CN107118195B - 一种能延长烟草净油保质期的异黄酮类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种能延长烟草净油保质期的异黄酮类化合物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种能延长烟草净油保质期的异黄酮类化合物及其制备方法与应用，属于植物化学技术领域。所述异黄酮类化合物是从传统药食同源植物葛根中分离得到，化合物命名为：4′‑羟基‑7‑羟甲基‑6‑甲氧基‑异黄酮，其分子式为C17H14O5，结构式如式（I）所示：，式（I）；制备方法是经浸膏提取、硅胶柱层析和高效液相色谱分离步骤制得。对该化合物进行了抗氧化活性筛选，实验结果显示该化合物显示出较强的抗氧化活性，且具有很好的延长烟草净油保质期的效果。卷烟感官评吸结果也表明添加该化合物不影响卷烟抽吸品质，是理想的烟草烟草净油抗氧化剂。

Description

一种能延长烟草净油保质期的异黄酮类化合物及其制备方法 与应用
技术领域
本发明属于植物化学技术领域，具体涉及一种从传统药食同源植物葛根中首次提取得到的异黄酮类化合物及其提取方法，同时，本发明化合物具有较好的抗氧化活性，可作为烟草净油的抗氧化剂，能显著延长烟草净油的保质期。
背景技术
葛根为豆科植物野葛或甘葛藤萝的块根，除新疆、西藏外，全国大部分地区均有分布，甘葛藤栽培或野生于山野灌丛和疏林中，分布于广东、广西、湖南、江西等地。葛根是我国南方一些省区的一种常食蔬菜，其味甘凉可口，常作煲汤之用，也可作药物。野生葛根内含12％的黄酮类化合物，如葛根素、大豆黄酮苷、花生素等营养成分，还有蛋白质、氨基酸、糖、和人体必需的铁、钙、铜、硒等矿物质，是老少皆宜的名贵滋补品，有“千年人参”之美誉。葛根中的主要化学成分为黄酮和异黄酮类化合物(大豆素、大豆甙、葛根素、葛根素-7-木糖甙等)，也含有萜类、内酯、甾醇等其它结构类型的化合物。最新出版的《农业和食品化学杂志》综述表明，葛根含大量异黄酮类化合物，该类化合物具有突出的抗氧化活性，可以改善代谢综合征的一些指标，包括血压、高胆固醇酯和血糖。
烟草净油是一种卷烟工业中应用最广泛的香料，含有丰富的香气成分，除用于卷烟中的添加剂，还可用于其它行业中所增加或替代的香精香料，如食品、化妆品和医药方面。但是，烟草净油中许多化合物含有容易氧化的不饱和双键，放置时间会因氧化而香气品质变差。合理的添加抗氧化剂能延缓烟草净油氧化性和延长贮存期，随着食品安全性与保健功能日益成为人们关注的焦点，食品原料乃至食品添加剂的选择趋向天然、健康、具有生物活性的材料，天然植物成为了食品抗氧化剂的重要来源。本发明从葛根中分离得到了一种异黄酮类化合物，活性研究表明该化合物具有较好的抗氧化活性；该异黄酮类化合物用作烟草净油的抗氧化剂，能延缓烟草净油氧化性，并能显著延长其贮存期。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种能延长烟草净油保质期的异黄酮类化合物；第二目的在于提供所述能延长烟草净油保质期的异黄酮类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述异黄酮类化合作为制备抗氧化剂的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一目的是这样实现的，所述的能延长烟草净油保质期的异黄酮类化合物是从传统中药材葛根中分离得到，其分子式为C17H14O5，其结构式如式(I)所示：
该化合物为浅黄色胶状物，命名为：4′-羟基-7-羟甲基-6-甲氧基-异黄酮，英文名为：4′-hodraxy-7-hydroxymethyl-6-methoxy-isoflavone。
本发明的第二目的是这样实现的，所述的能延长烟草净油保质期的异黄酮类化合物的制备方法，是以葛根为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析和高效液相色谱分离步骤制得，具体为：
A、浸膏提取：将葛根粉碎到20～40目，用溶剂超声提取2～5次，每次所用提取溶剂的质量为葛根质量的3～5倍，每次30～60分钟，合并提取液并过滤，滤液减压浓缩至肉眼观察到刚有沉淀析出，静置2～5h，滤除沉淀物，之后将所得滤液浓缩成浸膏；
B、硅胶柱层析：将浸膏上硅胶柱层析，装柱硅胶为160～200目，所用硅胶重量为浸膏重量6～10倍量；以体积比为1:0、9:1、8:2、7:3、1:1、3:7的氯仿和丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；每个梯度洗脱到TLC点板无点后(即该梯度洗脱不出物质后)，更换下一梯度洗脱；
C、高效液相色谱分离：将采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分采用高效液相色谱分离纯化，即得所述的异黄酮类化合物。
进一步，优选的是，所述A步骤的溶剂为体积浓度为70～100％的丙酮水溶液、体积浓度为90～100％的乙醇水溶液或体积浓度为90～100％的甲醇水溶液。
进一步，优选的是，所述B步骤中浸膏在经硅胶柱层析前，先用重量是浸膏1.5～3倍的丙酮或者甲醇溶解，然后用重量是浸膏0.8～1.2倍的80～100目硅胶拌样，之后上样。
进一步，优选的是，所述C步骤的高效液相色谱分离纯化是以体积浓度为44％的甲醇水溶液为流动相，流速15～25ml/min，以21.2×250mm，5μm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为332nm，每次进样150～300μL，收集28.9min的色谱峰，多次累加后蒸干。本领域技术人员应该知晓本技术方案只是一个优选技术方案，高效液相色谱分离纯化采用的流动相不限于此。
以上述方法制备得到的异黄酮类化合物的结构通过以下方法进行测定：
本发明化合物为黄色胶状物；HRESI-MS显示其准分子离子峰为321.0744[M+Na]+(计算值321.0739)，结合1H NMR和DEPT谱确定其分子式为C17H14O5，不饱和度为11。
红外光谱中显示了羟基(3356cm-1)、羰基(1645cm-1)和芳环(1612、1561、1507和1432cm-1)的共振吸收峰。而紫外光谱在210、265和332nm有最大吸收也说明了化合物中可能存在芳环结构。
化合物的1H和13C NMR谱(如图1、图2和表1)显示其含有17个碳和14个氢，包括1个异黄酮骨架(C-2～C-10和C-1′～C-6′，H-5、H-8、H-2′,6′和H-2′,6′)，一个甲氧基(δC56.3q，δH 3.85s)、一个羟甲基(δC 63.2s，δH 4.61s)和一个酚羟基(δH 10.84)。化合物的异黄酮骨架可进一步由H-5和C-4、C-6、C-7、C-9、C-10，H-8和C-6、C-7、C-9、C-10，H-2和C-1′、C-3、C-4、C-9，以及H-2′,6′和C-3的HMBC相关得到确认。
进一步分析其HMBC相关谱(如图3)，根据甲氧基氢(δH 3.85)与C-6(δC 153.3)的HMBC相关可推测两个甲氧基取代在异黄酮母核的C-6位。酚羟基取代在C-4′位可由酚羟基氢(δH 10.84)与C-3′,5′(δC 115.9)和C-4′(δC 157.1)的HMBC相关确认。最后，羟甲基取代在C-7位可由H-1″(δH 4.61)与C-6(δC 153.3)、C-7(δC 134.9)和C-8(δC 116.9)的HMBC相关得到确定。苯环上典型的质子信号H-5(δH 7.18)、H-8(δH 6.71)、H-2′,6′[δH 7.79(d,J＝8.8)]和H-3′,5′[(δH 6.81(d,J＝8.8)]也支持异黄酮母核上的上述取代基模式。
至此，化合物的结构得到确定，并命名为化合物命名为：4′-羟基-7-羟甲基-6-甲氧基-异黄酮。
化合物的红外、紫外和质谱数据：UV(甲醇)，λmax(logε)332(3.48)、265(3.80)、210(4.36)nm；IR(溴化钾压片)：νmax 3356、3060、2934、1715、1645、1612、1561、1507、1432、1369、1248、1146、1059、972、844cm-1；1H和13C NMR数据(500和125MHz,(CDCl3)，见表1；正离子模式ESI MS m/z 321[M+Na]+；正离子模式HRESIMS m/z 321.0744[M+Na]+(计算值C17H14NaO5，321.0739)。
表1.本发明化合物的1H NMR和13C NMR数据(CDCl3)
No. δ<sub>C</sub> δ<sub>H</sub> No. δ<sub>C</sub> δ<sub>H</sub>
2 152. 7.87 10 12
3 123. 1′ 12
4 176. 2′，6′ 13 7.79
5 115. 7.18 3′，5′ 11 6.81
6 153. 4′ 15
7 134. 1″ 6 4.61s
8 116. 6.71 OMe 5 3.85s
9 149. Ar- 10.84
本发明的第三目的是这样实现的：
本发明能延长烟草净油保质期的异黄酮类化合物作为制备抗氧化剂的应用。优选，所述的抗氧化剂为烟草净油用抗氧化剂。
对本发明化合物进行了抗氧化活性测试，抗氧化活性以清除DPPH自由基能力的大小表示；以50μg/mL的乙醇溶液为初筛浓度，测定其清除脂性自由基DPPH的活性。取一块costar 96孔板，加入新鲜配制的DPPH乙醇溶液(浓度为6.5×105mol/L)190μL/孔，加入本发明化合物样品l0μL/孔，空白孔加l0μL生理盐水，充分混匀，用封板膜封板后室温下避光静置30分钟，于UV2401分光光度计上测定仪上测定各孔吸光度值，测定波长为517nm；样品对脂性自由基DPPH清除率按下式计算:
DPPH清除率(％)＝(A空白-A样品)/A空白×100％
A空白：空白对照组吸光度值；A样品：加样品组吸光度值。
样品平行5次检测，计算半数清除浓度IC50测定结果为4.15μg/L，表明化合物具有良好的抗氧化活性和清除自由基活性。
本发明把能延长烟草净油保质期的异黄酮类化合物添加到烟草净油中，添加的质量为烟草净油质量的0.01％、0.02％和0.05％，观察其质变情况。结果表明：对照烟草净油的保质期仅为16个月(对照净油为未添加本发明化合物的净油)，添加0.01％、0.02％和0.05％的本发明化合物后，其保质期可分别延长到20个月、25个月和30个月，说明本发明化合物具有很好的延缓烟草净油中香气成分的氧化，具有延长其保质期的功效。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明能延长烟草净油保质期的异黄酮类化合物首次从葛根中被分离出来的，通过核磁共振和质谱测定方法确定了为异黄酮类化合物，并表征了其具体结构；本发明化合物结构简单，容易实现从天然植物中提取，如果采用人工合成工艺也容易实现，具有很好的延长烟草净油保质期的效果。本发明化合物来自传统药食来源植物葛根，毒理学检测结果表明化合物安全无毒。卷烟感官评吸结果也表明添加该化合物不影响卷烟抽吸品质，是理想的烟草烟草净油抗氧化剂，和未添加本发明化合物的精油相比感官评吸结果没有差别。
附图说明
图1本发明能延长烟草净油保质期的异黄酮类化合物的核磁共振碳谱(13C NMR)；
图2为本发明能延长烟草净油保质期的异黄酮类化合物的核磁共振氢谱(1HNMR)；
图3本发明能延长烟草净油保质期的异黄酮类化合物的关键HMBC相关图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料、试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明所采用的葛根全部普通市购干制品。
本发明所述的能延长烟草净油保质期的异黄酮类化合物，是从传统中药材葛根中分离得到，其分子式为C17H14O5，其结构式如式(I)所示：
命名为：化合物命名为：4′-羟基-7-羟甲基-6-甲氧基-异黄酮，英文名为：4′-hodraxy-7-hydroxymethyl-6-methoxy-isoflavone。
本发明所述能延长烟草净油保质期的异黄酮类化合物的制备方法，是以葛根为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析和高效液相色谱分离步骤制得，具体为：
A、浸膏提取：将葛根粉碎到20～40目，用溶剂超声提取2～5次，每次所用提取溶剂的质量为葛根质量的3～5倍，每次30～60分钟，合并提取液并过滤，滤液减压浓缩至肉眼观察到刚有沉淀析出，静置2～5h，滤除沉淀物，之后将所得滤液浓缩成浸膏；
B、硅胶柱层析：将浸膏上硅胶柱层析，装柱硅胶为160～200目，所用硅胶重量为浸膏重量6～10倍量；以体积比为1:0、9:1、8:2、7:3、1:1、3:7的氯仿和丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；
C、高效液相色谱分离：将采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分采用高效液相色谱分离纯化，即得所述的异黄酮类化合物。
所述A步骤的溶剂为体积浓度为70～100％的丙酮水溶液、体积浓度为90～100％的乙醇水溶液或体积浓度为90～100％的甲醇水溶液。
所述B步骤中浸膏在经硅胶柱层析前，先用重量是浸膏1.5～3倍的丙酮或者甲醇溶解，然后用重量是浸膏0.8～1.2倍的80～100目硅胶拌样，之后上样。
所述C步骤的高效液相色谱分离纯化是以体积浓度为44％的甲醇水溶液为流动相，流速15～25ml/min，以21.2×250mm，5μm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为332nm，每次进样150～300μL，收集28.9min的色谱峰，多次累加后蒸干。
实施例1
A、浸膏提取：将葛根粉碎到20目，用溶剂超声提取2次，每次所用提取溶剂的质量为葛根质量的3倍，每次30分钟，合并提取液并过滤，滤液减压浓缩至肉眼观察到刚有沉淀析出，静置2h，滤除沉淀物，之后将所得滤液浓缩成浸膏；
B、硅胶柱层析：浸膏先用重量是浸膏1.5倍的丙酮或者甲醇溶解，然后用重量是浸膏0.8倍的80目硅胶拌样，之后上样进行柱层析，其中，装柱硅胶为160目，所用硅胶重量为浸膏重量6倍量；以体积比为1:0、9:1、8:2、7:3、1:1、3:7的氯仿和丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；
C、高效液相色谱分离：将采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分采用高效液相色谱分离纯化，高效液相色谱分离纯化的具体方法是以体积浓度为44％的甲醇水溶液为流动相，流速15ml/min，以21.2×250mm，5μm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为332nm，每次进样150μL，收集28.9min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的异黄酮类化合物。
其中，所述A步骤的溶剂为体积浓度为80％的丙酮水溶液。
实施例2
A、浸膏提取：将葛根粉碎到40目，用溶剂超声提取5次，每次所用提取溶剂的质量为葛根质量的5倍，每次60分钟，合并提取液并过滤，滤液减压浓缩至肉眼观察到刚有沉淀析出，静置5h，滤除沉淀物，之后将所得滤液浓缩成浸膏；
B、硅胶柱层析：浸膏先用重量是浸膏3倍的丙酮或者甲醇溶解，然后用重量是浸膏1.2倍的100目硅胶拌样，之后上样进行柱层析，其中，装柱硅胶为200目，所用硅胶重量为浸膏重量10倍量；以体积比为1:0、9:1、8:2、7:3、1:1、3:7的氯仿和丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；
C、高效液相色谱分离：将采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分采用高效液相色谱分离纯化，高效液相色谱分离纯化的具体方法是以体积浓度为44％的甲醇水溶液为流动相，流速25ml/min，以21.2×250mm，5μm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为332nm，每次进样300μL，收集28.9min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的异黄酮类化合物。
其中，所述A步骤的溶剂为甲醇。
实施例3
A、浸膏提取：将葛根粉碎到30目，用溶剂超声提取4次，每次所用提取溶剂的质量为葛根质量的4倍，每次45分钟，合并提取液并过滤，滤液减压浓缩至肉眼观察到刚有沉淀析出，静置3h，滤除沉淀物，之后将所得滤液浓缩成浸膏；
B、硅胶柱层析：浸膏先用重量是浸膏2倍的丙酮或者甲醇溶解，然后用重量是浸膏1倍的90目硅胶拌样，之后上样进行柱层析，其中，装柱硅胶为180目，所用硅胶重量为浸膏重量8倍量；以体积比为1:0、9:1、8:2、7:3、1:1、3:7的氯仿和丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；
C、高效液相色谱分离：将采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分采用高效液相色谱分离纯化，高效液相色谱分离纯化的具体方法是以体积浓度为44％的甲醇水溶液为流动相，流速20ml/min，以21.2×250mm，5μm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为332nm，每次进样200μL，收集28.9min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的异黄酮类化合物。
其中，体积浓度为90％的乙醇水溶液。
实施例4
A、浸膏提取：将2.6kg葛根粉碎到30目，用体积浓度为70％的丙酮水溶液超声提取4次，每次所用提取溶剂的质量为葛根质量的2倍，每次60分钟，合并提取液并过滤，滤液减压浓缩至肉眼观察到刚有沉淀析出，静置3h，滤除沉淀物，之后将所得滤液浓缩成62g浸膏；
B、硅胶柱层析：浸膏先用重量120g的丙酮溶解，然后用重量是62g的100目硅胶拌样，之后上样，进行柱层析，其中，装柱硅胶为200目，所用硅胶重量为400g；以体积比为1:0、9:1、8:2、7:3、1:1、3:7的氯仿和丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到6个部分A-F；每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；
C、高效液相色谱分离：将采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分(D部分12g)采用高效液相色谱分离纯化，高效液相色谱分离纯化的具体方法是以体积浓度为44％的甲醇水溶液为流动相，流速20ml/min，以21.2×250mm，5μm的Zorbax PrepHTGF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为332nm，每次进样200μL，收集28.9min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的异黄酮类化合物。
实施例5
A、浸膏提取：将2.8kg葛根粉碎到35目，用体积浓度为70％的丙酮水溶液超声提取4次，每次所用提取溶剂的质量为葛根质量的3倍，每次50分钟，合并提取液并过滤，滤液减压浓缩至肉眼观察到刚有沉淀析出，静置5h，滤除沉淀物，之后将所得滤液浓缩成66g浸膏；
B、硅胶柱层析：浸膏先用重量140g的丙酮溶解，然后用重量为70g的100目硅胶拌样，之后上样，进行柱层析，其中，装柱硅胶为200目，所用硅胶重量为400g；以体积比为1:0、9:1、8:2、7:3、1:1、3:7的氯仿和丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到6个部分A-F；每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；
C、高效液相色谱分离：将采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分(D部分12g)采用高效液相色谱分离纯化，高效液相色谱分离纯化的具体方法是以体积浓度为44％的甲醇水溶液为流动相，流速20ml/min，以21.2×250mm，5μm的Zorbax PrepHTGF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为332nm，每次进样200μL，收集28.9min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的异黄酮类化合物。
实施例6
采用实施例1制备得到的异黄酮类化合物的结构通过以下方法进行测定：
本发明化合物为黄色胶状物；HRESI-MS显示其准分子离子峰为321.0744[M+Na]+(计算值321.0739)，结合1H NMR和DEPT谱确定其分子式为C17H14O5，不饱和度为11。
红外光谱中显示了羟基(3356cm-1)、羰基(1645cm-1)和芳环(1612、1561、1507和1432cm-1)的共振吸收峰。而紫外光谱在210、265和332nm有最大吸收也说明了化合物中可能存在芳环结构。
化合物的1H和13C NMR谱(如图1、图2和表1)显示其含有17个碳和14个氢，包括1个异黄酮骨架(C-2～C-10和C-1′～C-6′，H-5、H-8、H-2′,6′和H-2′,6′)，一个甲氧基(δC56.3q，δH 3.85s)、一个羟甲基(δC 63.2s，δH 4.61s)和一个酚羟基(δH 10.84)。化合物的异黄酮骨架可进一步由H-5和C-4、C-6、C-7、C-9、C-10，H-8和C-6、C-7、C-9、C-10，H-2和C-1′、C-3、C-4、C-9，以及H-2′,6′和C-3的HMBC相关得到确认。
进一步分析其HMBC相关谱(如图3)，根据甲氧基氢(δH 3.85)与C-6(δC 153.3)的HMBC相关可推测两个甲氧基取代在异黄酮母核的C-6位。酚羟基取代在C-4′位可由酚羟基氢(δH 10.84)与C-3′,5′(δC 115.9)和C-4′(δC 157.1)的HMBC相关确认。最后，羟甲基取代在C-7位可由H-1″(δH 4.61)与C-6(δC 153.3)、C-7(δC 134.9)和C-8(δC 116.9)的HMBC相关得到确定。苯环上典型的质子信号H-5(δH 7.18)、H-8(δH 6.71)、H-2′,6′[δH 7.79(d,J＝8.8)]和H-3′,5′[(δH 6.81(d,J＝8.8)]也支持异黄酮母核上的上述取代基模式。
至此，化合物的结构得到确定，并命名为化合物命名为：4′-羟基-7-羟甲基-6-甲氧基-异黄酮。
实施例7
取实施例2-5制备的化合物，为黄色胶状物。测定与实施例6相同，确认实施2-5制备的化合物为所述异黄酮类化合物——4′-羟基-7-羟甲基-6-甲氧基-异黄酮。
实施例8
对本发明化合物进行了抗氧化活性测试，抗氧化活性以清除DPPH自由基能力的大小表示；以50μg/mL的乙醇溶液为初筛浓度，测定其清除脂性自由基DPPH的活性。取一块costar 96孔板，加入新鲜配制的DPPH乙醇溶液(浓度为6.5×105mol/L)190μL/孔，加入本发明化合物l0μL/孔，空白孔加l0μL生理盐水，充分混匀，用封板膜封板后室温下避光静置30分钟，于UV2401分光光度计上测定仪上测定各孔吸光度值，测定波长为517nm；样品对脂性自由基DPPH清除率按下式计算:
DPPH清除率(％)＝(A空白-A样品)/A空白×100％
A空白：空白对照组吸光度值；A样品：加样品组吸光度值。
样品平行5次检测，计算半数清除浓度IC50测定结果为4.15μg/L，表明化合物具有良好的抗氧化活性和清除自由基活性。
实施例9
化合物的延长烟草净油保质期效果测试：
本发明把能延长烟草净油保质期的异黄酮类化合物添加到烟草净油中，添加的质量为烟草净油质量的0.01％、0.02％和0.05％，观察其质变情况。结果表明：对照烟草净油的保质期仅为16个月(对照净油为未添加本发明化合物的净油)，添加0.01％、0.02％和0.05％的本发明化合物后，其保质期可分别延长到20个月、25个月和30个月，说明本发明化合物具有很好的延缓烟草净油中香气成分的氧化，具有延长其保质期的功效。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (3)

1.一种能延长烟草净油保质期的异黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，以葛根为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析和高效液相色谱分离步骤制得，具体为：
A、浸膏提取：将葛根粉碎到20~40目，用溶剂超声提取2~5次，每次所用提取溶剂的质量为葛根质量的3~5倍，每次30~60分钟，合并提取液并过滤，滤液减压浓缩至肉眼观察到刚有沉淀析出，静置2~5h，滤除沉淀物，之后将所得滤液浓缩成浸膏；
B、硅胶柱层析：将浸膏上硅胶柱层析，装柱硅胶为160~200目，所用硅胶重量为浸膏重量6~10倍量；以体积比为1:0、9:1、8:2、7:3、1:1、3:7的氯仿和丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集各梯度的梯度洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；每个梯度洗脱到TLC点板无点后，更换下一梯度洗脱；
C、高效液相色谱分离：将采用体积比为7:3的氯仿-丙酮混合有机溶剂洗脱得到的部分采用高效液相色谱分离纯化，即得所述的异黄酮类化合物；
所述A步骤的溶剂为体积浓度为70~100%的丙酮水溶液、体积浓度为90~100%的乙醇水溶液或体积浓度为90~100%的甲醇水溶液；
所述异黄酮类化合物命名为：4′-羟基-7-羟甲基-6-甲氧基-异黄酮，英文名为：4′-hydroxyl-7- hydroxymethyl-6-methoxy-isoflavone，其分子式为C17H14O5，其结构式如式（I）所示：
，式（I）。
2.根据权利要求1所述的能延长烟草净油保质期的异黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，所述B步骤中浸膏在经硅胶柱层析前，先用重量是浸膏1.5~3倍的丙酮或者甲醇溶解，然后用重量是浸膏 0.8~1.2倍的80~100目硅胶拌样，之后上样。
3.根据权利要求1所述的能延长烟草净油保质期的异黄酮类化合物的制备方法，其特征在于，所述C步骤的高效液相色谱分离纯化是以体积浓度为44%的甲醇水溶液为流动相，流速15~25 ml/min，以21.2×250 mm，5 μm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为332 nm，每次进样150~300 mL，收集28.9 min的色谱峰，多次累加后蒸干。
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野葛异黄酮的分离纯化、抗氧化性及光质对异黄酮生物合成的影响;杨华;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20100715(第7期);第E057-56页，正文第16、38-43页 *

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