后3天各组新生上皮长度无差异(P>0.05)；而伤后7天，Control组，A，B，C，D组创面新生上皮长度分别为635.3μm，717.2μm，843.8μm，865.7μm和951.0μm，即D>C>B>A>Control，B、C组间差异不明显(P>0.05)。如图11所示，伤后3天各组新生上皮长度无差异(P>0.05)；而伤后7天新生上皮长度D>C≈B>A>Control(P<0.05)。
3、结果：
本研究中金黄色葡萄球菌及大肠杆菌共培养12h和24h，抗菌活性D>C>B>A>Control，仅AB组间差异不明显(P>0.05)，其余组间差异有统计学意义(P<0.05)，说明甲壳素季铵盐抗菌活性明显较强，而两亲离子起到了较好的协同作用。抗污染活性D>B>C>A，且各组间差异有统计学意义(P<0.05)。说明两亲离子作为同时具有亲水性以及亲脂性的化合物，具有较好的抗污染作用，其机制可能在于通过降低了蛋白质和细菌、微生物与表面的相互作用，从而降低了附着物的黏附强度。两亲离子可通过改变表面的形貌、电荷、表面基团的移动性和机械性能也能达到降低表面能的效果。因此，将具有亲水性抗生物黏附性能的聚合物和具有疏水性聚合物或低表面能的物质相结合，研制具有高效抗生物黏附的两亲性表面，越来越成为人们研究的热点。
而由细胞毒性来看仅当到第7日时，D组对细胞有轻微增值抑制(P<0.05)。这与壳聚糖及壳聚糖季铵盐、两亲离子均具有安全、无毒的特点，所以它们可以被广泛应用于食品工业中作为食品的保鲜剂、添加剂有关。由于烧伤患者体内和体表的防御屏障均遭到破坏，机体免疫能力显著下降，广泛组织坏死、体内外菌群的侵袭等均会导致患者发生创面感染。创面感染是烧伤患者最主要的并发症和死亡原因之一，约52％-70％烧伤患者因创面感染而死亡。本发明特采用较为成熟的小鼠创面感染模型，即混合滴入烧伤感染创面常见的革兰阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰阴性菌大肠杆菌，细菌浓度均为108个/ml。伤后3天，Control，A，B，C，D组愈合率分别为17.9％，23.8％，29.3％，35.6％，39.7％，即D>C>B>A>Control(P<0.05)；伤后7天分别为34.6％，44.7％，59.8％，62.2％，70.4％，即D>C>B>A>Control，仅B、C组间差异不明显(P>0.05)。说明对感染创面而言，初期(0-3天)的季铵盐起主要的抗菌作用，即以控制感染为主。而后期(3-7天)两亲离子的抗污染作用逐步显现，且其与季铵盐的后期作用虽然原理不同，但效果基本一致。若两者如D组协同作用，则可使细菌生长受到最大化抑制。而创面愈合的进程包含两部分，即创面收缩和创面的上皮化，对于紧致型皮肤的物种而言(例如人类)，创面愈合主要靠创面的再上皮化完成。伤后3天各组新生上皮长度无差异，这主要是因为伤后3天创缘表皮仍主要处于细胞增殖和迁移的准备期，新生上皮并不明显。伤后3天各组新生上皮长度无差异(P>0.05)；而伤后7天，Control，A，B，C，D组创面新生上皮长度分别为635.3μm，717.2μm，843.8μm，865.7μm和951.0μm，即D>C>B>A>Control，B、C组间差异不明显(P>0.05)。以上结果提示了在伤后晚期(伤后7天)，甲壳素复合季铵盐/两亲离子可同时通过控制感染和抗细菌粘附，显著的促进创面的再上皮化从而加速创面的愈合,但其是否有其它促进再上皮化机制还有待进一步研究。
总而言之，本研究成功制备了甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料，且D组材料抗菌抗污染效果均较好，亦能促进创面愈合，从而为天然敷料的创面应用提供新的手段和思路。
如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定成分或方法。本领域技术人员应可理解，不同地区可能会用不同名词来称呼同一个成分。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分成分的方式。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本发明的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.一种甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、预处理：将贝壳浸入HCl溶液中3天，制备得到预处理后的贝壳；
步骤2、合成抗菌单体：将N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基溶于乙腈，得到N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基的乙腈溶液，然后向N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基的乙腈溶液中加入己基溴并进行搅拌处理，然后使用真空过滤进行过滤，在冷冻干燥后得到白色固体，即为抗菌单体N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基己基-1-铵；
步骤3、制备冻干贝壳：将氨丙基硅油加入到稀酸性酸和乙醇溶液的混合物中，得到混合溶液，然后将预处理后的贝壳浸入混合溶液中浸泡；用水洗浸泡后的贝壳15次，然后进行冻干，制备得到冻干贝壳；
步骤4、具有抗菌表面的壳的制备：将N,N-二甲基甲酰胺、N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基和gEDC-HCl加入烧杯中，然后将冻干贝壳浸入混合物中，浸泡3天；然后使用N,N-二甲基甲酰胺和水清洗冻干贝壳，冻干后得到RAFT-shell；将RAFT-shell浸入N，N-二甲基甲酰胺、抗菌单体和偶氮二异丁腈的溶液中，然后使用N2将混合物脱气，过夜反应；然后使用N，N-二甲基甲酰胺和水清洗反应后的贝壳并进行冻干处理，得到具有抗菌表面的壳；
步骤5、甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料的制备：将N,N-二甲基甲酰胺，2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和偶氮二异丁腈混合搅拌，然后加入甲壳素+双亲离子材料，冰镇条件下N2除气，然后将烧瓶放入反应过夜；反应结束后用氯仿、N，N-二甲基甲酰胺和水依次清洗壳并冻干，即为甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料。
2.根据权利要求1所述的甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料的制备方法，其特征在于，步骤1中的HCl溶液的浓度为3％-8％。
3.根据权利要求1所述的甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料的制备方法，其特征在于，步骤2中的N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基的乙腈溶液的浓度为10％-20％；N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基与己基溴的摩尔比为1:1-1:1.5；搅拌处理温度为75-85℃，搅拌处理时间为12-20小时，搅拌处理转速为50-80r/min；真空过滤温度为35-40℃，真空过滤时间为45-75min；冷冻干燥温度为-25℃--15℃，冷冻干燥时间为45-75min。
4.根据权利要求1所述的甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料的制备方法，其特征在于，步骤3中的稀酸性酸的体积浓度为8％-12％；氨丙基硅油、稀酸性酸和乙醇的体积比为1-5：4-8:100；浸泡时间为12-18分钟。
5.根据权利要求1所述的甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料的制备方法，其特征在于，步骤4中的N,N-二甲基甲酰胺、N-(2-(丙烯酰氧基)乙基)-N，N-二甲基和gEDC-HCl的配比为10ml：36.4g:28.7g；N，N-二甲基甲酰胺、抗菌单体和偶氮二异丁腈的配比为8-12ml：0.1-0.3g：8-12mg；脱气时间为15-25分钟，反应温度为55-65℃。
6.根据权利要求1所述的甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料的制备方法，其特征在于，步骤5中的N，N-二甲基甲酰胺，2,2,3,3,4,4,4-七氟丙烯酸酯和偶氮二异丁腈的配比为8-12ml：0.1-0.3g：8-12mg；脱气时间为15-25分钟，反应温度为55-65℃。
7.一种由权利要求1-6中任一权利要求所述的制备方法制备得到的甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料。
8.一种由权利要求7所述的甲壳素-两亲离子/季铵盐天然敷料在制备治疗创面愈合药物中的应用。
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