CN107112193B - 用于确定大分子组装体的结构的方法 - Google Patents

Abstract

一种确定大分子组装体(MMA)的结构的方法，其包括以下步骤：(a)产生待研究的MMA物质的前驱体离子；(b)将所述MMA前驱体离子输送到碎裂区；(c)在所述碎裂区中进行所述MMA前驱体离子的脉冲碎裂；(d)对于第一多个MMA前驱体离子，检测所述所得MMA碎片离子的空间分布和所述MMA碎片离子的m/z分布两者；(e)分析由待研究的所述MMA物质的所述第一多个前驱体离子形成的碎片离子的所述空间和m/z分布，以确定那些碎片离子在所述前驱体MMA的所述结构内的相对位置；以及(f)根据对碎片离子的所述空间和m/z分布的所述分析重建所述MMA的三维(3D)结构。

Description

用于确定大分子组装体的结构的方法

技术领域

本发明涉及一种用于确定大分子或大分子组装体(MMA)的结构的方法。

背景技术

在生物化学中，术语“大分子”应用于大分子量的分子，且广泛地包含例如核酸、蛋白质和碳水化合物等生物聚合物以及例如l脂质和巨环等非聚合物分子。

大分子组装体(MMA)为大规模化学结构(通常数百kDa或甚至数MDa)，且涵盖大生物分子，例如病毒、蛋白质络合物、蛋白质配体络合物、蛋白质DNA络合物、抗体受体和多肽、多糖的其它复杂混合物等等，且还涵盖非生物材料，例如纳米粒子。

在本文中，术语大分子组装体(MMA)将用于指大分子和大分子组装体两者。

大分子组装体由其组成结构且还由其化学形状两者来限定。MMA的3D形状(构形)通常极受关注，这是因为例如对MMA的形状的了解可帮助理解MMA如何与其它分子相互作用。结构和动态MMA分析的应用介于如受环境变化或底物或辅因子的键结影响的不同MMA结构之间的平衡和动态相互转换的详细研究到对完整纳米机械(例如例如，整个病毒粒子、细胞器、蛋白酶体和核糖体)的分析的范围内。

一般来说，3D结构信息甚至对于许多已知蛋白质或蛋白质络合物并非广泛可用，因此确定MMA的结构的问题仍然严重。

存在用于以实验方式研究MMA结构的各种方法和技术。这些方法和技术的介绍性评述由Sali等人,Nature 422,216到225,2003年3月13日在“在结构蛋白质组研究中从词到文献”中给出。例如x射线晶体学、核磁共振、2维电子显微法、冷冻电子断层扫描和许多其它技术的技术各自对MMA的3D形状提供不同视角。每种技术与其它技术相比又具有优点和缺点。

本发明提议所属领域中所描述的方法的替代方法，以用于确定MMA的结构。

发明内容

根据本发明的第一方面，提供一种确定大分子组装体(MMA)的结构的方法，其包括以下步骤：产生待研究的MMA物质的前驱体离子；将所述MMA前驱体离子输送到碎裂区；在所述碎裂区中进行所述MMA前驱体离子的脉冲碎裂；对于第一多个MMA前驱体离子，检测所述所得MMA碎片离子的空间分布和所述那些MMA碎片离子的m/z分布两者；以及分析由待研究的所述MMA物质的所述第一多个前驱体离子形成的碎片离子的所述空间和m/z分布，以确定那些碎片离子在所述前驱体MMA的所述结构内的相对位置。

本发明因此提议一种方法，其中可使用脉冲碎裂技术通过MMA碎裂的互补产物的质谱成像来直接确定MMA的三维结构。优选地，使用高频、高功率脉冲激光。优选地，收集脉冲碎裂的结果的多个图像，且群集技术可应用于所述多个图像以便建构所关注MMA物质的三维图像。确切地说，所述方法可包括从碎片离子的多个空间和m/z分布建立MMA物质内的碎片的相对位置的相关性。可根据检测确定MMA碎片离子的m/z值，且可根据m/z值确定MMA碎片离子的化学特性。以此方式，所述方法可提供MMA物质内的碎片的位置以及其化学特性作为输出。

可使用第二操作模式来提供关于MMA碎片离子的特性的额外信息。在第二模式中，代替获得碎片离子的空间分布和m/z分布两者，离子可实际上被捕获并引导到高分辨率质量分析器(例如，轨道俘获质量分析器)中以用于在此处分析。

本发明还扩展到一种质谱仪，其包括：离子源，其用于产生待研究的MMA物质的前驱体离子；离子检测器布置，其具有检测器离子光学件和2D检测器；脉冲碎裂构件，其用于在定位于所述离子检测器布置与所述离子源之间的碎裂区中使所述MMA前驱体离子碎裂；离子光学件，其用于将所述MMA前驱体离子从所述离子源输送到所述碎裂区；以及处理器；其中，对于第一多个MMA前驱体离子，所述离子检测器布置的所述2D检测器被布置成检测由所述脉冲碎裂构件产生的MMA碎片离子的空间分布和那些MMA碎片离子的m/z分布两者；且进一步其中所述处理器被配置成分析由待研究的所述MMA物质的所述第一多个前驱体离子形成的MMA碎片离子的所述空间和m/z分布，以便确定那些MMA碎片离子在所述前驱体MMA的结构内的相对位置。

本发明的其它优选特征阐述于所附权利要求书中。

附图说明

本发明可以许多方式来实践，且现在将仅借助于实例并参看附图描述一些优选实施例，在附图中：

图1示出体现本发明且包含用于将MMA碎片离子导向检测器布置的电极布置的质谱仪的第一实施例；的

图2以示意性形式示出MMA在碎裂之前的结构和所述MMA的碎片在形成图1的检测器布置的一部分的2D检测器上的位置；

图3也以示意性形式示出MMA的不同初始定向如何与2D检测器上的MMA碎片的突起有关。

图4示出时间片法如何可用于使MMA碎片的相对定向与其到达2D检测器的时间相关。

图5示出根据本发明的质谱仪的第二实施例，所述质谱仪同样具有电极布置和不同于图1的检测器布置的同步检测器布置；且

图6示出包含图1和图5的质谱仪的方面中所示出的电极布置的替代电极布置。

具体实施方式

图1以示意性形式示出根据本发明的实施例的质谱仪10。质谱仪10包括离子源，例如大气压离子源20。离子源被布置成产生结构和构形有待研究的大分子组装体(MMA)的离子的连续或准连续供应。从溶液取出MMA且使用如所属领域中已知的电喷雾工艺将其转换成气相离子。举例来说，MMA可为蛋白质、蛋白质络合物、核酸、多糖、脂质、巨环、病毒、抗体或其它大分子或组装体。本发明特别适用于对质量为至少50kDa(千道尔顿)，或至少100kDa，或至少200kDa，至少500kDa，或至少1MDa(兆道尔顿)的大分子进行分析以及结构和构形确定。分子优选地为非共价结合络合物，例如非共价结合蛋白质络合物，尤其是在前述范围质量内。MMA可从天然状态(即，MMA处于近生理条件下(例如，在大致中性pH下))离子化。一般来说，MMA前驱体离子被产生为多电荷离子。优选地，所得MMA碎片的总电荷不超过MMA前驱体离子的初始电荷。归因于碎片的高质量，一般有可能仅在所述碎片被后加速到足够的能量(例如，10keV到30keV，尤其是20keV到30keV)时才检测到所述碎片，这需要碎片中的每一者携载至少某种电荷。

呈气态形式的MMA前驱体离子从离子源20进入质谱仪10且穿过第一离子光学件和弯曲多极30。离子光学件、弯曲多极和其下游的所有组件保持处于真空下。离子随后进入四极滤质器40。待研究的特定物质的离子可通过四极滤质器40来选择。举例来说，可选择单个电荷状态或单个修改。所选离子随后从四极滤质器40穿过第二离子光学件50且传递到弯曲线性离子阱(C阱)60中。MMA前驱体离子继续穿过C阱60(即，在纵向方向上而非正交射出)且到较高碰撞能量解离(HCD)单元中。HCD单元80可在两个模式中操作，在第一模式中，允许MMA前驱体离子穿过HCD单元80而无碎裂。在第二模式中，在于下游进一步处理之前，可在HCD单元80中使MMA前驱体离子碎裂。

本发明可最易于通过对在第一模式中处理MMA前驱体离子的另一解释来理解，其中允许所选物质的MMA前驱体离子穿过HCD单元80而在此处无碎裂。这些离子离开HCD单元80且进入多极90。紧靠多极90下游的是电极布置120。在图1的示意图中，电极布置120包括第一电极120a和第二电极120b，第一电极120a与第二电极120b在穿过质谱仪10的离子飞行方向上间隔开。形成电极布置120的第一电极120a和第二电极120b还具有彼此对准且与质谱仪10的飞行轴线对准的孔口。这些第一电极120a和第二电极120b提供加速间隙。由电极布置120的第一电极120a与第二电极120b之间的体积限定的区和从质谱仪10的纵向轴线正交延伸的距离限定图1中以点线形式示出的碎裂区110。应理解，碎裂区110为用以辅助理解本发明的有用概念，且在本发明的最一般实施例中，并未明确限定体积的精确程度。实际上，如将进一步结合图6解释，本发明的特别优选实施例提供用于将MMA前驱体离子聚焦在相对小的体积内的构件。

脉冲高功率激光100被导向碎裂区110处，其中脉冲高功率激光100的聚焦区处于碎裂区110内，最优选地，在电极布置120的第一电极与第二电极之间，但相比在质谱仪10的飞行轴线下游的第二电极更靠近第一电极(所述电极接近多极90))。通常，脉冲激光100的聚焦区可在所述飞行方向上距离电极布置120的第一电极几毫米，且处于质谱仪10的纵向轴线上。

脉冲激光100在10Hz与10,000Hz之间的高频率下运行。递送超过10¹⁰瓦特/平方米的激光功率密度连同超过100J/m²的能量密度。可使用从IR到UV的任何波长。

合乎需要的是，MMA前驱体离子的流动被调整成使得平均同时在聚焦区/碎裂区110中发现不多于一个MMA前驱体离子。如果MMA前驱体离子恰好由激光脉冲截断，那么其被快速加热且以爆破方式碎裂(在纳秒时间标度上)。

所得碎片在电极布置120的两个电极120a、120b之间、在10kV与30kV之间加速。所形成离子碎片的后加速在大分子(例如，数百kDa或更大)的情况下是必要的。经加速碎片进入质谱仪的飞行时间(TOF)区。TOF区具有衬垫130和检测器布置140。MMA碎片离子离开已由电极布置120加速的碎裂区110，飞过TOF区且撞击检测器布置140。

检测器布置140包含紧靠在2D检测器150前方的微通道板(MCP)145。MMA碎片离子根据其跨越TOF区的质荷比m/z通过飞行时间分开，且因此在不同时间撞击MCP145。此处，其转换成电子。那些电子以熟知方式倍增数目，且因此，放大信号可随后由MCP 145后方的2D检测器登记。以此方式，从个别MMA碎片离子的如从加速的时刻测量的飞行时间来推断个别MMA碎片离子的m/z分布。2D检测器将在检测器表面上登记两个维度(x,y)中的电子以在检测器处提供MMA碎片离子的2D(x,y)空间分布。如下文将示出，2D检测器表面可为平坦或弯曲的。

优选地，2D检测器150包含一个或多个TIMEPIX芯片(例如，单个65kpixel芯片或呈现256kpixel阵列的“四边形”配置中的一共4个)。X.Llopart等人,Nucl.Instrum.Meth.Phys.Res.A581(2007),第485到494页描述了具有此类TIMEPIX芯片的二维阵列。关于US-B-8,274,045中的简单线性MALDI-TOF分析器，且在A Kiss等人,REV.Sci.Instrum.84,013704(2013)中的SIMS-TOF中，公开使用微通道板后方的此类2D检测器150的一般概念。检测器允许获取数千像素中的数十到数百像素(针对多芯片检测器)同时获取当前将m/z分辨力限制于仅几百的时间分辨率。

所检测的所得MMA碎片离子的空间分布指其在2D检测器上的位置。每个个别MMA碎片转换成所检测碎片的(m/z,x,y)图像。

2D检测器150的输出由微处理器160捕获。

质谱仪10受控制器170全面控制。在图1中，在控制器的主连接与本发明的理解相关的范围内，以示意性形式说明控制器的主连接，但当然将理解，控制器也可控制质谱仪的其它部分。当然还将理解，控制器170和微处理器160可实际上形成为同一专用处理电路或计算机的一部分。控制器170使2D检测器150与来自脉冲激光100的脉冲同步。这允许使用检测器布置140处的MMA碎片离子的飞行时间来推断碎片离子的m/z。

图2示意性地说明MMA前驱体离子碎裂成MMA碎片离子且所述MMA碎片离子到达2D检测器150处。在图2中，在左侧示出在碎裂之前的MMA前驱体离子。当然，MMA前驱体离子将通常具有复杂或极复杂的结构，且图2中的极简说明仅意图解释MMA前驱体离子的不同部分如何可空间布置在MMA内，和在MMA前驱体离子碎裂后那些以不同方式空间布置的组成部分如何可撞击检测器布置140的2D检测器150。同样应注意，因为这些碎片具有不同m/z，所以其在不同时刻撞击检测器150，因此图2表示在最后一个碎片到达检测器150之后的时刻。不携载电荷的碎片归因于极低的动能而很可能不产生检测事件。

一般来说，在相反侧上的MMA前驱体离子的组成部分在碎裂之后将在大致相反的方向上发散，且因此在加速之后将到达相对于MMA碎片分布的质量中心位置的2D检测器的相反区。举例来说，可见示出于在碎裂之前的MMA前驱体离子的左侧的组成部分A和B在其左侧撞击2D检测器150，而在MMA前驱体离子的任意纵向轴线的相反侧上，组成部分D朝向其右侧照射2D检测器150。

对于碎裂的每个MMA前驱体离子，存储所检测碎片的所得(m/z,x,y)图像。使用下文将描述的处理方法一同分析许多这些碎片(例如，数百到数万)。由于在碎裂之前MMA前驱体离子相对于检测器布置140的不同对准，甚至来自相同MMA前驱体离子物质的每个图像将含有给定碎片的x和y位置的不同图案。甚至在使用下文将结合图6概述的技术来尝试确保MMA前驱体离子沿至少其两极轴线共同对准的情况下，取决于MMA前驱体离子在到达碎裂区110后的旋转定向而仍将存在不同的MMA碎片离子图像(m/z,x,y)。

出于此原因，需要平均在任一次使不多于单个MMA前驱体离子碎裂。MMA具有或至少可具有极其复杂的结构，并且如果来自多于一个MMA前驱体离子的碎片将同时到达检测器布置140，那么分析/处理的复杂度将再进一步增加。

图3同样示意性地示出MMA定向(其特征为相对于朝向2D检测器150的方向的角度α、β、γ)的不同变体如何在2D检测器150上产生不同碎片突起。图3A示出一般情况，且图3B到图3D示出尤其能经受重建检验的特定情况。一般来说，当这些碎片的原始定向平行于2D检测器150时，预期来自分子的相反侧的碎片的最大扩散(在图3中举例说明为b_max)。

在已收集来自所关注物质的多个MMA前驱体离子的多个三维图像(m/z,x,y)的情况下，基于类似于在单粒子冷冻电子断层扫描中使用的技术的三维重建技术而继续处理和分析。

所提议方法的主要区别是m/z信息可用作针对群集MMA图像的第一步。所有m/z谱是根据其类似性而群集，因此彼此分开不同碎裂路径。随后对于相同碎裂路径，每个集群中的这些高度类似的质谱的(x,y)图像以旋转方式对准且分组成具有(m/z,x,y)的高类似性的多个组。举例来说，对于对准，可假定具有最高信号强度或最高m/z的m/z沿角度定向，且接着所有其它信号相对于此原点定向(参见图3E)。通过在此类对准组内取平均值，可获得较高信噪比。

使用若干数据分析和图像分类算法中的一者来正常进行分组，所述算法例如多变值统计分析、互相关和层级上升(hierarchical ascendant)分类法，或K均值分类法等。预期通过用单粒子冷冻电子断层扫描技术进行类推，将使用多达数万图像的数据集，且通过对准的迭代程序和分类法来实现最优方案，由此通过分类法产生的强图像平均值被用作参考图像以用于整个数据集的后续对准。

在最简单的实施方案中，在对类似质谱进行对准和分组之后，可例如以成对方式甚至手动地建立空间约束和相关性。再次参看图2，适合的约束可为A-D、A+B、C-E、C+D等，(其中减号指示每一对的两个分量相对于MMA前驱体离子的质量中心彼此相反，且其中加号指示每个MMA碎片离子在MMA前驱体离子的质量中心的同一侧上)。

合乎需要的是，以使得仅揭露关于MMA前驱体构形的信息的所需细节的方式选择MMA前驱体离子的碎裂条件(例如，通量波长、功率密度的平顶分布、时序等等)。举例来说，尽管为高度示意性的，然而图2示出MMA前驱体离子仅碎裂成其子单元的理想情况。实际上，此种结构是不太可能的。碎裂的各种替代通道出现，且这又将产生子单元的不同组合以及子单元自身的碎片。还应预期所谓的非对称碎裂发生，在这种情况下大多数电荷被较小碎片带走，从而留下电荷和因此检测的效率不成比例地较低的较大碎片。

因此，可概括的是，方法允许基于MMA前驱体的不同视图或对准而对MMA结构进行三维重建。可见，相对于其它碎片是通过2D检测器150根据检测的坐标(x,y)来确定，每个碎片的m/z是根据其飞行时间和其在MMA中的位置来确定的。

在概念上，所提议方法类似于在物理学中广泛使用以用于研究光致解离和小分子的分子键的所谓的速度映射技术。所提议方法的主要区别不仅是研究的对象不同(高质量MMA离子相对于小中性分子)、个别MMA(和其组成)检测的优先使用，而且还聚焦于获得并非关于键能而是关于MMA结构内的碎片的相互空间定位的信息。然而，来自速度映射的现代技术可用于改进识别的品质。举例来说，所描述2D检测器理想地适合于所谓的时间片速度映射(仍在不多于单个MMA碎裂的条件下)。在时间片法(如例如在S.Wu等人.Molec.Phys.,103(13)(2005)1797-1807和Jungmann等人的“用于理解化学动力学的新成像法：使用真空中检测器的高效切片成像”Rev.Sci.Instr.(2010)81 103112中所描述，加速间隙120的场强度显著减小。这意味着使得碎片的飞行时间峰宽极宽广，以至于其变得显著大于检测器的时间分辨率。因此，变得可能的是使每个碎片的初始速度与其到达检测器的时间片相关。举例来说，仅具有零速度的碎片将在精确对应于其m/z的飞行时间到达检测器。

引出场的减小可通过使用聚焦透镜来补充以保持2D检测器的区域内的碎片分布。替代地，可在碎裂期间完全切换所述场，且仅在将充分允许碎片发散(所谓的延迟引出)的某一延迟(优选地，200ns到3000ns)之后施加所述场。

碎片离子的TOF与m/z之间的准确关系可在校准(例如，使用充分冷却的未碎裂CsI集群)期间建立，而碎片的准确m/z可使用如下文在描述中所描述的高分辨率质谱仪来确定。具有导向2D检测器150的非零初始速度的那些碎片将较早到达，而具有远离检测器的初始速度的那些碎片将较晚到达。反过来，初始速度由在碎裂后释放的能量的量确定，所述量可合计为数eV到数十eV。对于结构确定最重要的是，动量守恒将必然确保此速度被引导远离MMA的质量中心，因此准许碎片彼此有关。

图4中说明此过程。图4的顶部部分示出每个碎片的总计分布(来自数千次获取)。图4的其余部分分别(且从上到下)示出来自图3A到图3D的个别MMA的飞行时间的分布。对于MMA的3D结构的最简单重建，仅选择所有或大多数碎片到达中心时间片(即，所有或大多数碎片最初处于一个平面中(例如图2中所示出))的那些获取是足够的。随后，对应空间分布(x,y)变得更适用于对准得多。

前文描述通过3D重建的方法确定MMA的3D结构的技术。可辅助识别MMA的结构的其它分析信息可通过在第二模式中操作图1的质谱仪来获得。

在所述第二模式中，在MMA前驱体离子碎裂之后，由电极布置120反转电场。这导致MMA碎片离子相对于第一操作模式在相反方向上(即，在远离检测器布置140的方向上且返回朝向HCD单元80)行进。

作为能量守恒的结果，MMA碎片离子中的每一者的个别能量将小于MMA前驱体离子的能量。因此，通过在HCD单元80之前适当地调整多极90上的电压，当其它MMA前驱体离子穿过多极到达以供在碎裂区中碎裂时，多极90可存储碎片离子。确切地说，TOF分析器90内的势阱的高度可设置成使得从HCD单元80行进到多极90中的相对较高能量的MMA前驱体离子将穿过多极90且因此将进入碎裂区110以供碎裂，而在所述碎裂区110中产生且被引导回多极90中的相对较低能量的MMA碎片离子将由多极90俘获以供在此处存储。

将了解，承诺MMA前驱体离子穿过多极90到碎裂区110中同时俘获反方向行进的所得MMA碎片离子的能力依赖于多极的减少的压力中的MMA碎片离子的高效俘获。确切来说，这又可需要多极90中的气体压力(这又源自HCD单元80)与MMA碎片离子的离子能量之间的精细平衡。

因此描述的第二操作模式准许多极90用于累积来自MMA前驱体离子的MMA碎片离子。对于每个个别MMA前驱体离子，脉冲激光100产生MMA碎片，所述MMA碎片随后通过电极布置120施加反向电场而累积并存储于多极90中。

在足够数目的碎片离子已存储于多极90中后，所述碎片离子可随后再次在反方向上射出到HCD单元80中，在所述HCD单元80处，所述碎片离子可被冷却。冷却的MMA碎片离子随后传递到C阱60中，在所述C阱60处，所述MMA碎片离子正交射出到轨道阱分析器70以进行高分辨率分析。此处用显著高于线性TOF 130的m/z分辨率来分析离子。还可使用任何其它高分辨率分析器。此操作模式用于准确地确定所研究MMA的所有预期碎片。

现在转向图5，示出根据本发明的质谱仪的第二实施例。在图1的多极90上游的组件(即，离子源20、第一离子光学件/弯曲多极30、四极滤质器40、第二离子光学件50、C阱60和轨道阱70，以及HCD单元80)与图5相同且以类似方式加以配置。因此，为了简化图AA，与图1中相同的这些组件在图5中表示为已标注为“质谱仪”的单个框。

在图5中，检测器布置140包括在第一2D检测器150a前方的第一MCP 145a和在第二2D检测器150b前方的第二MCP 145b。与图1相反，第一MCP和第二MCP以及第一2D检测器和第二2D检测器在正交于质谱仪10'的飞行轴线的方向上彼此相对。

在图5中形成加速间隙的电极布置120(如同图1)被布置成紧靠多级90下游且在质谱仪10的飞行轴线上。然而，图5的电极布置120的第一加速电极和第二加速电极定向成与图1中的电极布置的定向成90°。确切地说，第一加速电极和第二加速电极中的每一者具有与MCP/2D检测器中的对应者对准的中心孔口。碎裂区110再一次限定在电极布置120的第一加速电极与第二加速电极之间。

提供脉冲激光100以准许使MMA前驱体离子碎裂。脉冲激光100的聚焦同样与质谱仪10'的飞行轴线对准，且还与分别面向2D检测器的每个相对部分的第一加速电极和第二加速电极中的孔口对准。在图5中所示出的视图中，脉冲激光束的方向为进入页面中，即，正交于质谱仪10'的纵向飞行轴线且正交于所得MMA碎片离子从碎裂区110朝向第一MCP 145a和第二相对MCP 145b的行进方向。

图5的质谱仪10'还包含离子存储阱(线性阱)180。线性阱180被定位成其纵向轴线和进入孔口沿质谱仪10'的飞行轴线(纵向轴线)。线性阱180的进入孔口在碎裂区110的相反侧上且在电极布置120下游，即，进入线性阱180与离开多极90相反。

在使用中，MMA前驱体离子离开多极90且进入碎裂区110。脉冲激光100致使MMA前驱体离子碎裂。在图AA的质谱仪10'的第一操作模式中，将电压(在优选实施例中，此电压是脉冲电压)施加到电极布置120的电极120a、120b。所得电场加速了第一极性的MMA碎片离子，使得其在一第一方向上朝向第一MCP 145a和第一2D检测器150a行进，而相反极性的MMA碎片离子在相反的方向上朝向第二MCP 145b和第二2D检测器150b行进。如同图1的布置，检测器布置140的两个部分与微处理器160通信，使得可同步地或异步地收集并存储每个2D检测器150a、150b的3D图像(m/z,x,y)。

同时收集正MMA碎片离子和负MMA碎片离子两者的能力可特别适用于分析膜蛋白络合物或可含有相反极性的子单元的含DNA/RNA的MMA。

线性阱180提供在质谱仪10'的第二操作模式中存储碎片离子的便利方式。确切地说，在不将电压施加到电极布置120的加速电极120a、120b的情况下，通过施加脉冲激光100的脉冲产生的MMA碎片离子不会在正交方向(朝向检测器布置140的部分)上离开碎裂区110，而是将继续大体上沿质谱仪10'的飞行轴线且将随后进入线性阱180。

在质谱仪10'是在此第二模式中操作的情况下，目的为收集MMA碎片离子以供使用轨道阱70(图1)进行后续质量分析。当试图从检测器布置150a、150b获得3D图像时，出于确定所关注MMA物质的构形的目的，如上文所解释，合乎需要的是，一次仅来自单个MMA前驱体离子的碎片离子到达检测器布置140，以简化所得图像数据的反卷积。然而，对于组成分析，在离子被捕获以便替代地用轨道阱70进行高分辨率质量分析的情况下，对平均一次在碎裂区中仅具有单个MMA前驱体离子的问题并不存在。因此，在图5的质谱仪10'的第二操作模式中，脉冲激光100可在最大重复率下运行，使得MMA碎片离子可在连续或准连续模式中存储于线性阱180中。对于额外选择性，可对离子到阱180的入射流动进行门控，同时激光脉冲仅允许经受来自聚焦区的激光脉冲的离子进入存储单元。在于此第二模式中已捕获足够数目的MMA碎片离子后，所述MMA碎片离子可沿质谱仪10'的飞行轴线射回，穿过碎裂区110和多极90，且射出到HCD单元80中。从这一点，所述MMA碎片离子可以上文结合图1所描述的方式来处理，即，在HCD单元80中冷却，传递到C阱60且随后正交射出到轨道阱70以供高分辨率质量分析。

体现本发明的又一检测器布置可由布置成围绕碎裂区110/电极布置120的一个或多个检测器构成。举例来说，检测器的圆形或其它大体上弓形的配置可布置在环绕碎裂区110的平面中。检测器布置可包括单个细长检测器，所述单个细长检测器在所述平面中的圆周方向上延伸(弯曲)，且在正交于平面的第二纵向方向上延伸以便形成大体上环形的检测器布置。替代地，检测器布置可包括多个分开的2D检测器，所述2D检测器各自大体上在圆周方向上延伸且被定位成在所述方向上彼此邻近，且同样还在垂直于平面的方向上延伸。那些个别检测器自身可为在圆周方向和纵向方向两者上大体上平坦的(使得当定位成环绕碎裂区彼此邻近时，其形成多边形形状)，或每个检测器可在圆周方向上弯曲，使得每个检测器形成(例如)圆弧。同样，尽管检测器可为平直、平坦的且垂直于检测器布置的平面，但其同样可与所述平面成角度地倾斜以便形成截头圆锥体布置，或其替代地可弯曲以便形成环面部分。在这些不同的检测器配置中，2D检测器仍在检测器表面上检测两个维度(x,y)中的离子以在检测器处提供MMA碎片离子的2D(x,y)空间分布。

在使用中，可检测到达检测器布置的离子的m/z连同此类离子的位置；例如，参数“x”可表示环绕检测器布置的离子的圆周位置，而参数“y”表示离子在纵向方向上的位置。此类布置准许以类似于粒子物理学中所使用的粒子追踪和事件重建技术的方式在可能任何方向上检测碎片离子(即，环绕碎裂区110呈360度圆弧)。

在此类检测器布置的情况下，可能需要在交替极性下通过带栅极的环形或其它形状的引出电极使用引出。图1和图5的质谱仪10和10'分别可通过使用图6中所示出的修改来进一步改进。图6以俯视截面图示出图1和图4的电极布置120以及电极布置120的第一加速电极120a和第二加速电极120b，第一加速电极120a和第二加速电极120b中的每一者具有大体上沿质谱仪10(图1)的飞行轴线或大体上正交于其(图5的质谱仪10')的中心孔口，还提供额外薄板电极190。薄板电极190被布置成平行于第一加速电极120a和第二加速电极120b，且具有中心间隙135。引导脉冲激光100以便穿过薄板电极190中的间隙135来传播。

在图6的布置中，可由控制器170(参见图1)跨越薄板电极190中的间隙135施加高电压脉冲数纳秒。控制器将高电压脉冲控制成刚好在来自脉冲激光100的激光脉冲之前施加所述高电压。在所述基础上，仅具有相对于薄板电极190的正确位置的离子通过适合与激光束相交的横向移位来位移。此举的结果是碎裂区110的体积比图1和图5的质谱仪的体积小得多。确切地说，MMA前驱体离子环绕脉冲激光100的焦点限制于小体积中。体积可例如为大致直径为0.5mm到1mm的圆柱。

此外，可使用约10⁷V/m或更高的强电场以便不仅产生MMA前驱体离子的横向移位，而且导致MMA的通常相当大的偶极矩与电场对准。特别是在结合在HCD单元80中低温冷却使用时，此技术可提供对MMA前驱体离子的定向的额外约束，这又可辅助其结构的反卷积。确切地说，如果可假定所关注MMA物质的轴线中的一者相对于每个所产生3D图像的检测器布置140处于相同的方向上，那么待解决的问题(通过3D重建识别结构)的自由度数目减小。

施加到薄板电极190以便根据MMA前驱体离子的偶极矩对准MMA前驱体离子的高电压脉冲以激光脉冲的结束而结束，与MMA前驱体离子碎片一样。随后，可施加正常、均匀场以朝向检测器布置140引出MMA碎片离子(其示出于图1中或如图AA中所示出)。

在质谱仪10或10'在第二模式中操作(对多个MMA碎片的高分辨率质量分析)的情况下，不需要在碎裂之前对MMA前驱体离子定向。

MMA的对准还可在不存在强电场的情况下借助于如例如Zhang等人(Phys.Rev.A83(2011)043410),Kraus等人(Phys.Rev.Lett.109(2012)233903,arXiv:1311.3923[physics.chem-ph]).中所描述的双色非谐振飞秒激光脉冲来实施。

尽管已描述本发明的一些优选实施例，但将理解，这些实施例仅仅是出于说明的目的，且预期各种替代布置。举例来说，尽管如关于图1的质谱仪10所描述(且同样适用于图5的质谱仪10')，在于离子源10中电离之后MMA前驱体离子完整到达碎裂区110，但这决非必要的。举例来说，可使用HCD单元80使MMA前驱体离子初始碎裂成较小碎片。通常，用于HCD单元80中的完整MMA前驱体离子的碎裂机构将不同于通过碎裂区110中的光致解离产生的碎裂机构。因此，在于碎裂区110中对那些初始碎片进行进一步光致解离之前完整MMA前驱体离子的初步碎裂可在识别和分析所关注原始MMA物质的结构和组合物时提供其它有帮助的信息。

因此应理解，在本说明书和权利要求书提及“MMA前驱体离子”的情况下，这应理解为不仅意味着完整、完全的MMA离子，而且意味着那些MMA离子的碎片或甚至那些MMA离子的第二代或第三代碎片，这是因为其进入碎裂区110且经受脉冲激光100以供在此处碎裂。此外，尽管所描述实施例提议四极滤质器和在离子源与碎裂区110之间的HCD单元，但用于MMA前驱体离子选择和初步碎裂的其它机构对于有经验的读者将为显而易见的。此外，用以允许特定MMA前驱体离子的过滤/隔离注入到碎裂区110中的布置对于所属领域的技术人员将为显而易见的。

举例来说，MMA离子在碎裂区110中的碎裂不仅可通过光子(例如，用纳秒、皮秒或飞秒时长的脉冲，用红外与真空紫外线之间任何位置的波长，通过激光或同步加速器产生)来进行，而且还可通过与气体碰撞(优选地在加速数千伏特之后)，通过具有相同或相反极性的离子束或通过电子束来进行。碎裂技术适用于体现本发明的方法的主要要求是MMA碎片在2D检测器150上的最终位置与其相对于MMA的质量中心在MMA内的原始位置之间存在相关性。此要求有利于碎裂意味着在快于MMA的旋转周期(即，快于几纳秒，优选地在皮秒范围内)的时间标度上实现碎裂。

2D检测器不限于TimePix阵列，但可属于另一空间解析检测器类型，例如，延迟线检测器、基于CMOS的有源像素检测器等。

此外，所提议技术可结合使用相同或分开的器械操作的任何其它基于MS的方法来使用，以允许确定MMA结构的所有能级，例如(但不限于)HD交换、交联、亲和标签MS、从上到下和从下到上的蛋白质组研究，以用于确定互补碎片、足迹法MS、限制性蛋白分解MS、离子迁移率等等。

尽管前述描述集中于MMA前驱体离子和其碎裂成碎片离子以供后续检测，但原理上还可能检测穿过HCD单元80飞出的中性分子(碎片或中和前驱体)，其限制条件为那些中性分子以足够能量通过碎裂区110。在所述情况下，可需要被专门配置成检测此类中性分子的第三经同步检测器。

最终，尽管本文中在轨道阱质量分析器70的上下文中已描述高分辨率质谱，但对于高分辨率，高分辨率质量分析的其它形式(例如，傅里叶变换质谱法(FTMS)或飞行时间质谱)可同样用于确定MMA前驱体或碎片离子的质量。对此类高分辨率分析器的主要要求是从质谱可靠地识别碎片的能力，这通常需要超过10,000到50,000的质量分辨力和更好大于3ppm到20ppm的质量准确度。

Claims (56)

1.一种确定大分子组装体的结构的方法，其包括以下步骤：

(a)产生待研究的大分子组装体物质的大分子组装体前驱体离子；

(b)将所述大分子组装体前驱体离子输送到碎裂区；

(c)在所述碎裂区中进行所述大分子组装体前驱体离子的脉冲碎裂；

(d)对于第一多个大分子组装体前驱体离子，检测所得大分子组装体碎片离子的空间分布和所述大分子组装体碎片离子的m/z分布两者；

(e)分析由待研究的所述大分子组装体物质的所述第一多个大分子组装体前驱体离子形成的碎片离子的所述空间和m/z分布，以确定那些碎片离子在所述大分子组装体的前驱体的结构内的相对位置；以及

(f)根据对碎片离子的所述空间和m/z分布的所述分析重建所述大分子组装体的三维(3D)结构。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述步骤(d)中，检测所得大分子组装体碎片离子的所述空间分布和检测所述大分子组装体碎片离子的所述m/z分布是同时进行的。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其进一步包括根据所述所得大分子组装体碎片离子的质荷比m/z通过飞行时间分开所述所得大分子组装体碎片离子，由此从所述大分子组装体碎片离子的飞行时间推断所述大分子组装体碎片离子的所述m/z分布。

4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述大分子组装体具有至少50kDa(千道尔顿)的质量，和/或为非共价结合络合物。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述大分子组装体具有至少100kDa的质量。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述大分子组装体具有至少200kDa的质量。

7.根据权利要求4所述的方法，其中所述大分子组装体具有至少500kDa的质量。

8.根据权利要求4所述的方法，其中所述大分子组装体具有至少1MDa(兆道尔顿)的质量。

9.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述前驱体离子为多电荷的，且所述所得大分子组装体碎片的总电荷不超过形成所述所得大分子组装体碎片的所述大分子组装体前驱体离子的电荷。

10.根据权利要求1所述的方法，其中进行所述大分子组装体前驱体离子的脉冲碎裂的所述步骤(c)包括在所述碎裂区中将脉冲激光或同步加速器光束聚焦于所述大分子组装体前驱体离子上。

11.根据权利要求10所述的方法，其中选择大分子组装体前驱体离子穿过所述碎裂区的流动速率和所述激光的脉冲速率，使得平均在所述激光的每次脉冲期间在所述碎裂区内使不多于一个大分子组装体前驱体离子碎裂。

12.根据权利要求10或权利要求11所述的方法，其中所述激光的功率密度超过10¹⁰瓦特/平方米，且所述激光的能量密度超过100J/m²。

13.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其进一步包括设置大分子组装体前驱体离子流动到所述碎裂区中或穿过所述碎裂区的流动速率，和设置所述脉冲碎裂的脉冲速率，使得平均一次在所述碎裂区内使不多于一个大分子组装体前驱体离子碎裂。

14.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中进行脉冲碎裂的所述步骤(c)是在超过10Hz的脉冲速率下执行。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述脉冲碎裂是在不大于10,000Hz的脉冲速率下执行。

16.根据权利要求1所述的方法，其中检测所述大分子组装体碎片离子的所述空间和m/z分布的所述步骤(d)包括使用定位在所述碎裂区下游的二维检测器来检测所述碎片离子。

17.根据权利要求16所述的方法，其进一步包括在所述大分子组装体前驱体离子的脉冲碎裂之后加速所述大分子组装体碎片离子。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述大分子组装体碎片离子加速了10keV到30keV。

19.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其进一步包括在定位成邻近于所述二维检测器且在所述二维检测器上游的微通道板(MCP)处将大分子组装体碎片离子转换成电子，使所产生电子的数目倍增，以及将所述倍增的电子引导到所述二维检测器。

20.根据权利要求16所述的方法，其包括：对于每个大分子组装体前驱体离子，产生由所述大分子组装体前驱体离子产生的所述大分子组装体碎片离子中的每一者的位置与飞行时间的映射，以及一同分析由待研究的所述大分子组装体物质的所述多个前驱体离子产生的所述多个映射。

21.根据权利要求20所述的方法，其中一同分析由待研究的所述大分子组装体物质的所述多个前驱体离子产生的所述多个映射的所述步骤包括基于质谱的类似程度和/或空间分布和/或所测量飞行时间与对应的大分子组装体碎片离子的预期飞行时间的偏离而对所述映射中的每一者进行分类和群集。

22.根据权利要求21所述的方法，其中每个集群中的所述映射的(x,y)图像以旋转方式对准且分组成具有高(m/z,x,y)类似性的多个组。

23.根据权利要求22所述的方法，其中通过建立大分子组装体碎片离子的倍数的空间约束和相关性来确定所述类似程度。

24.根据权利要求23所述的方法，其中通过将所述映射中的每一者中的大分子组装体碎片离子对分组在一起来建立所述空间约束，且基于检测频率、与其它大分子组装体碎片离子的分开程度和/或所述大分子组装体前驱体离子相对于所述二维检测器的多个定向之间的一致性和/或所测量飞行时间与所述对应大分子组装体碎片离子的预期飞行时间的偏离而获得相关性分数。

25.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其进一步包括在所述碎裂区中或紧靠所述碎裂区上游产生电磁场以便在固定空间方向上对准所述大分子组装体前驱体离子的轴线。

26.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，对于第二多个大分子组装体前驱体离子，在进行脉冲碎裂的所述步骤(c)之后，所述方法进一步包括以下步骤：

(h)将所述大分子组装体碎片离子导向离子存储装置；

(i)将所述大分子组装体碎片离子存储在所述离子存储装置中；

(j)将所述大分子组装体碎片离子从所述离子存储装置引导到高分辨率质谱仪中；以及

(k)使用所述高分辨率质谱仪来确定所述大分子组装体碎片离子的所述m/z。

27.根据权利要求26所述的方法，其进一步包括累积来自所述离子存储装置中的所述第二多个大分子组装体前驱体离子中的多个大分子组装体前驱体离子的大分子组装体碎片离子，之后将那些累积的大分子组装体碎片离子引导到所述高分辨率质谱仪中。

28.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述步骤(b)进一步包括输送所述大分子组装体前驱体离子穿过滤质器且选择物质的大分子组装体前驱体离子以使用所述滤质器来进行研究。

29.一种质谱仪，其包括：

离子源，其用于产生待研究的大分子组装体物质的前驱体离子；

离子检测器布置，其具有检测器离子光学件和第一二维检测器；

脉冲碎裂构件，其用于在定位于所述离子检测器布置与所述离子源之间的碎裂区中使所述大分子组装体前驱体离子碎裂；

离子光学件，其用于将所述大分子组装体前驱体离子从所述离子源输送到所述碎裂区；以及

处理器；

其中，对于第一多个大分子组装体前驱体离子，所述离子检测器布置的所述第一二维检测器被布置成检测由所述脉冲碎裂构件产生的大分子组装体碎片离子的空间分布和那些大分子组装体碎片离子的m/z分布两者；

且进一步其中所述处理器被配置成分析由待研究的所述大分子组装体物质的所述第一多个前驱体离子形成的大分子组装体碎片离子的所述空间和m/z分布，以便确定那些大分子组装体碎片离子在所述前驱体大分子组装体的结构内的相对位置且据此重建所述大分子组装体物质的三维(3D)结构。

30.根据权利要求29所述的质谱仪，其中所述脉冲碎裂构件包括聚焦在所述碎裂区上的激光或同步加速器光束。

31.根据权利要求30所述的质谱仪，其中所述激光或同步加速器光束的功率密度超过10¹⁰瓦特/平方米，且所述激光的能量密度超过100J/m²。

32.根据权利要求30或权利要求31所述的质谱仪，其中脉冲速率超过10Hz。

33.根据权利要求32所述的质谱仪，其中所述脉冲速率不大于10,000Hz。

34.根据权利要求29到31中任一项所述的质谱仪，其中所述离子检测器布置进一步包含定位在所述第一二维检测器前方的微通道板，所述微通道板将从所述碎裂区到达的大分子组装体碎片离子转换成电子，且在由所述第一二维检测器检测之前使那些电子倍增。

35.根据权利要求29到31中任一项所述的质谱仪，其中所述离子检测器布置被配置成与大分子组装体碎片离子的飞行时间分布同时检测那些大分子组装体碎片离子的所述空间分布，且进一步其中所述处理器被配置成对于每个大分子组装体前驱体离子，产生并存储由所述大分子组装体前驱体离子产生的所述大分子组装体碎片离子中的每一者的位置与飞行时间的映射，且一同分析由待研究的所述大分子组装体物质的所述多个前驱体离子产生的所述多个映射。

36.根据权利要求35所述的质谱仪，其中所述处理器被配置成基于所述映射之间的类似程度而对所述映射中的每一者进行分类。

37.根据权利要求29到31中任一项所述的质谱仪，其中所述第一二维检测器具有Timepix芯片或此类芯片的阵列。

38.根据权利要求29到31中任意一项所述的质谱仪，其中所述检测器离子光学件包含用以加速所述碎裂区与所述第一二维检测器之间的所述大分子组装体碎片离子的电极布置。

39.根据权利要求29到31中任一项所述的质谱仪，其进一步包括控制器。

40.根据权利要求39所述的质谱仪，其中所述控制器被布置成控制所述脉冲碎裂构件的脉冲速率且控制大分子组装体前驱体离子流动到所述碎裂区中或穿过所述碎裂区的流动速率，使得平均一次在所述碎裂区内使不多于一个大分子组装体前驱体离子碎裂。

41.根据权利要求38所述的质谱仪，其中所述质谱仪进一步包括控制器和高分辨率质量分析器，所述控制器被进一步布置成控制所述电极布置，使得对于大分子组装体物质的第二多个大分子组装体前驱体离子，由所述脉冲碎裂构件产生的大分子组装体碎片离子被导向所述高分辨率质量分析器，进而加以分析。

42.根据权利要求41所述的质谱仪，其进一步包括与所述碎裂区连通的离子存储装置，所述控制器被进一步配置成致使所述电极布置将源自所述第二多个大分子组装体前驱体离子的大分子组装体碎片离子从所述碎裂区引导到所述离子存储装置中以供在此处存储。

43.根据权利要求42所述的质谱仪，其中所述离子存储装置被定位成正交于所述离子检测器布置，使得对于来自所述第一多个大分子组装体前驱体离子的大分子组装体碎片离子，所述控制器致使所述电极布置将所述大分子组装体碎片离子导向所述第一二维检测器，而对于来自所述第二多个大分子组装体前驱体离子的大分子组装体碎片离子，所述控制器致使所述电极布置将来自所述第二多个大分子组装体前驱体离子的所述大分子组装体碎片从所述碎裂区导向所述离子存储装置。

44.根据权利要求42或权利要求43所述的质谱仪，其中所述离子检测器布置进一步包含定位于所述碎裂区的与所述第一二维检测器相反的侧上的第二二维检测器，所述控制器被配置成控制所述电极布置，使得由所述第一多个大分子组装体前驱体离子产生的第一极性的大分子组装体碎片离子被导向所述第一二维检测器，而由所述第一多个大分子组装体前驱体离子产生的第二极性的大分子组装体碎片离子被导向所述第二二维检测器。

45.根据权利要求42或权利要求43所述的质谱仪，其中所述离子检测器布置延伸且围绕所述电极布置的至少一部分。

46.根据权利要求45所述的质谱仪，其中所述离子检测器布置包括多个二维检测器，所述二维检测器中的每一者面向且至少部分地围绕所述碎裂区。

47.根据权利要求45所述的质谱仪，其中所述离子检测器布置包括细长二维检测器，当所述碎片离子从所述碎裂区飞向所述二维检测器时，所述细长二维检测器在垂直于所述碎片离子的方向飞行的平面中弯曲，使得所述细长二维检测器形成环绕所述碎裂区的圆弧。

48.根据权利要求41到43中任一项所述的质谱仪，其中所述脉冲碎裂构件被布置成正交于所述离子存储装置和二维检测器两者。

49.根据权利要求42或权利要求43所述的质谱仪，其中所述控制器被进一步配置成控制所述离子存储装置，以便累积来自所述第一多个大分子组装体前驱体离子中的多个大分子组装体前驱体离子的大分子组装体碎片离子，且致使所述累积的大分子组装体碎片离子从所述离子存储装置朝向所述高分辨率质量分析器射出，以供在此处分析所述累积的大分子组装体碎片离子。

50.根据权利要求42或权利要求43所述的质谱仪，其中所述控制器被配置成与所述脉冲碎裂构件合作对所述电极布置进行门控。

51.根据权利要求29到31中任一项所述的质谱仪，其进一步包括邻近于所述碎裂区的碎裂区离子光学件，所述碎裂区离子光学件用于将离子限制在所述碎裂区内的目标体积内。

52.根据权利要求51所述的质谱仪，其中所述碎裂区离子光学件包括具有间隙的一个或多个电极，所述脉冲碎裂构件可穿过所述间隙来传播。

53.根据权利要求39所述的质谱仪，其进一步包括具有间隙的一个或多个碎裂区电极，所述脉冲碎裂构件可穿过所述间隙来传播，且进一步其中所述控制器被配置成控制施加到碎裂区电极的电压以便在所述大分子组装体前驱体离子碎裂之前相对于所述离子检测器布置对准大分子组装体前驱体离子的偶极。

54.根据权利要求41到43中任一项所述的质谱仪，其进一步包括位于所述碎裂区与所述高分辨率质量分析器之间的离子冷却布置。

55.根据权利要求54所述的质谱仪，其中所述离子冷却布置包括较高碰撞能量解离单元。

56.根据权利要求39所述的质谱仪，其进一步包括紧靠所述碎裂区上游的多极。