CN107106521B - 用于治疗帕金森病的治疗方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗帕金森病及相关障碍的组合物和方法。更具体地，本发明涉及靶向α‑突触核蛋白聚集网络的帕金森病及相关障碍的新型组合疗法。特别地，本发明涉及这样的化合物，其单独或组合地可以有效地保护神经元细胞免于α‑突触核蛋白聚集。本发明还涉及生产用于治疗帕金森病的药物或药物组合的方法以及治疗帕金森病或相关障碍的方法。

Description

用于治疗帕金森病的治疗方法

发明领域

本发明涉及用于治疗帕金森病及相关障碍的组合物和方法。更具体地，本发明涉及帕金森病及相关障碍的新型组合疗法。

发明背景

帕金森综合征或帕金森病症是一类进行性、多中心神经退行性疾病，其主要特征是休息时震颤、强直、运动徐缓和姿势不稳。帕金森病(PD)是帕金森综合征的最常见形式并且是阿尔茨海默病之后的第二最常见神经退行性疾病。在工业国家，PD的患病率被估算在总人口的大约0.3%，老年人是最危险的(据估算80岁以上的人群的4%受影响)。发作的平均年龄为约60岁，但可能发生早期发作(小至20岁) [1]。

PD通常被归类为运动障碍。休息性震颤是最常见且通常是最早发展的症状。运动徐缓也通常出现在具有完成任务如书写或穿衣的困难的早期阶段。多动性运动障碍已被报道为帕金森病的一些治疗的副作用。在这方面，US5,952,389专利公开了阿坎酸用于减轻左旋多巴-诱发的多动性运动障碍的用途。然而，药物的限制性继发作用是不同的并且偏离疾病或相关症状的治疗。强直出现并且进展至僵硬和整个身体运动的抗性，降低运动的能力。在后期阶段，疾病进展为姿势不稳，导致受损平衡和经常跌倒。其他运动症状如步态或吞咽障碍可能出现。如果不治疗，则运动症状可能导致患者在平均十年后卧床不起[2, 3]。

在疾病的后期阶段，PD导致许多非运动症状，其随个体变化极大。失能然后通过发展自主和神经精神错乱而极大恶化。说话、认知、情绪、行为和/或思想的障碍将发展，最终导致痴呆。其他常见症状包括感觉、睡眠和情绪问题。那些障碍降低受影响个体的预期寿命并且死亡率为约没有PD的人的两倍[2-4]。

PD是特发病并且其病理生理学仍知之甚少[4]。然而，至少5%的PD病例可以归因于遗传变异。基因内的突变如SNCA (α-突触核蛋白)、PRKN (parkin)、LRRK2 (富含亮氨酸重复激酶2)、PINK1 (PTEN-诱导的公认激酶1)、DJ-1、ATP13A2和十一个基因座(PARK1-PARK11)已与家族性PD相关联[5]。DJ-1被怀疑是普遍存在的氧化还原响应的细胞保护蛋白，由此确认PD中的氧化应激的关键作用[6]，这由缺氧诱导因子(HIF)在针对氧化应激、线粒体功能障碍和铁稳态扰动的黑质多巴胺能细胞保护中的保护作用所证实[7]。除了遗传因素，已经提出许多环境危险因素涉及PD的发作，但都没有确凿的证据。最频繁重复的危险因素是暴露于金属、杀虫剂或除草剂如Agent Orange。另一方面，抽烟和咖啡因消费似乎保护个体免于PD [1]。

PD的病理生理学由四个特征表征[4]：

(i)突触核蛋白病，特征在于α-突触核蛋白异常积累到脑中的称为路易斯小体的内含物中。路易斯小体在整个脑中的分布随个体不同而变化，但经常直接与临床症状的表现和程度相关。

(ii)谷氨酸是哺乳动物神经系统中最丰富的兴奋性神经递质。在病理学条件下，其在突触间隙中的异常积累导致谷氨酸受体过度活化，这导致病理学过程并且最后导致神经元细胞死亡。这个过程，称为兴奋性中毒，通常在急性或慢性神经障碍期间在神经元组织中观察到。变得明显的是，兴奋性中毒涉及帕金森病的发病机理。

(iii) 由于黑质(中脑的一个区域)中产生多巴胺的细胞死亡所致的多巴胺能活性缺乏。这导致失去肌肉运动和音调控制，从而导致PD的运动症状。

(iv) NANC (非肾上腺素能，非胆碱能)、血清素能和胆碱能神经元的退化也发生在疾病的后期，导致PD的非运动症状。

由于没有可用的生物学试验，所以PD的诊断主要基于临床症状的观察和具有类似临床特征的其他障碍的排除[3]。对于明确诊断需要死后确认。通过神经成像的神经学检查可用用来检测多巴胺能神经元的变化以及排除其他疾病的可能性。对左旋多巴的阳性治疗响应是另一个诊断标准。一旦形成诊断，则使用阶段量表如统一的帕金森病评级量表对疾病的进展和严重度进行评级。

最广泛使用的治疗，尤其是在早期阶段，是多巴胺前体左旋多巴(L-DOPA) [8]。药物将缺乏的神经递质带入多巴胺能神经元，由此降低运动症状。然而，大多数的药物在到达血脑屏障（BBB）之前被代谢，引起各种副作用，尤其是胃肠道反应(如厌食症、恶心或呕吐)、运动障碍和精神症状[9]。因此，为了防止运动障碍现象，L-DOPA通常联合卡比多巴(carbidopa)或苄丝肼(benserazide) (外周多巴脱羧酶抑制剂)并且经常还联合儿茶酚-O-甲基转移酶抑制剂如恩他卡朋(entacapone)一起给予。这些药物旨在防止在到达大脑之前的L-DOPA代谢作用，增强药物的活性[8]。尽管在改善运动症状方面较不有效，但是多巴胺激动剂如培高利特、卡麦角林、阿朴吗啡或麦角乙脲以及单胺氧化酶-B抑制剂(涉及多巴胺的代谢分解)如司来吉兰或雷沙吉兰通常在疾病的早期使用。尽管较不有效，但是它们可能在延迟使用左旋多巴并因此延迟运动障碍的发作方面有用[9]。

其他药物如抗胆碱能类和烟碱乙酰基胆碱受体激动剂可以是有用的但它们对于PD的效力有待确认[9]。目前的研究还集中在神经保护性治疗，但是都没有提供退化改善的证据。它们靶向细胞凋亡(omigapil, CEP-1347)、谷氨酸受体、腺苷A2A受体、钙通道(伊拉地平)、生长因子(GDNF)、α-突触核蛋白和炎症[10]。

进行的药物研究已经显示出对基因治疗和神经移植越来越大的兴趣[10]。

WO 2009/133128, WO 2009/133141, WO 2009/133142, WO 2011/054759, WO2009/068668, WO 2009/153291披露了对于多种神经变性疾病(其中有PD)的潜在治疗。

至今PD仍是不可治愈的疾病，并且还没有发现有效的疾病缓和治疗。因此，当前的治疗旨在缓解症状和减轻疾病的缓慢进展。

发明简述

本发明涉及用于治疗帕金森综合征的新的治疗方法和组合物。本发明尤其基于确定了药物组合，该药物组合对具有帕金森综合征病症的受试者，特别是具有帕金森病的受试者提供改善的治疗效果和临床益处。

更特别地，本发明的一个目的涉及用于治疗帕金森综合征，特别是帕金森病的组合物，其包含选自以下的一种，优选至少两种药物：阿坎酸、巴氯芬、西那卡塞特、美西律、磺胺异噁唑、托拉塞米和他达拉非，或其任何化学纯度的盐、前药、衍生物，或缓释制剂。

本发明的另一个目的是一种用于治疗有需要的受试者的帕金森综合征，特别是帕金森病的方法，包括向所述受试者施用选自以下的一种，优选至少两种药物：阿坎酸、巴氯芬、西那卡塞特、美西律、磺胺异噁唑、托拉塞米和他达拉非，或其任何化学纯度的盐、前药、衍生物，或缓释制剂。

用于本发明的药物组合的优选实例包括，例如，巴氯芬和阿坎酸、巴氯芬和西那卡塞特、美西律和西那卡塞特、托拉塞米和巴氯芬、托拉塞米和磺胺异噁唑、西那卡塞特和他达拉非。在一个特别的实施方案中，所述组合物和方法还包括左旋多巴。在另一个特别的实施方案中，所述组合物和方法还包括司来吉兰或雷沙吉兰。在更特别的实施方案中，当本发明的组合物和方法包括多巴胺前体时，至少一种选自卡比多巴、苄丝肼、托卡朋、恩他卡朋、司来吉兰或雷沙吉兰的化合物可进一步用于所述组合物或方法。

本发明还涉及任何药物组合物，其本身包含选自巴氯芬和阿坎酸、巴氯芬和西那卡塞特、美西律和西那卡塞特、托拉塞米和巴氯芬、托拉塞米和磺胺异噁唑、西那卡塞特和他达拉非的任何药物组合。

本发明中的组合物可以进一步包含一种或数种药学上可接受的载体或赋形剂，并且它们可以重复地施用至受试者。优选的组合物经口施用。此外，药物可以一起、单独或依次配制或施用。本发明适用于治疗处于疾病的任何阶段的任何哺乳动物受试者，特别是人受试者中的帕金森综合征。本发明可以例如用于减慢疾病的发展，减少、延迟或防止震颤、运动功能减退(例如，运动徐缓、运动不能、强直)、姿势不稳和/或疼痛，和/或增加存活。

附图简述

图1：西那卡塞特和美西律联合治疗对于神经元皮层细胞谷氨酸毒性的作用。谷氨酸中毒通过西那卡塞特(64 pM)和美西律(25.6 pM)的组合被显著防止，而在那些浓度下，单独的西那卡塞特和美西律对中毒没有显著效果。*: p<0.001，显著不同于谷氨酸中毒；(ANOVA + Dunett事后检验)。

图2：磺胺异噁唑和托拉塞米联合治疗对于神经元皮层细胞谷氨酸毒性的作用。谷氨酸中毒通过磺胺异噁唑(6.8 nM)和托拉塞米(400 nM)的组合被显著防止，而在那些浓度下，单独的磺胺异噁唑和托拉塞米对中毒没有显著效果。*: p<0.001，显著不同于谷氨酸中毒；(ANOVA + Dunett事后检验)。

图3：巴氯芬和阿坎酸联合治疗对于神经元皮层细胞谷氨酸毒性的作用。谷氨酸中毒通过巴氯芬(400 nM)和阿坎酸(1.6 nM)的组合被显著防止，而在那些浓度下，单独的巴氯芬和阿坎酸对中毒没有显著效果。*: p<0.001，显著不同于谷氨酸中毒；(ANOVA+ Dunett事后检验)。

图4：巴氯芬和阿坎酸组合对于缺血性损伤的保护作用。虽然当巴氯芬(80 nM)或阿坎酸(0.32 nM)单独使用时没有获得显著保护作用，但在相同浓度下对于两种药物的组合观察到显著的保护作用(*: p<0.0001)。

图5：托拉塞米和磺胺异噁唑组合对于缺血性损伤的保护作用。磺胺异噁唑(1.36nM)和托拉塞米(80 nM)的组合诱导显著的保护作用(*: p<0.0001)，比单独使用托拉塞米获得的保护作用高110%，而当单独使用磺胺异噁唑时没有获得保护作用。

图6：西那卡塞特和美西律组合对于缺血性损伤的保护作用。当西那卡塞特(64pM)或美西律(25.6 pM)单独使用时没有观察到显著保护作用，但在相同浓度下对于两种药物的组合观察到显著的保护作用(*: p<0.0001)。

图7：巴氯芬和阿坎酸联合治疗对于多巴胺能神经元细胞6-OHDA损伤的作用。保护作用关联地随混合物浓度增加。观察到显著保护作用，其中TH神经元存活在剂量1 (分别为16 nM和64 pM)下增加34%，在剂量2 (80 nM和144 pM)下增加46%，以及在剂量3 (400 nM和1600 pM)下增加51% (***: p<0.0001; *: p<0.001: 显著不同于6-OHDA中毒的细胞(ANOVA + Dunett检验))。

图8：巴氯芬和托拉塞米联合治疗对于多巴胺能神经元细胞6-OHDA损伤的作用。观察到显著的保护作用，其中TH神经元存活在低剂量1 (分别为80 nM和16 nM)下增加50%，在中间剂量2 (240 nM和48 nM)下增加62%以及在高剂量3 (720 nM和144 nM)下增加58%(***: p<0.0001: 显著不同于6-OHDA中毒的细胞(ANOVA + Dunett检验))。

图9：西那卡塞特和美西律联合治疗对于多巴胺能神经元细胞6-OHDA损伤的作用。所有测试的浓度对于6-OHDA提供显著的保护作用。事实上，观察到显著的保护作用，其中TH神经元存活在剂量1 (分别为64 pM和5 pM)下增加36%，在剂量2 (64 pM和26 pM)下增加38%以及在剂量3 (1600 pM和64 pM)下增加46% (***: p<0.0001; *: p<0.001: 显著不同于6-OHDA中毒的细胞(ANOVA + Dunett检验))。

图10：起始时间试验，巴氯芬和阿坎酸联合治疗对于左侧黑质致密部中的6-OHDA立体定向病变的作用。左爪：没有显著变化。右爪：作为左侧黑质中的神经元死亡的结果，6-OHDA注射强烈地延迟起始时间。巴氯芬-阿坎酸治疗有力地保护免于6-OHDA诱导的运动不能并且这来自最弱剂量1 (分别地，巴氯芬-阿坎酸剂量1: 0.6 mg/kg bid和0.04 mg/kgbid；剂量2 : 1.5 mg/kg bid和0.1 mg/kg bid；剂量3: 3.75 mg/kg bid和0.25 mg/kgbid；***: p<0.0001; **: p<0.001：显著不同于6-OHDA中毒的细胞(ANOVA + Dunett检验))；ns：数据间无显著差异。

图11：反应时间试验，巴氯芬和阿坎酸联合治疗对于左侧黑质致密部中的6-OHDA立体定向病变的作用。左爪：没有显著变化。右爪：作为左侧黑质中的神经元死亡的结果，6-OHDA注射强烈地延迟反应时间。巴氯芬-阿坎酸治疗有力地保护免于6-OHDA诱导的运动不能并且这来自最弱剂量1。剂量2和3几乎完全减轻6-OHDA诱导的运动不能(巴氯芬-阿坎酸剂量1: 0.6 mg/kg bid和0.04 mg/kg bid；剂量2: 1.5 mg/kg bid和 0.1 mg/kg bid；剂量3: 3.75 mg/kg bid和0.25 mg/kg bid; ***: p<0.0001; *: p<0.05: 显著不同于6-OHDA中毒的细胞(ANOVA + Dunett检验))；ns：数据间无显著差异。

图12：巴氯芬(BCL)和阿坎酸(ACP)组合在保护多巴胺能神经元细胞免于6-OHDA损伤中协同起作用。A：剂量低至32 nM的巴氯芬，当与剂量低至10 pM的阿坎酸组合时，有力地保护多巴胺能神经元免于6-OHDA损伤(+38%存活率)，而相同剂量的单一药物具有低的作用。B：32 nM的巴氯芬与甚至更低剂量4 pM的阿坎酸组合，也有力地保护皮层神经元免于6-OHDA损伤(+35%)，而相同剂量的单一药物具有低的作用。***: p<0.001; *: p<0.05, 显著不同于6-OHDA中毒的细胞(ANOVA + Dunett检验)。S：协同性。

图13：阿坎酸和西那卡塞特联合治疗对多巴胺能神经元细胞6-OHDA损伤的作用。试验的浓度提供对抗6-OHDA的显著保护作用。事实上，观察到显著的保护作用，其中观察到TH神经元存活率增加17%-73%。在各自这些浓度下，组合发挥协同保护作用。***: p<0.001;显著不同于6-OHDA中毒的细胞(ANOVA + Dunett检验); ◊: <0.05: 显著不同于6-OHDA中毒(Student检验)。

图14：西那卡塞特和他达拉非联合治疗对多巴胺能神经元细胞6-OHDA损伤的作用。在不同的药物浓度下，联合治疗提供显著保护作用。对于提供的不同剂量，药物协同地起作用以赋予保护作用。(***: p<0.001; **: p<0.01, 显著不同于6-OHDA中毒的细胞(ANOVA + Dunett检验))。

图15：圆筒试验，巴氯芬和阿坎酸联合治疗对左侧黑质致密部中的6-OHDA立体定向病变的作用。作为左侧黑质中的神经元死亡的结果，6-OHDA注射强烈地降低双重接触次数(对照，黑色柱)。巴氯芬-阿坎酸治疗(分别为3.75 mg/kg bid和0.25 mg/kg bid)有力地保护大鼠免于6-OHDA诱导的运动不能，当与对照相比时接触次数显著提高。***: p<0.001;**: p<0.01 : 显著不同于6-OHDA中毒的细胞(ANOVA + Dunett检验))。

图16：巴氯芬和阿坎酸联合治疗(BCL – ACP; 分别为3.75 mg/kg bid和0.25 mg/kg bid)保护多巴胺能神经元免于体内死亡。A：BCL – ACP保护黑质致密部(SN)的多巴胺能神经元细胞体免于左侧SN中的6-OHDA立体定向病变。发现当与未治疗动物的SN的左侧(中毒)部分中的神经元的数量相比时，在BCL-ACP治疗的大鼠的SN的左侧(中毒)部分中多巴胺能神经元的数量显著增加。在L-DOPA治疗的大鼠中未观察到这样的神经保护作用。B：在左侧黑质致密部(SN)中的6-OHDA立体定向病变后BCL – ACP保护多巴胺能神经元的纹状体轴突投射。当与未治疗的中毒大鼠的左侧纹状体(对照，黑色柱)相比时，BCL – ACP治疗显著增加左侧纹状体中来自黑质的左侧部分(6-OHDA中毒)的多巴胺能神经元末梢的密度。对于L-DOPA治疗的大鼠未观察到这样的神经保护作用。OD : 关于纹状体中多巴胺能末梢的H³-氯苯咪吲哚标记的水平的光密度；标记表示为对于纹状体的右侧部分获得的OD的%。***: p<0.001; **: p<0.01 : 显著不同于对照；ns: 不显著不同于对照(ANOVA + Dunett检验)。

发明详述

本发明的目的是提供用于治疗帕金森综合征，更具体是帕金森病的新的治疗方法。更特别地，本发明公开了药物和药物组合的新用途及方法，其允许有效修正(correction)这样的疾病并且可以用于任何哺乳动物受试者。

帕金森综合征定义一类进行性神经退行性疾病，其特征在于与强直相关的休息性震颤和/或运动徐缓、姿势不稳、丧失姿势反射(postural reflexes)、弯曲姿势和/或冻结现象(当脚短暂地“粘接”至地面时)。帕金森综合征病症的实例包括帕金森病、进行性核上麻痹、多系统萎缩症、皮质基底神经节变性、弥漫性Lewy体疾病、帕金森-痴呆、X连锁肌张力障碍-帕金森综合征和续发性帕金森综合征(由于环境病因，例如毒素、药物、脑炎后、脑肿瘤、头部创伤、正常压力脑积水所致)。

帕金森病是帕金森综合征的最常见形式。帕金森病(“PD”)是这样的神经退行性疾病，其导致运动和非运动表现并且特征在于黑质纹状体系统中的多巴胺能神经元的广泛变性。PD的运动表现可归因于黑质内的多巴胺能神经元的退化。它们包括震颤、运动功能减退(例如，运动徐缓、运动不能、强直)、姿势不稳、步态异常和吞咽障碍。非运动症状包括自主和神经精神障碍，如嗅觉丧失、或睡眠异常。本发明上下文中，术语PD包括上述疾病表现的任一种。

如本文使用的，“治疗”包括由帕金森综合征，优选帕金森病的病因触发的症状或其症状的治疗、防止、预防、延缓和减少。术语治疗还表示震颤的延缓或延迟发作，疼痛减少，运动徐缓、运动不能、强直、姿势不稳、步态异常、嗅觉丧失和/或睡眠异常的降低或减少，和/或存活率增加。术语治疗尤其包括控制疾病进展及相关的运动和非运动症状。术语治疗特别包括：在治疗受试者中，i) 针对由α-突触核蛋白引起的毒性的保护，或所述毒性的减少或延缓，和/或ii) 针对由异常谷氨酸积累、氧化应激、线粒体功能障碍或神经炎症所致的毒性的多巴胺能神经元的保护，或所述毒性的减少或延缓。

在本发明的上下文中，特异性药物或化合物的名称意指不仅包括具体指明的分子，而且包括任何化学纯度的其任何药学上可接受的盐、水合物、衍生物、异构体、外消旋物、缀合物、前药或衍生物。

术语“组合或联合治疗/疗法”表示这样的治疗，其中至少两种或更多种药物共同施用至受试者以引起生物学作用。在根据本发明的联合治疗中，至少两种药物可以一起或单独地、在同时或依次地施用。而且，至少两种药物可以通过不同途径和方案施用。因此，尽管他们可以一起配制，但是组合的药物也可以单独配制。

若干生物学过程如氧化应激、线粒体功能障碍和神经炎症伴随聚集的α-突触核蛋白的积累，这导致多巴胺能神经元的退化。在另一方面，谷氨酸在突触间隙中的异常积累导致谷氨酸受体的过度活化，这导致病理过程并且最终导致神经元细胞死亡。称为兴奋性中毒的这个过程现在被公认为涉及帕金森病发展的重要病因。

本发明人能够建立成为α-突触核蛋白聚集的基础的网络，其是帕金森病中受影响的主要功能网络。本发明人已鉴别了在α-突触核蛋白聚集网络内的由若干靶蛋白质构成的功能组件。这样的蛋白质与帕金森病和帕金森综合征的起源和控制功能性地相关，并且代表对于治疗并且特别是联合治疗的有价值的靶标。

因此，本发明涉及特定药物的用途，其单独或优先组合地，调节上述途径以治疗帕金森综合征，特别是帕金森病。

在一个特别的实施方案中，本发明更具体地涉及使用药物组合的组合物和方法，该药物组合抑制在α-突触核蛋白聚集网络中涉及的至少两种不同蛋白质的活性。本发明的治疗方式有效保护神经元细胞，特别是有效保护中脑并且更特别地黑质中的多巴胺能神经元。

更特别地，本发明涉及用于治疗帕金森综合征，特别是帕金森病(PD)的组合物，其包含选自以下的至少两种药物：阿坎酸、巴氯芬、西那卡塞特、美西律、磺胺异噁唑、托拉塞米和他达拉非，或其任何纯度的盐或前药或衍生物，或缓释制剂。

事实上，本发明人已令人惊讶地发现，这些化合物表现出对抗谷氨酸毒性的保护活性，谷氨酸毒性是一种已知的帕金森病和帕金森综合征中神经元死亡的原因。本发明的化合物和组合治疗还表现出对抗缺血性应激的保护活性，缺血性应激与帕金森病共享共同的生理特征（尤其是线粒体功能障碍和氧化应激）。更特别地，本发明的化合物对于氧化应激在体内和体外特别有效，氧化应激是对于多巴胺能神经元的α-突触核蛋白毒性的一个组分。

本发明还涉及一种用于治疗帕金森综合征，特别是帕金森病(PD)的方法，包括向需要其的受试者施用选自以下的至少两种化合物：阿坎酸、巴氯芬、西那卡塞特、美西律、磺胺异噁唑、托拉塞米和他达拉非，或其任何纯度的盐或前药或衍生物，或缓释制剂。

如本文使用的，术语"前药"是指本发明化合物的任何功能性衍生物（或前体），其在施用至生物系统（例如人生物体）时，作为例如自发性化学反应、酶催化的化学反应、和/或代谢化学反应的结果而产生所述化合物。前药通常具有结构X-药物，其中X是惰性载体部分，和药物是活性化合物。前药通常是无活性或比所得药物更低活性的，并且可以用来例如改善药物的物理化学性质、将药物靶向特定组织、改善药物的药动学和药效学性质和/或减少不期望的副作用。适用于前药设计的一些常见官能团包括但不限于羧基、羟基、胺基、磷酸酯基/膦酸酯基和羰基。经由这些基团的修饰产生的前药通常包括但不限于酯类、碳酸酯类、氨基甲酸酯类、酰胺类和磷酸酯类。用于选择合适前药的具体技术指南是公知常识[11-15]。此外，前药的制备可以通过本领域技术人员已知的常规方法进行。可以用来合成其他前药的方法描述于大量关于该主题的综述[11，16-22]。例如，arbaclofen placarbil列于ChemID plus Advance数据库(网址：chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/)并且arbaclofen placarbil是一种熟知的巴氯芬的前药[23，24]。巴氯芬的前药的具体实例提供于Hanafi等，2011 [25]，特别是巴氯芬酯和巴氯芬酯氨基甲酸酯，其对于CNS靶向是特别关注的。因此，这样的前药特别适合于本发明的组合物。如前面提及的arbaclofenplacarbil也是一种熟知的前药并因此可以代替本发明的组合物中的巴氯芬而使用。巴氯芬的其他前药发现于以下专利申请：WO 2010/102071, US2009197958, WO 2009/096985,WO 2009/061934, WO 2008/086492, US2009216037, WO 2005/066122, US2011021571,WO 2003/077902和WO 2010/120370。

阿坎酸的有用前药，如阿坎酸的泛酸酯新戊基磺酰基酯、新戊基磺酰基酯前药或掩蔽羧酸酯新戊基磺酰基酯前药尤其列于WO 2009/033069, WO 2009/033061, WO 2009/033054 WO 2009/052191, WO 2009/033079, US20090099253, US20090069419,US20090082464, US20090082440和US20090076147。

可以使用如上所述的前药代替本文中公开的本发明的化合物。

术语化合物的“衍生物”包括与所述化合物功能和结构相关的任何分子，如这样的化合物的酸、酰胺、酯、醚、乙酰化变体、羟基化变体或烷基化(C1-C6)变体。术语“衍生物”还包括失去如上所列的一个或多个取代基的结构相关化合物。例如，高牛磺酸是阿坎酸的脱乙酰化衍生物。化合物的优选衍生物是与所述化合物具有显著相似度的分子，如通过已知的方法确定的。连同其与亲本分子的相似性指数的类似化合物可以发现于大量数据库如PubChem (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/)或DrugBank (http://www.drugbank.ca/)。在一个更优选的实施方案中，衍生物具有的与亲本药物的Tanimoto相似性指数应大于0.4，优选大于0.5，更优选地大于0.6，甚至更优选地大于0.7。Tanimoto相似性指数广泛用于测量两个分子之间的结构相似度。Tanimoto相似性指数可以通过软件如可在线(http://www.ebi.ac.uk/thorntonsrv/software/SMSD/)获得的Small MoleculeSubgraph Detector [26，27]计算。优选的衍生物应是结构和功能与亲本化合物相关的，即，它们还应保留亲本药物的至少部分活性，更优选地它们应对多巴胺能神经元具有保护活性以免于6-OHDA-诱导的应激和/或谷氨酸毒性和/或缺血性应激(如在实验部分例示的)。

术语“衍生物”还包括药物的代谢物，例如分子，其在施用至生物体后由通常通过专门化的酶系统(生物化学)修饰或加工所述药物产生，并且显示或保留药物的生物学活性。代谢物作为负责亲本药物的许多治疗作用而已被公开。在一个具体实施方案中，如本文使用的“代谢物”是指保留亲本药物的至少一部分活性的修饰或加工药物，优选对多巴胺能神经元具有保护活性以免于6-OHDA-诱导的应激和/或谷氨酸毒性和/或缺血性应激。代谢物的实例包括由于药物的肝代谢产生的托拉塞米的羟基化形式[28]。

术语“盐”是指本发明的化合物的药学上可接受的和相对无毒的、无机或有机加成盐。药用盐形成包括使酸性、碱性或两性药物分子与相反离子成对以产生药物的盐形式。各种各样的化学物质可以在中和反应中使用。本发明的药学上可接受的盐因此包括通过使充当碱的主要化合物与无机或有机酸反应以形成盐而获得的那些，例如，乙酸、硝酸、酒石酸、氢氯酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、樟脑磺酸、草酸、马来酸、琥珀酸或柠檬酸的盐。本发明的药学上可接受的盐还包括其中主要化合物充当酸并且与适当碱反应以形成的那些，例如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐或胆碱盐。尽管指定活性成分的大多数盐是生物等效物，但是一些可能尤其具有增加的溶解性或生物利用度性质。盐选择现在在药物开发过程中是常见的标准操作，如由H. Stahl和C.G Wermuth在其手册中教导的[29]。

在一个优选实施方案中，化合物的名称意思是指化合物本身，及其任何药学上可接受的盐、水合物、异构体、外消旋物。

下表1提供了用于本发明的化合物以及这些化合物的盐、衍生物、代谢物和/或前药的CAS编号的非限制性实例。

表1

在一个特别的实施方案中，使用所述化合物的缓释制剂。

本发明人已发现，阿坎酸、巴氯芬、西那卡塞特、美西律、磺胺异噁唑、托拉塞米和他达拉非在校正α-突触核蛋白聚集分子途径方面特别有效。

如实施例中公开的，本发明的分子对帕金森综合征，特别是帕金森病中涉及的生物学过程具有强大的、出乎意料的作用，并且代表该病理学的新的治疗方法。特别地，本发明的组合物提供对抗谷氨酸毒性出乎意料的保护作用。此外，本发明的药物和药物组合在6-OHDA-诱导的氧化应激以及缺血性应激下增加多巴胺能神经元存活率，并且诱导对PD的运动和非运动表现的保护作用。这些症状改进涉及多巴胺能神经元的实际神经元保护作用，这由本发明的组合物的治疗在体内实现。因此，本发明的治疗方法有效用于保护神经元细胞，特别是保护中脑并且更特别地黑质中的多巴胺能神经元，如体内显示的。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及使用选自以下的化合物，治疗帕金森综合征，特别是PD的组合物和方法：阿坎酸、巴氯芬、西那卡塞特、美西律、磺胺异噁唑、托拉塞米和他达拉非。

调节参与α-突触核蛋白聚集网络的至少两种不同蛋白质的活性的药物组合构成本发明的特别有利的实施方案。事实上，本发明人已观察到，上述药物，当以组合施用时，协同地起作用而有效地保护多巴胺能神经元。特别地，本发明的组合物对抗谷氨酸毒性、缺血诱导的细胞死亡和氧化应激具有出乎意料的作用。这样的对帕金森综合征，特别是PD涉及的生物学过程的强大且出乎意料的作用使得该病理的这些新的联合治疗方法特别被关注。

因此，本发明还涉及使用选自以下的至少两种药物，治疗帕金森综合征，特别是PD的组合物和方法：阿坎酸、巴氯芬、西那卡塞特、美西律、磺胺异噁唑、托拉塞米和他达拉非。

本发明的组合物和方法通过它们作用于疾病的运动以及非运动症状而导致PD的改善。本发明的治疗方法提供有效的神经元保护作用，特别是多巴胺能神经元，对抗氧化应激、线粒体功能障碍、兴奋性中毒损伤、神经炎症或细胞凋亡。更特别地，它们可提供黑质神经元的保护作用对抗聚集的α-突触核蛋白的毒性，以减少多巴胺能细胞损失的速率或程度并由此影响疾病进展的过程。

在这一方面，本发明的一个目的涉及用于治疗帕金森综合征，特别是PD的组合物，其包含选自以下的化合物：阿坎酸、巴氯芬、西那卡塞特、美西律、磺胺异噁唑、托拉塞米和他达拉非，或其任何纯度的盐或前药或衍生物，或缓释制剂。在一个优选实施方案中，组合物包含托拉塞米或美西律，或其任何纯度的盐或前药或衍生物，或缓释制剂。

本发明涉及用于治疗帕金森综合征，特别是PD的组合物，包含选自以下的至少两种化合物：阿坎酸、巴氯芬、西那卡塞特、美西律、磺胺异噁唑、托拉塞米和他达拉非，或其任何化学纯度的盐、前药、衍生物，或缓释制剂。

本发明涉及用于治疗帕金森综合征，特别是PD的组合物，包含选自以下的至少一种化合物：阿坎酸、西那卡塞特和托拉塞米，或其任何化学纯度的盐、前药、衍生物，或缓释制剂；以及选自以下的至少一种化合物：巴氯芬、美西律、磺胺异噁唑和他达拉非，或其任何化学纯度的盐、前药、衍生物，或缓释制剂。

更特别地，本发明涉及用于同时、相继或单独施用的包含以下药物组合中的至少一种的组合物：

- 巴氯芬和阿坎酸，

- 巴氯芬和西那卡塞特，

- 西那卡塞特和阿坎酸，

- 美西律和西那卡塞特，

- 托拉塞米和巴氯芬，

- 托拉塞米和磺胺异噁唑，或

- 西那卡塞特和他达拉非，

或其任何纯度的盐或前药或衍生物，或缓释制剂，用于治疗帕金森综合征，特别是PD。

本发明还涉及使用上述药物或组合物中的任一种，治疗受试者的帕金森综合征，特别是PD的方法。

本发明的一种特别优选的组合物或方法使用巴氯芬和阿坎酸，或其任何化学纯度的盐、前药、衍生物，或缓释制剂。

本发明的另一种优选的组合物或方法使用巴氯芬和托拉塞米，或其任何化学纯度的盐、前药、衍生物，或缓释制剂。

在另一个特别的实施方案中，本发明的组合物或方法使用阿坎酸和西那卡塞特，或其任何纯度的盐或前药或衍生物，或缓释制剂，其中阿坎酸的日剂量等于或低于10 mg。

本发明还涉及巴氯芬，或其任何化学纯度的盐、前药、衍生物，或缓释制剂，以与阿坎酸，或其任何化学纯度的盐、前药、衍生物，或缓释制剂的组合使用，通过组合、单独或相继施用至受试者，用于治疗帕金森综合征，特别是PD。

本发明还涉及任何上述组合物用于保护有需要的受试者免于多巴胺能(DA)神经元的死亡或退化的用途。在具体的实施方案中，所述受试者正患有帕金森综合征，更特别是PD。

因此本发明的优选药物组合物包含2、3、4或5种不同药物，更优选地2、3或4种不同药物，用于联合治疗有需要的受试者的帕金森综合征，特别是PD。在一个优选实施方案中，本发明的药物以组合形式用于联合、单独或相继施用，以便提供最有效的作用。

本发明人进一步发现，选自以下的至少一种药物组合(drug combination)：

- 巴氯芬和阿坎酸，

- 巴氯芬和西那卡塞特，

- 美西律和西那卡塞特，

- 西那卡塞特和阿坎酸，

- 托拉塞米和巴氯芬，

- 托拉塞米和磺胺异噁唑，或

- 西那卡塞特和他达拉非，

与一种药物的联合药物(combination)，所述一种药物不同于之前的选自药物阿坎酸、巴氯芬、西那卡塞特、美西律、磺胺异噁唑、托拉塞米和他达拉非，并且增强二元组合的治疗作用和产生甚至更有效的组合物用于治疗帕金森综合征，特别是PD。

因此，本发明还涉及用于治疗帕金森综合征，特别是PD的组合物，其包含西那卡塞特和阿坎酸，与选自药物巴氯芬、美西律、磺胺异噁唑、托拉塞米和他达拉非，或其盐、前药、衍生物或缓释制剂的药物组合，用于联合、单独或相继地施用。

本发明还涉及用于治疗帕金森综合征，特别是PD的组合物，包含巴氯芬和阿坎酸，与选自西那卡塞特、美西律、磺胺异噁唑、托拉塞米和他达拉非，或其盐、前药、衍生物或缓释制剂的药物组合，用于联合、单独或相继地施用。

本发明还涉及用于治疗帕金森综合征，特别是PD的组合物，包含巴氯芬和西那卡塞特，与选自阿坎酸、美西律、磺胺异噁唑、托拉塞米和他达拉非，或其盐、前药、衍生物或缓释制剂的药物组合，用于联合、单独或相继地施用。

在一个实施方案中，本发明还涉及用于治疗帕金森综合征，特别是PD的组合物，包含美西律和西那卡塞特，与选自阿坎酸、巴氯芬、磺胺异噁唑、托拉塞米和他达拉非，或其盐、前药、衍生物或缓释制剂的药物组合，用于联合、单独或相继地施用。

在另一个实施方案中，本发明涉及用于治疗帕金森综合征，特别是PD的组合物，包含托拉塞米和巴氯芬，与选自阿坎酸、磺胺异噁唑、西那卡塞特、美西律和他达拉非，或其盐、前药、衍生物或缓释制剂的药物组合，用于联合、单独或相继地施用。

在另一个实施方案中，本发明还涉及用于治疗帕金森综合征，特别是PD的组合物，包含西那卡塞特和他达拉非，与选自阿坎酸、巴氯芬、美西律、磺胺异噁唑和托拉塞米，或其盐、前药、衍生物或缓释制剂的药物组合，用于联合、单独或相继地施用。

本发明还涉及用于治疗帕金森综合征，特别是PD的组合物，包含托拉塞米和磺胺异噁唑，与选自阿坎酸、巴氯芬、美西律、西那卡塞特和他达拉非，或其盐、前药、衍生物或缓释制剂的药物组合，用于联合、单独或相继地施用。

在更特别的实施方案中，本发明涉及用于治疗帕金森综合征，特别是PD的组合物，包含以下药物组合中的至少一种：

- 巴氯芬和西那卡塞特和美西律，

- 西那卡塞特和阿坎酸和美西律，

- 巴氯芬和阿坎酸和西那卡塞特，

- 巴氯芬和阿坎酸和托拉塞米，

- 巴氯芬和阿坎酸和美西律，

- 巴氯芬和阿坎酸和他达拉非，

- 托拉塞米和巴氯芬和西那卡塞特，

- 西那卡塞特和他达拉非和美西律，

- 西那卡塞特和他达拉非和阿坎酸，或

- 西那卡塞特和他达拉非和巴氯芬，

或其盐、前药、衍生物或缓释制剂，用于联合、单独或相继地施用。

本发明的另一个目的在于如上所述的组合物在制备用于治疗帕金森综合征，特别是PD的药物中的用途。

本发明的另一个目的涉及如上所述的组合物在制备用于保护有需要的受试者免于DA神经元的死亡或退化的药物中的用途。

如之前指出的，在本发明的联合治疗中，所述化合物或药物可以一起配制，或单独配制，并且一起、单独或相继地施用。

本发明的另一个目的是治疗帕金森综合征、特别是PD的方法，所述方法包括向有需要的受试者同时、单独或相继地施用有效量的上述组合物。

在这方面，本发明的一个特别目的是一种治疗帕金森综合征、特别是PD的方法，所述方法包括向有需要的受试者同时、单独或相继地施用有效量的上述药物组合。

在一个优选实施方案中，本发明涉及一种治疗有需要的受试者的帕金森综合征、特别是PD的方法，包括向所述受试者同时、单独或相继地施用有效量的选自以下的至少一种化合物的组合物：阿坎酸、巴氯芬、西那卡塞特、美西律、磺胺异噁唑、托拉塞米和他达拉非。

在一个更优选的实施方案中，本发明涉及一种治疗有需要的受试者的帕金森综合征、特别是PD的方法，包括向所述受试者同时、单独或相继地施用有效量的选自以下的至少两种化合物的组合：阿坎酸、巴氯芬、西那卡塞特、美西律、磺胺异噁唑、托拉塞米和他达拉非。

在甚至更优选的实施方案中，本发明涉及一种治疗有需要的受试者的帕金森综合征、特别是PD的方法，包括向所述受试者同时、单独或相继地施用有效量的以下药物组合、或其盐、前药衍生物或缓释制剂中的至少一种的联合药物(combination)：

- 巴氯芬和阿坎酸，

- 巴氯芬和西那卡塞特，

- 西那卡塞特和阿坎酸，

- 美西律和西那卡塞特，

- 托拉塞米和巴氯芬，

- 托拉塞米和磺胺异噁唑，或

- 西那卡塞特和他达拉非。

在另一个优选的实施方案中，本发明涉及一种治疗有需要的受试者的帕金森综合征、特别是PD的方法，包括向所述受试者同时、单独或相继地施用有效量的以下药物组合、或其盐、前药衍生物或缓释制剂中至少一种的联合药物(combination)，：

- 巴氯芬和西那卡塞特和美西律，

- 西那卡塞特和阿坎酸和美西律，

- 巴氯芬和阿坎酸和西那卡塞特，

- 巴氯芬和阿坎酸和托拉塞米，

- 巴氯芬和阿坎酸和美西律，

- 巴氯芬和阿坎酸和他达拉非，

- 托拉塞米和巴氯芬和西那卡塞特，

- 西那卡塞特和他达拉非和美西律，

- 西那卡塞特和他达拉非和阿坎酸，或

- 西那卡塞特和他达拉非和巴氯芬。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种保护有需要的受试者免于DA神经元的死亡或退化的方法，所述方法包括施用任一种上述组合物。

本发明的组合物典型地包含一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。另外，对于用于本发明，所述药物或化合物通常与药学上可接受的赋形剂或载体混合。

在这方面，本发明的另一个目的是制备药物组合物的方法，所述方法包括在适当的赋形剂或载体中混合上述化合物或化合物组合。

尽管在体内和体外非常有效，但是取决于受试者或具体病症，上述方法、组合物或组合治疗可以进一步联合或结合或组合另外的药物或治疗使用。

联合根据本发明的药物或药物组合使用的另外的治疗可以包括减轻PD的症状的一种或多种药物、可以用于PD的姑息治疗的一种或多种药物或当前在用于治疗帕金森病的临床试验范围中评价的一种或多种药物。

因此，本发明的组合物可以组合多巴胺能药物如多巴胺前体(优选左旋多巴、甲左多巴)、多巴胺受体激动剂(优选他利克索、吡贝地尔、罗替戈汀、溴隐亭、培高利特、卡麦角林、麦角乙脲、普拉克索、罗平尼咯或阿朴吗啡)或多巴胺代谢酶的抑制剂(优选司来吉兰、雷沙吉兰)。

本发明的组合物还可以组合用于PD的其他已知治疗、用于PD的辅助治疗、或PD的非运动症状的治疗，或优选单唾液酸四己糖神经节苷脂、胞磷胆碱、屈昔多巴马扎替可、普鲁米近、喹硫平、普环啶、邻甲苯海拉明、多潘立酮、苯扎托品、三己芬迪、比哌立登、氯氮平、地昔帕明、西酞普兰、去甲替林、帕罗西汀、阿托西汀、文拉法辛、金刚胺、多奈哌齐、利凡斯的明或美金刚。

本发明的方法、组合物和组合与上述治疗的这样的用途将允许降低关注药物的治疗剂量并因此将减少、延迟或避免与这些药物相关的已知副作用，例如峰值剂量运动障碍，其在用左旋多巴治疗的患者中观察到。

在这方面，本发明的另一个目的涉及用于治疗帕金森综合征、特别是PD的组合物，包含上述的组合物与选自以下的至少一种化合物的组合：左旋多巴、甲左多巴、他利克索、吡贝地尔、罗替戈汀、溴隐亭、培高利特、卡麦角林、麦角乙脲、普拉克索、罗平尼咯、阿朴吗啡、司来吉兰、雷沙吉兰、单唾液酸四己糖神经节苷脂、胞磷胆碱、屈昔多巴马扎替可、普鲁米近、喹硫平、普环啶、邻甲苯海拉明、多潘立酮、苯扎托品、三己芬迪、比哌立登、氯氮平、地昔帕明、西酞普兰、去甲替林、帕罗西汀、阿托西汀、文拉法辛、金刚胺、多奈哌齐、利凡斯的明和美金刚，或其任何纯度的盐或前药或衍生物，或缓释制剂。

因此，本发明的特别实施方案涉及用于治疗帕金森综合征、特别是PD的组合物，包含选自以下的至少一种化合物：阿坎酸、巴氯芬、西那卡塞特、美西律、磺胺异噁唑、托拉塞米或他达拉非，或其任何化学纯度的盐、前药、衍生物，或缓释制剂；与选自以下的至少一种化合物组合：左旋多巴、甲左多巴、他利克索、吡贝地尔、罗替戈汀、溴隐亭、培高利特、卡麦角林、麦角乙脲、普拉克索、罗平尼咯、阿朴吗啡、司来吉兰、雷沙吉兰、单唾液酸四己糖神经节苷脂、胞磷胆碱、屈昔多巴马扎替可、普鲁米近、喹硫平、普环啶、邻甲苯海拉明、多潘立酮、苯扎托品、三己芬迪、比哌立登、氯氮平、地昔帕明、西酞普兰、去甲替林、帕罗西汀、阿托西汀、文拉法辛、金刚胺、多奈哌齐、利凡斯的明和美金刚，或其任何纯度的盐或前药或衍生物，或缓释制剂。

本发明的一个优选实施方案涉及用于治疗帕金森综合征、特别是PD的组合物，其包含以下药物组合的至少一种：

- 巴氯芬和左旋多巴，

- 托拉塞米和左旋多巴，

- 磺胺异噁唑和左旋多巴，

- 美西律和左旋多巴，

- 西那卡塞特和左旋多巴，

- 他达拉非和左旋多巴，

- 巴氯芬和司来吉兰或雷沙吉兰，

- 托拉塞米和司来吉兰或雷沙吉兰，

- 磺胺异噁唑和司来吉兰或雷沙吉兰，

- 美西律和司来吉兰或雷沙吉兰，

- 西那卡塞特和司来吉兰或雷沙吉兰，或

- 他达拉非和司来吉兰或雷沙吉兰，

或其任何纯度的盐或前药或衍生物，或缓释制剂，用于联合、单独或相继地施用。

本发明还涉及包含以下药物组合的至少一种的组合物本身：

- 巴氯芬和左旋多巴，

- 托拉塞米和左旋多巴，

- 磺胺异噁唑和左旋多巴，

- 美西律和左旋多巴，

- 西那卡塞特和左旋多巴，

- 他达拉非和左旋多巴，

- 巴氯芬和司来吉兰或雷沙吉兰，

- 托拉塞米和司来吉兰或雷沙吉兰，

- 磺胺异噁唑和司来吉兰或雷沙吉兰，

- 美西律和司来吉兰或雷沙吉兰，

- 西那卡塞特和司来吉兰或雷沙吉兰，或

- 他达拉非和司来吉兰或雷沙吉兰，

或其任何纯度的盐或前药或衍生物，或缓释制剂，用于联合、单独或相继地施用。

在一个实施方案中，本发明还涉及治疗有需要的受试者的帕金森综合征、特别是PD的方法，包括向所述受试者同时、单独或相继地施用有效量的选自以下的至少两种化合物的组合：阿坎酸、巴氯芬、西那卡塞特、美西律、磺胺异噁唑、托拉塞米或他达拉非；与选自以下的至少一种化合物的组合：左旋多巴、甲左多巴、他利克索、吡贝地尔、罗替戈汀、溴隐亭、培高利特、卡麦角林、麦角乙脲、普拉克索、罗平尼咯、阿朴吗啡、司来吉兰、雷沙吉兰、单唾液酸四己糖神经节苷脂、胞磷胆碱、屈昔多巴马扎替可、普鲁米近、喹硫平、普环啶、邻甲苯海拉明、多潘立酮、苯扎托品、三己芬迪、比哌立登、氯氮平、地昔帕明、西酞普兰、去甲替林、帕罗西汀、阿托西汀、文拉法辛、金刚胺、多奈哌齐、利凡斯的明和美金刚，或其任何纯度的盐或前药或衍生物，或缓释制剂。

在另一个实施方案中，本发明涉及治疗有需要的受试者的帕金森综合征、特别是PD的方法，包括向所述受试者同时、单独或相继地施用有效量的巴氯芬和阿坎酸或其盐、前药、衍生物或缓释制剂，与选自以下的至少一种化合物的组合：左旋多巴、甲左多巴、他利克索、吡贝地尔、罗替戈汀、溴隐亭、培高利特、卡麦角林、麦角乙脲、普拉克索、罗平尼咯、阿朴吗啡、司来吉兰、雷沙吉兰、单唾液酸四己糖神经节苷脂、胞磷胆碱、屈昔多巴马扎替可、普鲁米近、喹硫平、普环啶、邻甲苯海拉明、多潘立酮、苯扎托品、三己芬迪、比哌立登、氯氮平、地昔帕明、西酞普兰、去甲替林、帕罗西汀、阿托西汀、文拉法辛、金刚胺、多奈哌齐、利凡斯的明和美金刚，或其任何纯度的盐或前药或衍生物，或缓释制剂。

在另一个实施方案中，本发明涉及治疗有需要的受试者的帕金森综合征、特别是PD的方法，包括向所述受试者同时、单独或相继地施用有效量的美西律和西那卡塞特或其盐、前药、衍生物或缓释制剂，与选自以下的至少一种化合物的组合：左旋多巴、甲左多巴、他利克索、吡贝地尔、罗替戈汀、溴隐亭、培高利特、卡麦角林、麦角乙脲、普拉克索、罗平尼咯、阿朴吗啡、司来吉兰、雷沙吉兰、单唾液酸四己糖神经节苷脂、胞磷胆碱、屈昔多巴马扎替可、普鲁米近、喹硫平、普环啶、邻甲苯海拉明、多潘立酮、苯扎托品、三己芬迪、比哌立登、氯氮平、地昔帕明、西酞普兰、去甲替林、帕罗西汀、阿托西汀、文拉法辛、金刚胺、多奈哌齐、利凡斯的明和美金刚，或其任何纯度的盐或前药或衍生物，或缓释制剂。

在另一个实施方案中，本发明涉及治疗有需要的受试者的帕金森综合征、特别是PD的方法，包括向所述受试者同时、单独或相继地施用有效量的托拉塞米和巴氯芬或其盐、前药、衍生物或缓释制剂，与选自以下的至少一种化合物的组合：左旋多巴、甲左多巴、他利克索、吡贝地尔、罗替戈汀、溴隐亭、培高利特、卡麦角林、麦角乙脲、普拉克索、罗平尼咯、阿朴吗啡、司来吉兰、雷沙吉兰、单唾液酸四己糖神经节苷脂、胞磷胆碱、屈昔多巴马扎替可、普鲁米近、喹硫平、普环啶、邻甲苯海拉明、多潘立酮、苯扎托品、三己芬迪、比哌立登、氯氮平、地昔帕明、西酞普兰、去甲替林、帕罗西汀、阿托西汀、文拉法辛、金刚胺、多奈哌齐、利凡斯的明和美金刚，或其任何纯度的盐或前药或衍生物，或缓释制剂。

在另一个实施方案中，本发明涉及治疗有需要的受试者的帕金森综合征、特别是PD的方法，包括向所述受试者同时、单独或相继地施用有效量的磺胺异噁唑和托拉塞米或其盐、前药、衍生物或缓释制剂，与选自以下的至少一种化合物的组合：左旋多巴、甲左多巴、他利克索、吡贝地尔、罗替戈汀、溴隐亭、培高利特、卡麦角林、麦角乙脲、普拉克索、罗平尼咯、阿朴吗啡、司来吉兰、雷沙吉兰、单唾液酸四己糖神经节苷脂、胞磷胆碱、屈昔多巴马扎替可、普鲁米近、喹硫平、普环啶、邻甲苯海拉明、多潘立酮、苯扎托品、三己芬迪、比哌立登、氯氮平、地昔帕明、西酞普兰、去甲替林、帕罗西汀、阿托西汀、文拉法辛、金刚胺、多奈哌齐、利凡斯的明和美金刚，或其任何纯度的盐或前药或衍生物，或缓释制剂。

在另一个实施方案中，本发明涉及治疗有需要的受试者的帕金森综合征、特别是PD的方法，包括向所述受试者同时、单独或相继地施用有效量的西那卡塞特和阿坎酸或其盐、前药、衍生物或缓释制剂，与选自以下的至少一种化合物的组合：左旋多巴、甲左多巴、他利克索、吡贝地尔、罗替戈汀、溴隐亭、培高利特、卡麦角林、麦角乙脲、普拉克索、罗平尼咯、阿朴吗啡、司来吉兰、雷沙吉兰、单唾液酸四己糖神经节苷脂、胞磷胆碱、屈昔多巴马扎替可、普鲁米近、喹硫平、普环啶、邻甲苯海拉明、多潘立酮、苯扎托品、三己芬迪、比哌立登、氯氮平、地昔帕明、西酞普兰、去甲替林、帕罗西汀、阿托西汀、文拉法辛、金刚胺、多奈哌齐、利凡斯的明和美金刚，或其任何纯度的盐或前药或衍生物，或缓释制剂。

在另一个实施方案中，本发明涉及治疗有需要的受试者的帕金森综合征、特别是PD的方法，包括向所述受试者同时、单独或相继地施用有效量的巴氯芬和西那卡塞特或其盐、前药、衍生物或缓释制剂，与选自以下的至少一种化合物的组合：左旋多巴、甲左多巴、他利克索、吡贝地尔、罗替戈汀、溴隐亭、培高利特、卡麦角林、麦角乙脲、普拉克索、罗平尼咯、阿朴吗啡、司来吉兰、雷沙吉兰、单唾液酸四己糖神经节苷脂、胞磷胆碱、屈昔多巴马扎替可、普鲁米近、喹硫平、普环啶、邻甲苯海拉明、多潘立酮、苯扎托品、三己芬迪、比哌立登、氯氮平、地昔帕明、西酞普兰、去甲替林、帕罗西汀、阿托西汀、文拉法辛、金刚胺、多奈哌齐、利凡斯的明和美金刚，或其任何纯度的盐或前药或衍生物，或缓释制剂。

在另一个实施方案中，本发明涉及治疗有需要的受试者的帕金森综合征、特别是PD的方法，包括向所述受试者同时、单独或相继地施用有效量的西那卡塞特和他达拉非或其盐、前药、衍生物或缓释制剂，与选自以下的至少一种化合物的组合：左旋多巴、甲左多巴、他利克索、吡贝地尔、罗替戈汀、溴隐亭、培高利特、卡麦角林、麦角乙脲、普拉克索、罗平尼咯、阿朴吗啡、司来吉兰、雷沙吉兰、单唾液酸四己糖神经节苷脂、胞磷胆碱、屈昔多巴马扎替可、普鲁米近、喹硫平、普环啶、邻甲苯海拉明、多潘立酮、苯扎托品、三己芬迪、比哌立登、氯氮平、地昔帕明、西酞普兰、去甲替林、帕罗西汀、阿托西汀、文拉法辛、金刚胺、多奈哌齐、利凡斯的明和美金刚，或其任何纯度的盐或前药或衍生物，或缓释制剂。

在一个优选实施方案中，本发明的组合物，用于治疗帕金森综合征、特别是PD，包含以下药物组合、或其盐、前药、衍生物或缓释制剂中的至少一种，所述组合每一个中的药物用于联合、单独或相继地施用：

- 巴氯芬和阿坎酸和左旋多巴，

- 美西律和西那卡塞特和左旋多巴，

- 托拉塞米和巴氯芬和左旋多巴，

- 巴氯芬和西那卡塞特和左旋多巴，

- 西那卡塞特和阿坎酸和左旋多巴，

- 磺胺异噁唑和托拉塞米和左旋多巴，

- 西那卡塞特和他达拉非和左旋多巴，

- 巴氯芬和阿坎酸和司来吉兰或雷沙吉兰，

- 美西律和西那卡塞特和司来吉兰或雷沙吉兰，

- 托拉塞米和巴氯芬和司来吉兰或雷沙吉兰，

- 巴氯芬和西那卡塞特和司来吉兰或雷沙吉兰，

- 西那卡塞特和阿坎酸和司来吉兰或雷沙吉兰，

- 磺胺异噁唑和托拉塞米和司来吉兰或雷沙吉兰，或

- 西那卡塞特和他达拉非和司来吉兰或雷沙吉兰。

本发明还涉及组合物本身，其包含以下药物组合、或其盐、前药、衍生物或缓释制剂中的至少一种，所述组合的每一个中的药物用于同时、单独或相继地施用：

- 巴氯芬和阿坎酸和左旋多巴，

- 美西律和西那卡塞特和左旋多巴，

- 托拉塞米和巴氯芬和左旋多巴，

- 巴氯芬和西那卡塞特和左旋多巴，

- 西那卡塞特和阿坎酸和左旋多巴，

- 磺胺异噁唑和托拉塞米和左旋多巴，

- 西那卡塞特和他达拉非和左旋多巴，

- 巴氯芬和阿坎酸和司来吉兰或雷沙吉兰，

- 美西律和西那卡塞特和司来吉兰或雷沙吉兰，

- 托拉塞米和巴氯芬和司来吉兰或雷沙吉兰，

- 巴氯芬和西那卡塞特和司来吉兰或雷沙吉兰，

- 西那卡塞特和阿坎酸和司来吉兰或雷沙吉兰，

- 磺胺异噁唑和托拉塞米和司来吉兰或雷沙吉兰，或

- 西那卡塞特和他达拉非和司来吉兰或雷沙吉兰。

在另一个优选实施方案中，本发明涉及本发明的组合物，用于治疗帕金森综合征、特别是PD，包含以下药物组合、或其盐、前药、衍生物或缓释制剂中的至少一种，所述组合的每一个中的药物用于联合、单独或相继地施用：

- 巴氯芬、西那卡塞特、美西律和左旋多巴，

- 西那卡塞特、阿坎酸、美西律和左旋多巴，

- 巴氯芬、阿坎酸、西那卡塞特和左旋多巴，

- 巴氯芬、阿坎酸、托拉塞米和左旋多巴，

- 巴氯芬、阿坎酸、美西律和左旋多巴，

- 巴氯芬、阿坎酸、他达拉非和左旋多巴，

- 托拉塞米、巴氯芬、西那卡塞特和左旋多巴，

- 西那卡塞特、他达拉非、美西律和左旋多巴，

- 西那卡塞特、他达拉非、阿坎酸和左旋多巴，

- 西那卡塞特、他达拉非、巴氯芬和左旋多巴，

- 巴氯芬、西那卡塞特、美西律和司来吉兰或雷沙吉兰，

- 西那卡塞特、阿坎酸、美西律和司来吉兰或雷沙吉兰，

- 巴氯芬、阿坎酸、西那卡塞特和司来吉兰或雷沙吉兰，

- 巴氯芬、阿坎酸、托拉塞米和司来吉兰或雷沙吉兰，

- 巴氯芬、阿坎酸、美西律和司来吉兰或雷沙吉兰，

- 巴氯芬、阿坎酸、他达拉非和司来吉兰或雷沙吉兰，

- 托拉塞米、巴氯芬、西那卡塞特和司来吉兰或雷沙吉兰，

- 西那卡塞特、他达拉非、美西律和司来吉兰或雷沙吉兰，

- 西那卡塞特、他达拉非、阿坎酸和司来吉兰或雷沙吉兰，或

- 西那卡塞特、他达拉非、巴氯芬和司来吉兰或雷沙吉兰。

在一个特别的实施方案中，当本发明的组合物或组合治疗包含多巴胺前体时，它们可以进一步组合选自以下的至少一种化合物：外周多巴脱羧酶抑制剂、儿茶酚-O-甲基转移酶抑制剂或单胺氧化酶抑制剂。更特别地，当本发明的组合物或组合治疗包含多巴胺前体时，它们可以进一步组合选自以下的至少一种化合物：卡比多巴、苄丝肼、托卡朋、恩他卡朋、司来吉兰或雷沙吉兰。

本发明的另一目的在于如上所述的组合物在制备用于治疗帕金森综合征、特别是PD的药物中的用途。

在另一个实施方案中，本发明的组合物或组合治疗可以与用于PD的手术治疗如深脑刺激联合使用。更特别地，手术治疗是底丘脑核或苍白球内的深脑刺激。

在这方面，本发明涉及一种组合物，其包含选自以下的至少一种化合物：阿坎酸、巴氯芬、西那卡塞特、美西律、磺胺异噁唑、托拉塞米和他达拉非，或其任何化学纯度的盐、前药、衍生物，或缓释制剂，其组合底丘脑核或苍白球内的深脑刺激用于治疗帕金森综合征、特别是PD。

PD运动症状可以在纹状体的多巴胺能去神经支配和黑质多巴胺能神经元损失已广泛发生时后期形成。因此，在运动症状出现之前和预防中的PD的治疗是必需的以便改变疾病的进展和进程。

在这方面，在一个优选实施方案中，任何上述方法、组合物或组合治疗可以用于防止、预防或延迟由PD病因触发的症状或其症状。

非运动症状、最特别是嗅觉丧失的早期检测与评估纹状体多巴胺转运体的变化的成像技术(单个光子发射计算技术，正电子成像术)的组合可以是合适的方法以鉴别在出现运动症状之前处于风险的PD患者，从而允许神经保护性治疗的早期开始。

一些PD情形可以归因于基因内的突变，所述基因例如是SNCA (α-突触核蛋白)、PRKN (parkin)、LRRK2 (富含亮氨酸重复激酶2)、PINK1 (PTEN-诱导的公认激酶1)、DJ-1和ATP13A2以及十一个基因座(PARK1-PARK11)。在这方面，在一个特别实施方案中，本发明涉及上述方法、组合物或组合治疗用于治疗具有在以下基因的至少一个的突变的受试者中的PD的用途：SNCA、PRKN、LRRK2、PINK1、DJ-1、ATP13A2和PARK1至PARK11。

高浓度暴露或慢性暴露于金属如锰、铜或铅，或化学品如杀虫剂(例如百草枯、鱼藤酮和代森锰)，有可能引起帕金森综合征、特别是PD。在这方面，在一个特别实施方案中，本发明涉及上述方法、组合物或组合治疗在治疗受试者的帕金森综合征、特别是PD的用途，所述受试者暴露于、怀疑已暴露于或有风险暴露于已知是发展PD或相关障碍的危险因素的化学品或金属。

在一个优选实施方案中，上述方法、组合物或组合治疗可以用于处于发展PD或与PD相关的症状的风险的受试者。

在另一个优选的实施方案中，上述方法、组合物或组合治疗可用于保护处于发展PD或与PD相关的症状的风险的受试者免于DA神经元的死亡或退化。

根据本发明的治疗可以在家庭、医生办公室、临床、医院门诊部或医院中提供，以使医生能够密切地观察治疗效果并且进行需要的任何调整。

治疗的持续时间取决于治疗的疾病的阶段、患者的年龄和状况、以及患者如何响应于治疗。组合的每个组分的施用剂量、频率和模式可以独立地控制。例如，一种药物可以经口地施用而第二药物可以肌肉内地施用。联合治疗可以在包括休息期的打开和关闭周期中给予，以使患者身体具有从任何还没有预见的副作用中恢复的机会。药物也可以一起配制以使一次施用递送所有药物。

组合的每个药物的施用可以是任何合适的方式，其产生与其他组分组合的药物的浓度能够减轻患者病症或有效地治疗疾病或障碍。

虽然组合的药物可能作为纯化学物质施用，但是优选将它们作为药物组合物呈现，在本上下文中也称为药物制剂。可能的组合物包括适用于经口、直肠、局部(包括透皮、颊下和舌下)或肠胃外(包括皮下、肌肉内、静脉内和皮内)施用的那些。

更常见地，这些药物制剂对患者以“患者包装”开处方，该患者包装在单个包装通常为泡罩包装中包含大量用药单位或其它方式用于施用多个计量单位剂量以在不同治疗期期间使用。患者包装相对于传统处方具有优势，其中药剂师将患者的药物供应从整体供应划分，因为患者总是可取阅患者包装中容纳的包装说明书，通常在传统处方中缺失。纳入包装说明书已被证实改善患者对医师指示的顺应性。因此，本发明进一步包括一种药物制剂，如本文之前描述的，其组合有适用于所述制剂的包装材料。在这样的患者包装中，用于组合治疗的制剂的所需用途可以通过说明书、装置、规定、改编本和/或其他工具推断，以有助于使用最适合治疗的制剂。这样的措施使得患者包装特别适合于并且适应于用本发明的组合的治疗。

药物可以以任何适当的量包含在任何合适的载体物质中。药物可以以多至组合物的总重量的99%重量的量提供。组合物可以以剂型提供，所述剂型适用于经口、胃肠外(例如，静脉内、肌肉内)、直肠、皮肤、经鼻、阴道、吸入、皮肤(贴剂)或眼部施用途径。因此，组合物可以为例如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂包括水凝胶、糊剂、软膏、霜剂、药膏、浸润剂(drenches)、等张递送装置、栓剂、灌肠剂、注射剂、植入物、喷雾剂或气溶胶的形式。

药物组合物可以根据常规制药学实践配制(参见，例如，Remington: The Scienceand Practice of Pharmacy (第20版) [30]和Encyclopedia of PharmaceuticalTechnology [31])。

根据本发明的药物组合物可以配制成在施用后基本上立即或在施用之后任何预定时间或时间段释放活性药物。

受控释放制剂包括(i)在延长的时间期内在身体内产生基本上恒定的药物浓度的制剂；(ii)在预定延迟时间后，在延长的时间期内在身体内产生基本上恒定的药物浓度的制剂；(iii)在与活性药物物质的血浆水平波动相关的不期望副作用的伴随最小化下，通过维持身体中相对恒定的有效药物水平，在预定时间期期间持续药物作用的制剂；(iv) 通过例如在患病组织或器官附近或之中空间放置受控释放组合物定位药物作用的制剂；和(v)通过使用载体或化学衍生物来将药物递送至特定靶标细胞类型而靶向药物作用的制剂。

以受控释放制剂的形式施用药物在这样的情况下是特别优选的，其中所述药物具有(i) 窄的治疗指数(即，导致有害副作用或毒性反应的血浆浓度和导致治疗作用的血浆浓度之间的差异小；一般地，治疗指数TI被定义为半致死量(LD50)与半有效剂量(ED50)的比率)；(ii) 在胃肠道中的窄吸收窗；或(iii) 极短的生物学半衰期使得需要一天期间的频繁用药以便将血浆水平维持在治疗水平。

可以进行大量策略的任一个以获得受控释放，其中释放速率胜过所述药物的代谢速率。受控释放可以通过适当选择各种制剂参数和成分而获得，包括例如各种类型的受控释放组合物和包衣。因此，所述药物与适当赋形剂配制成药物组合物，其在施用后，以受控方式释放所述药物(单个或多个单位片剂或胶囊组合物，油溶液，混悬剂，乳剂，微胶囊，微球体，纳米粒子，贴剂和脂质体)。

用于经口使用的固体剂型

用于经口使用的制剂包括含有与无毒的药学上可接受的赋形剂混合的本发明的组合物的片剂。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂或填料(例如，蔗糖，微晶纤维素，淀粉，包括马铃薯淀粉，碳酸钙，氯化钠，磷酸钙，硫酸钙，或磷酸钠)；粒化和崩解剂（例如，纤维素衍生物，包括微晶纤维素，淀粉，包括马铃薯淀粉，交联羧甲基纤维素钠，海藻酸盐或藻酸)；粘合剂(例如，阿拉伯树胶，褐藻酸，褐藻酸钠，明胶，淀粉，预凝胶化淀粉，微晶纤维素，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟丙甲纤维素，乙基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，或聚乙二醇)；和润滑剂、助流剂，以及抗粘剂(例如，硬脂酸，硅酸盐或滑石)。其他药学上可接受的赋形剂可以是着色剂、调味剂、增塑剂、保湿剂、缓冲剂等。

片剂可以是未包衣的或者它们可以通过已知的技术包衣，任选地用于延迟胃肠道中的崩解和吸收并由此在更长时期内提供持续作用。包衣可以适于以预定模式释放活性药物物质(例如，为了实现受控释放制剂)或者它可以适于直到通过胃后才释放活性药物物质（肠溶衣）。包衣可以是糖包衣、薄膜包衣(例如基于羟丙甲纤维素，甲基纤维素，甲基羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，羧甲基纤维素，丙烯酸酯共聚物，聚乙二醇和/或聚乙烯吡咯烷酮)，或肠溶衣（例如，基于甲基丙烯酸共聚物，邻苯二甲酸乙酸纤维素，邻苯二甲酸羟丙甲纤维素，琥珀酸乙酸羟丙基甲基纤维素，聚乙烯乙酸邻苯二甲酸酯，虫胶和/或乙基纤维素)。可以采用时间延迟材料，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

固体片剂组合物可以包括适于保护组合物免于不希望的化学变化(例如，在活性药物物质释放之前的化学降解)的包衣。包衣可以以在制药技术百科全书中描述的类似方式施加到固体剂型上。

药物可以在片剂中混合在一起，或者可以分隔开。例如，第一药物容纳在片剂的内侧，而第二药物在外侧上，以使第二药物的实质部分在第一药物释放之前释放。

用于经口使用的制剂也可以呈现为咀嚼片或呈现为硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如，马铃薯淀粉，微晶纤维素，碳酸钙，磷酸钙或高岭土)混合；或呈现为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质，例如液体石蜡或橄榄油混合。粉剂和颗粒剂可以常规方式在片剂和胶囊下使用上述成分制备。

用于经口使用的受控释放组合物例如可以构建成通过控制活性药物物质的溶解和/或扩散而释放活性药物。

溶解或扩散受控释放可以通过适当包衣药物的片剂、胶囊、丸剂或颗粒制剂，或通过将药物整合到适当基质中而实现。受控释放包衣可以包括一种或多种上述包衣物质，和/或例如，虫胶，蜂蜡，糖蜡(glycowax)，蓖麻蜡，巴西棕榈蜡，硬脂醇，单硬脂酸甘油酯，二硬脂酸甘油酯、硬脂酸棕榈酸甘油酯，乙基纤维素，丙烯酸树脂，dl-聚乳酸，乙酸丁酸纤维素，聚氯乙烯，聚乙烯乙酸酯，乙烯吡咯烷酮，聚乙烯，聚甲基丙烯酸酯，甲基丙烯酸甲酯，2-羟基甲基丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯水凝胶，1,3丁二醇，甲基丙烯酸乙二醇酯，和/或聚乙二醇。在受控释放基质制剂中，基质材料也可以包括例如水合甲基纤维素，巴西棕榈蜡和硬脂醇，聚羧乙烯934，硅酮，三硬脂酸甘油酯，丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲酯，聚氯乙烯，聚乙烯，和/或卤代碳氟化合物。

含有所要求保护的组合的一种或多种药物的受控释放组合物也可以为胃漂浮片(buoyant tablet)或胶囊的形式（即在经口施用后，漂浮在胃内容物顶部某一段时间的片剂或胶囊）。药物的胃漂浮片剂制剂可以通过对药物与赋形剂以及20-75% w/w的水状胶体如羟乙基纤维素、羟丙基纤维素或羟丙甲基纤维素的混合物粒化而制备。获得的颗粒然后可以压缩成片剂。在接触胃液后，该片剂在其表面周围形成基本上水不可渗透凝胶屏障。此凝胶屏障参与维持小于1的密度，由此允许片剂在胃液中保持漂浮。

用于经口施用的液体

适用于通过加入水制备含水混悬剂的粉剂、可分散粉剂或颗粒剂是用于经口施用的方便剂型。作为混悬剂的制剂提供与分散剂或润湿剂、助悬剂以及一种或多种防腐剂混合的活性成分。合适的助悬剂例如是羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、海藻酸钠等。

胃肠外组合物

药物组合物也可以通过注射、输注或植入(静脉内，肌肉内，皮下等)以含有常规的无毒的药学上可接受的载体和助剂的剂型、制剂，或经由合适的递送装置或植入物胃肠外施用。这样的组合物的配方和制剂对于药物制剂领域的技术人员是熟知的。

用于肠胃外使用的组合物可以以单位剂型(例如在单个剂量安剖瓶中)或在容纳多个剂量，并且其中可以添加合适的防腐剂（参见下文）的小瓶中提供。组合物可以为溶液、混悬剂、乳液、输注装置和用于植入的递送装置的形式，或者可以作为待用水或另一合适溶媒在使用前重构的干粉末呈现。除了活性药物，组合物可以包括适合肠胃外可接受的载体和/或赋形剂。活性药物可以整合到微球体、微胶囊、纳米粒子、脂质体等中用于受控释放。组合物可以包括助悬剂、增溶剂、稳定剂、pH调节剂和/或分散剂。

根据本发明的药物组合物可以为适用于无菌注射的形式。为了制备这样的组合物，将合适的活性药物溶解或悬浮在肠胃外可接受的液体溶媒中。在可接受的溶媒和溶剂之中，可以采用的是水、通过加入适当量的盐酸、氢氧化钠或合适的缓冲剂调节至合适pH的水、1,3-丁二醇、林格溶液、和等张氯化钠溶液。含水制剂也可以含有一种或多种防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯、乙酯或正丙酯)。在其中药物之一仅很少或微溶于水的情况下，可以加入溶解增强或增溶剂，或者溶剂可以包括10-60% w/w的丙二醇等。

受控释放的胃肠外组合物可以为水性悬浮液、微球体、微胶囊、磁性微球体、油性溶液、油性悬浮液或乳液的形式。或者，活性药物可以整合到生物相容性载体、脂质体、纳米粒子、植入物或输注装置中。用于制备微球体和/或微胶囊的材料例如是生物可降解/生物蚀解聚合物如polygalactin、聚-(氰基丙烯酸异丁酯)、聚(2-羟乙基-L-谷氨酰胺)。当配制受控释放的胃肠外制剂时可以使用的生物相容性载体是糖类（例如右旋糖）、蛋白质(例如白蛋白)、脂蛋白或抗体。用于植入物的材料可以是非生物降解的（例如聚二甲基硅氧烷）或生物降解的（例如聚(己内酯)，聚(乙醇酸)或聚(原酸酯))。

替代途径

尽管较不优选和较不方便，但是可以考虑其他施用途径，并且因此其他制剂。在这方面，对于直肠施用，组合物的合适剂型包括栓剂(乳剂或混悬剂类型)，和直肠明胶胶囊(溶液或混悬剂)。在典型的栓剂制剂中，活性药物与适当的药学上可接受的栓剂基质如可可脂、酯化的脂肪酸、甘油化明胶和各种水溶性或分散性基质如聚乙二醇组合。可以整合各种添加剂、增强剂或表面活性剂。

药物组合物也可以以含有常规无毒的药学上可接受的载体和赋形剂包括微球体和脂质体的剂型或制剂局部施用到皮肤上，用于经皮吸收。制剂包括霜剂、软膏、洗剂、擦剂、凝胶剂、水凝胶、溶液、混悬剂、贴剂、喷雾剂、糊剂、药膏和其他种类的透皮药物递送系统。药学上可接受的载体或赋形剂可以包括乳化剂、抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、保湿剂、渗透增强剂、螯合剂、胶凝剂、软膏基质、香料和皮肤保护剂。

防腐剂、保湿剂、渗透增强剂可以是对羟基苯甲酸酯类，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯，以及苯扎氯铵、甘油、丙二醇、尿素等。

上述用于局部施用到皮肤上的药物组合物也可以联合局部施用到或靠近要治疗的身体部分使用。所述组合物可以适用于直接施用或借助于特殊药物递送装置如敷料或药膏、垫、海绵、条或其他形式的合适柔性材料施用。

治疗的剂量和持续时间

应理解，所述组合的药物可以在相同或不同药物制剂中同时施用或相继地施用。如果是相继施用，施用第二(或另外的)活性成分的延迟不应为使得失去活性成分的组合的有效作用的益处。对于根据本说明书的组合的最低要求是所述组合应意图为以活性成分的组合的有效作用的益处联合使用。组合的意图使用可以通过装置、规定、改编本和/或其他手段推断以有助于利用根据本发明的组合。

在本发明的组合中的药物的治疗有效量包括，例如，对于减少帕金森病症状、终止或减慢疾病的进展（一旦其已是临床明显的）、或防止或减少形成该疾病的风险是有效的量。

尽管本发明的活性药物可以以分开的剂量施用，例如每天两次或三次，但是优选组合中的每个药物的单个日剂量，其中最优选在单个药物组合物中的所有药物的单个日剂量（单位剂型）。

施用可以是每天一次至多次，持续若干天至若干年，并且可以甚至持续患者是一生。慢性或至少周期性重复的长期施用在大多数情况下被指明。

术语“单位剂型”是指适合作为用于人受试者的单位剂量的物理上离散的单位(如胶囊，片剂，或装载注射器筒)，每个单位含有预定量的一种或多种活性材料（被计算产生期望的治疗效果）连同所需的药用载体。

在优选单位剂量组合物中的每个药物的量取决于多种因素，包括施用方法、患者的体重和年龄、疾病的阶段、考虑到要治疗个人的总体健康状况的潜在副作用的风险。另外，关于特定患者的药物组学信息(基因型对治疗剂的药动学、药效学或效力概况的作用)会影响所使用的剂量。

除了当响应于特别受损情况外，在可能需要更高剂量的情况下，所述组合中的每个药物的优选剂量通常在不高于对于长期维持治疗规定的或证实在3期临床研究中是安全的剂量的剂量范围内。

本发明的一个显著优点是，每个化合物可以在联合治疗中以低剂量使用，同时以组合对患者产生实质性的临床益处。联合治疗实际上可以在其中化合物单个地具有低效果或没有效果的剂量下是有效的。因此，本发明的特别优点在于使用每个化合物的亚最佳剂量的能力，即低于通常规定的治疗剂量的剂量，优选为治疗剂量的1/2，更优选地1/3、1/4、1/5，或甚至更优选地为治疗剂量的1/10。在特别的实例中，使用的剂量低至治疗剂量的1/20、1/30、1/50、1/100或甚至更低。

如上所提及的，这可能是由于本发明的组合物对参与α-突触核蛋白聚集网络的数个靶标的同时活性导致。在特别的实施方案中，这样的分子作用的结合可进一步导致协同的组合。协同性可通过本领域技术人员熟知的方法评价。例如，协同性可通过使用确定各药物之间的相互作用是否是显著的(即，协同性[32])的双向ANOVA，或通过自各化合物单独和它们的组合的剂量效果曲线计算组合指数[33,34]来表征。

这样的亚治疗剂量下，所述化合物将不会表现出副作用，同时根据本发明的组合在治疗帕金森综合征，更优选PD方面是完全有效的。

优选的剂量对应于对于长期维持治疗通常规定的那些的1%直至50%的量。

最优选的剂量可以对应于对于长期维持治疗通常规定的那些的1%直至10%的量。

用于本发明的药物的剂量(相当于活性分子的量)的具体实例在以下提供：

- 阿坎酸: 1000 mg或更低/天，优选小于500 mg/天，优选小于400 mg/天，更优选地小于200 mg/天，更优选地小于50 mg/天，或甚至小于10 mg/天，甚至更优选地为约0.1至1000 mg/天，进一步优选0.5 mg至100 mg，通常0.8 mg/天，2 mg/天，20 mg/天，40 mg/天，或80 mg/天，这样的剂量特别适用于经口施用，

- 巴氯芬: 150 mg或更低/天，优选小于100 mg/天，更优选地小于50 mg/天，更优选地小于30 mg/天，甚至更优选地为0.01 mg至30 mg/天，通常12 mg/天，24 mg/天，30 mg/天，这样的剂量特别适用于经口施用。这样的剂量特别适用于经口施用。

- 西那卡塞特: 150 mg或更低/天, 优选小于100 mg/天, 优选小于50 mg/天,更优选地小于36 mg/天, 并且甚至更优选地为0.01至25 mg/天，这样的剂量特别适用于经口施用，

- 美西律: 120 mg或更低/天, 优选小于60 mg/天, 更优选地小于30 mg/天,更优选地小于15 mg/天, 甚至更优选地为6至15 mg/天，这样的剂量特别适用于经口施用，

- 托拉塞米: 4 mg或更低/天, 优选小于2 mg/天, 更优选地小于1 mg/天, 更优选地小于0.5 mg/天, 并且甚至更优选地为0.05至0.5 mg/天，这样的剂量特别适用于经口施用，

- 磺胺异噁唑：800 mg或更低/天, 优选小于400mg, 更优选地小于200 mg/天,更优选地小于100mg/天, 甚至更优选地小于20 mg/天，这样的剂量特别适用于经口施用，

- 他达拉非：20 mg或更低/天, 优选小于10mg/天, 更优选地小于4 mg/天, 更优选地小于2.5 mg/天, 甚至更优选地0.025-2.5 mg/天，这样的剂量特别适用于经口施用，

- 左旋多巴：1.5 g或更低/天, 优选小于750 mg/天, 更优选地小于375 mg/天,甚至更优选地小于100 mg/天，这样的剂量特别适用于经口施用，

- 雷沙吉兰：0.5 mg或更低/天, 优选小于0.25 mg/天, 更优选地小于0.1 mg/天, 更优选地小于0.05 mg/天, 甚至更优选地0.005-0.05 mg/天，这样的剂量特别适用于经口施用，

- 司来吉兰：5 mg或更低/天, 优选小于2.5mg/天, 更优选地小于1 mg/天, 更优选地小于0.5 mg/天, 甚至更优选地0.05-0.1 mg/天，这样的剂量特别适用于经口施用。

在特别优选的实施方案中，本发明的联合疗法包括施用0.4 mg至50 mg的阿坎酸和6 mg至15 mg巴氯芬，每日两次。

在一个实施方案中，本发明的联合疗法包括施用0.4 mg阿坎酸和6 mg巴氯芬，每日两次。

在优选的实施方案中，本发明的联合疗法包括施用1 mg阿坎酸和15 mg巴氯芬，每日两次。

在又一个优选的实施方案中，本发明的联合疗法包括施用10 mg阿坎酸和6 mg巴氯芬，每日两次。

在另一优选的实施方案中，本发明的联合疗法包括施用20 mg阿坎酸和12 mg巴氯芬，每日两次。

在又一实施方案中，本发明的联合疗法包括施用40 mg阿坎酸和12 mg巴氯芬，每日两次。

在又一实施方案中，本发明的联合疗法包括施用40 mg阿坎酸和30 mg巴氯芬，每日两次。

在另一特别的实施方案中，除了包括施用上述巴氯芬-阿坎酸方案之一，本发明的疗法还包括以其通常的剂量和方案(即作为附加疗法)或甚至以用于治疗帕金森病通常规定的那些的1 %直至50 %的更低的剂量施用左旋多巴或甲左多巴。

在另一特别的实施方案中，除了包括施用上述巴氯芬-阿坎酸方案之一，本发明的疗法还包括以其通常的剂量和方案(即作为附加疗法)或甚至以用于治疗PD通常规定的那些的1 %直至50 %的更低的剂量施用雷沙吉兰或司来吉兰。

当所述组合物包含巴氯芬和阿坎酸时，这两种化合物可以不同的比率使用，例如巴氯芬/阿坎酸重量比包括0.05-1000 (W:W)，优选0.05-100 (W:W)，更优选0.05-62.5 (W:W)，甚至更优选0.3-15 (W:W)。通常这样的巴氯芬/阿坎酸重量比是0.3、0.6、0.75、1.2、3.1、12、15、25或62.5。

应理解，实际施用的药物或药物组合的量将依据相关情况由医师决定，所述情况包括要治疗的一种或多种病症，要施用的确切组合物，个体患者的年龄、重量和反应，患者症状的严重度，以及所选的施用途径。因此，上述剂量范围意在为本文的教导提供指导和支持，但不意图限制本发明的范围。

给出以下实施例用于举例说明的目的而绝不用于限制的目的。

实施例

所有动物程序依照美国国立卫生研究院(NIH)对于实验动物的护理和使用指南进 行，并且由国家动物实验委员会批准。

A-防止对神经元细胞的谷氨酸毒性

谷氨酸毒性涉及帕金森病的致病机理。在这组实验中，测试候选化合物防止或减少对神经元细胞的谷氨酸毒性的毒性作用的能力。药物首先单个地测试，接着测定它们的组合作用。

神经元细胞制备

本发明的药物组合的效力在原代皮层神经元细胞上进行评估。

大鼠皮层神经元如由Singer等所述进行培养[35]。简而言之，将15天孕期的怀孕雌性大鼠通过颈脱位法(Rats Wistar)杀死并且从子宫取出胎仔。取下皮层并置于含有2%的青霉素10.000 U/ml 和链霉素10mg/ml 以及1%的牛血清白蛋白(BSA)的Leibovitz的冰冷介质(L15)中。在37ºC下通过胰蛋白酶(0.05%)使皮质解离20分钟。通过加入Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM) (含有II级DNA酶1和10%的胎牛血清(FCS))停止反应。然后细胞被连续通过10 ml移液管3次来机械分离并在+4°C下以515 g离心10 min。抛弃上清并且细胞沉淀再悬浮于确定培养基（由补充有B27 (2%)、L-谷氨酰胺(0.2mM)、2%的PS溶液和10 ng/ml的BDNF的Neurobasal组成）中。使用台盼蓝排斥试验在Neubauer细胞仪中计数存活的细胞。将细胞以30 000个细胞/孔的密度接种到96孔板中(孔用聚-L-赖氨酸(10 μg/ml)预先包被)并且在加湿的空气(95%)/CO2 (5%)气氛中在+37°C培养。

谷氨酸毒性测定

化合物的神经保护作用通过量化神经突网络(神经丝免疫染色(NF)，其特别揭示谷氨酸能神经元)进行评估。

在神经元培养12天后，候选组合的药物溶解在培养基(+0.1% DMSO)中。然后候选组合在谷氨酸损伤之前用神经元预先温育1小时。在温育后一小时，在候选组合存在下，加入谷氨酸达20min，至终浓度为40μM，以避免进一步的药物稀释。在温育结束时，用具有候选组合但没有谷氨酸的培养基改变培养基。培养物在谷氨酸损伤后24小时固定。MK801 (地佐环平马来酸氢盐, 77086-22-7 - 20 μM)用作阳性对照。

在用皂角苷(Sigma)渗透后，细胞用含有10%山羊血清的PBS封闭2h，然后细胞用针对神经丝蛋白抗体(NF, Sigma)的小鼠单克隆第一抗体温育。这种抗体用Alexa Fluor 488羊抗-小鼠IgG揭示。

细胞的核通过荧光标记物(Hoechst溶液, SIGMA)标记，并且神经突网络量化。使用六个孔/条件来评估3种不同培养物中的神经元存活率。

结果

所有测试的药物组合对于皮层神经元细胞的谷氨酸毒性提供保护作用。结果示于下表2。

如图1至图3所例示的，本发明的组合在上述实验条件下强烈保护神经元免于谷氨酸毒性。值得注意的是，使用单独使用的药物不具有显著或更低的保护作用的药物浓度观察到有效保护。

事实上，如图1所例示的，美西律-西那卡塞特组合有效地保护神经元细胞免于谷氨酸毒性，而通过单个的药物不提供保护。巴氯芬-阿坎酸(图3)组合对于皮层神经元细胞的谷氨酸毒性提供保护作用。巴氯芬和阿坎酸的组合诱导相比于单独阿坎酸超过200%的改进并且相比于单独使用的巴氯芬超过47%的改进。

表2

药物组合	对于谷氨酸毒性的神经保护作用
		巴氯芬和托拉塞米	+
巴氯芬-阿坎酸-托拉塞米	+
		美西律和西那卡塞特	+
磺胺异噁唑和托拉塞米	+
		巴氯芬和阿坎酸	+
阿坎酸和西那卡塞特	+
		巴氯芬和西那卡塞特	+

B- 对于缺血/缺氧诱导的神经元细胞死亡的保护作用

大鼠神经元皮层细胞制备

细胞如之前地制备。

氧和葡萄糖丧失测定(缺血的体外模型)

化合物的神经保护作用通过使用MAP2抗体量化神经突网络进行评估。利鲁唑(一种神经保护药物) (Riluteck^®, 5 μM)用作阳性对照。

在神经元培养10天后，候选药物溶解在培养基(+0.1% DMSO)中，然后在氧和葡萄糖丧失之前用神经元预温育1小时。在候选药物温育后一小时，移出培养基并且加入没有葡萄糖的新鲜培养基。这种培养基由没有葡萄糖的DMEM (lnvitrogen)构成，其补充有2%B27, 0.2 mM L-谷氨酰胺, 1% PS溶液, 10 ng/ml的BDNF。在37°C，将细胞转移到具有95 %N₂和5 % CO₂的厌氧温育器中。

在2小时后，25 mM的D-葡萄糖加入到培养基中并在37°C将细胞转移到具有95%空气/5% CO₂的典型温育器中。在氧葡萄糖再灌注24小时后，细胞通过乙醇(alcool)/乙酸的冷溶液在5分钟期间固定。

在用皂角苷(Sigma)渗透化后，细胞用含有10%山羊血清的PBS封闭2小时，然后细胞用针对MAP2的小鼠单克隆第一抗体(MAP2, Sigma)温育。这些抗体用Alexa Fluor 488山羊抗-小鼠IgG (Molecular probe)揭示。

细胞的核通过荧光标记物(Hoechst溶液, SIGMA)标记。使用6个孔/条件来评估在3种不同培养中的神经元存活率。

对于每个条件，拍摄2x10图片/孔并使用InCell Analyzer TM 1000 (GEHealthcare)在20x放大倍数下进行分析。

结果

如下表3所示，所有要求保护的药物组合对于皮层神经元细胞的缺血/缺氧诱导的细胞死亡提供保护作用。

表3

药物组合	对于缺血/缺氧的保护作用
		巴氯芬和托拉塞米	+
巴氯芬-阿坎酸-托拉塞米	+
		美西律和西那卡塞特	+
磺胺异噁唑和托拉塞米	+
		巴氯芬和阿坎酸	+
阿坎酸和西那卡塞特	+
		巴氯芬和西那卡塞特	+

图4至图6进一步显示本发明的组合治疗强烈保护神经元免于氧和葡萄糖丧失。如图4至图6所示，使用单独的药物不具有显著保护作用的药物浓度观察到有效保护。例如，观察到巴氯芬(80 nM)/阿坎酸(0.32 nM)组合或西那卡塞特(64 pM) /美西律(25.6 pM)组合或托拉塞米(80 nM) /磺胺异噁唑(1.36 nM)在缺血中的显著保护作用，而当在相同浓度下单独使用巴氯芬、阿坎酸、西那卡塞特、美西律、托拉塞米和磺胺异噁唑时没有获得显著的保护作用。

因此，这些结果证实所述组合治疗对氧化应激和线粒体功能障碍或细胞凋亡(其是缺血条件以及PD的基础)的有效且协同作用。

C- 药物对于多巴胺能神经元6-OHDA损伤的神经保护作用

6-羟基多巴胺(6-OHDA)是神经毒性药物，其通过产生活性氧物质和线粒体呼吸功能障碍（这被认为反映了在帕金森病的脑中发生的事件），而选择性地起始多巴胺能神经元的神经元退化。6-OHDA毒性在体内和体外通常用来研究帕金森综合征。

中脑多巴胺能神经元的培养

大鼠多巴胺能神经元如由Schinelli等所描述的进行培养[36]。15天孕期的怀孕雌性大鼠通过颈脱位法杀死(Rats Wistar; Janvier)并从子宫取出胎仔。取出胚胎中脑并置于含有2%的青霉素-链霉素(PS; PanBiotech)和1%的牛血清白蛋白(BSA; PanBiotech)的Leibovitz (L15; PanBiotech)的冰冷介质中。仅中脑曲的腹侧部分被用于制备细胞，因为这是富含多巴胺能神经元的发育大脑的区域。中脑通过在37ºC胰蛋白酶(胰蛋白酶EDTA1X; PanBiotech)消化20min而分离。通过加入含有II级DNA酶I (0.1 mg/ml; PanBiotech)和10%胎牛血清(FCS; Invitrogen)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM; PanBiotech)停止反应。然后使细胞3次通过10 ml移液管机械地分离并且在L15介质中在BSA (3.5%)层上在+4℃以180 x g离心10min。抛弃上清并且将细胞沉淀再悬浮在由以下构成的确定培养基中：补充有B27 (2%; Invitrogen), L-谷氨酰胺(2 mM; PanBiotech)和2%的PS溶液的Neurobasal (Invitrogen)，和10ng/ml脑源性神经营养因子(BDNF, PanBiotech)和1 ng/ml的胶质细胞源性神经营养因子(GDNF, PanBiotech)。使用台盼蓝排斥试验，在Neubauer细胞仪中计数存活细胞。将细胞以40 000个细胞/孔的密度接种在96孔板(预先包被聚-L-赖氨酸(Greiner))中并在37°C在加湿空气(95%) /CO2 (5%)气氛中培养。每2天用新鲜培养基改变一半的培养基。5%至6%的神经元细胞群是多巴胺能神经元。

6-OHDA 和试验化合物暴露

在培养的第6天，移去培养基并加入新鲜培养基，其中有或没有以下浓度的6-OHDA：在对照培养基中稀释的48小时期间，20 μM。试验化合物在48小时期间在6-OHDA施加之前预先温育1h。

终点评价：酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元的总数量的量度

在用6-OHDA中毒48小时之后，细胞通过在室温在PBS, pH=7.3中的4%多聚甲醛(Sigma)的溶液固定20分钟。细胞在PBS中再清洗两次，然后渗透并且非特异性位点在室温用含有0.1%皂角苷(Sigma)和1% FCS的PBS溶液封闭15min。接着，在室温，细胞用在小鼠中产生的单克隆抗-酪氨酸羟化酶抗体(TH, Sigma)温育2h，该抗体以在含有1% FCS, 0.1%皂角苷的PBS中按1/1000稀释。这些抗体在室温用Alexa Fluor 488山羊抗-小鼠IgG(Molecular Probes)揭示1h，其以在含有1% FCS, 0.1%皂角苷的PBS中按1/800稀释。

对于每种条件，利用InCell AnalyzerTM 1000 (GE Healthcare)在10x 放大倍数下获取2 x 10图片(代表~ 80 %的总孔面积)/孔。所有图像在相同的条件下获得。TH阳性神经元数量的分析使用Developer软件(GE Healthcare)进行。

数据以对照条件(没有中毒，没有6-OHDA = 100%)的百分比表示以便表示6-OHDA损伤。所有值表示为3个培养物(n=6孔/条件/培养物)的平均值+/- SEM (s.e.mean)。当使用Statview软件版本5.0允许时，统计分析包括ANOVA，接着Dunett和PLSD Fisher检验。

结果

在多巴胺能神经元48 h 6-OHDA损伤后，在TH神经元存活试验中对本发明的组合观察到神经保护作用。

在所有实验(对照，图7-9，12-14)中，用中脑神经元的48h 6-OHDA (20 μM)温育产生多巴胺能神经元的显著中毒(约-33%的TH神经元)。

BDNF用作阳性对照。在1.85 nM的一小时BDNF预处理显著保护多巴胺能神经元免于这种6-OHDA损伤。

如下表4所示，所有要求保护的药物组合给出对于在多巴胺能神经元细胞中的6-OHDA损伤的保护作用。

表4

如图7-9和12-14所示，巴氯芬-阿坎酸、巴氯芬-托拉塞米、美西律-西那卡塞特、阿坎酸-西那卡塞特、西那卡塞特-他达拉非成功地保护多巴胺能神经元免于6-OHDA中毒。

值得注意的是，巴氯芬-阿坎酸组合在大的浓度范围的巴氯芬(16 nM-400 nM)和阿坎酸(4 pM-1600 pM)中显示有效体外保护多巴胺能神经元。

此外，发明人已能够对于各巴氯芬、阿坎酸、西那卡塞特和他达拉非绘制剂量-效果曲线(未显示)，这进一步允许根据Loewe [33,34]，确定这些药物的组合物的组合指数(CI)。低于1的组合指数表征为给定组合内的药物之间的协同性。

如图12所示，还发现在上述谷氨酸毒性和缺血体外模型中显示协同活性的巴氯芬-阿坎酸混合物，在6-OHDA毒性模型中具有协同活性。例如，32 nM的巴氯芬当与4 pM或10pM的阿坎酸组合时，显示对6-OHDA中毒的多巴胺能神经元细胞的协同保护活性(S, 图12)，CI分别为0.4或0.5。

不同药物浓度的阿坎酸和西那卡塞特的试验组合也发现具有针对6-OHDA诱导的毒性的协同保护作用。它们的神经保护作用是特别重要的，特别是当考虑极低浓度的药物时，如图13和表5中所示。关于不同试验组合物的组合指数远远低于1的界限，这表明混合物阿坎酸-西那卡塞特对多巴胺能神经元的强协同保护作用(表5)。

西那卡塞特和他达拉非的试验组合也发现有效保护多巴胺能神经元免于6-OHDA毒性。针对6-OHDA诱导的毒性的该保护作用对于各种剂量的单独药物已发现协同性。它们的神经保护作用在图14中示出。关于不同试验组合物的组合指数低于1的界限，这表明混合物西那卡塞特和他达拉非对多巴胺能神经元的强协同保护作用(表6)。

N/A：未获得

D- 对体内多巴胺能神经元损失和对运动症状的作用

1）体内运动不能的改进

动物管理和手术程序

在至少5天的适应期后，使用Wistar大鼠(5周)。在氯胺酮(50 mg/kg)和甲苯噻嗪(10 mg/kg)下进行手术。在左侧黑质致密部，以1 μl/min的流速，动物接受单侧注射的溶解在6 μl的0.9%无菌NaCl（含有0.1%抗坏血酸(以保护6-OHDA免于氧化)）中的12 μg的6-OHDA(sigma Aldrich)。根据De Groot (1959)的大鼠脑立体定位图谱[37]，注射部位的脑立体定位坐标为：中间+ 2.2 mm，侧向2.0 mm, 背腹侧+ 3 mm，其中门牙杆在耳间平面上方+5.0 mm。

药物治疗

治疗或溶媒的第一次施用在脑立体定位注射6-OHDA (对于病变组)或溶媒前一天进行,并且所有都在行为试验前15天内进行。参考治疗组的大鼠施用L-DOPA (8 mg/kg)和苄丝肼(一种外周DPA脱羧酶抑制剂，12.5 mg/kg)的组合。在研究期间并且对于每只动物，基于相应组的动物的平均体重，确定经口施用的体积。体重每周确定两次并且施用的体积将因此相应地调整。

溶媒和化合物在上午和下午通过口服途径每天施用两次(即，bid:一日两次)；两次施用间隔八小时(+/- 30 min)，约9:30 AM和约17:30 PM。

在行为试验的当天，对每只动物，在行为试验之前，对L-DOPA治疗组约1小时而对药物组合约2小时(+/- 15 min)施用药物。

行为测试

每个试验在手术之前（2天或3天前）进行以确定基础水平值。行为功能的评价使用两个不同试验在手术注射6-OHDA后15天进行。

起始时间试验（ITT）：动物由受训技师保持在平面前侧。两个前肢中仅一个保持为自由活动。开始朝向平面的运动所需的时间被记录，使用180秒作为断开点[38]。

踏步试验(ST)：大鼠由实验人员保持并且两个前肢中的仅一个保持为在平面上自由活动。另一只手固定没有被监测的前肢，其中一只爪接触台面。然后动物通过实验人员向后或向前慢慢移动(5秒，9m)。对右爪计数调整步子的数量[38]。

圆筒试验(CT)：大鼠置于树脂玻璃圆筒中，并且在之后立即录像15 min以检查在该新环境中在探索行为期间它们前爪使用的对称性/不对称性。测定在该期间用同侧爪、对侧爪和双爪(双接触)在圆筒壁上进行的接触次数，并表示为总接触次数的百分比[39,40]。

结果

体内测定用本发明的药物组合进行。测试的发明的药物组合在起始时间试验或踏步试验中都引起显著的改善(表7)。

表7

如图10和图11中所例示的，本发明的药物组合强烈保护大鼠免于6-OHDA脑立体定位病变。值得注意的是，用巴氯芬-阿坎酸组合的治疗以剂量依赖方式导致踏步试验和起始试验中几乎完全减轻运动不能。

还在也用于评价运动不能的不同试验(圆筒试验)中评价本发明的组合对运动不能的这种作用。结果示于图15，表明巴氯芬-阿坎酸(分别为3.75 mg/kg bid和0.25 mg/kgbid)组合减轻由6-OHDA中毒导致的在圆筒上的双接触的降低，这表明大鼠自发运动行为的改善。

对于巴氯芬-阿坎酸组合，已经测试了若干剂量和比率的药物。下表8中汇集的结果证实了大范围的剂量或比率的巴氯芬和阿坎酸有效对抗由脑立体定位注射6–OHDA导致的运动不能。

表8

*ITT、CT或ST的至少一种

2) 体内运动不能的改进涉及在治疗的动物中的神经元损失减少

用于大型组织学的组织制备

通过致死性注射戊巴比妥处死所有动物。快速取出脑，然后在干冰中冷冻，并贮存在-80°C。

纹状体切片制备：在-20°C下用冷冻切片机(HM560)切割纹状体水平上的冠状(10µm厚)组织切片。然后将每只动物三个连续的纹状体切片包埋在SuperFrost Plus玻璃载玻片(Fisher Scientific)上并贮存在-80°C，直到组织学分析。

黑质致密部(SN)切片制备：切片分布在覆盖整个SN的三组切片中(坐标：自前卤-4.8、-5.3和-5.8mm AP)。SN切片在冲洗后，浸入0.3% H₂O₂，在含有5% BSA的PBS中预孵育30min，然后在含有单克隆抗-酪氨酸羟化酶抗体(TH, Sigma)的相同溶液中孵育过夜，所述抗体稀释度为1/1000。随后将切片与染料标记的抗-小鼠第二抗体孵育2小时。

用[ ³ H]-氯苯咪吲哚染色标记纹状体中多巴胺能末梢神经元

通过结合至多巴胺吸收部位的[³H]-氯苯咪吲哚的分析，评价纹状体中的DA末梢损失，作为多巴胺能去神经程度的指标[40]。事实上，氯苯咪吲哚是多巴胺再吸收运载体的阻滞剂，其通常在实验生物学中用于标记多巴胺能神经元。

简言之，纹状体切片经空气干燥(用实验室空气干燥机)和在含120 mM NaCl和5mM KCl的50 mM Tris缓冲液中冲洗5 min。然后将它们用在含300 mM NaCl和5 mM KCl的50mM Tris缓冲液(添加有0.3 mM地昔帕明以封闭去甲肾上腺素吸收部位)中的15 nM [³H]-氯苯咪吲哚(NEN, DuPont; specific activity, 17 Ci/mM)孵育40 min。在Tris孵育缓冲液中冲洗切片两次3 min，和在双蒸水中冲洗10 s，经空气干燥。[³H]-敏感性照相胶片(Kodal BioMax MS Film, Sigma)暴露于在x-射线暗盒中的切片，并在室温下暴露3周。[³H]-氯苯咪吲哚标记的水平通过来自胶片放射自显影图像的数字化图像分析，使用BIOCOM分析系统(Densirag, BIOCOM)定量。使用外部标准(校准密度分级表, Kodak)，将灰度水平转化为光学密度(OD)。在减去在各切片上测量的背景信号(通过扫描已知缺少DA末梢的胼胝体的区域)后，自三个切片/动物确定平均OD值。

SN中的TH阳性神经元的定量

在中心位于SN中6-OHDA注射针的轨迹上的一组三个切片中计数TH阳性神经元，其覆盖了几乎全部SN。DA神经元损害的特异性，在相同区域的甲苯胺蓝色标记的切片上计数SN中的球形细胞。通过CDD照相机，使用连接至计算机图像分析系统的显微镜进行计数细胞。

结果

在左侧SN中的6-OHDA注射导致SN中的DA细胞体的密度和纹状体的左侧的DA末梢密度降低(图16)。L-DOPA，其被公认为PD的仅症状性治疗，不能抑制该6-OHDA导致的神经元损失。当与未治疗的动物相比，施用巴氯芬-阿坎酸组合的剂量3 (分别为3.75 mg/kg bid和0.25 mg/kg bid)导致SN中以及纹状体中DA神经元的统计学显著升高(图16)。因此，与L-DOPA (当前最有效的通过仅症状性的治疗)不同，巴氯芬-阿坎酸组合提供针对6-OHDA引起的退化的DA神经元的实际保护。不仅SN的DA神经元的细胞体，而且纹状体中的神经末梢也受到保护，因此这种保护似乎还作用于顺行的神经元退化。

参考文献

1 De Lau LML & Breteler MMB (2006) Epidemiology of Parkinson’sdisease. Lancet Neurol. 5, 525–35.

2 Samii A, Nutt JG & Ransom BR (2004) Parkinson’s disease. Lancet363, 1783–93.

3 Savitt JM, Dawson VL & Dawson TM (2006) Diagnosis and treatment ofParkinson disease: molecules to medicine. J. Clin. Invest. 116, 1744–54.

4 Schapira AH & Jenner P (2011) Etiology and pathogenesis ofParkinson’s disease. Mov. Disord. 26, 1049–55.

5 Gao H-M & Hong J-S (2011) Gene-environment interactions: key tounraveling the mystery of Parkinson’s disease. Prog. Neurobiol. 94, 1–19.

6 Kahle PJ, Waak J & Gasser T (2009) DJ-1 and prevention of oxidativestress in Parkinson’s disease and other age-related disorders. Free Radic.Biol. Med. 47, 1354–61.

7 Lee DW, Rajagopalan S, Siddiq A, Gwiazda R, Yang L, Beal MF, RatanRR & Andersen JK (2009) Inhibition of prolyl hydroxylase protects against 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced neurotoxicity: model forthe potential involvement of the hypoxia-inducible factor pathway inParkinson disease. J. Biol. Chem. 284, 29065–76.

8 Abbott A (2010) Levodopa: the story so far. Nature 466, S6–7.

9 Rascol O, Lozano A, Stern M & Poewe W (2011) Milestones inParkinson’s disease therapeutics. Mov. Disord. 26, 1072–82.

10 Obeso JA, Rodriguez-Oroz MC, Goetz CG, Marin C, Kordower JH,Rodriguez M, Hirsch EC, Farrer M, Schapira AH V & Halliday G (2010) Missingpieces in the Parkinson’s disease puzzle. Nat. Med. 16, 653–61.

11 Ettmayer P, Amidon GL, Clement B & Testa B (2004) Lessons learnedfrom marketed and investigational prodrugs. J. Med. Chem. 47, 2393–404.

12 Beaumont K, Webster R, Gardner I & Dack K (2003) Design of esterprodrugs to enhance oral absorption of poorly permeable compounds: challengesto the discovery scientist. Curr. Drug Metab. 4, 461–85.

13 Heimbach T, Oh DM, Li LY, Rodríguez-Hornedo N, Garcia G & FleisherD (2003) Enzyme-mediated precipitation of parent drugs from their phosphateprodrugs. Int. J. Pharm. 261, 81–92.

14 Yang CY, Dantzig AH & Pidgeon C (1999) Intestinal peptidetransport systems and oral drug availability. Pharm. Res. 16, 1331–43.

15 Steffansen B, Nielsen CU, Brodin B, Eriksson AH, Andersen R &Frokjaer S (2004) Intestinal solute carriers: an overview of trends andstrategies for improving oral drug absorption. Eur. J. Pharm. Sci. 21, 3–16.

16 Stella VJ (2007) Prodrugs: challenges and rewards. (A. Press andSpringer, eds.) Springer Singapore Pte. Limited, New-York.

17 Wermuth CG (2003) Designing prodrugs and bioprecusrors. In ThePractice of Medicinal Chemistry (Hardbound, ed), 2nd ed., pp. 561–585.Academic Press.

18 Pezron I, Mitra AK, Duvvuri S & Tirucherai GS (2002) Prodrugstrategies in nasal drug delivery. Expert Opin. Ther. Pat. 12, 331–340.

19 Stella VJ (2004) Prodrugs as therapeutics. Expert Opin. Ther. Pat.14, 277–280.

20 Stella VJ & Nti-Addae KW (2007) Prodrug strategies to overcomepoor water solubility. Adv. Drug Deliv. Rev. 59, 677–94.

21 Higuchi T & Stella VJ (1975) Pro-drugs as Novel Drug DeliverySystem, ACS Sympos American Chemical Society, Washington, DC.

22 Roche EB (1977) Design of biopharmaceutical properties throughprodrugs and analogs: a symposium, American P The Academy, Washington, DC.

23 Lal R, Sukbuntherng J, Tai EHL, Upadhyay S, Yao F, Warren MS, LuoW, Bu L, Nguyen S, Zamora J, Peng G, Dias T, Bao Y, Ludwikow M, Phan T,Scheuerman RA, Yan H, Gao M, Wu QQ, Annamalai T, Raillard SP, Koller K,Gallop MA & Cundy KC (2009) Arbaclofen placarbil, a novel R-baclofen prodrug:improved absorption, distribution, metabolism, and elimination propertiescompared with R-baclofen. J. Pharmacol. Exp. Ther. 330, 911–21.

24 Xu F, Peng G, Phan T, Dilip U, Chen JL, Chernov-Rogan T, Zhang X,Grindstaff K, Annamalai T, Koller K, Gallop MA & Wustrow DJ (2011) Discoveryof a novel potent GABA(B) receptor agonist. Bioorg. Med. Chem. Lett. 21,6582–5.

25 Hanafi R, Mosad S, Abouzid K, Niess R & Spahn-Langguth H (2011)Baclofen ester and carbamate prodrug candidates: a simultaneouschromatographic assay, resolution optimized with DryLab. J. Pharm. Biomed.Anal. 56, 569–76.

26 Leach AR & Gillet VJ An Introduction to Chemoinformatics(Springer-Verlag New York Inc, ed.).

27 Rahman SA, Bashton M, Holliday GL, Schrader R & Thornton JM (2009)Small Molecule Subgraph Detector (SMSD) toolkit. J. Cheminform. 1, 12.

28 Neugebauer G, Besenfelder E & von Möllendorff E (1988)Pharmacokinetics and metabolism of torasemide in man. Arzneimittelforschung.38, 164–6.

29 Stahl H & Wermuth CG (2011) Pharmaceutical salts: Properties,selection, and use, 2nd ed. (Wiley-VCH, ed.).

30 Gennaro AR (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy,20th ed. (A. D. Gennaro, W. Lippincott, and Wilkins, eds.) LippincottWilliams & Wilkins.

31 Swarbrick J & Boylan JC (eds.) Encyclopedia of PharmaceuticalTechnology Dekker, Marcel, New-York.

32 Slinker BK (1998) The Statistics of Synergism. J. Mol. Cell.Cardiol. 30, 723–731.

33 LOEWE S (1953) The problem of synergism and antagonism of combineddrugs. Arzneimittelforschung. 3, 285–90.

34 Grabovsky Y & Tallarida RJ (2004) Isobolographic analysis forcombinations of a full and partial agonist: curved isoboles. J. Pharmacol.Exp. Ther. 310, 981–6.

35 Singer CA, Figueroa-Masot XA, Batchelor RH & Dorsa DM (1999) Themitogen-activated protein kinase pathway mediates estrogen neuroprotectionafter glutamate toxicity in primary cortical neurons. J. Neurosci. 19, 2455–63.

36 Schinelli S, Zuddas A, Kopin IJ, Barker JL & di Porzio U (1988) 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine metabolism and 1-methyl-4-phenylpyridinium uptake in dissociated cell cultures from the embryonicmesencephalon. J. Neurochem. 50, 1900–7.

37 De GROOT (1959) The rat hypothalamus in stereotaxic coordinates.J. Comp. Neurol. 113, 389–400.

38 Olsson M, Nikkhah G, Bentlage C & Björklund A (1995) Forelimbakinesia in the rat Parkinson model: differential effects of dopamineagonists and nigral transplants as assessed by a new stepping test. J.Neurosci. 15, 3863–75.

39 Lundblad M, Andersson M, Winkler C, Kirik D, Wierup N & Cenci MA(2002) Pharmacological validation of behavioural measures of akinesia anddyskinesia in a rat model of Parkinson’s disease. Eur. J. Neurosci. 15, 120–32.

40 Jouve L, Salin P, Melon C & Kerkerian-Le Goff L (2010) Deep brainstimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus hasefficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellularresponses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson’s disease.J. Neurosci. 30, 9919–28.

Claims (24)

1.他达拉非和西那卡塞特，或其盐，或缓释制剂在制备用于治疗有需要的受试者的帕金森综合征的药物中的用途。

2.权利要求1的用途，进一步包含选自以下的化合物：阿坎酸、巴氯芬、美西律、磺胺异噁唑和托拉塞米，或其盐，或缓释制剂。

3.权利要求2的用途，其中所述药物包含以下的化合物组合之一：

- 他达拉非、西那卡塞特和美西律，

- 他达拉非、西那卡塞特和阿坎酸，或

- 他达拉非、西那卡塞特和巴氯芬，

或其盐，或缓释制剂。

4.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述药物进一步包含至少一种选自以下的化合物：多巴胺前体、多巴胺受体激动剂或多巴胺代谢酶的抑制剂。

5.权利要求4的用途，其中多巴胺前体选自：左旋多巴和甲左多巴，或其盐，或缓释制剂；多巴胺受体激动剂选自：他利克索、吡贝地尔、罗替戈汀、溴隐亭、培高利特、卡麦角林、麦角乙脲、普拉克索、罗平尼咯和阿朴吗啡，或其盐，或缓释制剂；和多巴胺代谢酶的抑制剂选自：卡比多巴、苄丝肼、恩他卡朋、托卡朋、司来吉兰和雷沙吉兰，或其盐，或缓释制剂。

6.权利要求5的用途，其中所述药物包含以下的化合物组合之一：

- 他达拉非、西那卡塞特和左旋多巴，

- 他达拉非、西那卡塞特、美西律和左旋多巴，

- 他达拉非、西那卡塞特、阿坎酸和左旋多巴，或

- 他达拉非、西那卡塞特、巴氯芬和左旋多巴，

或其盐，或缓释制剂。

7.权利要求6的用途，其中所述药物进一步包含至少一种选自以下的化合物：卡比多巴、苄丝肼、恩他卡朋、托卡朋、司来吉兰和雷沙吉兰，或其盐，或缓释制剂。

8.权利要求7的用途，其中所述至少一种化合物是卡比多巴，或其盐，或缓释制剂。

9.权利要求5的用途，其中所述药物包含以下的化合物组合之一：

- 他达拉非、西那卡塞特和司来吉兰或雷沙吉兰，

- 他达拉非、西那卡塞特、美西律和司来吉兰或雷沙吉兰，

- 他达拉非、西那卡塞特、阿坎酸和司来吉兰或雷沙吉兰，或

- 他达拉非、西那卡塞特、巴氯芬和司来吉兰或雷沙吉兰，

或其盐，或缓释制剂。

10.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述化合物与药学上可接受的载体或赋形剂一起使用。

11.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述化合物经配制以一起或单独施用。

12.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述化合物经配制以重复施用给受试者。

13.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述化合物经配制以口服施用。

14.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述受试者正患有选自以下的病况：帕金森病、进行性核上麻痹、多系统萎缩症、皮质基底神经节变性、弥漫性Lewy体疾病、帕金森-痴呆、X连锁肌张力障碍-帕金森综合征和续发性帕金森综合征。

15.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述受试者正患有选自以下的病况：帕金森病、Lewy体痴呆和多系统萎缩症。

16.权利要求1-3中任一项的用途，用于保护受试者的黑质纹状体系统的多巴胺能神经元免于退化或死亡。

17.权利要求1-3中任一项的用途，用于治疗所述受试者的运动徐缓或运动不能。

18.权利要求1-3中任一项的用途，用于预防性治疗处于帕金森综合征的风险的受试者。

19.一种药物组合物，包含他达拉非和西那卡塞特，或其药学上可接受的盐，或缓释制剂。

20.权利要求19的组合物，进一步包含选自以下的化合物：阿坎酸、巴氯芬、美西律、磺胺异噁唑和托拉塞米，或其药学上可接受的盐，或缓释制剂。

21.权利要求20的组合物，包含以下的化合物组合之一：

- 他达拉非、西那卡塞特和美西律，

- 他达拉非、西那卡塞特和阿坎酸，或

- 他达拉非、西那卡塞特和巴氯芬，

或其盐，或缓释制剂。

22.权利要求19或21的组合物，进一步包含左旋多巴或其药学上可接受的盐，或缓释制剂。

23.权利要求19或21的组合物，进一步包含司来吉兰或雷沙吉兰，或其药学上可接受的盐，或缓释制剂。

24.权利要求22的组合物，进一步包含至少一种选自以下的化合物：卡比多巴、苄丝肼、恩他卡朋、托卡朋、司来吉兰和雷沙吉兰，或其药学上可接受的盐，或缓释制剂。

Images