CN107106543A

CN107106543A - 自身免疫性疾病中的褪黑激素

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Publication number: CN107106543A
Application number: CN201580073200.2A
Authority: CN
Inventors: M·法雷; F·J·昆塔纳; J·科雷亚莱
Original assignee: Brigham and Womens Hospital Inc
Current assignee: Brigham and Womens Hospital Inc
Priority date: 2014-11-12
Filing date: 2015-11-12
Publication date: 2017-08-29
Also published as: JP2017537083A; CA2967961A1; US20170333371A1; EP3217973A1; US10555919B2; EP3217973A4; WO2016077654A1

Abstract

本发明披露了用于在患有多发性硬化症(MS)的受试者中治疗MS的季节性恶化或减少其发展的风险的方法，该方法包括向受试者给予褪黑激素激动剂。

Description

自身免疫性疾病中的褪黑激素

优先权声明

这一申请要求于2014年11月12日提交的美国临时申请序列号62/078,473的权益。以上文献的全部内容通过引用结合在此。

联邦资助的研究或进展

本发明在受美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的政府支持下完成，批准号为AI093903和NS087867。美国政府享有本发明的一定的权利。

技术领域

在此描述了用于在患有多发性硬化症(MS)的受试者中治疗MS的季节性恶化或减少其发展的风险的方法，该方法包括向受试者给予褪黑激素激动剂。

发明背景

认为多发性硬化症(MS)是由于自体反应性T细胞所致的髓鞘破坏引起的中枢神经系统(CNS)的免疫介导性疾病。CD4⁺ T细胞特征在于IFN-γ(Th1细胞)或IL-17(Th17细胞)的产生被认为是MS免疫病理的重要促成因素(Miossec等人，2009；Sospedra和Martin，2005；Steinman，2014)。FoxP3⁺调节性T细胞(FoxP3⁺)和IL-10分泌型1调节性T细胞(Tr1)调节效应T细胞的活性，相应地Tregs和Tr1细胞的不足已经描述于MS中(Astier等人，2006；Sakaguchi等人，2010；Viglietta等人，2004)。因此，效应T细胞和调节性T细胞之间的平衡控制MS疾病活性(Miossec等人，2009；Sospedra和Martin，2005；Steinman，2014)。

已经将遗传多态性与MS风险和/或发病机理关联(Beecham等人，2013；Sawcer等人，2011)。然而，环境因素，例如感染(Ascherio等人，2001；Correale和Farez，2007；Correale等人，2006)、钠摄入(Farez等人，2014)、吸烟(Hernan，2005)和维生素D水平(Ascherio等人，2014)也影响MS发展和进程。例如，较低水平的维生素D与较高复发率相关联(Runia等人，2012；Simpson等人，2010)。作为维生素D合成受日照调节的结果，在多数地点观察到维生素D水平的显著季节性波动，其中在春夏达到峰值，并且在秋季和冬季达到最低点(Rosecrans和Dohnal，2014)。因此，基于维生素D的已报道的抗炎作用(Correale等人，2009)(Ascherio等人，2010)，预计MS复发出现在秋季和冬季期间达到峰值。然而，若干研究，包括荟萃分析(Jin等人，2000)和最近的多中心研究(Spelman等人，2014)发现MS疾病活性在春季和夏季较高，提示有另外的因素在MS复发季节性方面起作用。

发明概述

如在此描述的，在秋冬达到峰值的褪黑激素水平示出与MS患者中的临床疾病活性的负相关。此外，褪黑激素限制了EAE的发展并且控制了Th17和Tr1细胞分化。因此，褪黑激素水平中的季节性变动可能通过至少部分地由效应T细胞和调节性T细胞的调节介导的机理，促成在秋季和冬季观察到的降低的疾病活性。

因此，在此提供了用于在已经患有多发性硬化症(MS)的受试者中，治疗多发性硬化症(MS)或减少其发展的风险的方法，或用于治疗多发性硬化症(MS)的季节性恶化或减少其发展的风险的方法。这些方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的褪黑激素激动剂。

还提供了用于通过向对其有需要的受试者给予治疗有效量的褪黑激素激动剂，在受试者中降低Th17细胞水平和/或增加Tr1细胞水平的方法。在一些实施例中，受试者患有自身免疫性疾病，例如多发性硬化症、肠道易激综合征、克罗恩病、脊柱关节炎、系统性红斑性狼疮、白癜风、类风湿关节炎、银屑病、舍格伦综合征、或糖尿病(例如1型糖尿病)。

在一些实施例中，这些方法包括在来自受试者的样品中，检测褪黑激素(例如6-羟基硫酸褪黑激素(6-SM))的水平；将该样品中的褪黑激素的水平与褪黑激素的参比水平进行比较，该参比水平代表对照受试者(例如患有MS的受试者)中的褪黑激素的水平，该对照受试者具有患有MS的季节性恶化或发展MS的季节性恶化的增加的风险；并且当该样品中的褪黑激素的水平低于参比水平时，将该受试者鉴定为具有患有MS的季节性恶化或发展MS的季节性恶化的增加的风险。

在一些实施例中，褪黑激素的参比水平是或对应于20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、或24ng/mg肌酸酐。

在一些实施例中，褪黑激素激动剂是雷美替胺((S)-N-[2-(1，6，7，8-四氢-2H-茚并[5，4-b]呋喃-8-基)乙基]丙酰胺)、阿戈美拉汀(N-[2-(7-甲氧基萘-1-基)乙基]乙酰胺)、他司美琼((1R，2R)-N-[2-(2，3-二氢苯并呋喃-4-基)环丙基甲基]丙酰胺)、或TIK-301(LY-156735)(N-[(2R)-(6-氯-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)丙基]乙酰胺)。

在一些实施例中，受试者具有MS的季节性恶化的病史，具有与其MS的季节性恶化相关联的一个或多个症状，具有低褪黑激素水平，生活在低褪黑激素季节正在发生或即将发生的气候中，或生活在褪黑激素水平通常很低的气候中。

在一些实施例中，这些方法包括给予REV-ERB激动剂或ROR激动剂。

在一些实施例中，褪黑激素激动剂是口服给予的、经鼻给予的、静脉内给予的、或鞘内给予的。

在此还提供了褪黑激素激动剂用于在患有多发性硬化症(MS)的受试者中治疗MS的季节性恶化或减少其发展的风险中的用途。

在一些实施例中，该受试者具有低于参比水平的褪黑激素水平，例如，褪黑激素的参比水平是或对应于20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、或24ng/mg肌酸酐。

在一些实施例中，褪黑激素激动剂是在包括REV-ERB激动剂或ROR激动剂的组合物中。

在一些实施例中，褪黑激素激动剂被配制为是口服给予的、经鼻给予的、静脉内给予的、或鞘内给予的。

此外，在此提供了用于鉴定用褪黑激素激动剂进行治疗的受试者的方法，该治疗用于减少多发性硬化症(MS)的季节性恶化的发展的风险。这些方法包括选择患有MS的受试者；在来自该受试者的样品中，检测褪黑激素(例如6-羟基硫酸褪黑激素(6-SM))的水平；将该样品中的褪黑激素的水平与褪黑激素的参比水平进行比较，该参比水平代表对照受试者(例如患有MS的受试者)中的褪黑激素的水平，该对照受试者具有患有MS的季节性恶化或发展MS的季节性恶化的增加的风险；当该样品中的褪黑激素的水平低于参比水平时，将该受试者鉴定为具有患有MS的季节性恶化或发展MS的季节性恶化的增加的风险；并且任选地给予褪黑激素拮抗剂至受试者。

除非另外定义，在此所使用的全部技术术语和科学术语具有与本发明所属领域之内的普通技术人员通常所理解的相同的意思。在此描述了用于本发明的方法和材料；还可使用本领域已知的其他合适的方法和材料。这些材料、方法、以及实例仅是说明性的，并且不旨在进行限制。在此提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献通过引用以其整体结合。在有矛盾的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。

本发明的其他特征和优点将从下列详述和附图以及从权利要求中显而易见。

附图说明

图1.褪黑激素示出与MS临床复发逆相关。(a)评估每个季节的恶化率，持续随访的持续时间，并且在主轴中加以描绘。在每个季节，在首次晨尿中测量的6-羟基硫酸褪黑激素被描绘为在副轴中的平均值±s.e.m。P值对应于泊松回归模型。缺少恶化率和维生素D(b)，报道的呼吸道感染(c)、和布宜诺斯艾利斯城中的UV辐射(d)之间的关联。还参见表1。

图2.褪黑激素给予改善了EAE。(a)在用载体(0.01％DMSO)或褪黑激素(5mg/kg)处理的C57/B6中的EAE发展。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)(n≥20只小鼠/组)P值对应于在混合效应模型的重复测量中的治疗效果。(b)在疾病诱导后第7天，来自载体或褪黑激素处理的小鼠的脾的IL-17⁺、IL10⁺、IFN-γ⁺和FoxP3⁺ CD4⁺细胞的流式细胞术分析。每组分析至少4只小鼠，并且数据呈现为平均值±SEM。*未配对T检验的P＜0.05。(c-d)来自处于EAE的临床峰值的对照的或褪黑激素处理的小鼠的CNS的IL-17⁺、IFN-γ⁺、IL-17⁺-IFN-γ⁺(DP)和IL-17⁺-GM-CSF⁺ CD4⁺ T细胞的流式细胞术分析。*未配对T检验的P＜0.05。(e)载体或褪黑激素处理的小鼠的CD4⁺ T细胞对MOG_35-55的增殖应答。每组分析至少3只小鼠，并且数据呈现为平均值±s.e.m。*单向方差分析的P＜0.05。(f)通过增殖来自载体和褪黑激素处理的小鼠的CD4⁺ T细胞的细胞因子分泌。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)*未配对T检验的P＜0.05。(g)在与源自褪黑激素处理的或未处理的小鼠的树突细胞共培养中的CD4⁺ T细胞的增殖应答和细胞因子谱(h)。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)。*单向方差分析的P＜0.05。(i)在树突细胞存在下，褪黑激素处理的2D2CD4⁺ T细胞对MOG_35-55的增殖应答。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)*单向方差分析的P＜0.05。(j)褪黑激素处理的2D2CD4+ T细胞对仅用抗CD3和抗CD28刺激的MOG_35-55的增殖应答。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)*单向方差分析的P＜0.05。(k)处理的2D2CD4⁺ T细胞对MOG_35-55刺激的褪黑激素处理的DC的增殖应答。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)。还参见图7a-e。

图3.褪黑激素干扰人类Th17细胞分化并且促进Tr1产生。(a)在褪黑激素(500ng/ml)和阿戈美拉汀(500ng/ml)存在或不存在下，在人类Th17分化的CD4⁺ T细胞(IL-1β、IL-6和TGF-β1)中IL-17表达的流式细胞术分析。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)*单向方差分析的P＜0.05。(b).在褪黑激素(500ng/ml)和阿戈美拉汀(500ng/ml)存在或不存在下，通过在人类Th17分化的CD4⁺ T细胞中的IL-17的ELISA进行的细胞因子定量。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)*单向方差分析的P＜0.05。(c)如在a.中培养的Th17细胞的RT-PCR分析。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)*单向方差分析的P＜0.05。(d)在褪黑激素(500ng/ml)和阿戈美拉汀(500ng/ml)存在或不存在下，在人类Th1分化的CD4+T细胞(IL-12)中IFN-g表达的流式细胞术分析。数据代表三次独立实验(平均值和SEM)。(e).在褪黑激素(500ng/ml)和阿戈美拉汀(500ng/ml)存在或不存在下，通过在人类Th1分化的CD4⁺ T细胞中的IFN-γ的ELISA进行的细胞因子定量。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)*单向方差分析的P＜0.05。(f)如在d中培养的Th1细胞的RT-PCR分析。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)*单向方差分析的P＜0.05。(g)在褪黑激素(500ng/ml)和阿戈美拉汀(500ng/ml)存在或不存在下，在人类Tr1分化的CD4+ T细胞中IL-10表达的流式细胞术分析。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)*单向方差分析的P＜0.05。(h)如在f中培养的Tr1细胞的定量PCR分析。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)。*单向方差分析的P＜0.05。还参见图8。

图4.褪黑激素经由Erk1/2-C/EBPα途径干扰Th17细胞分化。(a)在褪黑激素(2ng/ml)存在或不存在下，通过添加TFG-β、IL-6(0h)和IL-23(48h)将CD4⁺初始T细胞分化为Th17细胞，并且在72h后通过RT-PCR进行分析。展示的图片代表五次实验。*未配对T检验的P＜0.05。(b)如在a中培养72h后，IL-17和IL-10的细胞因子分泌分析。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)*未配对T检验的P＜0.05。(c)在褪黑激素(2ng/ml)、阿戈美拉汀(20ng/ml，MTNR1A配体)和CGP 52608(20ng/ml，ROR-α配体)存在或不存在下，在Th17分化的CD4⁺ T细胞中的细胞因子分泌。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)。*单向方差分析的P＜0.05。(d)如在c中培养的Th17细胞的RT-PCR分析。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)。*单向方差分析的P＜0.05。(e)在野生型小鼠和MTNR1A缺陷小鼠中，如在a中的IL-17表达的流式细胞术分析。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)*未配对T检验的P＜0.05。(f)如在e中培养的野生型和MTNR1A缺陷小鼠的定量PCR分析。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)*未配对T检验的P＜0.05。(g)使用反向蛋白质阵列(reverse proteinarray)进行的信号转导谱。数据代表两次独立实验(平均值和s.e.m.)*未配对T检验的P＜0.05。(h)T-和P-Erk1/2的免疫印迹分析。数据代表两次独立实验(平均值和s.e.m.)。(i)T-和P-C/EBPα的免疫印迹分析。数据代表两次独立实验(平均值和s.e.m.)。(J)在nr1d1中的C/EBPα的推定的结合位点(左侧小图)；用抗C/EBPα进行的染色质免疫沉淀反应(右侧小图)。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)*单向方差分析的P＜0.05。(k)用针对nr1d1启动子的萤光素酶报告基因构建体转染的HEK-293细胞的萤光素酶活性。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)*未配对T检验的P＜0.05。(l)在野生型小鼠和C/EBPα缺陷小鼠中，如在a中的IL-17表达的流式细胞术分析。数据代表两次独立实验(平均值和s.e.m.)。*单向方差分析的P＜0.05。(M)在野生型小鼠和C/EBPα缺陷小鼠中，如在(A)中的IL-17表达的流式细胞术分析。数据代表三次独立实验(平均值和SEM)。*未配对T检验的p＜0.05。还参见图9-10。

图5.褪黑激素通过限制NFIL3表达，干扰Th17细胞分化。(a)介导褪黑激素对Th17细胞分化的作用的建议机制的示意图。(b)在Th0、Th17和Tr1极化条件下持续3天，在活化的CD4⁺ T细胞中nr1d1表达的RT-PCR分析。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)。*未配对T检验的P＜0.05。(c)在Th17极化条件下持续3天，用载体、褪黑激素(2ng/ml)或阿戈美拉汀(20ng/ml)处理，活化的CD4+ T细胞中nr1d1(左侧小图)和nfil3(右侧小图)表达的RT-PCR分析。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)。*未配对T检验的P＜0.05。通过蛋白质印迹(d)进一步确认NFIL3表达。数据代表两次独立实验(平均值和s.e.m.)。(e)在褪黑激素(2ng/ml)和/或UO126存在下，在Th17极化条件下持续3天，活化的CD4⁺ T细胞中nfil3表达的RT-PCR分析。数据代表五次独立实验(平均值和s.e.m.)。*单向方差分析的P＜0.05。(f，g)在褪黑激素(2ng/ml)和/或UO126存在下，在Th17极化条件下，活化的CD4⁺ T细胞中IL-17表达(f)和rorc表达(g)的流式细胞术分析。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)*单向方差分析的P＜0.05。(h，i)在Th17极化条件下，在褪黑激素(2ng/ml)存在下，在感染对照或nr1d1编码逆转录病毒后，活化的CD4+ T细胞中IL-17表达(h)和rorc及il17表达(i)的流式细胞术分析。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)*单向方差分析的P＜0.05。(j，k)在褪黑激素(2ng/ml)存在下，在Th17极化条件下，活化的野生型和REV-ERBα缺陷CD4+ T细胞中IL-17表达(j)和rorc及il17表达(k)的流式细胞术分析。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)*单向方差分析的P＜0.05。(l)在rorc和rora中，Nfil3的推定的结合位点(左侧小图)；在Th17极化条件下，在活化的CD4+ T细胞中，具有其推定的结合位点的NFIL3的相互作用的ChIP分析(右侧小图)。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)*单向方差分析的P＜0.05。(m)在褪黑激素(2ng/ml)存在下，在Th17极化条件下，活化的CD4+ T细胞中rorc和rora表达的RT-PCR分析。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)*未配对T检验的P＜0.05。(n，o)在Th17极化条件下，在褪黑激素(2ng/ml)存在下，并且用对照或nfil3编码逆转录病毒转导，活化的CD4+ T细胞中IL-17表达(n)和rorc及il17表达(o)的流式细胞术分析。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)*单向方差分析的P＜0.05。(p，q)在褪黑激素(2ng/ml)存在下，在Th17极化条件下，在活化的CD4+ T细胞中，野生型小鼠和NFIL3缺陷小鼠中IL-17表达(p)和rorc及il17表达(q)的流式细胞术分析。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)*单向方差分析的P＜0.05。(r)在来自用野生型、MTNR1A-REV-ERBα或NFIL3缺陷CD4+ T细胞重建的、用CFA中的MOG_35-55免疫的并且用载体或褪黑激素(5mg/kg)处理的RAG-1缺陷小鼠的CD4⁺ T细胞中，IL-17和IFN-γ表达的流式细胞术分析。*未配对T检验的P＜0.05。还参见图11。

图6.褪黑激素促进Tr1细胞分化。(a)在褪黑激素(2ng/ml)存在或不存在下，在Tr1分化的CD4⁺ T细胞中，il10、ahr和maf表达的RT-PCR分析。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)。*单向方差分析的P＜0.05。(b)体外抑制测定，在与先前标记有CSFE的CD4⁺ T细胞一起72h后，将如在a中的处理的或未处理的分化的Tr1细胞共培养，并且在48h后，通过流式细胞术测量增殖周期(CSFE稀释)。数据代表两次独立实验(平均值和s.e.m.)。*单向方差分析的P＜0.05。(c)在褪黑激素(2ng/ml)、阿戈美拉汀(20ng/ml，MTNR1A配体)和CGP 52608(20ng/ml，ROR-α配体)存在或不存在下，在Tr1分化的CD4⁺ T细胞中的IL-10表达的流式细胞术分析。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)*单向方差分析的P＜0.05。(d)如在c中培养的Th1细胞的RT-PCR分析。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)*单向方差分析的P＜0.05。(e)在野生型小鼠和MTNR1A缺陷小鼠中，如在c中的il10表达的RT-PCR分析。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)*单向方差分析的P＜0.05。(f)添加或不添加UO126的情况下，褪黑激素处理的Tr1细胞中il10的RT-PCR表达。数据代表五次独立实验(平均值和s.e.m.)。*对比载体和信号转导抑制剂对照条件，未配对T检验的P＜0.05。**对比UO126处理的条件的载体，P＜0.05。(g)在野生型小鼠和ROR-α缺陷小鼠中，如在c中的IL-10表达的流式细胞术分析。(h)ROR-α推定的结合位点存在于il10启动子中(下方小图)，以及用抗ROR-α进行的染色质免疫沉淀反应(上方小图)。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)。*未配对T检验的P＜0.05。(i)用针对il10启动子的萤光素酶报告基因构建体转染的HEK-293细胞的萤光素酶活性。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)*未配对T检验的P＜0.05。(j)描绘Tr1细胞中的褪黑激素的作用的示意图。

图7.褪黑激素依赖性EAE改善涉及的机制涉及图2(A)在疾病诱导后第15天开始，用载体(或褪黑激素(5mg/kg))处理的C57/B6中的EAE发展。数据代表两次独立实验(平均值和SEM)(nR10小鼠/组)。中间小图中的P值对应于在混合效应模型的重复测量中的治疗效果。*未配对T检验的p＜0.05。(B)在疾病的峰值，来自载体或褪黑激素处理的小鼠的CNS的IL-17+、IL10+、IFN-g+和FoxP3+ CD4+细胞的流式细胞术分析。每组分析至少4只小鼠，并且数据呈现为平均值±SEM。*未配对T检验的p＜0.05。(C)在疾病的峰值，来自载体或褪黑激素处理的小鼠的脾的CD19+ B细胞、gd T细胞和Lin-CD90+CD127+IL17+IL22+先天淋巴细胞(ILC)的流式细胞术分析。每组分析至少4只小鼠，并且数据呈现为平均值±SEM。*未配对T检验的p＜0.05。(D)来自处于EAE的临床峰值的对照或褪黑激素处理的小鼠的CNS的IL-17+、IL-17+-IFN-g+、IL-17+-GM-CSF+CD4+ T细胞的流式细胞术分析(总数)。*未配对T检验的p＜0.05。(E)在抗原呈递细胞和MOG35-55肽存在下，体外培养的2D2+T细胞的上清液中的IL17、IL-10、和IFN-g。数据代表两次独立实验(平均值和SEM)。*未配对T检验的p＜0.05。(F)在载体或褪黑激素存在下，用抗体CD3和CD28刺激3天后，碘化丙啶+和膜联蛋白V+CD4+T细胞的流式细胞术分析。数据代表两次独立实验(平均值和SEM)。*未配对T检验的p＜0.05。(G)在载体和褪黑激素20ng/ml存在下，如在(F)中描述的活化的CD4+T细胞中Bcl-xl和肌动蛋白的免疫印迹分析。数据代表两次独立实验(平均值和SEM)。(H)在褪黑激素和对照或IL-10阻断抗体存在下，用针对CD3和CD28的抗体刺激的CD4+ T细胞的增殖应答。数据代表三次独立实验(平均值和SEM)。单向方差分析的*p＜0.05。

图8.褪黑激素干扰人类Th17Cell细胞分化，涉及图3(A)在褪黑激素(500ng/ml)和阿戈美拉汀(500ng/ml)存在或不存在下，在人类Th17分化的CD4+T细胞(IL-1b、IL-6和IL-23)中IL-17表达的流式细胞术分析。数据代表三次独立实验(平均值和SEM)。单向方差分析的*p＜0.05。(B)通过如在a中，在褪黑激素(500ng/ml)和阿戈美拉汀(500ng/ml)存在或不存在下，在人类Th17分化的CD4+ T细胞中的IL-17的ELISA进行的细胞因子定量。数据代表三次独立实验(平均值和SEM)。单向方差分析的*p＜0.05。(C)如在a中培养的Th17细胞的RT-PCR分析。数据代表三次独立实验(平均值和SEM)。单向方差分析的*p＜0.05。

图9.褪黑激素选择性地干扰Th17细胞分化并且促进Tr1产生，涉及图4(A和B)在载体或褪黑激素(2ng/ml)存在下，在Th17(A)或Th1(B)极化条件下，活化3天的CD4+ T细胞的增殖应答的流式细胞术分析。数据代表三次独立实验(平均值和SEM)。单向方差分析的*p＜0.05。(C)在载体或褪黑激素(2ng/ml)存在下，在Th17极化条件下，活化3天的CD4+ T细胞的RORgt表达的流式细胞术分析。数据代表三次独立实验(平均值和SEM)。*未配对T检验的p＜0.05。(D)在载体或褪黑激素(2ng/ml)存在下，在Th1极化条件下，活化3天的CD4+ T细胞的T-bet表达的流式细胞术分析。数据代表三次独立实验(平均值和s.e.m.)。(E)添加或不添加褪黑激素(2ng/ml)，在有利于Th1、Th2、Th17、Tr1和FoxP3+iTreg细胞的分化的机化条件下，活化3天的CD4+初始T细胞的流式细胞术分析。数据代表三次独立实验(平均值和SEM)。*未配对T检验的p＜0.05。(F)如在(E)中描述的培养的CD4+ T细胞中，基因表达的RT-PCR分析。数据代表两次独立实验(平均值和SEM)。*未配对T检验的p＜0.05。

图10.褪黑激素和相关药物影响Th17细胞分化，涉及图4(A和B)在褪黑激素(2ng/ml)和对照或IL-2阻断抗体存在下，在Th17极化条件下，活化的CD4+ T细胞中rorc(A)和il17(B)表达的RT-PCR分析。数据代表两次独立实验(平均值和SEM)。*未配对T检验的p＜0.05。(C)在褪黑激素(2ng/ml)存在下，在Th17或Tr1极化条件下持续3天，活化的初始CD4+T细胞中MTNR1A的表达的免疫印迹分析。数据代表两次独立实验(平均值和SEM)。(D)在体内分化3天后，不同CD4+ T细胞亚群中的rora表达的RT-PCR分析。数据代表五次独立实验(平均值和SEM)。*未配对T检验的p＜0.05。(E)用编码RORa的构建体和针对RORa响应性bmal启动子的萤光素酶报告基因构建体共转染的HEK293细胞中的萤光素酶活性。数据代表两次独立实验(平均值和SEM)。*未配对T检验的p＜0.05。(F)在载体、褪黑激素(2ng/ml)和雷美替胺(10ng/ml)存在下，在Th0或Th17极化条件下，活化的鼠CD4+ T细胞的上清液中的IL17和IL-10。(G)如在(F)中活化的CD4+ T细胞中的rorc和il17表达的RT-PCR分析。数据代表两次独立实验(平均值和SEM)。*未配对T检验的p＜0.05。(H和I)在Th17极化条件下，并且用载体、褪黑激素(2ng/ml)或阿戈美拉汀(20ng/ml)处理，活化的野生型或MTNR1A KO CD4+ T细胞中的Erk1/2磷酸化的流式细胞术分析的磷/总Erk比率(H)和MFI比率(I)的百分率。数据代表两次独立实验(平均值和SEM)。*未配对T检验的p＜0.05。

图11.在CD4+ T细胞中，EAE中的褪黑激素作用是由MTNR1A和Nfil3介导的，涉及图5。在来自用野生型、MTNR1A-或NFIL3-缺陷CD4+ T细胞重建的、用CFA中的MOG35-55免疫的并且用载体或褪黑激素(5mg/kg)处理的RAG-1缺陷小鼠的CNS的CD4+ T细胞中，rorc、il17和csf2表达的RT-PCR分析。*未配对T检验的p＜0.05。

图12.在REV-ERB α激动剂SR9009(5微摩尔)存在或不存在下，通过添加TFG-b、IL-6(0hr)和IL-23(48hr)将CD4+初始T细胞分化为Th17细胞，并且在72h后通过RT-PCR进行分析。*未配对T检验的p＜0.05。

发明详述

强流行病学证据支持维生素D在减少MS复发方面的作用(Ascherio等人，2012)。引人注目地，维生素D水平在春季和夏季(此时MS患者复发发生达到峰值)较高。因此，在多个季节中复发的较低发生(特征在于较低的维生素D水平)提出了一个“季节性悖论”：在春季和夏季，维生素D水平较高时，复发频率较低，这与多数研究中发现的相反(Jin等人，2000；Spelman等人，2014)，只有少数例外(等人，2012)。我们的数据可以通过鉴定褪黑激素(它的水平是由昼长的季节性波动调节，为MS中免疫应答附加调节子)来解决这一悖论。注意到夜班工作(与较低总体褪黑激素水平关联)(Schernhammer等人，2004)增加了发展MS的风险(等人，2011)。这些发现提示褪黑激素还可能是MS危险因素；褪黑激素水平和发展MS的风险之间的关系是正在进行的研究的焦点。最后，在不同地理位置中褪黑激素和已知影响MS的其他季节性环境因素(例如维生素D)之间的相互作用仍然要进一步阐明。

在过去50年中，自身免疫障碍的发病率的提高已经达到流行性的比例并且不能仅归因于遗传危险性。因此，环境因素及其对免疫应答特别是T细胞分化的影响正不断引起日益增加的关注。例如，存在于家庭产品中的若干化合物会活化芳烃受体并且同时影响Th17细胞和调节细胞的分化(Quintana等人，2008)；在西化饮食和加工食品中的钠会增强Th17细胞分化(Wu等人，2013)；共生微生物群的组成影响T细胞分化和应答(Lathrop等人，2011)；并且缺少日照和饮食习惯会降低维生素D水平并且影响调节性T细胞的功能(Correale等人，2009)。这些环境因素中的每一个作用于不同信号传导途径，它们之间的复杂相互作用的研究可以阐明环境对免疫系统的影响。

促炎性Th17细胞被认为促成EAE和MS的发病机理(Miossec等人，2009)。由ROR-α和ROR-γt调节Th17细胞分化，并且靶向Th17细胞的疗法目前正在MS和其他自身免疫性疾病中测试，具有初步令人鼓舞的结果(Dominique L.P.Baeten和Kuchroo，2013)。尽管具有活化ROR-α的潜能，褪黑激素经由其膜受体以NFIL3依赖性方式抑制Th17细胞的产生。有趣地，最近已经示出，在夜间，昼夜节律时钟通过类似的NFIL3依赖性机制，抑制Th17发展(Yu等人，2013)。我们的工作提示在夜间，除了Th17细胞，Tr1细胞也以Erk1/2-和ROR-α依赖性方式受褪黑激素调节。基于褪黑激素由松果体产生及其受日光调节的高度进化保守性(Macchi和Bruce，2004)，可能褪黑激素对免疫应答的昼夜节律的和季节性的影响起到生理学作用，该生理学作用在进化期间驱动其正向选择。

Tr1细胞特征在于IL-10的产生(Pot等人，2011；Roncarolo等人，2006)。AhR、c-Maf和Erk1/2调节Tr1细胞发育和IL-10表达(Apetoh等人，2010；Gandhi等人，2010)。本工作示出，褪黑激素通过活化Erk1/2信号转导促进Tr1细胞分化，这已经在先前被描述为控制T细胞和DC中的IL-10表达(Saraiva和O′Garra，2010)。我们还将ROR-α鉴定为Tr1细胞中褪黑激素作用的介体。因此，这些数据提示褪黑激素利用多个途径来促进Tr1细胞分化。

促炎性的和调节性的细胞之间的相互作用控制自身免疫性疾病(例如MS)的发展。在此我们报道了褪黑激素(它的水平示出季节变异性)控制了致病性和调节性T细胞之间的平衡。本数据将褪黑激素依赖性信号转导鉴定为治疗性免疫调节的潜在靶点。

治疗方法

如在此所示，褪黑激素(它的水平示出季节变异性)可以控制致病性和调节性T细胞之间的平衡并且改善其中致病性Th17 T以增加的水平存在和/或具有增加的活性的自身免疫性疾病，例如MS。例如，可以受益于使用在此描述的组合物和方法的治疗的其他自身免疫性病症包括但不限于阿狄森病、脱发、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎、白塞氏病、大疱性类天疱疮、脂泻病、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经疾病、丘-施二氏综合征、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素病、CREST综合征、克罗恩病、糖尿病(例如I型糖尿病)、家族性植物神经功能不全、子宫内膜组织异位、嗜酸粒细胞增多肌痛综合征、原发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛、综合征/纤维性肌炎、格雷夫斯氏病、吉兰-巴雷综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、炎症性肠病(IBD)、扁平苔癣、狼疮、美尼尔氏病、混合性结缔组织病(MCTD)、多发性硬化症、重症肌无力、天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、软骨炎、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、雷诺氏现象、莱特尔综合征、风湿热、类风湿关节炎、结节病、硬皮病、舍格伦综合征、脊椎关节病(脊柱关节炎)、僵体综合征、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、自身免疫性甲状腺疾病、溃疡性结肠炎、自身免疫性眼色素层炎、自身免疫性血管炎、白癜风、以及韦格纳氏肉芽肿病。在一些实施例中，自身免疫性疾病是IBD、克罗恩病、脊柱关节炎、系统性红斑性狼疮、白癜风、类风湿关节炎、银屑病、舍格伦综合征、或糖尿病，例如I型糖尿病，所有这些都已经关系到Th17细胞功能障碍(参见例如Korn等人，Annu RevImmunol.[免疫学年鉴]2009；27：485-517Dong，Cell Research[细胞研究](2014)24：901-903；Zambrano-Zaragoza等人，Int J Inflam.[国际炎症杂志]2014；2014：651503；Waite和Skokos，International Journal of Inflammation；Volume 2012(2012)，Article ID819467，10pages[国际炎症杂志；2012卷(2012)，文章ID 819467，10页]，dx.doi.org/10.1155/2012/819467；Han等人，Frontiers ofMedicine[医学前沿]9(1)：10-19(2015)。

在此描述的方法包括使用褪黑激素受体(例如MTNR1A)的激动剂治疗自身免疫性疾病，例如多发性硬化症(MS)。因此，在一些实施例中，该障碍是MS。在春季和夏季的月份期间，当褪黑激素水平较低时，这些方法是特别有用的，而且可以在任何时间使用。

在一些实施例中，一旦已经确定某人患有自身免疫性疾病，例如MS，则可以给予包括给予治疗有效量的褪黑激素激动剂的治疗。这些方法可以包括从受试者获得样品，并且评估样品中褪黑激素的存在和/或水平，并且将该存在和/或水平与一个或多个参比进行比较，这些参比例如是代表褪黑激素的正常水平的对照参比，例如与冬季月份关联的受试者中的水平，和/或代表与夏季月份关联的褪黑激素的水平的受影响的参比。低于参比水平的褪黑激素的水平的存在指示受试者应该用褪黑激素激动剂进行处理。这些方法还可以用来预测某人是否将受益于用褪黑激素激动剂进行治疗；与具有高于参比水平的褪黑激素的水平的受试者相比，具有低于参比水平的褪黑激素的水平的受试者更可能受益于用褪黑激素激动剂进行的治疗。此外，这些方法可以用于为受试者选择治疗；对于具有低于参比水平的褪黑激素的水平的受试者，选择用褪黑激素激动剂进行的治疗。在一些实施例中，受试者具有与其自身免疫性疾病(例如MS)的季节性恶化相关联的一个或多个症状，具有低褪黑激素水平，生活在低褪黑激素季节正在发生或即将发生的气候中，或生活在褪黑激素水平通常很低的气候(例如热带气候)中。

通常，这些方法包括给予治疗有效量的如在此所述的褪黑激素激动剂至需要、或已经被确定为需要此类治疗的受试者。如在此上下文中使用的，“治疗”意指改善与自身免疫性疾病(例如MS)的季节性恶化相关联的障碍的至少一个症状。治疗会导致自身免疫性疾病(例如MS)的一个或多个症状(例如抑郁和疲劳、膀胱功能障碍、痉挛状态、疼痛、共济失调、和意向震颤)的减少。治疗有效量可以是足以预防急性加重的发作，或足以缩短急性加重的持续时间，或足以减小一个或多个症状(例如热敏性、核间性眼肌麻痹、视神经炎、和Lhermitte[莱尔米特]症状)的严重性的量。在一些实施例中，治疗有效量是足以预防受试者的脑、视神经、和脊髓中的一个或多个内的脱髓鞘病变的出现，延迟或预防该脱髓鞘病变的生长(即尺寸增加)，或促进该脱髓鞘病变的治愈的量，例如，如MRI所证明。

复发-缓解型和进展型MS

多发性硬化症(MS)是中枢神经系统(CNS)的炎性脱髓鞘疾病。MS典型地临床特征在于由CNS中的病变引起的复发的或慢性进展性的神经功能障碍。病理上，这些病变包括影响脑、视神经、和脊髓的多个区域的脱髓鞘。潜在的病因是不确定的，但是MS被广泛认为至少部分地是自身免疫性的或免疫介导的疾病。

在85％的患者中，在最初的、其中急性自身免疫攻击中枢神经系统(CNS)的复发-缓解过程后(RRMS)，MS完全恢复(Compston和Coles，Lancet[柳叶刀]372，1502-1517(2008))。大部分RRMS患者接下来发展继发进展型MS(SPMS)，其特征在于神经失能的进展型的、不可逆的积累(Rovaris等人，Lancet Neurol[柳叶刀神经病学]5，343-354(2006))。表征SPMS的进展型的并且不可逆的失能在不存在新炎性病变的情况下发生，提示在MS的这个阶段，其他机制可能发挥作用(Rovaris等人，Lancet Neurol[柳叶刀神经病学]5，343-354(2006))。尽管若干疗法示出对RRMS的积极作用，但是它们通常在SPMS时无效，并且没有标记可用于监测到SPMS的转换。实际上，阻止适应性炎症应答的治疗示出对RRMS管理的积极作用，但是通常在SPMS中无效(Lopez-Diego和Weiner，Nat Rev Drug Discov[自然评论药物发现]7，909-925(2008))。因此，重要的是表征到SPMS的转换所涉及的过程，从而鉴定针对进展型MS的疗法，并且鉴定用来监测RRMS到SPMS转换的生物标记。

继发性进展型多发性硬化症(SPMS)，即多发性硬化症的四种国际上认可的形式之一(其他形式是复发/缓解型多发性硬化症、原发性进展型多发性硬化症和进展型性复发性多发性硬化症)特征在于伴随或不伴随叠加的复发和轻度缓解和平台期，临床神经学损伤的稳定进展。发展SPMS的人将通常先前已经遭受一个时期的复发/缓解型多发性硬化症(RRMS)，该病可能已经持续从两年到40年或更久。偶尔地，在SPMS的发展后，受试者将具有一些复发和缓解，但是随着时间发展，这些倾向于变得频率较低。

原发性进展型MS(PPMS)相对更罕见(约15％的MS患者群体)，并且特征在于从疾病发作开始，能力的缓慢进展型丧失。多数PPMS患者患有进展型脊髓病或进展型小脑功能障碍。

可以使用本领域已知的方法进行MS的诊断、和亚型的确定，例如基于在空间和时间上播散的CNS病变的存在，和替代性诊断的消除(Problems of experimental trials oftherapy in multiple sclerosis：Report by the panel on the evaluation ofexperimental trials of therapy in multiple sclerosis.Ann N Y Acad Sci.[多发性硬化症治疗中的实验性试验问题：小组评估多发性硬化症治疗中实验性试验的报告.纽约科学院学报]122：1965；552-568)。可替代地，可以基于临床体征和症状(包括热敏性、核间性眼肌麻痹、视神经炎、和Lhermitte[莱尔米特]症状)的存在来做出诊断(参见例如McDonald等人，Recommended Diagnostic Criteria for Multiple Sclerosis：Guidelines From the International Panel on the Diagnosis of MultipleSclerosis.Ann.Neurol.[推荐的多发性硬化症诊断标准：国际多发性硬化症诊断小组指导.神经学年报]2001；50：121；和Polman等人，Diagnostic Criteria for MultipleSclerosis：2005Revisions to the“McDonald Criteria.”Ann Neurol[多发性硬化症的诊断标准：“麦当劳标准”2005年修订版神经学年报]2005；58：840-846)。

量化MS中的失能方法包括库茨科扩展残疾状态量表(EDSS)；MRI扫描；临时神经症状测定量表(SNRS)；克虏伯疲劳严重度量表(FSS)；无行为能力状态量表(ISS)；功能独立性量表(FIM)；步行指数(AI)；剑桥多发性硬化症基础评分(CAMBS)；多发性硬化症的功能评估(FAMS)；心境状态量表(POMS)；以及疾病影响量表(SIP)。

在现有技术中可以找到关于诊断和治疗MS，以及进展型MS，例如PPMS或SMPS的另外的信息，例如在Hurwitz等人，Ann Indian Acad Neurol.2009Oct-Dec[印度神经病学学院年鉴.200910月-12月]；12(4)：226-230；和Spinal Cord Medicine，Principles andPractice[脊髓医学，原理与实践]，Lin等人编，(Demos Medical Publishing，Inc.[戴蒙医学出版公司]，2003)中，例如，部分V，32章，“Multiple Sclerosis[多发性硬化症]”。通常，在此描述的方法可以在任何哺乳动物，优选人类上实践。

褪黑激素激动剂

在此描述的方法中有用的褪黑激素激动剂包括例如褪黑激素(N-乙酰-5-甲氧基色胺，CAS 73-31-4)(西格玛公司(Sigma))；治疗失眠的Circadin/Neurin/PRM(也称为延长释药的褪黑激素)(Neurim Pharmaceuticals Ltd)，用作抗抑郁药并且是MT₁和MT₂受体二者的激动剂的阿戈美拉汀/维度新/S-20098((N-[2-(7-甲氧基-1-萘基)乙基]-乙酰胺；CAS138112-76-2)(施维雅公司(Servier Laboratories)；诺华公司(Novartis))；N-乙酰5-羟色胺(NAS)；二甲氧基丙酰胺98(百时美施贵宝公司(Bristol Myers Squib))；治疗重性抑郁障碍的TAK-375/雷美替胺/Rozerem(N-[2-[(8S)-2，6，7，8-四氢-1H-环戊二烯并[e][1]苯并呋喃-8-基]乙基]丙酰胺；CAS 196597-26-9))(武田药品工业株式会社(TakedaPharmaceutical Company Limited))、他司美琼/Hetlioz(N-[[(1R，2R)-2-(2，3-二氢-1-苯并呋喃-4-基)环丙基]甲基]丙酰胺)(万达制药公司(Vanda Pharmaceuticals))。Luzindole(褪黑素抑制剂，N-[2-(2-苄基-1H-吲哚-3-基)乙基]乙酰胺)是具有针对MT2褪黑激素受体的15至25倍较高的亲合力的非选择性配体，并且4P-PDOT N-(4-苯基-1，2，3，4-四氢化萘-2-基)丙酰胺或N-[(2S，4S)-4-苯基-1，2，3，4-四氢化萘-2-基]丙酰胺或N-[(2R，4R)-4-苯基-1，2，3，4-四氢化萘-2-基]丙酰胺)是选择性MT2配体；IIK7(N-丁酰基-2-(2-甲氧基-6H-异吲哚[2，1-a]吲哚-11-基)-乙胺(西格玛公司(Sigma))、文拉法辛或郁复伸(1-[2-(二甲氨基)-1-(4-甲氧苯基)乙基]环已-1-醇；盐酸化物)；CAS 99300-78-4)(西格玛公司)；以及相关的SSRI。褪黑激素受体拮抗剂还包括以下项：BMS-214778(N-[[(1R，2R)-2-(2，3-二氢-1-苯并呋喃-4-基)环丙基]甲基]丙酰胺)；舍曲林4(1S，4S)-4-(3，4-二氯苯基)-N-甲基-1，2，3，4-四氢化萘-1-胺；帕罗西汀(3S，4R)-3-(1，3-苯并二唑-5-基氧甲基)-4-(4-氟苯基)哌啶；氟西汀(N-甲基-3-苯基-3-[4-(三氟甲基)苯氧基]丙-1-胺)；AMMTC(N-[(6-甲氧基-9-甲基-1，2，3，4-四氢咔唑-4-基)甲基]乙酰胺)。小分子MT1和2特异性受体激动剂的另外的实例可以发现于以下文献：US 20140011849；WO 2007148808(褪黑激素(N-乙酰基-5-甲氧色胺))；US 20090042861；WO 2006107019 A1((S)-N-[2-(1，6，7，8-四氢-2H-茚并[5，4-b]呋喃-8-基)乙基]丙酰胺)；US 13/751,011；US 14/688,301和US 20140357710(N-[[(1R，2R)-2-(2，3-二氢-1-苯并呋喃-4-基)环丙基]甲基]丙酰胺)；US 20050164987/WO 2005063297(ML-23或N-[2-(5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)乙基]-2，4-二硝基苯胺)；US20050137247(LY-156735；BMS-214778)；US 8859593；US 8389544；US 20090209638，WO2007137247和WO 2011126948。

在一些实施例中，这些方法包括给予AA-NAT(芳烷基胺N-乙酰转移酶)和/或HIOMT(羟基吲哚-O-甲基转移酶)的激动剂，除了其他活性，它们在褪黑激素合成中发挥作用。这些可以包括血管紧张素受体激动剂，例如L-162，313(5，7-二甲基-2-乙基-3-[[4-[2(正-丁氧基羰基亚磺酰氨基)-5-异丁基-3-噻吩基]苯基]甲基]-咪唑[4，5-b]吡啶)和[Val5]-血管紧张素II乙酸盐水合物。

REV-ERB/ROR激动剂

在一些实施例中，除了褪黑激素激动剂之外或作为褪黑激素激动剂的替代，这些方法包括给予REV-ERB(例如REV-ERBα和/或REV-ERBβ)的和/或视黄酸受体相关的孤儿受体(ROR，例如RORα，RORβ和/或RORγ的激动剂)的激动剂，其中的一些是本领域已知的。例如，这些方法可以包括(或排除)给予天然REV-ERB/ROR配体，例如血红素；胆固醇/胆固醇硫酸酯；7α-羟基胆固醇；7β-羟基胆固醇；7-酮基胆固醇；20α-羟基胆固醇；22R-羟基胆固醇；25-羟基胆固醇；24S-羟基胆固醇；24R-羟基胆固醇；24，25-环氧胆固醇；硬脂酸；全反式维甲酸；新鲁斯可皂苷元；或(25S)-鲁斯可皂苷元。可替代地或此外，这些方法可以包括给予合成的REV-ERB配体，例如GSK4112、SR9009；SR9011；GSK2945；GSK0999；GSK5072；和/或GS2667；和/或合成的ROR配体，例如T0901317；SR1078；SR3335(也称为SR3335/ML176)；SR1001；SR2211；Sr1555；地高辛；熊果酸；ML209；和/或在Zhang，W.等人，Mol.Pharmacol[分子药理学].82，583-590(2012)(例如化合物1a；化合物1b：N-(4，6-二甲基苯并[d]噻唑-2-基)-3-甲基噻吩-2-甲酰胺；化合物1c：N-(2-(4-乙基苯基)-2H-苯并-[d][1，2，3]三唑-5-基)丙酰胺；和/或抑制剂Y：N-(5-苯甲酰基-4-苯基噻唑-2-基)-2-(4-(乙磺酰基)苯基)乙酰胺。参见例如Kojetin和Burris，Nature Reviews Drug Discovery 13，197-216(2014)。

标准治疗

在一些实施例中，在此描述的治疗包括结合以下用于MS的标准治疗给予褪黑激素激动剂，这些标准治疗例如给予皮质类固醇疗法、干扰素β-1b、醋酸格拉默、米托蒽醌、芬戈莫德、特立氟胺、富马酸二甲酯、那他珠单抗、大麻，或其组合。在一些实施例中，在此描述的治疗是结合用于MS的一个或多个症状的治疗进行给予，这些症状例如是抑郁和疲劳、膀胱功能障碍、痉挛状态、疼痛、共济失调、以及意向震颤；此类治疗包括药理学试剂、锻炼、以及适当的矫正术。关于MS的诊断和治疗的另外的信息可以发现于National MS Societywebsite[国家MS协会网站]上，在万维网上，网址为nationalmssociety.org。

在一些实施例中，在受试者被鉴定为在特定时段内，患有或可能发展MS的季节性恶化，例如，被鉴定为具有低于参比水平的褪黑激素的水平的情况下，给予用于进展型MS的治疗，包括米托蒽醌或那他珠单抗。

药物组合物

在此描述的方法包括制造和使用药物组合物，这些药物组合物包含作为活性成分的褪黑激素激动剂。还包含的是药物组合组分自身。

药物组合物典型地包含药学上可接受的载体。如在此使用，表达“药学上可接受的载体”包括与药物给予可相容的盐、溶剂、分散介质、涂料、抗细菌的和抗真菌的药剂、等渗剂和吸收延迟剂等。还可以将补充性活性化合物掺入组合物中。

典型地，药物组合物被配制成与预期的给予途径相容。在本发明的方法中尤其有用的给予途径的实例包括肠胃外(例如静脉内的)、鞘内、口服、以及鼻腔或鼻内(例如通过作为滴剂或吸入剂给予)给予。对于并不跨越血脑屏障的化合物，可以使用直接进入CNS或CSF的递送，例如使用植入的鞘内泵(参见例如Borrini等人，Archives of PhysicalMedicine and Rehabilitation[物理医学与康复档案]2014；95：1032-8；Penn等人，N.Eng.J.Med.320：1517-21(1989)；和Rezai等人，Pain Physician[疼痛医师]2013；16：415-417)，或纳米颗粒，例如金纳米颗粒(例如葡萄糖包衣的金纳米颗粒，参见例如Gromnicova等人(2013)PLoS ONE 8(12)：e81043)。配制并且递送适合的药物组合物的方法是本领域已知的，参见例如以下系列中的图书：Drugs and the PharmaceuticalSciences：a Series of Textbooks and Monographs[药物与药物科学：教科书和专著系列](Dekker，NY)；和Allen等人，Ansel′s Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems[安塞尔氏药物剂型和药物递送系统]，Lippincott Williams&Wilkins出版社；第8版(2004)。

适合于可注射使用的药物组合物可以包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散体、以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内的给予，适当的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(BASF[巴斯夫公司]，帕西波尼(Parsippany)，新泽西州(N.J.))或磷酸酯缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，该组合物必须是无菌的并且必须具有达到容易注射的程度的流动性。它在制造和储存条件下应该稳定并且必须抗诸如细菌和真菌的微生物污染作用而保存。该载体可以是包含以下物质的溶剂或分散介质：例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，及其适合的混合物。可以例如通过使用一种包衣(如卵磷脂)、通过在分散情况下维持所需颗粒大小以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，优选在组合物中纳入等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的一种药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)而使可注射组合物的吸收延长。

按照需要，可以通过将活性化合物以需要的量加入具有以上列举的组分中的一种或多种组合的适当溶剂中，随后进行无菌过滤来制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物加入无菌载体中来制备分散体，该无菌载体包含基础分散介质以及来自以上列举的那些所需的其他成分。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥，这些方法产生活性成分的粉末以及来自其以前的无菌过滤溶液的任何另外的所需成分。

对于口服给予，可以用惰性稀释剂或可食用载体来配制组合物。出于口服治疗性给药的目的，可以将活性化合物随赋形剂一起加入并且以片剂、锭剂或胶囊剂(例如明胶胶囊剂)的形式使用。口服组合物还可以使用一种用作嗽口水的液体载体而被制备。可以包含药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可以包含以下成分或具有类似性质的化合物中的任一种：粘合剂，如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖，崩解剂，如海藻酸、Primogel、或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或氢化植物油；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味品。

对于通过吸入给药，化合物可以从加压容器或分配器(其中包含合适的推进剂，例如气体(如二氧化碳))、或喷雾器以气溶胶喷雾形式递送。此类方法包括美国专利号6,468,798中描述的那些。

可以通过适合给予核酸剂，例如DNA疫苗的任何方法，来给予是或包含核酸的治疗性化合物。这些方法包括基因枪、生物注射器、和皮肤贴剂，连同无针方法，例如美国专利号6,194,389中披露的微颗粒DNA疫苗技术，以及如在美国专利号6,168,587中披露的使用粉状疫苗的哺乳动物透皮无针疫苗接种。另外，鼻内递送是可能的，如尤其描述于Hamajima等人，Clin.Immunol.Immunopathol.[临床免疫学和免疫病理学]，88(2)，205-10(1998)中。

脂质体(例如，如描述于美国专利号6,472,375中)和微囊包封可以用于递送在此描述的化合物。还可以使用生物可降解微颗粒递送系统(例如，如描述于美国专利号6,471,996中)。

在一个实施例中，将这些治疗性化合物与保护这些治疗性化合物免于从体内快速消除的载体一起制备，如控释配制品，包括植入物和微囊化的递送系统。可使用生物可降解、生物相容的聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯及聚乳酸。此类配制品可以使用标准技术制备，或例如从Alza公司(Alza Corporation)和Nova制药公司(Nova Pharmaceuticals，Inc.)购买获得。脂质体悬浮液(包括用细胞抗原的单克隆抗体靶向到选择的细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据在本领域中的普通技术人员已知的方法而制备，例如，如在美国专利号4,522,811中所说明的。

药物组合物可以与给药的说明书一起包括在容器、包装、或分配器，例如单次剂量分配器中。容器、包装、或分配器还可以被包括为试剂盒的一部分，该试剂盒可以包含例如用于一天的、一周的、或一个月的治疗的足够的单次剂量分配器。

剂量

可以例如通过细胞培养或实验动物中的标准制药程序来确定化合物的剂量、毒性和治疗效果，例如，用于确定LD50(使50％的群体致死的剂量)和ED50(在50％的患者群体中治疗有效的剂量)。在毒性和治疗效果之间的剂量比为治疗指数，它可以表示为比率LD50/ED50。表现出高治疗指数的化合物是优选的。尽管可以使用表现出有毒副作用的化合物，但是应该小心设计将此类化合物靶向至受影响的组织的部位的递送系统，从而将对未感染的细胞的潜在损伤最小化，并且由此减少副作用。

从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于配制一系列的用于在人类中使用的剂量。优选这些化合物的剂量处于包括ED50在内的有很小毒性或没有毒性的循环浓度范围内。该剂量可根据所应用的剂型和所使用的给药途径在该范围内变化。对于用于本发明方法的任何化合物，均可根据细胞培养试验初步估计治疗有效剂量。一种剂量可以在动物模型中被配制以达到在细胞培养中确定的一种循环血浆浓度范围，该范围包括IC50(即该测试化合物的完成半最大症状的抑制的浓度)。该信息可用于更精确地确定在人中有用的剂量。可以例如通过高效液相色谱法来测量血浆中的水平。

“有效量”是足以实现有益的或希望的结果的量。例如，治疗量为达到所需疗效的量。所述量可与预防上有效量相同或不同，所述预防上有效量为预防疾病或疾病症状的发作所需的量。可以在一次或多次施用或应用或给药时施用有效量。组合物的治疗上有效量取决于所选的组合物。可以从每天一次或多次至每周一次或多次来给予组合物；包括每隔一天一次。技术人员将理解，某些因素可以影响有效治疗受试者所需的剂量和时程，包括但不限于疾病或障碍的严重性、先前的治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄，以及存在的其他疾病。此外，用治疗有效量的在此描述的组合物对受试者进行的治疗可以包括单一治疗或一系列治疗。

实例

本发明在以下实例中进一步说明，这些实例不得限制权利要求书中所描述的本发明的范围。

实验程序

在以下所示的实例中使用以下材料和方法。

患者。在同一年的9月和11月之间，从位于劳尔卡雷亚神经研究所(Raúl CarreaInstitute for Neurological Research)(FLENI)的MS诊所募集根据McDonald[麦克唐纳]标准(Polman等人，2011)，患有复发-缓解型MS的连续患者。所有患者都住在布宜诺斯艾利斯市(Buenos Aires City)(纬度34.6°S，经度58.4°W)。在2011-2012年期间，在上午8和9点之间，每个季节收集血清和首次晨尿，并且储存在-80℃。在2015年的1月和2月之间，募集第二群组的26名复发-缓解型MS患者，并且在上午8和9点之间收集血清和全血，用于CD4+ T细胞分离和褪黑激素测量。对于每个样品，记录严格的收集日期和时间，以及处理。如下根据南半球定义季节：夏季(1月-3月)，秋季(4月-6月)，冬季(7月-9月)，春季(10月-12月)。由研究所伦理委员会批准研究实验方案，并且所有受试者都签署了知情同意书。

动物和EAE。如下诱导EAE：用100μgMOG_35-55和500μg结核分枝杆菌提取物H37Ra(Difco公司)免疫小鼠。在第0天和第2天，用200ng百日咳毒素对小鼠进行腹膜内注射。在下午7:00，每天给予褪黑激素(5mg/kg)或载体(0.01％DMSO)。

流式细胞术染色和获取对于细胞内细胞因子染色，在37℃，用佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯(50ng/ml；西格玛公司)、离子霉素(1μg/ml；西格玛公司)和莫能菌素(GolgiStop；1μg/ml；BD生物科学公司(BD Biosciences))刺激细胞4h。在表面标记被染色后，根据制造商的说明书(BD生物科学公司)，将细胞固定并且使其可渗透。针对细胞因子的所有抗体都来自Biolegend公司。所有实验都在同一时间开始(上午8-9点)。用LSR II或FACSAria(BD生物科学公司)收集数据，然后用FlowJo软件(Treestar)进行分析。

细胞因子的测量。在72-96h后，通过如先前描述的酶联免疫吸附测定，在组织培养上清液中测量分泌的细胞因子(Farez等人，2009)。

定量RT-PCR。用RNAeasy柱(凯杰公司(Qiagen)，美国)提取RNA，然后根据制造商的说明书(美国应用生物系统公司(Applied Biosystems))制备cDNA，并且将其用作用于实时PCR的模板。所有引物和探针都是由美国应用生物系统公司(Applied Biosystems)提供的，并且将它们在ViiA 7实时PCR系统(美国应用生物系统公司)上使用。表达被标准化为管家基因Gapdh的表达。

免疫印迹分析。对于免疫印迹分析而言，用补充有蛋白酶抑制剂“鸡尾酒(cocktail)”(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))的放射免疫沉淀反应缓冲液裂解细胞。用电泳，通过4％-12％Bis-Tris Nupage凝胶(英杰公司(Invitrogen)，美国)分解不同T细胞亚群的总裂解液，并且将其转移到PVDF膜(密理博公司(Millipore))上。使用以下第一抗体：抗ROR-α(艾博抗公司(Abcam))；抗MTNR1A(圣克鲁兹生物技术公司(Santa Cruz))、抗总的和磷酸化的Erk1/2(Cell Signalling)、抗总C/EBP α(Cell Signaling公司)、抗磷酸化C/EBPα(Cell Signaling公司)、抗Nfil3(圣克鲁兹生物技术公司)、以及抗GADPH(艾博抗公司)。如制造商(Pierce公司)提示的，用SuperSignal West Femto最高灵敏度底物使印迹显色。

临床数据。从我们的MS患者数据库检索临床数据。将从2007年直至2012年发生的复发次数用于计算每月的和季度的恶化率。恶化被定义为由神经学检查确认的新症状的发展或现存症状的加剧，持续至少48小时，并且之前是持续至少30天的稳定性或改善。

褪黑激素、维生素D、UVB和感染评估。在劳尔卡雷亚神经研究所的(RaúlCarreaInstitute for Neurological Research)(FLENI)的临床实验室，将维生素D水平量化。通过如先前描述的ELISA(Graham等人，1998)(Genway Biotech公司)，测量为主要褪黑激素代谢物并且已经与夜间褪黑激素水平良好相关的6-羟基硫酸褪黑激素(6-SM)(Graham等人，1998)。对于一些实验而言，使用竞争ELISA试剂盒(Genway Biotech公司)测量血清褪黑激素。由政府官员提供研究的时段期间，在布宜诺斯艾利斯市中，上呼吸道感染的官方报告。通过Giovanni系统(ht中：//disc.sci.gsfc.nasa.gov/giovanni)，从NASA卫星获得布宜诺斯艾利斯位置的UV入射。

动物和EAE。MTNR1A和ROR-α基因敲除小鼠购买自杰克逊实验室(JacksonLaboratories)。C57BL/6野生型购买自拉普拉塔大学的兽医学院(Faculty of Veterinaryin La Plata University)和杰克逊实验室。NFIL3缺陷小鼠由Chen Zhu提供；REV-ERBα缺陷小鼠由Mitch Lazar(宾夕法尼亚大学(University of Pennsylvania)，费城(Philadelphia)，美国)提供，并且C/EBPα基因敲除小鼠由Daniel Tehen(贝斯以色列女执事医疗中心(Beth Israel Deaconess Medical Center)，波士顿(Boston)，美国)提供。如下诱导EAE：用100μgMOG35-55(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)和500μg结核分枝杆菌提取物H37Ra(Difco公司)免疫小鼠。在第0天和第2天，用200ng百日咳毒素对小鼠进行腹膜内注射。在下午7:00，每天给予褪黑激素(5mg/kg)或载体(0.01％DMSO)。所有实验都是根据哈佛大学医学院(Harvard Medical School)的研究机构动物护理和使用委员会(IACUC)和IBYME规定的指南进行的。

CNS浸润液的分离。如所述分离CNS浸润液(Mascanfroni等人，2013)。用冰冷的PBS灌注小鼠。取出脑和脊髓，并且在包含III型胶原酶(2mg/ml；Worthington公司)和DNA酶(20单位/ml；西格玛-奥德里奇公司)的PBS中孵育。然后将组织匀浆，并且上样到30％-37％-70％Percoll梯度上，用于CNS浸润液的富集。

体外小鼠T细胞分化。使用磁珠(CD4+ T细胞分离试剂盒，美天旎公司(MiltenyiBiotec))，初始CD4+ T细胞(CD4+CD44loCD62LhiCD25-)来自C57BL/6野生型、MTNR1A-、NFIL3-、REV-ERBα、C/EBPα-缺陷的或RORα缺陷的小鼠的脾和淋巴结。所有实验都在上午7和9点之间开始。用板结合的抗CD3(2μg/ml；14-0031-86；亿生物科技(eBioscience))和抗CD28(2μg/ml；16-0281-86；亿生物科技)活化细胞。添加小鼠IL-27(30ng/ml；34-8271；Biolegend公司)，用于产生Tr1细胞。添加IL-6(30ng/ml；406-ML-025；R&D系统公司(R&DSystems))、TGF-β1(15ng/ml；130-095-067；美天旎公司)、抗IL-4(2.5μg/ml；C17.8；Biolegend公司)以及抗IFN-γ(5μg/ml；XMG1.2；Biolegend公司)，用于产生Th17细胞。在第2天添加重组小鼠IL-23(30ng/ml；1887-ML-010；R&D系统公司)。对于一些实验，作为替代，使用IL-6和IL-1β(10ng/ml；401-ML-025；R&D系统公司)或TGF-β1和IL-21(100ng/ml；594-ML-010；R&D系统公司)，用于Th17细胞分化。使用IL-12(30ng/ml；419-ML-010；R&D系统公司)和抗IL-4(2.5μg/ml；C17.8；Biolegend公司)，用于产生Th1细胞。添加IL-4(30ng/ml；404-ML-010；R&D Systems)和抗IFN-γ(5μg/ml；XMG1.2；Biolegend公司)，用于产生Th2细胞。使用TGF-β1(15ng/ml；130-095-067；美天旎公司)，用于产生Foxp3+ Tregs。在培养开始时和在第2天，以2-20ng/ml的终浓度，添加褪黑激素(Gador，阿根廷)、阿戈美拉汀、和CGP-52608(西格玛-奥德里奇公司)。

体外人类T细胞分化。对于Th17分化，用磁珠(初始人类CD4+ T细胞分离试剂盒II，美天旎公司)从PBMC分离初始CD45RA+ CD4+ T细胞，并将其以5×105个细胞/ml的密度接种在涂覆有抗CD3(2μg/ml)以及可溶性抗CD28的24孔板中，并且在以下细胞因子(IL-1β(25ng/ml)、IL-6(50ng/ml)、和TGF-β1(2ng/ml))与中和抗体存在下培养至IFN-g(10mg/ml)和IL-4(10微克/ml)。可替代地，通过使用IL-1β(25ng/ml)、IL-6(50ng/ml)、和IL-23(50ng/ml)与中和抗体将Th17细胞分化至IFN-g(10mg/ml)和IL-4(10微克/ml)。对于Th1分化，在IL-12(20ng/ml)和抗IL-4(10μg/ml)存在下，培养CD4+ T细胞。

定量RT-PCR。用于小鼠实验的引物-探针混合物如下(来自美国应用生物系统公司；括号中为标识符)：rorc(Mm01261022_ml)、il23r(Mm00519942_ml)、il10(Mm0043614_ml)、i117(Mm00439619_ml)、il21(Mm00517640_m1)、rora(Mm01173766_m1)、rorc(Mm00441144_g1)、foxp3(Mm00475156_m1)、tbx21(Mm00450960_ml)、gata3(Mm00484683_m1)、nrld1(Mm00520708_m1)、nfil3(Mm00600292_s1)和gapdh(Mm99999915_g1)。用于人类实验的引物-探针混合物如下(来自美国应用生物系统公司；括号中为标识符)：RORC(Hs01076122_m1)、IL17A(Hs00174383_m1)、IL17F(Hs00369400_m1)、IL10(Hs00961622_m1)、IFNG(Hs00989291_m1)和18s(Hs03003631_g1)。

染色质免疫沉淀反应。用4％多聚甲醛交联细胞中的DNA-蛋白质复合物，并且用包含1×蛋白酶抑制剂“鸡尾酒”(Roche Molecular Biochemicals公司)的0.35ml裂解缓冲液(1％SDS，10mM EDTA和50mM Tris-HCl，pH 8.1)进行裂解。通过超声处理剪切染色质，并且将离心后收集的上清液稀释于缓冲液(1％Triton X-100，2mM EDTA，150mM NaCl和20mMTris-HCl，pH 8.1)中。将5μg抗体预先结合至蛋白A和蛋白G Dynal磁珠(英杰公司)持续最少6h，并且用包含5％BSA的冰冷的PBS洗涤样品三次，然后添加至稀释的染色质，随后进行免疫沉淀反应过夜。然后在放射免疫沉淀反应缓冲液(50mM HEPES，pH 7.6，1mM EDTA，0.7％Na脱氧胆酸盐，1％NP-40和0.5M LiCl)中洗涤磁珠染色质复合物三次，随后用Tris-EDTA缓冲液洗涤两次。然后用1％SDS和0.1MNaHCO3的溶液提取免疫沉淀的染色质，并且在65℃下加热至少6h，用于逆转多聚甲醛交联。用QIAquick DNA纯化试剂盒(凯杰公司)纯化DNA片段，并且用SYBR绿实时PCR(宝生物工程有限公司(Takara Bio))进行分析。

信号转导测定。在72-96h期间，用载体(DMSO0.001％)、褪黑激素(2-10ng/mL)、阿戈美拉汀(2-10ng/mL)和CGP-52608(2-10ng/mL)处理极化条件下活化的细胞，并且进行裂解。将裂解液转移至384孔聚丙烯板，并且用装有固体点样针的机器人微阵列点样器(Genetix公司)点样到Super Epoxi片(Telechem公司)上。然后如所述对这些片进行探测、处理和分析(Farez等人，2009)。

增殖测定。在用MOG35-55进行免疫后10天，自载体或褪黑激素处理的WT小鼠获得脾细胞，并且在MOG35-55存在下，将这些细胞在体外重新刺激3天。将细胞用[3H]胸苷(1μCi/孔)脉冲处理最后24h。通过流式细胞术评估产生IL-17(亿生物科技)、IFN-γ(Biolegend公司)或IL-10(BD Pharmingen公司)的T细胞和Foxp3+ T细胞(亿生物科技)的频率。对于基于CFSE的增殖测定，用1μM CFSE(羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯；Molecular Probes公司)标记CD4+ T细胞。在LSR III(BD生物科学公司)或MacsQuants(美天旎公司)上获取数据，并且用FlowJo软件(Treestar)进行分析。

质粒。IL-10启动子报告基因和C-Maf与AhR载体如先前所描述(Apetoh等人，2010)，表达ROR-α的载体购买自哈佛大学医学院的PlasmID。编码C/EBPα(44627)和Bmal报告基因(46824)的载体购买自Addgene。由Laura Hooper(西南医学中心(UTSouthwestern)，德克萨斯州，美国)友好地提供了用于在T细胞中的nfil3过量表达的逆转录病毒。由Bart Staels(巴斯德研究所(Institut Pasteur)，里尔(Lille)，法国，美国)友好地提供了用于在T细胞中的nr1d1过量表达的逆转录病毒。由Vincent Laudent(巴黎高等师范大学(Ecole Normale Supérieure)，里昂(Lyon)，法国)友好地提供了nr1d1启动子报告基因。

转染和萤光素酶测定。根据制造商的说明书(罗氏公司(Roche))，在补充有10％FBS的DMEM中生长HEK293细胞，并且用FuGENE HD转染试剂和2μg的各种质粒进行转染。在转染48h后，并且在用双萤光素酶测定试剂盒(普洛麦格公司(Promega))处理24h后，分析萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶的活性。

逆转录病毒转导。将逆转录病毒表达构建体与eco和gag-pol病毒包膜构建体一起转染进人胚肾HEK293T细胞。在转染72h后收集病毒上清液。通过在32℃，在聚凝胺(8μg/ml；西格玛公司)存在下，在1200g下的离心感染细胞的方法，进行慢病毒转导。

T细胞转移和免疫。将来自C57BL/6、MTNR1A-、REV-ERBα和NFIL3缺陷小鼠的经分类的脾CD4+ T细胞经腹腔内注射(i.p.)转移进RAG-1缺陷小鼠中(每个小鼠10x 106个细胞)。转移十天后，检查小鼠的CD4+ T细胞重建并且用CFA中的MOG35-55免疫。免疫20天后，分离T细胞并且将细胞因子染色。

统计分析。使用泊松回归模型来评估季节、6-SM水平和临床复发次数的影响，产生发病率比率(IRR)和相应的95％置信区间(CI)。使用重复测量混合模型来评估治疗的作用及其与EAE实验中的时间的相互作用。使用线性回归模型来分析血清褪黑激素水平和IL-17或IL-10基因表达之间的关系。适当时，使用学生t检验、曼-惠特尼检验、单向方差分析或威尔科克森秩和检验来分析两种或更多种条件之间的差异。小于0.05的p值视为显著的。除非另外指明，所有数据呈现为平均值±SEM。使用Stata v12(Statacorp LP公司(StatacorpLP)，德克萨斯州，美国)进行所有统计分析。

实例1.褪黑激素水平与MS临床复发负相关

我们首先在我们的139名复发-缓解型MS患者的群组中建立了MS复发的季节性(表1)。使用泊松回归模型，我们在发生在秋季和冬季的复发次数中检测到32％降低(发病率比率，IRR 0.682，95％CI0.49-0.95，P＝0.02)。因此，在此研究中使用的MS患者群组示出先前针对其他群组描述的MS复发的季节性(Jin等人，2000；Spelman等人，2014)。

褪黑激素产生受黑暗刺激并且伴随季节性模式，其中在秋季和冬季期间具有较高水平(Brzezinski，1997)。褪黑激素影响若干生物过程，包括昼夜节律时钟和免疫应答(Brzezinski，1997)。因此，我们通过测量复发-缓解型MS患者中的6-羟基硫酸褪黑激素(6-SM)水平，研究了褪黑激素和MS疾病活性之间的关系。因为6-SM是主要褪黑激素代谢物，其在首次晨尿中的水平与夜间褪黑激素分泌强相关，支持其用于流行病学研究(Graham等人，1998；McMullan等人，2013)。与先前报告(Morera和Abreu，2007；Ueno-Towatari等人，2007)一致，我们检测到在秋季和冬季期间增加的褪黑激素分泌，其在春季和夏季期间具有较低水平(图1a和表1)。此外，我们发现了6-SM水平和MS恶化率之间的显著负相关(P＜0.01史匹曼(Spearman)相关)。在年龄与性别调节的泊松回归模型中进一步确认了这一点，对于每6-SM单位增加，具有复发次数中的3％降低(IRR 0.97，95％CI0.95-0.99，P＝0.007)。最后，为了检验褪黑激素水平和恶化率之间的关系是否是同步的，我们延迟了复发的发生1个月(IRR1.01，95％CI0.97-1.05；P＝0.7)、2个月(IRR 1.03，95％CI 0.99-1.07；P＝0.1)、和3个月(IRR 1.03，95％CI 0.99-1.07；P＝0.7)，其中没有复发发生中的延迟效果的证据。

我们还评估了维生素D水平，并且如先前针对我们的地区中的健康对照和MS患者所报告的(Correale等人，2009；Fassi等人，2003)，贯穿全年，总体水平很低，其中在夏季期间具有较高水平，但是与MS复发无显著相关(图1b)。最后，我们并没有检测到MS复发和另外的环境因素(例如，如分别通过国家注册库和NASA卫星所确定的，报道的上呼吸道感染和UV入射)之间的关联(图1c、d)。因此，在秋季和冬季期间的较高褪黑激素水平与临床复发的减少相关联。

表1.研究群体的基线和临床特征

实例2.褪黑激素改善了实验性自身免疫性脑炎

基于我们的流行病学发现，我们使用MS的实验性自身免疫性脑炎(EAE)模型，研究了褪黑激素对于CNS炎症的影响。用MOG_35-55免疫初始C57BL/6野生型小鼠，并且每天用褪黑激素(5mg/kg，腹膜内地)或载体处理这些小鼠。褪黑激素给予改善了EAE临床症状(图2a，表2和图7a)。EAE的改善与脾、淋巴结和CNS中的Th17细胞的减少的个数和频率相关联；还在已经关联至EAE的发病机理的IL-17⁺ IFNγ⁺和IL-17⁺GM-CSF⁺ CD4⁺ T细胞中检测到这一减少(Codarri等人，2011；El-Behi等人，2011；Lee等人，2012a)(图2c、d)。我们还检测到IL-10分泌CD4⁺ T细胞中的伴随性增加；在其他T细胞亚群、B细胞、γδT细胞或先天淋巴细胞(ILC)的个数或频率方面，没有检测到显著变化(图2b和图7b-d)。

为了进一步表征褪黑激素对致脑炎T细胞应答的作用，我们分析了对MOG_35-55的回忆应答。来自褪黑激素处理的小鼠的脾细胞示出对MOG_35-55的降低的增殖应答(伴随IL-10产生的增加，IL-17减少)，然而，没有检测到对IFN-γ产生的显著影响(图2e、f)。因此，褪黑激素阻止可致脑炎性Th17细胞应答。

为了研究褪黑激素是否直接作用于T细胞或者它通过其对抗原递呈细胞的影响间接控制T细胞应答，我们将来自褪黑激素处理的或对照的小鼠的、分类的CD4⁺ T细胞与处理转换的树突细胞(DC)共孵育。当与分离自载体处理的小鼠的对照相比时，与分离自对照小鼠的脾DC共孵育的来自褪黑激素处理的小鼠的CD4⁺ T细胞示出减少的增殖和IL-17分泌，伴随增加的IL-10产生(图2g、h)。相反地，当我们使用分离自褪黑激素或载体处理的小鼠的DC来活化来自对照处理的小鼠的CD4⁺ T细胞时，我们并没有检测到显著性差异。

支持褪黑激素对T细胞的直接影响，褪黑激素抑制了使用MOG_35-55和DC的对初始2D2⁺转基因T细胞的体外活化(图2i，图7e)，或在DC不存在的情况下，抑制了使用针对CD3和CD28的抗体的对初始2D2⁺转基因T细胞的体外活化(图2j)。在MOG_35-55存在下，用褪黑激素预处理DC并没有影响其活化2D2⁺ T细胞的能力(图2k)。褪黑激素并没有增加用针对CD3和CD28的抗体刺激的CD4⁺ T细胞中的凋亡，如通过以下项所示：膜联蛋白V的分析，和通过流式细胞术的碘化丙啶染色或Bcl-x1的表达水平(图7f、g)。然而，IL-10阻断、消除了褪黑激素对T细胞增殖的抑制作用(图7h)。

表2.EAE的临床特征，涉及图2a

*P＝0.05

**P＜0.05

实例3.褪黑激素影响人类T-细胞分化

然后我们研究了褪黑激素对人类CD4⁺ T细胞的影响。此外，我们还分析了阿戈美拉汀的作用，它能活化褪黑激素依赖性信号转导(Hickie和Rogers，2011)。基于在EAE期间褪黑激素给予对T细胞的影响，我们将我们的研究聚焦在人类Th17和Tr1细胞。褪黑激素和阿戈美拉汀减少了在Th17极化条件下，通过活化的人类CD4⁺ T细胞的IL-17、RORC和IL17A表达的产生(图3a-e和图8)，没有检测到对人类Th1细胞的分化的影响(图3d-f)。伴随地，褪黑激素和阿戈美拉汀增加了IL10表达。实际上，在Tr1极化条件下，通过活化的人类CD4⁺ T细胞，褪黑激素和阿戈美拉汀还增加了IL-10的产生(图3g、h)。

为了进一步研究褪黑激素对MS中的免疫应答的作用，我们分析了血清褪黑激素水平和在26名RRMS患者的外周CD4⁺ T细胞中的IL17与IL10表达之间的关联(表3)。使用经年龄与性别调节的线性回归模型，我们检测到了血清中的褪黑激素和外周CD4⁺ T细胞中的IL17表达之间的负相关(P＝0.012)：较高血清褪黑激素水平与较低IL17表达相关联(表4)。相反地，线性回归分析鉴定了外周CD4⁺ T细胞中的较高IL10表达和血清中的褪黑激素之间的正相关(P＝0.003)。我们并没有检测到褪黑激素水平和CD4⁺ T细胞中的RORC、NR1D1或NFIL3的表达之间的显著相关(表4)。因此，褪黑激素体外调节人类Th17和Tr1细胞的分化，并且内源褪黑激素水平与RRMS患者中的外周CD4⁺ T细胞中的IL17和IL10的表达水平相关联。

表3.将MS群组的基线和临床特征用于表达研究

表4.褪黑激素和分离自MS患者的CD4+细胞中的IL10与IL17F之间的关联。

变量	系数	标准误差	95％CI	P值
					IL10	0.009	0.00053	0.007-0.011	0.003
IL17	-3.92	0.89	-6.4--1.4	0.012
					RORC	0.001	0.0011	-0.004-0.003	0.387
NR1D1	0.00000951	0.0000625	-0.0002-0.0001	0.882
					NFIL3	0.00013	0.00008	0.00006-0.0003	0.163

实例4.褪黑激素干扰Th17产生

与Th1细胞一起，Th17细胞被认为促成MS和EAE的发病机理(Kom等人，2009)。基于褪黑激素对EAE和通过CD4⁺ T细胞的IL-17产生的抑制作用，我们研究了褪黑激素对鼠Th17细胞分化的影响。如通过对于Th17细胞分化为完全致病细胞而言所必需的rorc、IL-17、和IL-23的表达所示，褪黑激素干扰Th17细胞的体外分化；没有检测到对FoxP3⁺ iTregs、Th1或Th2细胞的分化的影响。(图4a、b和图9)(Lee等人，2012b)。褪黑激素还增加了与非致病Th17细胞关联的IL-10的表达(Lee等人，2012b；McGeachy等人，2007)(图4a、b)。

已经示出IFNγ和IL-2限制Th17细胞分化(Korn等人，2009)。然而，在我们的研究中，在IFNγ阻断抗体存在下，Th17细胞发生分化，并且IL-2阻断抗体不能消除褪黑激素对Th17分化的抑制(图10a、b)。因此，褪黑激素通过独立于IFNγ或IL-2的机制，抑制了Th17细胞分化。

褪黑激素的生理浓度导致了受细胞膜和细胞核受体控制的信号传导途径的活化(Brzezinski，1997)。由多种组织，包括免疫系统的细胞表达褪黑激素膜受体MTNR1A(Jockers等人，2008；Pozo等人，1997)。此外，褪黑激素结合细胞核类视黄醇相关的孤儿受体α(ROR-α)，该受体还由免疫细胞表达(Pozo等人，2004)，并且在Th17发育中发挥作用(Yang等人，2008)。我们检测到Th17细胞上的MTNR1A和ROR-α两者的表达(图10c、d)。为了研究关于褪黑激素对Th17细胞的影响，MTNR1A信号转导的作用，我们使用MTNR1A特异性激动剂阿戈美拉汀和雷美替胺(Karim等人，2006)(图10e)。类似于我们关于褪黑激素的观察，通过阿戈美拉汀或雷美替胺的MTNR1A活化抑制了Th17细胞的分化(图4c、d和图10f、g)。相反地，褪黑激素不能抑制使用的MTNR1A缺陷的(MTNR1A KO)Th17细胞的分化(图4e、f)。因此，MTNR1A介导了褪黑激素对Th17细胞分化的抑制作用。

实例5.褪黑激素经由Erk1/2和C/EBPα活化抑制了Th17细胞分化

REV-ERBα(由nr1d1编码)是通过限制NFIL3(rorc转录的直接抑制剂)的表达促进Th17分化的昼夜节律时钟的组分(Yu等人，2013)。褪黑激素调节了昼夜节律的和季节性的时钟二者的活性(Pévet，2003)。实际上，褪黑激素水平示出与nr1d1表达的昼夜节律逆相关，提示褪黑激素影响REV-ERBα表达(Kojetin和Burris，2014)。因此，我们研究了褪黑激素是否作用于REV-ERBα，从而抑制Th17细胞分化。

使用反向蛋白质阵列(Farez等人，2009)，我们分析了在T细胞中由褪黑激素触发的信号传导途径，并且检测了在Erk1/2的活化中，MTNR1A依赖性增加(图4g、h；图10h、i)。应注意，Erk1/2抑制已经先前示出增强了Th17细胞分化(Tan和Lam，2010)，并且Erk1/2磷酸化已经与REV-ERB蛋白的减少的表达相关联(Castellano等人，2014；Kojetin和Burris，2014)，但是尚未表征涉及的机制及其针对T细胞的相关性。通过nr1d1启动子的生物信息学分析，我们鉴定了用于CAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα，在细胞分化的调节中涉及的一种亮氨酸拉链转录因子)的结合位点(Lekstrom-Himes和Xanthopoulos，1998)。C/EBPα是由磷酸化活化的Erk1/2的下游靶标(Johnson，2005)。因此，我们分析了Erk1/2是否以C/EBPα依赖性方式调节nr1d1启动子的转录活性。

在褪黑激素存在下，Th17细胞分化导致C/EBPα磷酸化和C/EBPα向nr1d1启动子的募集(图4i、j)。在MTNR1A KO T细胞中并且在Erk1/2抑制剂UO216存在下，抑制了C/EBPα磷酸化和向nr1d1启动子的募集(图4i、j)。因此，褪黑激素以MTNR1A-和Erk1/2依赖性方式，触发了C/EBPα向nr1d1启动子的募集。

为了分析C/EBPα对nr1d1启动子的转录活性的影响，我们使用了其中nr1d1启动子控制萤光素酶表达的受体构建体。用褪黑激素或阿戈美拉汀处理nr1d1受体转染的HEK293细胞，导致降低的萤光素酶活性，并且通过C/EBPα过量表达实现了类似的效果(图4k)。最后，为了研究C/EBPα对褪黑激素抑制Th17细胞分化的作用，我们使用了C/EBPα缺陷T细胞(Yang等人，2005)。C/EBPα缺陷消除了由褪黑激素诱导的nr1d1表达的降低和Th17分化的抑制(图4l、m)。因此，褪黑激素通过MTNR1A、Erk1/2和C/EBPα介导的机制，抑制了Th17的分化。

此外，在REV-ERB α激动剂SR9009(5微摩尔)存在或不存在下，通过添加TFG-b、IL-6(0hr)和IL-23(48hr)将CD4+初始T细胞分化为Th17细胞，并且在72h后通过RT-PCR进行分析。*未配对T检验的p＜0.05。示于图12中的结果示出，REV-ERB激动剂抑制了向Th17细胞的分化。

实例6.褪黑激素通过诱导Nfil3，抑制了Th17细胞中的ROR-γt和ROR-α表达。

NFIL3通过抑制ROR-γt的表达，限制了Th17细胞分化(Yu等人，2013)。REV-ERBα抑制了nfil3表达(Yu等人，2013)。因此，我们假设由褪黑激素诱导的nr1d1表达的降低导致rorc表达的NFIL3依赖性抑制(图5a)。我们检测了在Th17细胞中，而不是在Th0或Tr1细胞中的nr1d1表达(图5b)。在Th17细胞分化期间，褪黑激素抑制了nr1d1表达，导致ROR-γt受体NFIL3的表达的伴随增加(图5c、d)。与我们关于Th17细胞分化的结果一致，由褪黑激素调节REV-ERBα和NFIL3表达是通过其膜受体MTNR1A和Erk1/2介导的(图5c-g)。在nr1d1过量表达实验中并且通过使用REV-ERBα缺陷T细胞，确认了REV-ERBα表达的调节与通过褪黑激素调节Th17细胞分化的相关性。Nr1d1过量表达和REV-ERBα缺陷消除了褪黑激素对Th17细胞分化的影响(图5h-k)。因此，由褪黑激素触发的MTNR1A依赖性信号转导通过调节REV-ERBα表达抑制了Th17细胞分化。

ROR-α促进了Th17细胞分化(Yang等人，2008)。因此，通过特异性激动剂CGP 52608的ROR-α活化，促进了Th17细胞分化(图4c、d)。由褪黑激素直接活化了ROR-α(Brzezinski，1997)。实际上，褪黑激素促进了MTNR1A缺陷Th17细胞的分化(图4e)，提示褪黑激素触发的MTNR1A信号转导干扰了由ROR-α促进的Th17细胞分化。基于NFIL3对ROR-γt表达和Th17细胞分化的抑制作用(Yu等人，2013)，我们还研究了NFIL3是否还抑制ROR-α表达。

生物信息学分析鉴定了rora和rorc启动子中的NFIL3结合位点。因此，在褪黑激素存在下，在Th17极化条件下，伴随ROR-α和ROR-γt二者的减少的表达，我们检测了在活化的CD4⁺ T细胞中，NFIL3向rora和rorc启动子的募集(图5l、m)。然后我们研究了NFIL3表达的调节与Th17细胞分化的调节的相关性。NFIL3的过量表达(图5n、o)和NFIL3缺陷(图5p、q)消除了褪黑激素对Th17细胞分化的抑制作用。因此，由褪黑激素调节NFIL3表达介导了其对体外Th17细胞的分化的抑制作用。为了评估MTNR1A和NFIL3对体内褪黑激素对Th17细胞分化的抑制的作用，我们使用了用野生型、MTNR1A、REV-ERBα或NFIL3缺陷CD4⁺ T细胞重建的并且用CFA中的MOG_35-55免疫的RAG-1缺陷小鼠。与我们的体外观察一致，MTNR1A、REV-ERBα和NFIL3缺陷消除了体内褪黑激素对Th17细胞分化的抑制(图5r、图11)。实际上，我们检测到响应于用MTNR1A-、REV-ERBα或NFIL3-缺陷T细胞重建的小鼠的治疗，Th17细胞分化的增加最可能反映了褪黑激素对ROR-α的非对抗激动活性，及其对Th17细胞的分化的促进作用。总之，这些数据提示褪黑激素经由通过NFIL3依赖性机制抑制ROR-γt和ROR-α表达，干扰了Th17细胞分化。

实例7.褪黑激素经由Erk1/2和ROR-α促进Tr1细胞分化

产生CD4⁺ IL-10的Tr1细胞在调节免疫应答中发挥重要作用(Pot等人，2011；Roncarolo等人，2006)。通过褪黑激素给予改善EAE与产生IL-10的T细胞的增加相关(图2)。因此，我们研究了在Tr1极化条件下，褪黑激素对初始CD4⁺ T细胞的活化的影响。我们发现，褪黑激素促进IL-10和Tr1相关分子il21、ahr和cmaf的表达(Apetoh等人，2010)(图6a)。此外，褪黑激素促进体外Tr1细胞的抑制活性(图6b)。

然后我们研究了褪黑激素影响Tr1调节细胞的潜在机制。通过Tr1细胞，我们检测到MTNR1A和ROR-α两者的表达(图10c、d)。实际上，阿戈美拉汀和CGP 52608两者分别是MTNR1A和ROR-α的特异性激动剂，促进了Tr1细胞分化(图6c、d)。与这些结果一致，MTNR1A缺陷或由UO126抑制MTNR1A活化的Erk1/2通过褪黑激素干扰了Tr1分化的促进(图6e、f)。应注意，报道Erk1/2活化通过CD4+ T细胞促进了cmaf依赖性IL-10生产(Saraiva等人，2009)。此外，ROR-α缺陷通过褪黑激素抑制了由IL-27诱导的Tr1细胞的分化及其促进(图6g)。

ROR-α通过结合靶基因中的ROR反应元件(RORE)发挥其生物效应(Jetten，2009)。生物信息学分析鉴定了il10启动子中的ROR-α结合位点(图6h)，提示褪黑激素可以增加ROR-α向il10启动子的募集，并且因此增加il10转录。与这一假设一致，在褪黑激素存在下，在Tr1极化条件下，在T-细胞活化后，我们检测到ROR-α与il10启动子的增加的结合(图6h)。此外，在报告基因测定中，ROR-α反式活化了il10启动子，并且与芳烃受体(AhR)和c-Maf协同促进了其促进il10表达的能力(Apetoh等人，2010；Gandhi等人，2010)(图6i)。总之，这些数据提示褪黑激素通过其对MTNR1A和ROR-α的影响促进了Tr1细胞分化(图6j)。

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其他实施方案

应理解，虽然已经结合其详细描述，对本发明进行了描述，但前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求书的范围限定。其他方面、优点以及修改都在以下权利要求书的范围之内。

Claims

1.一种在患有多发性硬化症(MS)的受试者中，治疗MS或减少其发展的风险、或治疗MS的季节性恶化或减少其发展的风险的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的褪黑激素激动剂。

2.如权利要求1所述的方法，进一步包括在来自受试者的样品中，检测褪黑激素(例如6-羟基硫酸褪黑激素(6-SM))的水平；

将该样品中的褪黑激素的水平与褪黑激素的参比水平进行比较，该参比水平代表对照受试者(例如患有MS的受试者)中的褪黑激素的水平，该对照受试者具有患有MS的季节性恶化或发展MS的季节性恶化的增加的风险；并且

当该样品中的褪黑激素的水平低于该参比水平时，将该受试者鉴定为具有患有MS的季节性恶化或发展MS的季节性恶化的增加的风险。

3.如权利要求2所述的方法，其中褪黑激素的该参比水平是或对应于20ng/mg、20.5ng/mg、21ng/mg、21.5ng/mg、22ng/mg、22.5ng/mg、23ng/mg、23.5ng/mg、或24ng/mg肌酸酐。

4.如权利要求1所述的方法，其中该褪黑激素激动剂是雷美替胺((S)-N-[2-(1，6，7，8-四氢-2H-茚并[5，4-b]呋喃-8-基)乙基]丙酰胺)、阿戈美拉汀(N-[2-(7-甲氧基萘-1-基)乙基]乙酰胺)、他司美琼((1R，2R)-N-[2-(2，3-二氢苯并呋喃-4-基)环丙基甲基]丙酰胺)、或TIK-301(LY-156735)(N-[(2R)-(6-氯-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)丙基]乙酰胺)。

5.如权利要求1所述的方法，其中该受试者具有MS的季节性恶化的病史，具有与其MS的季节性恶化相关联的一个或多个症状，具有低褪黑激素水平，生活在低褪黑激素季节正在发生或即将发生的气候中，或生活在褪黑激素水平通常很低的气候中。

6.如权利要求1所述的方法，进一步包括给予REV-ERB激动剂或ROR激动剂。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该褪黑激素激动剂是口服给予的、经鼻给予的、静脉内给予的、或鞘内给予的。

8.褪黑激素激动剂用于在患有多发性硬化症(MS)的受试者中治疗MS的季节性恶化或减少其发展的风险中的用途。

9.用于如权利要求8所述的用途的褪黑激素激动剂，其中该受试者具有低于参比水平的褪黑激素的水平。

10.用于如权利要求9所述的用途的褪黑激素激动剂，其中褪黑激素的参比水平是或对应于20ng/mg、20.5ng/mg、21ng/mg、21.5ng/mg、22ng/mg、22.5ng/mg、23ng/mg、23.5ng/mg、或24ng/mg肌酸酐。

11.用于如权利要求8所述的用途的褪黑激素激动剂，其中该褪黑激素激动剂是雷美替胺((S)-N-[2-(1，6，7，8-四氢-2H-茚并[5，4-b]呋喃-8-基)乙基]丙酰胺)、阿戈美拉汀(N-[2-(7-甲氧基萘-1-基)乙基]乙酰胺)、他司美琼((1R，2R)-N-[2-(2，3-二氢苯并呋喃-4-基)环丙基甲基]丙酰胺)、或TIK-301(LY-156735)(N-[(2R)-(6-氯-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)丙基]乙酰胺)。

12.用于如权利要求8所述的用途的褪黑激素激动剂，其中该受试者具有MS的季节性恶化的病史，具有与其MS的季节性恶化相关联的一个或多个症状，具有低褪黑激素水平，生活在低褪黑激素季节正在发生或即将发生的气候中，或生活在褪黑激素水平通常很低的气候中。

13.用于如权利要求8所述的用途的褪黑激素激动剂，该褪黑激素激动剂处于包含REV-ERB激动剂或ROR激动剂的组合物中。

14.用于如权利要求8所述的用途的褪黑激素激动剂，该褪黑激素激动剂被配制为是口服给予的、经鼻给予的、静脉内给予的、或鞘内给予的。

15.一种鉴定用褪黑激素激动剂进行治疗的受试者的方法，该治疗用于减少多发性硬化症(MS)的季节性恶化的发展的风险，该方法包括：

选择患有MS的受试者；

在来自该受试者的样品中，检测褪黑激素(例如6-羟基硫酸褪黑激素(6-SM))的水平；

将该样品中的褪黑激素的水平与褪黑激素的参比水平进行比较，该参比水平代表对照受试者(例如患有MS的受试者)中的褪黑激素的水平，该对照受试者具有患有MS的季节性恶化或发展MS的季节性恶化的增加的风险；

当该样品中的褪黑激素的水平低于参比水平时，将该受试者鉴定为具有患有MS的季节性恶化或发展MS的季节性恶化的增加的风险；并且

任选地向该受试者给予褪黑激素拮抗剂。

16.如权利要求15所述的方法，其中褪黑激素的该参比水平是或对应于20ng/mg、20.5ng/mg、21ng/mg、21.5ng/mg、22ng/mg、22.5ng/mg、23ng/mg、23.5ng/mg、或24ng/mg肌酸酐。

17.如权利要求15所述的方法，其中该褪黑激素激动剂是雷美替胺((S)-N-[2-(1，6，7，8-四氢-2H-茚并[5，4-b]呋喃-8-基)乙基]丙酰胺)、阿戈美拉汀(N-[2-(7-甲氧基萘-1-基)乙基]乙酰胺)、他司美琼((1R，2R)-N-[2-(2，3-二氢苯并呋喃-4-基)环丙基甲基]丙酰胺)、或TIK-301(LY-156735)(N-[(2R)-(6-氯-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)丙基]乙酰胺)。

18.如权利要求15所述的方法，其中该受试者具有MS的季节性恶化的病史，具有与其MS的季节性恶化相关联的一个或多个症状，具有低褪黑激素水平，生活在低褪黑激素季节正在发生或即将发生的气候中，或生活在褪黑激素水平通常很低的气候中。

19.如权利要求15所述的方法，进一步包括给予REV-ERB激动剂或ROR激动剂。

20.如权利要求15-19中任一项所述的方法，其中该褪黑激素激动剂是口服给予的、经鼻给予的、静脉内给予的、或鞘内给予的。

21.一种在受试者中降低Th17细胞水平和/或增加Tr1细胞水平的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的褪黑激素激动剂。

22.如权利要求21所述的方法，其中该褪黑激素激动剂是雷美替胺((S)-N-[2-(1，6，7，8-四氢-2H-茚并[5，4-b]呋喃-8-基)乙基]丙酰胺)、阿戈美拉汀(N-[2-(7-甲氧基萘-1-基)乙基]乙酰胺)、他司美琼((1R，2R)-N-[2-(2，3-二氢苯并呋喃-4-基)环丙基甲基]丙酰胺)、或TIK-301(LY-156735)(N-[(2R)-(6-氯-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)丙基]乙酰胺)。

23.如权利要求21所述的方法，其中该受试者患有自身免疫性疾病。

24.如权利要求23所述的方法，其中该受试者患有多发性硬化症、肠道易激综合征、克罗恩病、脊柱关节炎、系统性红斑性狼疮、白癜风、类风湿关节炎、银屑病、舍格伦综合征、或糖尿病。

25.如权利要求21所述的方法，进一步包括给予REV-ERB激动剂或ROR激动剂。

26.如权利要求21-25中任一项所述的方法，其中该褪黑激素激动剂是口服给予的、经鼻给予的、静脉内给予的、或鞘内给予的。