CN107119018A

CN107119018A - 一种抗凋亡细胞系及其建立方法和应用

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Publication number: CN107119018A
Application number: CN201710202547.3A
Authority: CN
Inventors: 夏海滨; 张伟锋; 肖丹; 单琳琳
Original assignee: Shaanxi Normal University
Current assignee: Shaanxi Normal University
Priority date: 2017-03-30
Filing date: 2017-03-30
Publication date: 2017-09-01
Anticipated expiration: 2037-03-30
Also published as: CN107119018B

Abstract

本发明公开了一种抗凋亡细胞系，在真核细胞中缺失了Caspase3、Caspase6、Caspase7、AIF1中的三个或四个基因。并给出了抗凋亡细胞系的建立方法，包括筛选靶向Caspase3、Caspase6、Caspase7和AIF1基因外显子区的sgRNA，构建携带Cas9、sgRNA、puromycin表达元件的真核表达载体，建立Caspase3敲除的真核细胞系，建立Caspase3、Caspase6、Caspase7和AIF1敲除的真核细胞系，所建立的抗凋亡的细胞系能够应用于蛋白的表达以及腺病毒包装、腺相关病毒包装以及慢病毒包装。

Description

一种抗凋亡细胞系及其建立方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗凋亡细胞系及其建立方法，以及该抗凋亡的细胞系的应用。

背景技术

细胞凋亡在细胞的生理和病理中发挥着重要的作用。然而在生物工程中，细胞凋亡却有着负面的影响。在蛋白的表达或者病毒的包装中，尤其是在表达一些促凋亡蛋白或者包装携带促凋亡基因的病毒时，常常由于宿主细胞的凋亡无法获得高的蛋白或病毒产量。虽然已有一些方法可以对细胞凋亡产生一定的抑制效果，包括siRNA干扰Bax和Bak基因以及通过锌指核酸酶敲除Bax和Bak基因等，但是这些方法都不太彻底，效果并不理想。Caspase3、Caspase6、Caspase7和AIF1是细胞凋亡途径中的最后的执行分子，因此通过敲除这四个基因有可能使细胞获得抗凋亡效果，目前还没有相关的研究报道。

CRISPR/Cas技术是近几年发展起来的第三代基因编辑技术，与前两代基因编辑技术(锌指核酸酶技术和转录激活因子样效应物核酸酶技术)相比，CRISPR/Cas技术更加的简单易行、成本低，而且非常适用于多基因编辑。CRISPR/Cas对基因组进行靶向的切割后，细胞通过非同源末端连接途径对断裂位点进行修复，从而造成靶位点的突变。将Cas9核酸内切酶与多个sgRNA同时转入到靶细胞就可以实现多基因同时敲除。

综上，CRISPR/Cas技术对细胞凋亡相关的四个执行分子Caspase3、Caspase6、Caspase7和AIF1进行敲除，从而获得具有抗凋亡能力的细胞。使蛋白表达或病毒包装的效率得到提高。尤其是对于促凋亡相关蛋白的表达或者携带促凋亡相关基因的病毒包装具有重要意义。

发明内容

针对上述抗细胞系存在的技术难题，本发明的目的在于，提供一种抗凋亡细胞系及其建立方法，并将该抗凋亡的细胞系应用于蛋白的表达以及腺病毒包装、腺相关病毒包装以及慢病毒包装。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种抗凋亡细胞系，其特征在于，在真核细胞中缺失了Caspase3、Caspase6、Caspase7、AIF1中的三个或四个基因。

根据本发明，所述的真核细胞是HEK293细胞或HEK293T细胞。

所说的缺失是指在HEK293细胞或HEK293T细胞的编码区发生了基因突变，造成该基因功能的丧失，突变类型是缺失碱基、插入碱基、碱基替换中的任意一种或2-3种突变类型的组合。

根据本发明，所述的真核细胞是HEK293细胞，在HEK293细胞中敲除Caspase3、Caspase6、Caspase7和AIF1四个基因。

上述抗凋亡细胞系的建立方法，其特征在于，由下述步骤组成：

(1)筛选靶向Caspase3、Caspase6、Caspase7和AIF1基因外显子区的sgRNA

从NCBI查找Caspase3、Caspase6、Caspase7和AIF1四个基因的基因组序列，分别在每个基因的外显子区选择四个sgRNA结合位点并设计相应的sgRNA引物，将sgRNA引物退火后连接到sgRNA表达载体，与Cas9表达载体共转染到HEK293细胞后，收集基因组DNA通过T7E1检测每个sgRNA的切割效率，从靶向每个基因的sgRNA中挑选一个效率最高的待用；

(2)构建携带Cas9、sgRNA、puromycin表达元件的真核表达载体

将筛选获得的靶向Caspase3基因的sgRNA表达元件、Cas9表达元件、puromycin表达元件依次插入到真核表达载体，获得pCas9-Casp3 sgRNA-puromycin。将靶向Caspase6、Caspase7和AIF1的sgRNA表达元件串联，与Cas9表达元件、puromycin表达元件依次插入到真核表达载体，获得pCas9-CCA sgRNAs-puromycin；

(3)建立Caspase3敲除的真核细胞系

将pCas9-Casp3 sgRNA-puromycin转染目标细胞，转染24小时后用puromycin筛选24-48小时，进行克隆化，获得Caspase3敲除的真核细胞系；

(4)建立Caspase3、Caspase6、Caspase7和AIF1敲除的真核细胞系

将pCas9-CCA sgRNAs-puromycin转染Caspase3敲除的细胞系，转染24小时后用puromycin筛选24-48小时，进行克隆化，获得Caspase3、Caspase6、Caspase7和AIF1敲除的真核细胞系。

本发明采用CRISPR/Cas介导的靶向基因修饰技术在HEK293细胞或HEK293T细胞中敲除Caspase3、Caspase6、Caspase7和AIF1中的三个基因或四个基因，根据申请人的实验表明，所建立的抗凋亡的细胞系能够应用于蛋白的表达以及腺病毒包装、腺相关病毒包装以及慢病毒包装。

附图说明

图1是sgRNA表达载体结构示意图。

图2是sgRNA切割效率T7E1检测结果。

图3是pU6/CCA sgRNAs结构及构建过程图示。

图4是同时携带sgRNA、Cas9、puromycin的多基因打靶载体结构示意图。

图5是CCCA KO HEK293细胞系基因组测序结果。

图6是CCCA KO HEK293细胞系蛋白水平检测。

图7是CCCA KO HEK293细胞系抗凋亡能力检测结果。

图8是BAX蛋白表达水平检测结果。

图9是携带Bax基因的腺病毒包装结果。

图10是携带Bax基因的慢病毒包装结果。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，这些实施例是较优的例子，本发明不限于这些实施例。

具体实施方式

为了提高多基因敲除的效果，申请人构建了携带筛选基因的靶向多基因敲除载体，即将Cas9、多个sgRNA、以及筛选基因同时插入到同一个真核表达载体，在转染后，通过筛选基因的筛选使携带多基因敲除载体的细胞得到富集，从而提高多基因打靶效率。

上述抗凋亡细胞系的建立方法，包括筛选靶向Caspase3、Caspase6、Caspase7和AIF1四个基因的sgRNA，构建携带Cas9、靶向Caspase3、Caspase6、Caspase7和AIF1四个基因的sgRNA、筛选基因的多基因敲除载体，将多基因敲除载体导入细胞用筛选基因筛选，将筛选后的细胞克隆化，克隆化的细胞克隆进行测序鉴定。并且证明了该抗凋亡细胞系能够在蛋白表达和病毒包装中的应用。

以下是发明人给出的具体实施例。

实施例1：

以下是以Caspase3、Caspase6、Caspase7和AIF1敲除的HEK293细胞系CCCA KOHEK293为例的具体实例。

1、CCCA KO HEK293细胞系结构如下

该HEK293细胞系的Caspase3、Caspase6、Caspase7和AIF1四个基因编码区DNA基因组序列发生了变化，发生变化的基因组序列分别位于Caspase3的第8个外显子、Caspase6的第5个外显子、Caspase7的第8个外显子、AIF1的第11个外显子，其它基因组序列与野生型HEK293细胞相同。

发生变化的基因组序列如下：

Caspase3 allele A(Exon8)：

CATCCAGTCGCTTTGTGCCATGCTGAAACAGTATGCCGACAAGCTTGAATTTATGCACATTCTTACCCGGGTTAACCGAAAGGTGGCAACAGAATTTGAGTCCTTTTCCTTTGACGCTACTTTTCATGCAAAGAAACAGATTCCATGTATTGTTTCCATGCTCACAAAAGAACTCTATTTTTATCACTAAAGAAATGGTTGGTTGGTGGTTTTTTTTAGTTTGTATGCCAAGTGAGAAGATGGTATATTTGGTACTGTATTTCCCTCTCATTTTGACCTACTCTCATGCTGCAGAGGGTACTTTAAGACATACTCCTTCCATCAAATAGAACCACTATGAAGCTACCTCAAACTTCCAGTCAGGTAGTTGCAATTGAATTAAATTAGGAATAAATAAAAATGGATACTGGTGCAGTCATTATGAGAGGCAATGATTGTTAATTTACAGCTTTCATGATTAGCAAGTTACAGTGATGCTGTGCTATGAATTTTCAAGTAATTGTGAAAAAGTTAAACATTGAAGTAATGAATTTTTATGATATTCCCCCCACTTAAGACTGTGTATTCTAGTTTTGTCAAACTGTAGAAATGATGATGTGGAAGAACTTAGGCATCTGTGGGCATGGTCAAAGGCTCAAACCTTTATTTTAGAATTGATATACACGGATGACTTAACTGCATTTTTAGACCATTTATCTGGGATTATGGTTTTGTGATGTTTGTCCTGAACACTTTTGTTGTAAAAAAATAATAATAATGTTTAATATTGAGAAAGAAACTAATATTTTATGTGAGAGAAAGTGTGAGCAAACTAACTTGACTTTTAAGGCTAAAACTTAACATTCATAGAGGGGTGGAGTTTTAACTGTAAGGTGCTACAATGCCCCTGGATCTACCAGCATAAATATCTTCTGATTTGTCCCTATGCATATCAGTTGAGCTTCATATACCAGCAATATATCTGAAGAGCTATTATATAAAAACCCCAAACTGTTGATTATTAGCCAGGTAATGTGAATAAATTCTATAGGAACATATGAAAATACAACTTAAATAATAAACAGTGGAATATAAGGAAAGCAATAAATGAATGGGCTGAGCTGCCTGTAACTTGAGAGTAGATGGTTTGAGCCTGAGCAGAGACATGACTCAGCCTGTTCCATGAAGGCAGAGCCATGGACCACGCAGGAAGGGCCTACAGCCCATTTCTCCATACGCACTGGTATGTGTGGATGATGCTGCCAGGGCGCCATCGCCAAGTAAGAAAGTGAAGCAAATCAGAAACTTGTGAAGTGGAAATGTTCTAAAGGTGGTGAGGCAATAAAAATCATAGTACTCTTTGTAGCAAAATTCTTAAGTATGTTATTTTCTGTTGAAGTTTACAATCAAAGGAAAATAGTAATGTTTTATACTGTTTACTGAAAGAAAAAGACCTATGAGCACATAGGACTCTAGACGGCATCCAGCCGGAGGCCAGAGCTGAGCCCTCAGCCCGGGAGGCAGGCTCCAGGCCTCAGCAGGTGCGGAGCCGTCACTGCACCAAGTCTCACTGGCTGTCAGTATGACATTTCACGGGAGATTTCTTGTTGCTCAAAAAATGAGCTCGCATTTGTCAATGACAGTTTCTTTTTTCTTACTAGACCTGTAACTTTTGTAAATACACATAGCATGTAATGGTATCTTAAAGTGTGTTTCTATGTGACAATTTTGTACAAATTTGTTATTTTCCATTTTTATTTCAAAATATACATTCAAACTTAAAATTA。

Caspase3 allele B(Exon8)：

GTTATTATTCTTGGCGAAATTTCAAAGGATGGCTCCTGGTTCATCCAGTCGCTTTGTGCCATGCTGAAACAGTATGCCGACAAGCTTGAATTTATGCACATTCTTACCCGGGTTAACCGAAAGGTGGCAACAGAATTTGAGTCCTTTTCCTTTGACGCTACTTTTCATGCAAAGAAACAGATTCCATGTATTGTTTCCATGCTCACAAAAGAACTCTATTTTTATCACTAAAGAAATGGTTGGTTGGTGGTTTTTTTTAGTTTGTATGCCAAGTGAGAAGATGGTATATTTGGTACTGTATTTCCCTCTCATTTTGACCTACTCTCATGCTGCAGAGGGTACTTTAAGACATACTCCTTCCATCAAATAGAACCACTATGAAGCTACCTCAAACTTCCAGTCAGGTAGTTGCAATTGAATTAAATTAGGAATAAATAAAAATGGATACTGGTGCAGTCATTATGAGAGGCAATGATTGTTAATTTACAGCTTTCATGATTAGCAAGTTACAGTGATGCTGTGCTATGAATTTTCAAGTAATTGTGAAAAAGTTAAACATTGAAGTAATGAATTTTTATGATATTCCCCCCACTTAAGACTGTGTATTCTAGTTTTGTCAAACTGTAGAAATGATGATGTGGAAGAACTTAGGCATCTGTGGGCATGGTCAAAGGCTCAAACCTTTATTTTAGAATTGATATACACGGATGACTTAACTGCATTTTTAGACCATTTATCTGGGATTATGGTTTTGTGATGTTTGTCCTGAACACTTTTGTTGTAAAAAAATAATAATAATGTTTAATATTGAGAAAGAAACTAATATTTTATGTGAGAGAAAGTGTGAGCAAACTAACTTGACTTTTAAGGCTAAAACTTAACATTCATAGAGGGGTGGAGTTTTAACTGTAAGGTGCTACAATGCCCCTGGATCTACCAGCATAAATATCTTCTGATTTGTCCCTATGCATATCAGTTGAGCTTCATATACCAGCAATATATCTGAAGAGCTATTATATAAAAACCCCAAACTGTTGATTATTAGCCAGGTAATGTGAATAAATTCTATAGGAACATATGAAAATACAACTTAAATAATAAACAGTGGAATATAAGGAAAGCAATAAATGAATGGGCTGAGCTGCCTGTAACTTGAGAGTAGATGGTTTGAGCCTGAGCAGAGACATGACTCAGCCTGTTCCATGAAGGCAGAGCCATGGACCACGCAGGAAGGGCCTACAGCCCATTTCTCCATACGCACTGGTATGTGTGGATGATGCTGCCAGGGCGCCATCGCCAAGTAAGAAAGTGAAGCAAATCAGAAACTTGTGAAGTGGAAATGTTCTAAAGGTGGTGAGGCAATAAAAATCATAGTACTCTTTGTAGCAAAATTCTTAAGTATGTTATTTTCTGTTGAAGTTTACAATCAAAGGAAAATAGTAATGTTTTATACTGTTTACTGAAAGAAAAAGACCTATGAGCACATAGGACTCTAGACGGCATCCAGCCGGAGGCCAGAGCTGAGCCCTCAGCCCGGGAGGCAGGCTCCAGGCCTCAGCAGGTGCGGAGCCGTCACTGCACCAAGTCTCACTGGCTGTCAGTATGACATTTCACGGGAGATTTCTTGTTGCTCAAAAAATGAGCTCGCATTTGTCAATGACAGTTTCTTTTTTCTTACTAGACCTGTAACTTTTGTAAATACACATAGCATGTAATGGTATCTTAAAGTGTGTTTCTATGTGACAATTTTGTACAAATTTGTTATTTTCCATTTTTATTTCAAAATATACATTCAAACTTAAAATTA。

Caspase6 allele A(Exon5)：

TGTCAACTGTTAGCCACGCAGATGCCGATTGCTTTGTGTGTGTCTTCCTGAGCCATGGGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAACGAAGGCAATCACATTTATGCATATGATGCTAAAATCGAAATTCAGACATTAACTGGCTTGTTCAAAGGAGACAAGTGTCACAGCCTGGTTGGAAAACCCAAGATATTTATCATTCAG。

Caspase6 alleleB(Exon5)：

TGTCAACTGTTAGCCACGCAGATGCCGATTGCTTTGTGTGTGTCTTCCTGAGCAAGGCAATCACATTTATGCATATGATGCTAAAATCGAAATTCAGACATTAACTGGCTTGTTCAAAGGAGACAAGTGTCACAGCCTGGTTGGAAAACCCAAGATATTTATCATTCAG。

Caspase7 allele A(Exon8)：

GTATGGGAACAGACAAAGATGCCGAGGCGCTCTTCAAGTGCTTCCGAAGCCTGGGTTTTGACGTGATTGTCTATAATGACTGCTCTTGTGCCAAGATGCAAGATCTGCTTAAAAAAG。

Caspase7 allele B(Exon8)：

GTATGGGCGTTCGAACGGAACAGACAAAGATGCCGAGGCGCTCTTCAAGTGCTTCCGAAGCCTGGGTTTTGACGTGATTGTCTATAATGACTGCTCTTGTGCCAAGATGCAAGATCTGCTTAAAAAAG。

AIF1 allele A(Exon11)：

AGGGGGTTAAGGTGATGCCCAATGCTATTGTGCAATCCGTTGGAGTCAGCAGTGGCAAGTTACTTATCAAGCTGAAAGACGGCAAGGAAGG。

AIF1 allele B(Exon11)：

AGGGGGTTAAGGTGATGCCCAATGCTATTGTGCAATCCGTTGGAGTCAGCAGTGGCAAGTTACTTATCAAGCTGAAAGACGGCCCCGAGAGACACAGGGACTCTGCCCTGCAGTGTGGAAGGCATGTGTGCCCCGGCCCCACTGCTGACTTGGGGATGCAGGTCTGCACCTGGGGGAAGTGCCCGGGGCCTATGCTGGAAGG。

发生变化的DNA序列也可位于Caspase3、Caspase6、Caspase7、AIF1基因的其它编码区。

2、CCCA KO HEK293细胞系的构建过程如下

(1)sgRNA的设计和筛选

在金斯瑞生物科技有限公司将pUC19(addgene购买)载体中的BsaI酶切位点通过PCR定点突变，获得pUC19/BM。

在华大基因公司合成以下引物：

EMBHL for：AATTACGCGTGGTACCTTGAATTCTTACTAGTTTAGATCT；

EMBHLreverse：AGCTAGATCTAAACTAGTAAGAATTCAAGGTACCACGCGT；

将P1/P2在室温退火后，与经过HindIII和EcoRI酶切处理的pUC19/BM载体连接，获得pUC19/BM-EMBHL。

在华大基因公司合成U6-sgRNA backbone DNA片段，序列如下：

GGTACCAATCTAGAAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGAGACCGAATTCGGTCTCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTACTAGT。

将U6-sgRNA backbone用KpnI和SpeI酶切后与经过同样酶切处理的pUC19/BM-EMBHL载体连接，获得sgRNA表达载体pU6-sgRNA，载体结构见附图1。

从NCBI查找Caspase3、Caspase6、Caspase7、AIF1四个基因的基因组序列，编号如下：Caspase3(AC_000136)、Caspase6(NG_029187)、Caspase7(NC_000010)、AIF1(NG_013217)，分别在每个基因的编码区选择四个sgRNA结合位点并设计引物，序列如下：

Human Caspase3 sgRNA1 for：ACCGTTGTGGAATTGATGCGTGA；

Human Caspase3 sgRNA1 reverse：AAACTCACGCATCAATTCCACAA；

Human Caspase3 sgRNA2 for：ACCGTATTCTTGGCGAAATTCAA；

Human Caspase3 sgRNA2 reverse：AAACTTGAATTTCGCCAAGAATA；

Human Caspase3 sgRNA3 for：ACCGCTTACCCGGGTTAACCGAA；

Human Caspase3 sgRNA3 reverse：AAACTTCGGTTAACCCGGGTAAG；

Human Caspase3 sgRNA4 for：ACCGACCCGGGTTAACCGAAAGG；

Human Caspase3 sgRNA4 reverse：AAACCCTTTCGGTTAACCCGGGT；

Human Caspase6 sgRNA1 for：ACCGAAAGCAATCGGCATCTGCG；

Human Caspase6 sgRNA1 reverse：AAACCGCAGATGCCGATTGCTTT；

Human Caspase6 sgRNA2 for：ACCGTCTTCCTGAGCCATGGCGA；

Human Caspase6 sgRNA2 reverse：AAACTCGCCATGGCTCAGGAAGA；

Human Caspase6 sgRNA3 for:ACCGATTGCCTTCGCCATGGCTC；

Human Caspase6 sgRNA3 reverse：AAACGAGCCATGGCGAAGGCAAT；

Human Caspase6 sgRNA4 for:ACCGAATGTGATTGCCTTCGCCA；

Human Caspase6 sgRNA4 reverse:AAACTGGCGAAGGCAATCACATT；

Human Caspase7 sgRNA1 for：ACCGCAGGTATGGGCGTTCGAAA；

Human Caspase7 sgRNA1 reverse:AAACTTTCGAACGCCCATACCTG；

Human Caspase7 sgRNA2 for:ACCGGACAATCACGTCAAAACCC；

Human Caspase7 sgRNA2 reverse：AAACGGGTTTTGACGTGATTGTC；

Human Caspase7 sgRNA3 for:ACCGAAGCACTTGAAGAGCGCCT；

Human Caspase7 sgRNA3 reverse：AAACAGGCGCTCTTCAAGTGCTT；

Human Caspase7 sgRNA4 for：ACCGTTCAAGTGCTTCCGAAGCC；

Human Caspase7 sgRNA4 reverse：AAACGGCTTCGGAAGCACTTGAA；

Human AIF1 sgRNA1 for：ACCGCCCCGAATACCTCAGCAAC；

Human AIF1 sgRNA1 reverse：AAACGTTGCTGAGGTATTCGGGG；

Human AIF1 sgRNA2 for：ACCGAAGCTGAAAGACGGCAGGA；

Human AIF1 sgRNA2 reverse：AAACTCCTGCCGTCTTTCAGCTT；

Human AIF1 sgRNA3 for：ACCGCTGGAGCCCAATGTTGAGT；

Human AIF1 sgRNA3 reverse：AAACACTCAACATTGGGCTCCAG；

Human AIF1 sgRNA4 for:ACCGCTCAGATTTTGGTGGCTTC；

Human AIF1 sgRNA4 reverse：AAACGAAGCCACCAAAATCTGAG；

将引物两两退火形成sgRNA寡聚核苷酸，将退火形成的sgRNA寡聚核苷酸链与BsaI酶切处理的sgRNA表达载体pU6-sgRNA连接，获得相应的sgRNA表达质粒pU6/Casp3 sgRNA1、pU6/Casp3 sgRNA2、pU6/Casp3 sgRNA3、pU6/Casp3 sgRNA4、pU6/Casp6 sgRNA1、pU6/Casp6sgRNA2、pU6/Casp6 sgRNA3、pU6/Casp6 sgRNA4、pU6/Casp7 sgRNA1、pU6/Casp7 sgRNA2、pU6/Casp7 sgRNA3、pU6/Casp7 sgRNA4、pU6/AIF1 sgRNA1、pU6/AIF1 sgRNA2、pU6/AIF1sgRNA3、pU6/AIF1 sgRNA4。

在华大基因公司合成Cas9表达元件CMV-Cas9-SV40pA和puro-T2A-mcherry表达元件CMV-puro-T2A-mcherry，序列如下：

CMV-Cas9-SV40pA：

ACGCGTGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATgccaccATGGACAAGAAGTACTCCATTGGGCTCGATATCGGCACAAACAGCGTCGGCTGGGCCGTCATTACGGACGAGTACAAGGTGCCGAGCAAAAAATTCAAAGTTCTGGGCAATACCGATCGCCACAGCATAAAGAAGAACCTCATTGGCGCCCTCCTGTTCGACTCCGGGGAGACGGCCGAAGCCACGCGGCTCAAAAGAACAGCACGGCGCAGATATACCCGCAGAAAGAATCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTTAGTAATGAGATGGCTAAGGTGGATGACTCTTTCTTCCATAGGCTGGAGGAGTCCTTTTTGGTGGAGGAGGATAAAAAGCACGAGCGCCACCCAATCTTTGGCAATATCGTGGACGAGGTGGCGTACCATGAAAAGTACCCAACCATATATCATCTGAGGAAGAAGCTTGTAGACAGTACTGATAAGGCTGACTTGCGGTTGATCTATCTCGCGCTGGCGCATATGATCAAATTTCGGGGACACTTCCTCATCGAGGGGGACCTGAACCCAGACAACAGCGATGTCGACAAACTCTTTATCCAACTGGTTCAGACTTACAATCAGCTTTTCGAAGAGAACCCGATCAACGCATCCGGAGTTGACGCCAAAGCAATCCTGAGCGCTAGGCTGTCCAAATCCCGGCGGCTCGAAAACCTCATCGCACAGCTCCCTGGGGAGAAGAAGAACGGCCTGTTTGGTAATCTTATCGCCCTGTCACTCGGGCTGACCCCCAACTTTAAATCTAACTTCGACCTGGCCGAAGATGCCAAGCTTCAACTGAGCAAAGACACCTACGATGATGATCTCGACAATCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCAGACCTTTTTTTGGCGGCAAAGAACCTGTCAGACGCCATTCTGCTGAGTGATATTCTGCGAGTGAACACGGAGATCACCAAAGCTCCGCTGAGCGCTAGTATGATCAAGCGCTATGATGAGCACCACCAAGACTTGACTTTGCTGAAGGCCCTTGTCAGACAGCAACTGCCTGAGAAGTACAAGGAAATTTTCTTCGATCAGTCTAAAAATGGCTACGCCGGATACATTGACGGCGGAGCAAGCCAGGAGGAATTTTACAAATTTATTAAGCCCATCTTGGAAAAAATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTAAAGCTTAACAGAGAAGATCTGTTGCGCAAACAGCGCACTTTCGACAATGGAAGCATCCCCCACCAGATTCACCTGGGCGAACTGCACGCTATCCTCAGGCGGCAAGAGGATTTCTACCCCTTTTTGAAAGATAACAGGGAAAAGATTGAGAAAATCCTCACATTTCGGATACCCTACTATGTAGGCCCCCTCGCCCGGGGAAATTCCAGATTCGCGTGGATGACTCGCAAATCAGAAGAGACCATCACTCCCTGGAACTTCGAGGAAGTCGTGGATAAGGGGGCCTCTGCCCAGTCCTTCATCGAAAGGATGACTAACTTTGATAAAAATCTGCCTAACGAAAAGGTGCTTCCTAAACACTCTCTGCTGTACGAGTACTTCACAGTTTATAACGAGCTCACCAAGGTCAAATACGTCACAGAAGGGATGAGAAAGCCAGCATTCCTGTCTGGAGAGCAGAAGAAAGCTATCGTGGACCTCCTCTTCAAGACGAACCGGAAAGTTACCGTGAAACAGCTCAAAGAAGACTATTTCAAAAAGATTGAATGTTTCGACTCTGTTGAAATCAGCGGAGTGGAGGATCGCTTCAACGCATCCCTGGGAACGTATCACGATCTCCTGAAAATCATTAAAGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAGAACGAGGACATTCTTGAGGACATTGTCCTCACCCTTACGTTGTTTGAAGATAGGGAGATGATTGAAGAACGCTTGAAAACTTACGCTCATCTCTTCGACGACAAAGTCATGAAACAGCTCAAGAGGCGCCGATATACAGGATGGGGGCGGCTGTCAAGAAAACTGATCAATGGGATCCGAGACAAGCAGAGTGGAAAGACAATCCTGGATTTTCTTAAGTCCGATGGATTTGCCAACCGGAACTTCATGCAGTTGATCCATGATGACTCTCTCACCTTTAAGGAGGACATCCAGAAAGCACAAGTTTCTGGCCAGGGGGACAGTCTTCACGAGCACATCGCTAATCTTGCAGGTAGCCCAGCTATCAAAAAGGGAATACTGCAGACCGTTAAGGTCGTGGATGAACTCGTCAAAGTAATGGGAAGGCATAAGCCCGAGAATATCGTTATCGAGATGGCCCGAGAGAACCAAACTACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGTAGGGAAAGGATGAAGAGGATTGAAGAGGGTATAAAAGAACTGGGGTCCCAAATCCTTAAGGAACACCCAGTTGAAAACACCCAGCTTCAGAATGAGAAGCTCTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCAGGGACATGTACGTGGATCAGGAACTGGACATCAATCGGCTCTCCGACTACGACGTGGATCATATCGTGCCCCAGTCTTTTCTCAAAGATGATTCTATTGATAATAAAGTGTTGACAAGATCCGATAAAAATAGAGGGAAGAGTGATAACGTCCCCTCAGAAGAAGTTGTCAAGAAAATGAAAAATTATTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAACTGATCACACAACGGAAGTTCGATAATCTGACTAAGGCTGAACGAGGTGGCCTGTCTGAGTTGGATAAAGCCGGCTTCATCAAAAGGCAGCTTGTTGAGACACGCCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAAATTCTCGATTCACGCATGAACACCAAGTACGATGAAAATGACAAACTGATTCGAGAGGTGAAAGTTATTACTCTGAAGTCTAAGCTGGTCTCAGATTTCAGAAAGGACTTTCAGTTTTATAAGGTGAGAGAGATCAACAATTACCACCATGCGCATGATGCCTACCTGAATGCAGTGGTAGGCACTGCACTTATCAAAAAATATCCCAAGCTTGAATCTGAATTTGTTTACGGAGACTATAAAGTGTACGATGTTAGGAAAATGATCGCAAAGTCTGAGCAGGAAATAGGCAAGGCCACCGCTAAGTACTTCTTTTACAGCAATATTATGAATTTTTTCAAGACCGAGATTACACTGGCCAATGGAGAGATTCGGAAGCGACCACTTATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTGTGGGACAAGGGTAGGGATTTCGCGACAGTCCGGAAGGTCCTGTCCATGCCGCAGGTGAACATCGTTAAAAAGACCGAAGTACAGACCGGAGGCTTCTCCAAGGAAAGTATCCTCCCGAAAAGGAACAGCGACAAGCTGATCGCACGCAAAAAAGATTGGGACCCCAAGAAATACGGCGGATTCGATTCTCCTACAGTCGCTTACAGTGTACTGGTTGTGGCCAAAGTGGAGAAAGGGAAGTCTAAAAAACTCAAAAGCGTCAAGGAACTGCTGGGCATCACAATCATGGAGCGATCAAGCTTCGAAAAAAACCCCATCGACTTTCTCGAGGCGAAAGGATATAAAGAGGTCAAAAAAGACCTCATCATTAAGCTTCCCAAGTACTCTCTCTTTGAGCTTGAAAACGGCCGGAAACGAATGCTCGCTAGTGCGGGCGAGCTGCAGAAAGGTAACGAGCTGGCACTGCCCTCTAAATACGTTAATTTCTTGTATCTGGCCAGCCACTATGAAAAGCTCAAAGGGTCTCCCGAAGATAATGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAACAACACAAACACTACCTTGATGAGATCATCGAGCAAATAAGCGAATTCTCCAAAAGAGTGATCCTCGCCGACGCTAACCTCGATAAGGTGCTTTCTGCTTACAATAAGCACAGGGATAAGCCCATCAGGGAGCAGGCAGAAAACATTATCCACTTGTTTACTCTGACCAACTTGGGCGCGCCTGCAGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATAGACAGAAAGCGGTACACCTCTACAAAGGAGGTCCTGGACGCCACACTGATTCATCAGTCAATTACGGGGCTCTATGAAACAAGAATCGACCTCTCTCAGCTCGGTGGAGACAGCAGGGCTGACCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGTGACACCGCGGGGAGATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCASGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCCCGGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGAGGTCGACTCTAGTCCCCGCGGTGGCGGTACCGAATTCACTAGT。

CMV-puro-T2A-mcherry：

AGATCTGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAAGACAACATGGCTATCATCAAAGAGTTCATGCGGTTCAAGGTCCACATGGAGGGCTCTGTCAACGGGCACGAGTTTGAAATAGAAGGGGAAGGGGAGGGGCGGCCCTACGAAGGAACCCAAACCGCCAAGCTGAAGGTTACCAAAGGCGGGCCCCTGCCCTTTGCCTGGGACATACTGTCCCCTCAGTTTATGTACGGCTCTAAAGCCTATGTTAAACATCCTGCCGATATACCCGATTATCTGAAGCTCTCTTTTCCAGAAGGATTTAAATGGGAGCGGGTCATGAATTTCGAGGATGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGATTCTAGCCTCCAGGATGGGGAGTTTATATATAAGGTGAAGCTGCGGGGAACCAATTTCCCAAGCGACGGGCCTGTGATGCAGAAGAAGACAATGGGTTGGGAGGCCAGCTCTGAACGGATGTATCCTGAGGATGGAGCCCTGAAGGGTGAGATTAAACAGAGGCTGAAGCTCAAGGACGGCGGCCATTATGATGCCGAAGTAAAAACAACTTACAAGGCTAAGAAGCCAGTCCAGCTCCCCGGCGCATATAATGTCAATATCAAACTGGACATTACTTCTCATAATGAGGACTACACAATCGTGGAGCAATACGAGCGGGCCGAAGGCAGGCATTCTACCGGAGGGATGGACGAGCTGTACAAGGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCCGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTGGACCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGAACTAGT。

将CMV-puro-T2A-mcherry用BglII和SpeI酶切，与经过同样酶切处理的pUC19/BM-EMBHL载体连接获得pUC19/puro-T2A-mcherry。将CMV-Cas9-SV40pA用MluI和SpeI酶切，与经过同样酶切处理的pUC19/puro-T2A-mcherry载体连接，获得的载体命名为pCas9。

将1×10⁶HEK293细胞铺到60mm培养皿，24小时后取6μg pCas9与3μg sgRNA表达质粒(即以下质粒之一：pU6/Casp3 sgRNA1、pU6/Casp3 sgRNA2、pU6/Casp3 sgRNA3、pU6/Casp3 sgRNA4、pU6/Casp6 sgRNA1、pU6/Casp6 sgRNA2、pU6/Casp6 sgRNA3、pU6/Casp6sgRNA4、pU6/Casp7 sgRNA1、pU6/Casp7 sgRNA2、pU6/Casp7 sgRNA3、pU6/Casp7 sgRNA4、pU6/AIF1 sgRNA1、pU6/AIF1 sgRNA2、pU6/AIF1 sgRNA3、pU6/AIF1 sgRNA4)通过磷酸钙共沉淀共转染HEK293细胞，转染48小时后收集细胞，用天根基因组提取试剂盒提取基因组DNA，通过T7E1 assay分析每个sgRNA的切割效率。

T7E1 assay步骤如下：以提取的基因组DNA为模板，分别扩增Caspase3、Caspase6、Caspase7和AIF1 sgRNA切割位点附近约100-2000bp的DNA片段，引物序列如下：

AIF1 DNA detection for：AATTCCTGGAAGTGCTG；

AIF1 DNA detection reverse：GCTAAGGGAAAGTGGTT；

Caspase3 DNA detection for：CACATTCGTCCTTCAGCATCA；

P38 Caspase3 DNA detection reverse：ACCACCAACCAACCATTTCT；

Caspase6 DNA detection for：CCTGGCTACATGGCAAAAC；

Caspase6 DNA detection reverse：ACAGGGAGTAGCACATTGG；

Caspase7 DNA detection for：GGAACCTTGGCTTTGATGGG；

Caspase7 DNA detection reverse：GGCCATGGTGGGCGGATCG；

PCR产物进行变性退火，琼脂糖凝胶电泳回收后，取500ng PCR产物，0.5μl T7E1酶，37摄氏度处理30分钟，进行琼脂糖凝胶电泳检测,检测结果见附图2。电泳图片中较小条带与较大条带灰度值的比值反映出sgRNA切割效率，比值越高，切割效率越高。

依据T7E1检测结果，分别选择Casp3 sgRNA3、Casp6 sgRNA3、Casp7 sgRNA1、AIF1sgRNA2用于进一步研究。

(2)多基因打靶载体的构建

将pU6/Casp3 sgRNA3用KpnI和SpeI酶切与经过同样酶切处理的pCas9载体连接，获得同时携带Cas9、Casp3 sgRNA、puromycin的打靶载体pCas9-Casp3 sgRNA。

将pU6/AIF1 sgRNA2用KpnI和SpeI酶切并回收片段，与经过KpnI和XbaI酶切处理的pU6/Casp6 sgRNA3连接获得pU6/CA sgRNAs，将pU6/Casp7 sgRNA1用KpnI和SpeI酶切并回收片段，与经过KpnI和XbaI酶切处理的pU6/CA sgRNAs载体连接，获得pU6/CCA sgRNAs，该载体结构及构建过程见附图3。

将pU6/CCA sgRNAs用KpnI和SpeI酶切并回收片段，与经过同样酶切处理的pCas9载体连接，获得同时携带Cas9、Casp6 sgRNA、Casp7 sgRNA、AIF1 sgRNA、puromycin的多基因打靶载体pCas9-CCA sgRNAs，该载体结构见附图4。

(3)CCCA KO HEK293细胞系的建立

将1×10⁶HEK293细胞铺到60mm培养皿，24小时后，将12μg pCas9-Casp3 sgRNA通过磷酸钙共沉淀转染HEK293细胞，转染24小时后加入puromycin至终浓度1μg/ml筛选48小时，之后将筛选的细胞进行克隆化，获得Caspase3敲除的HEK293细胞Casp3^-/-HEK293。

将1×10⁶Casp3^-/-HEK293细胞铺到60mm培养皿，24小时后，将12μg pCas9-CCAsgRNAs通过磷酸钙共沉淀转染Casp3^-/-HEK293，转染24小时后加入puromycin至终浓度1μg/ml筛选48小时。将筛选后的细胞通过有限稀释法进行克隆化，挑选10-50个克隆，提取基因组后对sgRNA切割位点进行测序并通过Western blot进行蛋白表达水平检测，四个基因的sgRNA切割位点均发生突变的克隆即为CCCA KO HEK293细胞系，附图5显示了clone7的测序结果，图中可见四个基因的sgRNA切割位点附近均发生了不同类型的突变，造成了该基因的功能丧失。附图6显示了clone7的蛋白水平检测结果，图中可见四个基因所编码的蛋白均检测不到表达。

3、CCCA KO HEK293细胞系抗凋亡检测

1×10⁶CCCA KO HEK293铺于60mm细胞培养皿，24小时后，将6μg Bax表达质粒转染到CCCA KO HEK293中，16小时后收集细胞用Annexin染色后进行流式检测，HEK293用同样的方法处理作为对照组。检测结果见附图7，结果可见CCCA KO HEK293细胞系与HEK293细胞相比具有更好的抗凋亡能力。

4、CCCA KO HEK293细胞系在BAX蛋白表达中的应用

以人cDNA文库为模板，PCR扩增获得Bax基因，同时在Bax基因的3＇端引入Flag标签，引物序列如下：

Bax KpnI XhoI for：AGGTACCCTCGAGATGGACGGGTCCGGGGAG；

Bax-flag XbaI NotI reverse：

AGCGGCCGCTCTAGATTACTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAGTCGCCCATCTTCTTCCAG；

用KpnI和NotI酶切并回收Bax基因片段，与经过同样酶切处理的pcDNA3.1(+)(addgene购买)连接，获得pcDNA3.1/Bax-flag。

分别将1×10⁶CCCA KO HEK293细胞和HEK293细胞铺到60mm细胞培养皿，24小时后，将12μg pcDNA3.1/Bax-flag通过磷酸钙共沉淀分别转染CCCA KO HEK293细胞和HEK293细胞，72小时后，收集细胞提取蛋白，用抗Flag单克隆抗体进行Western blot检测，以GAPDH作为内参，比较CCCA KO HEK293细胞和HEK293细胞中BAX蛋白的表达。附图8显示了BAX蛋白在两种细胞中的表达水平，图中可见CCCA KO HEK293细胞中BAX蛋白表达水平远高于HEK293组。

5、CCCA KO HEK293细胞系在腺病毒包装中的应用

将用KpnI和NotI酶切回收的Bax基因片段与经过同样酶切处理的腺病毒E1区穿梭载体pShuttle-CMV(addgene购买)连接，获得pshuttle/CMV-Bax。将12μgpshuttle/CMV-Bax和8μg腺病毒骨架载体pAdEasy-1(addgene购买)混合后用2μlPacI酶切线性化，转染HEK293细胞(ATCC购买)进行同源重组，转染7-8天后显微镜下可见腺病毒病灶，即携带Bax的腺病毒成功包装。出现病灶后收集细胞，反复冻融三次后离心取上清感染新的60mm培养皿中的HEK293细胞。如此反复扩增至10个150mm细胞培养皿的HEK293细胞后，收集病毒，通过Cscl₂密度梯度离心纯化腺病毒。用4MOI Ad-Bax感染CCCA KO HEK293细胞，用同样滴度的病毒感染HEK293作为对照，72小时后收集病毒感染U87细胞，24小时后收集细胞提取基因组，通过Realtime-PCR检测Ad-Bax的扩增效果。附图9显示了携带Bax基因的腺病毒Ad-Bax包装效率，与对照组HEK293细胞相比，CCCA KO HEK293细胞具有更高的包装效率。

6、CCCA KO HEK293细胞系在慢病毒包装中的应用

将猿猴病毒40大T抗原基因(SV40 large T)通过KpnI和NotI位点克隆到pcDNA3.1(+)载体，获得pcDNA3.1/large T。取8μgpcDNA3.1/large T通过磷酸钙共沉淀转染到1×10⁶CCCA KO HEK293细胞后用400μg/ml G418筛选7-20天获得稳定表达SV40 large T的细胞系CCCA KO HEK293T。

用XhoI和XbaI酶切步骤3中所获得的Bax基因并回收，与经过同样酶切处理的慢病毒载体pLenti-puro(addgene购买)连接，获得携带Bax基因的慢病毒载体pLenti/Bax。

取3μg的pLenti/Bax、3μg的pRSV-Rev(addgene购买)、3μg的pMDLg/pRRE(addgene购买)通过磷酸钙共沉淀共转染1×10⁶CCCA KO HEK293T细胞，48小时后收集细胞上清感染U87(1×10⁶)细胞，感染24小时后收集细胞通过实时荧光定量PCR检测Bax从而反应慢病毒的包装滴度。HEK293T作为对照。附图10显示了携带Bax基因的慢病毒的包装结果。图中可看出在CCCA KO HEK293T细胞中的病毒包装量明显高于对照组HEK293T。

7、CCCA KO HEK293细胞系在腺相关病毒包装中的应用

将携带Trail基因的腺相关病毒质粒与腺相关病毒辅助质粒通过磷酸钙共沉淀转染CCCA KO HEK293细胞系，72小时候收集细胞获取病毒。

实施例2：

以Caspase3、Caspase6、Caspase7敲除的HEK293T细胞系CCC KO HEK293T为例，该CCC KO HEK293T细胞系结构如下：

该HEK293T细胞系的Caspase3、Caspase6、Caspase7三个基因编码区DNA序列发生了变化，发生变化的基因组序列分别位于Caspase3的第5个外显子、Caspase6的第6个外显子、Caspase7的第7个外显子，其它基因组序列与野生型HEK293T细胞相同。

发生变化的基因组序列如下：

Caspase3 allele A：

GAATGACATCTCGGTCTGGTACAGATGTCGTGATGCAGCAAACCTCAGGGAAACATTCAGAAACTTGAAATATGAAGTCAGGAATAAAAATGATCTTACACGTGAAGAAATTGTGGAATTGATGCGTGATG。

Caspase3 allele B：

GAATGACATCTCGGTCTGGTACAGATGTCGATGCAGCAAACCTCAGGGAAATTCAGAAACTTGAAATATGAAGTCAGGAATAAAAATGATCTTACACGTGAAGAAATTGTGGAATTGATGCGTGATG。

Caspase6 allele A：

GCATGTCGGGGAAACCAGCACGACCAGTCATTCCTTTGGATGTAGTAGATAATCAGACAGAGAAGTTGGACACCAACATAACTGAGGTGGATGCAGCCTCCGTTTACACGCTGCCTGCTGGAGCTGACTTCCTCATGTGTTACTCTGTTGCAGAAG。

Caspase6 allele B：

GCATGTCGGGGAAACCAGCACGATGTGCCAGTCATTCCTTTGGATGTAGTAGATAATCAGACAGAGAAGTTGGACACCAACATAACTGAGGTGGATGCAGCCTCCGTTTACACGCTGCCTGCTGGAGCTGAATGTGTTACTCTGTTGCAGAAG。

Caspase7 allele A：

CCCCTGACTCTGGAACTTTAATTTCACCAGTAAGAAGAAGAAAAATGTCACCATGCGATCCATCAAGACCACCCGGGACCGAGTGCCTACATATCAGTACAACATGAATTTTGAAAAGCTGGGCAAATGCATCATAATAAACAACAAGAACTTTGATAAAGTGACAG。

Caspase7 allele B：

CCCCTGACTCTGGAACTTTATATTTCACCAGTAAGAAGAAGAAAAATGTCACCATGCGATCCATCAAGACCACCCGGGACCGAGTGCCTACATATCAGTACAACATGAATTTTGAAAAGCTGGCATCATAATAAACAACAAGAACTTTGATAAAGTGACAG。

发生变化的基因组DNA序列也可位于Caspase3、Caspase6、Caspase7基因的其它编码区。

实施例3：

以Caspase3、Caspase6、AIF1敲除的HEK293细胞系CCA1 KO HEK293为例，该CCA1KO HEK293细胞系结构如下：

该HEK293细胞系的Caspase3、Caspase6、AIF1三个基因编码区DNA序列发生了变化，发生变化的基因组序列分别位于Caspase3的第4个外显子、Caspase6的第2个外显子、AIF1的第10个外显子，其它基因组序列与野生型HEK293细胞相同。

发生变化的基因组序列如下：

Caspase3 allele A：

AAAGATCATACATGGAAGCGAATCAATGGACTCATCCCTGGACAACAGTTATAAAATGGATTATCCTGAGATGGGTTTATGTATAATAATTAATAATAAGAATTTTCATAAAAGCACTG。

Caspase3 allele B：

AAAGATCATACATGGAAGCGAATCAATGGACTCTGGAATATCCCTGGACTTATAAAATGGATTATCCTGAGATGGGTTTATGTATAATAATTAATAATAAGAATTTTCATAAAAGCACTG。

Caspase6 allele A：

TTTTTAATAGGTGGAAGAAAACATGACAGAAACAGATGCCTTCTATAAAAG。

Caspase6 allele B：

TTTTTAATAGGTGGGGAAGAAAACATGACAGAAACAGATGCTTCTATAAAAG。

AIF1 allele A：

CTCGAGCCTTGGGCAAGAAGTGATTCAACTCTTCCCCGAGAAAGGAAATATGGGAAAGATCCTCCCCGAATACCTCAGCAACTGGACCATGGAAAAAGTCAGACGAG。

AIF1 allele B：

CTCGAGCCTTGGGCACAGAAGTGATTCAACTCTTCCCCGAGAAAGGAAATATGGGAAAGATCCTCCCCGAATACCTCAGCAACTGGACCATGGAAAAAGTCGACGAG。

发生变化的基因组DNA序列也可位于Caspase3、Caspase6、AIF1基因的其它编码区。

实施例4：

以Caspase3、Caspase7、AIF1敲除的HEK293细胞系CCA2 KO HEK293为例，该CCA2KO HEK293细胞系结构如下：

该HEK293细胞系的Caspase3、Caspase7、AIF1三个基因编码区DNA序列发生了变化，发生变化的基因组序列分别位于Caspase3的第6个外显子、Caspase7的第8个外显子、AIF1的第12个外显子，其它基因组序列与野生型HEK293细胞相同。

发生变化的基因组序列如下：

Caspase3 allele A：

TTTCTAAAGAAGATCACAGCAAGCAGTTTTGTTTGTGTGCTTCTGAGCCATGGTGAAGAAGGAATAATTTTTGGAACAAATGGACCTGTTGACCTGAAAAAAATAACAAACTTTTTCAGAGGGGATCGTTGTAGAAGTCTAACTGGAAAACCCAAACTTTTCATTATTCAG。

Caspase3 allele B：

TTTCTAAAGAAGATCACAGCAAAAGGAGCAGTTTTGTTTGTGTGCTTCTGAGCCATGGTGAAGAAGGAATAATTTTTGGAACAAATGGACCTGTTGACCTGAAAAAAATAACAAACTTTTTCAGAGGGGATCGGATAGAAGTCTAACTGGAAAACCCAAACTTTTCATTATTCAG。

Caspase7 allele A：

GTATGGGCGTTCGAAACGGAACAGACAAAGATGCCGAGGCGCTCTTCAAGTGCTTCCGAAGCCTGGGTTTTGACGTGATTGTCTATAATGACTGCTCTTGTGCCAAGATGCAAGTCTGCTTAAAAAAG。

Caspase7 allele B：

GTATGGGCGTTCGAAAGATGCCGAGGCGCTCTTCAAGTGCTTCCGAAGCCTGGGTTTTGACGTGATTGTCTATAATGACTGCTCTTGTGCCAAGATGCAAGATCTGCTTAAAAAAG。

AIF1 allele A：

GTAGAAACTGACCACATAGTGGCAGCTGTGGGCCTGGAGCCCAATGTTGAGTTGGCCAAGACTGGTGGCCTGGAAATAGACTCAGATTTTGGTGGCTTCCGCTACAAGCACGCTCTAACATCTGGGTG。

AIF1 allele B：

GTAGAAACTGACCACATAGTGGCAGCTGTGGGCCTGGAGCCCAATGTTGAGTTGGCCAAGACTGGTGGCCTGGAAATAGACTCAGATTTTGGTGGCTTCCGGGTAAATGATGGAAACAGAGCTACAAGCACGCTCTAACATCTGGGTG。

发生变化的基因组DNA序列也可位于Caspase3、Caspase7、AIF1基因的其它编码区。

实施例5：

以Caspase6、Caspase7、AIF1敲除的HEK293细胞系CCA3 KO HEK293为例，该CCA3KO HEK293细胞系结构如下：

该HEK293细胞系的Caspase6、Caspase7、AIF1三个基因编码区DNA序列发生了变化，发生变化的基因组序列分别位于Caspase6的第3个外显子、Caspase7的第7个外显子、AIF1的第11个外显子，其它基因组序列与野生型HEK293细胞相同。

发生变化的基因组序列如下：

Caspase6 allele A：

AGAAATGTTTGATCCGGCAAGTACAAAATGGACCACAGGAGGAGAGGAATTGCTTTAATCTTCAATCATGAGAGGTTCTTTTGGCACTTAACACTGCCAGAAAGGCGGGGCACCTGCGCAGATAGAGACAATCTTACCCGCAG。

Caspase6 allele B：

AGAAATGTTTGATCCGGCAGAAAAGTACAAAATGGACCACAGGAGGAGAGGAATTGCTTTAATCTTCAATCATGAGAGGTTCTTTTGGCACTTAACACTGCCAGAAAGGCGGGGCACCTGCGCAGATAAGACAATCTTACCCGCAG。

Caspase7 allele A：

CCCCTGACTCTGGAACTTTATATTTCACCAGTAAGAAGAAGAAAAATGTCACCATGCGATCCATCAAGACCACCCGGGACCGAGTGCCTACATATCAGTACAATGAATTTTGAAAAGCTGGGCAAATGCATCATAATAAACAACAAGAACTTTGATAAAGTGACAG。

Caspase7 allele B：

CCCCTGACTCTGGAACTTTATATTTCACCAGTAAGAAGAAGAAAAATGTCACCATGCGATCCATCAAGACCACCCGGGACCGAGTGCCTACATATCAGTACAACATGAATTTTGAAAAGCTGGTGCATCATAATAAACAACAAGAACTTTGATAAAGTGACAG。

AIF1 allele A：

AGGGGGTTAAGGTGATGCCCAATGCTATTGTGCCGTTGGAGTCAGCAGTGGCAAGTTACTTATCAAGCTGAAAGACGGCAGGAAG。

AIF1 allele B：

AGGGGGTTAAGGTGATGCCCAATGCTATTGTGCAGTTCAATCCGTTGGAGTCAGCAGTGGCAAGTTACTTATCAAGCTGAAAGACGGCAGGAAG。

发生变化的基因组DNA序列也可位于Caspase6、Caspase7、AIF1基因的其它编码区。

实施例6：

以CCCA KO HEK293细胞系在BAK蛋白表达中的应用为例。

以人cDNA文库为模板，PCR扩增获得Bak基因，用KpnI和NotI酶切并回收Bak基因片段，与经过同样酶切处理的pcDNA3.1(+)(addgene购买)连接，获得pcDNA3.1/Bak。

分别将1×10⁶CCCA KO HEK293细胞和HEK293细胞铺到60mm细胞培养皿，24小时后，将12μg pcDNA3.1/Bak通过磷酸钙共沉淀分别转染CCCA KO HEK293细胞和HEK293细胞，72小时后，收集细胞提取蛋白。

用于表达该蛋白的细胞系也可以是CCC KO HEK293、CCA1 KO HEK293、CCA2 KOHEK293、CCA3 KO HEK293、CCA4 KO HEK293细胞系中的任意一种。

实施例7：

以携带Bak基因的腺病毒在CCCA KO HEK293细胞中的包装为例。

将用KpnI和NotI酶切回收的Bak基因片段与经过同样酶切处理的腺病毒E1区穿梭载体pShuttle-CMV(addgene购买)连接，获得pshuttle/CMV-Bak。将12μgpshuttle/CMV-Bak和8μg腺病毒骨架载体pAdEasy-1(addgene购买)混合后用2μlPacI酶切线性化，转染HEK293细胞(ATCC购买)进行同源重组，转染7-8天后显微镜下可见腺病毒病灶，即携带Bak的腺病毒成功包装。出现病灶后收集细胞，反复冻融三次后离心取上清感染新的60mm培养皿中的HEK293细胞。如此反复扩增至10个150mm细胞培养皿的HEK293细胞后，收集病毒，通过Cscl₂密度梯度离心纯化腺病毒。

用于包装该病毒的细胞系也可以是CCC KO HEK293、CCA1 KO HEK293、CCA2 KOHEK293、CCA3 KO HEK293、CCA4 KO HEK293细胞系中的任意一种。

实施例8：

以携带Trail基因的慢病毒在CCCA KO HEK293细胞中的包装为例。

用XhoI和XbaI酶切Trail基因并回收，与经过同样酶切处理的慢病毒载体pLenti-puro(addgene购买)连接，获得携带Trail基因的慢病毒载体pLenti/Trail。

取3μg pLenti/Trail、3μg pRSV-Rev(addgene购买)、3μg pMDLg/pRRE(addgene购买)通过磷酸钙共沉淀共转染1×10⁶CCCA KO HEK293T细胞，48小时后收集细胞上清获得携带Trail的慢病毒。

核苷酸或氨基酸序列表

<110> 陕西师范大学

<120>一种抗凋亡细胞系及其建立方法和应用

<160>

<210> 1

<211> 1766

<212> Caspase3 allele A（Exon8）

<213> DNA

<220>

<400>

<210> 2

<211> 1807

<212> Caspase3 allele B（Exon8）

<213> DNA

<220>

<400>

<210> 3

<211> 238

<212> Caspase6 allele A（Exon5）

<213> DNA

<220>

<400>

<210> 4

<211> 169

<212> Caspase6 alleleB（Exon5）

<213> DNA

<220>

<400>

<210> 5

<211> 117

<212> Caspase7 allele A（Exon8）

<213> DNA

<220>

<400>

<210> 6

<211> 128

<212> Caspase7 allele B（Exon8）

<213> DNA

<220>

<400>

<210>7

<211> 91

<212> AIF1 allele A（Exon11）

<213> DNA

<220>

<400>

<210> 8

<211> 202

<212> AIF1 allele B（Exon11）

<213> DNA

<220>

<400>

<210> 9

<211> 40

<212> 引物EMBHL for

<213> DNA

<220>

<400>

AATTACGCGTGGTACCTTGAATTCTTACTAGTTTAGATCT。

<210> 10

<211> 40

<212> 引物EMBHL reverse

<213> DNA

<220>

<400>

AGCTAGATCTAAACTAGTAAGAATTCAAGGTACCACGCGT。

<210> 11

<211> 387

<212> U6-sgRNA backbone片段

<213> DNA

<220>

<400>

<210> 12

<211> 23

<212>引物 Human Caspase3 sgRNA1 for

<213> DNA

<220>

<400>

ACCGTTGTGGAATTGATGCGTGA。

<210> 13

<211> 23

<212> 引物Human Caspase3 sgRNA1 reverse

<213> DNA

<220>

<400>

AAACTCACGCATCAATTCCACAA。

<210> 14

<211> 23

<212> 引物Human Caspase3 sgRNA2 for

<213> DNA

<220>

<400>

ACCGTATTCTTGGCGAAATTCAA。

<210> 15

<211> 23

<212> 引物Human Caspase3 sgRNA2 reverse

<213> DNA

<220>

<400>

AAACTTGAATTTCGCCAAGAATA。

<210> 16

<211> 23

<212> 引物Human Caspase3 sgRNA3 for

<213> DNA

<220>

<400>

ACCGCTTACCCGGGTTAACCGAA。

<210> 17

<211> 23

<212> 引物Human Caspase3 sgRNA3 reverse

<213> DNA

<220>

<400>

AAACTTCGGTTAACCCGGGTAAG。

<210> 18

<211> 23

<212> 引物Human Caspase3 sgRNA4 for

<213> DNA

<220>

<400>

ACCGACCCGGGTTAACCGAAAGG。

<210> 19

<211> 23

<212> 引物Human Caspase3 sgRNA4 reverse

<213> DNA

<220>

<400>

AAACCCTTTCGGTTAACCCGGGT。

<210> 20

<211> 23

<212> 引物Human Caspase6 sgRNA1 for

<213> DNA

<220>

<400>

ACCGAAAGCAATCGGCATCTGCG。

<210> 21

<211> 23

<212> 引物Human Caspase6 sgRNA1 reverse

<213> DNA

<220>

<400>

AAACCGCAGATGCCGATTGCTTT。

<210> 22

<211> 23

<212> 引物Human Caspase6 sgRNA2 for

<213> DNA

<220>

<400>

ACCGTCTTCCTGAGCCATGGCGA。

<210> 23

<211> 23

<212> 引物Human Caspase6 sgRNA2 reverse

<213> DNA

<220>

<400>

AAACTCGCCATGGCTCAGGAAGA。

<210> 24

<211> 23

<212> 引物Human Caspase6 sgRNA3 for

<213> DNA

<220>

<400>

ACCGATTGCCTTCGCCATGGCTC。

<210> 25

<211> 23

<212> 引物Human Caspase6 sgRNA3 reverse

<213> DNA

<220>

<400>

AAACGAGCCATGGCGAAGGCAAT。

<210> 26

<211> 23

<212> 引物Human Caspase6 sgRNA4 for

<213> DNA

<220>

<400>

ACCGAATGTGATTGCCTTCGCCA。

<210> 27

<211> 23

<212> 引物Human Caspase6 sgRNA4 reverse

<213> DNA

<220>

<400>

AAACTGGCGAAGGCAATCACATT。

<210> 28

<211> 23

<212>引物Human Caspase7 sgRNA1 for

<213> DNA

<220>

<400>

ACCGCAGGTATGGGCGTTCGAAA。

<210> 29

<211> 23

<212>引物Human Caspase7 sgRNA1 reverse

<213> DNA

<220>

<400>

AAACTTTCGAACGCCCATACCTG。

<210> 30

<211> 23

<212>引物Human Caspase7 sgRNA2 for

<213> DNA

<220>

<400>

ACCGGACAATCACGTCAAAACCC。

<210> 31

<211> 23

<212>引物Human Caspase7 sgRNA2 reverse

<213> DNA

<220>

<400>

AAACGGGTTTTGACGTGATTGTC

<210> 32

<211> 23

<212>引物Human Caspase7 sgRNA3 for

<213> DNA

<220>

<400>

ACCGAAGCACTTGAAGAGCGCCT。

<210> 33

<211> 23

<212>引物Human Caspase7 sgRNA3 reverse

<213> DNA

<220>

<400>

AAACAGGCGCTCTTCAAGTGCTT。

<210> 34

<211> 23

<212>引物Human Caspase7 sgRNA4 for

<213> DNA

<220>

<400>

ACCGTTCAAGTGCTTCCGAAGCC。

<210> 35

<211> 23

<212>引物Human Caspase7 sgRNA4 reverse

<213> DNA

<220>

<400>

AAACGGCTTCGGAAGCACTTGAA。

<210> 36

<211> 23

<212>引物AIF1 sgRNA1 for

<213> DNA

<220>

<400>

ACCGCCCCGAATACCTCAGCAAC。

<210> 37

<211> 23

<212>引物AIF1 sgRNA1 reverse

<213> DNA

<220>

<400>

AAACGTTGCTGAGGTATTCGGGG。

<210> 38

<211> 23

<212>引物Human AIF1 sgRNA2 for

<213> DNA

<220>

<400>

ACCGAAGCTGAAAGACGGCAGGA。

<210> 39

<211> 23

<212>引物Human AIF1 sgRNA2 reverse

<213> DNA

<220>

<400>

AAACTCCTGCCGTCTTTCAGCTT。

<210> 40

<211> 23

<212>引物Human AIF1 sgRNA3 for

<213> DNA

<220>

<400>

ACCGCTGGAGCCCAATGTTGAGT

<210> 41

<211> 23

<212>引物Human AIF1 sgRNA3 reverse

<213> DNA

<220>

<400>

AAACACTCAACATTGGGCTCCAG。

<210> 42

<211> 23

<212>引物Human AIF1 sgRNA4 for

<213> DNA

<220>

<400>

ACCGCTCAGATTTTGGTGGCTTC。

<210> 43

<211> 23

<212>引物Human AIF1 sgRNA4 reverse

<213> DNA

<220>

<400>

AAACGAAGCCACCAAAATCTGAG。

<210> 44

<211> 5131

<212>Cas9表达元件CMV-Cas9-SV40pA

<213> DNA

<220>

<400>

<210> 45

<211> 1901

<212>puro-T2A-mcherry表达元件CMV-puro-T2A-mcherry

<213> DNA

<220>

<400>

<210> 46

<211> 17

<212>引物 AIF1 DNA detection for

<213> DNA

<220>

<400>

AATTCCTGGAAGTGCTG。

<210> 47

<211> 17

<212>引物AIF1 DNA detection reverse

<213> DNA

<220>

<400>

GCTAAGGGAAAGTGGTT。

<210> 48

<211> 21

<212>引物Caspase3 DNA detection for

<213> DNA

<220>

<400>

CACATTCGTCCTTCAGCATCA。

<210> 49

<211> 20

<212>引物Caspase3 DNA detection reverse

<213> DNA

<220>

<400>

ACCACCAACCAACCATTTCT。

<210> 50

<211> 19

<212>引物Caspase6 DNA detection for

<213> DNA

<220>

<400>

CCTGGCTACATGGCAAAAC。

<210> 51

<211> 19

<212>引物Caspase6 DNA detection reverse

<213> DNA

<220>

<400>

ACAGGGAGTAGCACATTGG。

<210> 52

<211> 20

<212>引物Caspase7 DNA detection for

<213> DNA

<220>

<400>

GGAACCTTGGCTTTGATGGG。

<210> 53

<211> 19

<212> Caspase7 DNA detection reverse

<213> DNA

<220>

<400>

GGCCATGGTGGGCGGATCG。

<210> 54

<211> 31

<212> Flag标签序列Bax KpnI XhoI for

<213> DNA

<220>

<400>

AGGTACCCTCGAGATGGACGGGTCCGGGGAG。

<210> 55

<211> 58

<212> Flag标签序列Bax-flag XbaI NotI reverse

<213> DNA

<220>

<400>

AGCGGCCGCTCTAGATTACTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAGTCGCCCATCTTCTTCCAG。

<210> 56

<211> 131

<212>实施例2中发生变化的基因组序列Caspase3 allele A

<213> DNA

<220>

<400>

<210> 57

<211> 127

<212>实施例2中发生变化的基因组序列Caspase3 allele B

<213> DNA

<220>

<400>

<210> 58

<211> 156

<212>实施例2中发生变化的基因组序列Caspase6 allele A

<213> DNA

<220>

<400>

<210> 59

<211> 153

<212>实施例2中发生变化的基因组序列Caspase6 allele B

<213> DNA

<220>

<400>

<210> 60

<211> 167

<212>实施例2中发生变化的基因组序列Caspase7 allele A

<213> DNA

<220>

<400>

<210> 61

<211> 161

<212>实施例2中发生变化的基因组序列Caspase7 allele B

<213> DNA

<220>

<400>

<210> 62

<211> 119

<212>实施例3中发生变化的基因组序列Caspase3 allele A

<213> DNA

<220>

<400>

<210> 63

<211> 120

<212>实施例3中发生变化的基因组序列Caspase3 allele B

<213> DNA

<220>

<400>

<210> 64

<211> 51

<212>实施例3中发生变化的基因组序列Caspase6 allele A

<213> DNA

<220>

<400>

TTTTTAATAGGTGGAAGAAAACATGACAGAAACAGATGCCTTCTATAAAAG。

<210> 65

<211> 52

<212>实施例3中发生变化的基因组序列Caspase6 allele B

<213> DNA

<220>

<400>

TTTTTAATAGGTGGGGAAGAAAACATGACAGAAACAGATGCTTCTATAAAAG。

<210> 66

<211> 107

<212>实施例3中发生变化的基因组序列AIF1 allele A

<213> DNA

<220>

<400>

<210> 67

<211> 107

<212>实施例3中发生变化的基因组序列AIF1 allele B

<213> DNA

<220>

<400>

<210> 68

<211> 171

<212>实施例4中发生变化的基因组序列Caspase3 allele A

<213> DNA

<220>

<400>

<210> 69

<211> 175

<212>实施例4中发生变化的基因组序列Caspase3 allele B

<213> DNA

<220>

<400> TTTCTAAAGAAGATCACAGCAAAAGGAGCAGTTTTGTTTGTGTGCTTCTGAGCCATGGTGAAGAAGGAATAATTTTTGGAACAAATGGACCTGTTGACCTGAAAAAAATAACAAACTTTTTCAGAGGGGATCGGATAGAAGTCTAACTGGAAAACCCAAACTTTTCATTATTCAG。

<210> 70

<211> 128

<212>实施例4中发生变化的基因组序列Caspase7 allele A

<213> DNA

<220>

<400>

<210> 71

<211> 116

<212>实施例4中发生变化的基因组序列Caspase7 allele B

<213> DNA

<220>

<400> GTATGGGCGTTCGAAAGATGCCGAGGCGCTCTTCAAGTGCTTCCGAAGCCTGGGTTTTGACGTGATTGTCTATAATGACTGCTCTTGTGCCAAGATGCAAGATCTGCTTAAAAAAG。

<210> 72

<211> 128

<212>实施例4中发生变化的基因组序列AIF1 allele A

<213> DNA

<220>

<400>

<210> 73

<211> 148

<212>实施例4中发生变化的基因组序列AIF1 allele B

<213> DNA

<220>

<400>

<210> 74

<211> 143

<212>实施例5中发生变化的基因组序列Caspase6 allele A

<213> DNA

<220>

<400>

<210> 75

<211> 146

<212>实施例5中发生变化的基因组序列Caspase6 allele B

<213> DNA

<220>

<400> 75 AGAAATGTTTGATCCGGCAGAAAAGTACAAAATGGACCACAGGAGGAGAGGAATTGCTTTAATCTTCAATCATGAGAGGTTCTTTTGGCACTTAACACTGCCAGAAAGGCGGGGCACCTGCGCAGATAAGACAATCTTACCCGCAG。

<210> 76

<211> 166

<212>实施例5中发生变化的基因组序列Caspase7 allele A

<213> DNA

<220>

<400>

<210> 77

<211>163

<212>实施例5中发生变化的基因组序列Caspase7 allele B

<213> DNA

<220>

<400>

<210> 78

<211> 85

<212>实施例5中发生变化的基因组序列AIF1 allele A

<213> DNA

<220>

<400>

<210> 79

<211> 94

<212>实施例5中发生变化的基因组序列AIF1 allele B

<213> DNA

<220>

<400>

Claims

1.一种抗凋亡细胞系，其特征在于，在真核细胞中缺失了Caspase3、Caspase6、Caspase7、AIF1中的三个基因或四个基因。

2.如权利要求1所述的抗凋亡细胞系，其特征在于，所述的真核细胞是HEK293细胞或HEK293T细胞。

3.如权利要求1所述的抗凋亡细胞系，其特征在于，所说的缺失是指在HEK293细胞或HEK293T细胞的相应基因的编码区发生了基因突变，造成该基因功能的丧失，突变类型是缺失碱基、插入碱基、碱基替换中的任意一种或2-3种突变类型的组合。

4.如权利要求1所述的抗凋亡细胞系，其特征在于，所述的真核细胞是HEK293细胞，在HEK293细胞中敲除Caspase3、Caspase6、Caspase7和AIF1四个基因。

5.权利要求1至4其中之一所述的抗凋亡细胞系的建立方法，其特征在于，由下述步骤组成：

(1)筛选靶向Caspase3、Caspase6、Caspase7和AIF1基因外显子区的sgRNA

(2)构建携带Cas9、sgRNA、puromycin表达元件的真核表达载体

将筛选获得的靶向Caspase3基因的sgRNA表达元件、Cas9表达元件、puromycin表达元件依次插入到真核表达载体，获得pCas9-Casp3sgRNA-puromycin。将靶向Caspase6、Caspase7和AIF1的sgRNA表达元件串联，与Cas9表达元件、puromycin表达元件依次插入到真核表达载体，获得pCas9-CCA sgRNAs-puromycin；

(3)建立Caspase3敲除的真核细胞系

将pCas9-Casp3sgRNA-puromycin转染目标细胞，转染24小时后用puromycin筛选24-48小时，进行克隆化，获得Caspase3敲除的真核细胞系；

(4)建立Caspase3、Caspase6、Caspase7和AIF1敲除的真核细胞系

6.权利要求1至4所述的抗凋亡细胞系在蛋白表达中的应用。

7.权利要求1至4所述的抗凋亡细胞系在腺病毒包装中的应用。

8.权利要求1至4所述的抗凋亡细胞系在腺相关病毒包装中的应用。

9.权利要求1至4所述的抗凋亡细胞系在慢病毒包装中的应用。